專利名稱：：乙醛酸的生物化學制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及通過使用微生物和/或來自微生物的酶的由乙二醛制備乙醛酸的方法。乙醛酸作為香草醛、乙基香草醛等的合成原料而被使用，也是作為農(nóng)藥、甚至醫(yī)藥品的合成中間體的有用的化合物。
背景技術：
：以往，作為乙醛酸的制備方法，已知的是乙二醛的硝酸氧化等化學的方法，而且現(xiàn)在幾乎全部的乙醛酸還是通過這樣的化學方法來制備的?？墒牵叶┑南跛嵫趸鹊幕瘜W方法容易產(chǎn)生乙醛酸以外的有機酸等副產(chǎn)物，對制備的乙醛酸的品質帶來不好的影響，為了除去這些副產(chǎn)物而需要煩雜的工序。另外，在大量使用硝酸等的中和工序中，生成的大量的鹽類廢棄物的處理也成為問題。作為乙醛酸的生物化學的制備方法，已知的有使用來自植物的羥乙酸氧化酶，將羥乙酸變換為乙醛酸的方法(參照特許特表平7-502895號公報、特表平8-508159號公報)、或通過微生物由羥乙酸變換為乙醛酸的方法等(參照特開平7-163380號公報、特開平8-322581號公報)。可是沒有報道過由作為乙醛酸化學合成法中所使用的原料的乙二醛通過生物化學的方法進行乙醛酸合成的方法，所述的乙二醛比乙二醇或乙醛容易合成，并且是能夠廉價獲得的化合物。另外，氧化醛基的氧化酶，雖然被確認為主要存在于動物、植物等中，但還沒有這些酶對乙二醛顯示活性的報道。另外，我們知道，PHanerochaetechrysosporium等白色腐朽菌的一部分，與乙二醛反應后在細胞外產(chǎn)生具有能生成過氧化氫活性的酶(被稱為乙二醛氧化酶)(參照JournalofBacteriology，(1987)，169，2195-2201、Pro.Natl.Acad.Sci.(1990)，87，2936-2940)?？墒牵挥脤τ谟蛇@些白色腐朽菌產(chǎn)生的酶催化的乙二醛的氧化反應時的生成物進行鑒定，由于這些木材腐蝕型真菌的酶即使是對于乙醛酸也具有與乙二醛相同程度的氧化活性，所以通過這些酶將乙二醛變換·蓄積為乙醛酸是困難的。另外，在這些木材腐蝕型真菌的酶以外，也沒有報道氧化乙二醛的來自微生物的氧化酶。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種具有將乙二醛變換為乙醛酸活性的微生物和/或具有該活性的酶，以及使用這些的有效率的乙醛酸制備方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明者們，為開發(fā)乙醛酸的有效率的制備方法進行了深刻的研究，結果發(fā)現(xiàn)了具有將乙二醛變換為乙醛酸的活性微生物，并對使用了這些微生物和/或由該微生物得到的酶液的乙醛酸合成進行了詳細的研究，以至完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及一種乙醛酸的制備方法，其特征在于，使具有能夠產(chǎn)生將乙二醛變換為乙醛酸能力的氧化還原酶、或具有該氧化還原酶能力的微生物培養(yǎng)液、培養(yǎng)液的上清液、細胞以及細胞處理物中的任意1種、或者2種或2種以上的物質的混合物作用于乙二醛，從而變換為乙醛酸。上述氧化還原酶優(yōu)選氧化酶。上述氧化還原酶，優(yōu)選是由選自寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)屬、鏈霉菌(Streptomyces)屬、假單胞菌(Pseudomonas)屬、微桿菌(Microbacterium)屬、無色桿菌(Achrromobacter)屬、纖維單胞菌(Cellulomonas)屬、Cellulosimicrobium(セルロシミクロビウム)屬、摩根氏菌(Morganella)屬中的至少1種微生物得到的酶。上述微生物優(yōu)選寡養(yǎng)單胞菌種(Stenotrophomonassp.)KNK235((保藏單位獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心，地址日本國茨城縣つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵政編碼305-8566)、保藏日平成14年9月6日、保藏號FERMP-19002)、鏈霉菌種(Streptomycessp.)KNK269((保藏單位獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心，地址日本國茨城縣つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵政編碼305-8566)、保藏日平成14年9月6日、保藏號FERMBP-08556)、假單胞菌種(Pseudomonassp.)KNK058((保藏單位獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心，地址日本國茨城縣つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵政編碼305-8566)、保藏日平成14年12月13日、保藏號FERMBP-08555)、假單胞菌種KNK254((保藏單位獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心，地址日本國茨城縣つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵政編碼305-8566)、保藏日平成14年9月6日、保藏號FERMP-19003)、微桿菌種(Microbacteriumsp.)KNK011((保藏單位獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心，地址日本國茨城縣つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵政編碼305-8566)、保藏日平成14年12月13日、保藏號FERMBP-08554)、無色桿菌種(Achromobactersp.)IFO13495(保藏單位獨立行政法人制品評價技術基盤機構生物技術本部·生物遺傳資源部門(NBRC)、地址292-0818日本國千葉縣木更津市かずさ鎌足2-5-8)、纖維單胞菌種(Cellulomonassp.)JCM2471(保藏單位獨立行政法人理化學研究所微生物系統(tǒng)保存施設(JCM)、地址351-0198日本國埼玉縣和光市廣沢2-1)、渾濁纖維單胞菌(Cellulomonasturbata)IFO15012(保藏單位獨立行政法人制品評價技術基盤機構生物技術本部·生物遺傳資源部門(NBRC)、地址292-0818日本國千葉縣木更津市かずさ鎌足2-5-8)、渾濁纖維單胞菌IFO15014(保藏單位獨立行政法人制品評價技術基盤機構生物技術本部·生物遺傳資源部門(NBRC)、地址292-0818日本國千葉縣木更津市かずさ鎌足2-5-8)、渾濁纖維單胞菌IFO15015(保藏單位獨立行政法人制品評價技術基盤機構生物技術本部·生物遺傳資源部門(NBRC)、地址292-0818日本國千葉縣木更津市かずさ鎌足2-5-8)、CellulosimicrobiumCellulans(セルロシミクロビウム·セルランス)IFO15013(保藏單位獨立行政法人制品評價技術基盤機構生物技術本部·生物遺傳資源部門(NBRC)、地址292-0818日本國千葉縣木更津市かずさ鎌足2-5-8)、CellulosimicrobiumcellulansIFO15516(保藏單位獨立行政法人制品評價技術基盤機構生物技術本部·生物遺傳資源部門(NBRC)、地址292-0818日本國千葉縣木更津市かずさ鎌足2-5-8)、CellulosimicrobiumcellulansJCM6201(保藏單位獨立行政法人理化學研究所微生物系統(tǒng)保存施設(JCM)、地址351-0198日本國埼玉縣和光市廣沢2-1)、摩氏摩根氏菌(Morganellamorganii)IFO3848(保藏單位獨立行政法人制品評價技術基盤機構生物技術本部·生物遺傳資源部門(NBRC)、地址292-0818日本國千葉縣木更津市かずさ鎌足2-5-8)。在上述乙醛酸的制備方法中，優(yōu)選允許過氧化氫酶共存于反應過程中。另外，本發(fā)明涉及作用于乙二醛而生成乙醛酸的來自微生物的醛氧化酶。對上述乙醛酸的活性，優(yōu)選為對乙二醛的活性的1/10倍或1/10倍以下的活性。上述醛氧化酶，優(yōu)選選自寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、微桿菌屬(Microbacterium)、無色桿菌屬(Achromobacter)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、Cellulosimicrobium屬、摩根氏菌屬(Morganella)中至少一種微生物所產(chǎn)生的物質。上述微生物，優(yōu)選為寡養(yǎng)單胞菌種KNK235(FERMP-19002)、鏈霉菌種KNK269(FERMBP-08556)、假單胞菌種KNK058(FERMBP-08555)、假單胞菌種KNK254(FERMP-19003)、微桿菌種KNK011(FERMBP-08554)、無色桿菌種IFO13495、纖維單胞菌種JCM2471、渾濁纖維單胞菌IFO15012、渾濁纖維單胞菌IFO15014、渾濁纖維單胞菌IFO15015、CellulosimicrobiumcellulansIFO15013、CellulosimicrobiumcellulansIFO15516、CellulosimicrobiumcellulansJCM6201、摩氏摩根氏菌IFO3848。上述醛氧化酶優(yōu)選的為具有以下(1)～(3)物理化學性質的鏈霉菌屬微生物所產(chǎn)生的醛氧化酶。(1)最適宜pH6～9(2)熱穩(wěn)定性在pH7.2、60℃處理20分后，保持90％或90％以上的活性(3)分子量經(jīng)凝膠過濾分析為約11萬，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時，具有約2.5萬、約3.5萬、約8萬的3個亞單元蛋白質上述醛氧化酶優(yōu)選的為屬于具有以下(1)～(3)物理化學性質的假單胞菌屬的微生物所產(chǎn)生的醛氧化酶。(1)分子量經(jīng)凝膠過濾分析為約15萬(2)反應最適宜溫度60～70℃(3)反應最適宜pH5～7上述醛氧化酶優(yōu)選的為具有以下物理化學性質的微桿菌屬微生物在細胞內(nèi)以及細胞外所產(chǎn)生的醛氧化酶。分子量在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時為約11萬的單一蛋白質上述醛氧化酶優(yōu)選的為具有以下物理化學性質的Cellulosimicrobium屬微生物在細胞內(nèi)以及細胞外所產(chǎn)生的醛氧化酶。分子量在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時為約9～10萬的單一蛋白質屬于上述鏈霉菌屬的微生物優(yōu)選為鏈霉菌種KNK269(FERMBP-08556)。屬于上述假單胞菌屬的微生物優(yōu)選為假單胞菌種KNK058(FERMBP-08555)。屬于上述微桿菌屬的微生物優(yōu)選為微桿菌種KNK011(FERMBP-08554)。屬于上述Cellulosimicrobium屬的微生物優(yōu)選為CellulosimicrobiumcellulansIFO15516。上述醛氧化酶優(yōu)選的為作為亞單元具有以下(a)或(b)的蛋白質的醛氧化酶。(a)含有序列號1、2或3所示氨基酸序列的蛋白質(b)含有下述氨基酸序列中任何一個的蛋白質，所述氨基酸序列為在氨基酸序列(a)中缺失、置換或添加了1個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列上述醛氧化酶優(yōu)選的為具有由以下(a)或(b)DNA編碼的蛋白質作為亞單元的醛氧化酶。(a)含有序列號4、5或6的核苷酸序列的DNA(b)與包含下述核苷酸序列的DNA的任何一個在嚴格條件下雜交的DNA，所述核苷酸序列為與含有(a)核苷酸序列的DNA互補的核苷酸序列上述醛氧化酶優(yōu)選的為含有以下(a)或(b)氨基酸序列的醛氧化酶。(a)序列號7、8、11或12所示的氨基酸序列(b)在氨基酸序列(a)中缺失、置換或添加了1個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列上述醛氧化酶優(yōu)選的為由以下(a)或(b)DNA編碼的醛氧化酶。(a)含有序列號9、10、13或14核苷酸序列的DNA(b)與包含下述核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交的DNA，所述核苷酸序列為與含有(a)核苷酸序列的DNA互補的核苷酸序列另外，本發(fā)明還涉及編碼上述醛氧化酶的DNA。詳細地說，上述DNA優(yōu)選的是編碼上述醛氧化酶的亞單元的DNA，其中含有以下(a)或(b)。(a)含有序列號4、5或6的核苷酸序列的DNA(b)與包含下述核苷酸序列的DNA的任何一個在嚴格條件下雜交的DNA，所述核苷酸序列為與含有(a)核苷酸序列的DNA互補的核苷酸序列上述DNA優(yōu)選的是編碼上述醛氧化酶的DNA，其中含有以下(a)或(b)的任意一個。(a)含有序列號9、10、13或14的核苷酸序列的DNA(b)與包含下述核苷酸序列的DNA的任何一個在嚴格條件下雜交的DNA，所述核苷酸序列為與含有(a)核苷酸序列的DNA互補的核苷酸序列上述DNA優(yōu)選的是編碼上述醛氧化酶的亞單元的DNA，其中含有在序列號1、2或3所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加了1個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列中的任意一個。上述DNA優(yōu)選的是編碼上述醛氧化酶的DNA，其中含有在序列號7、8、11或12所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加了1或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列中的任意一個。圖1是表示氧化酶反應的活性測定法的原理的圖。圖2是表示來自本發(fā)明KNK269的酶的反應最適宜pH的圖。作為緩沖液，使用了0.1MMacIlvine緩沖液(●)、0.1M磷酸緩沖液(○)、0.1MTricine緩沖液(△)、或0.1MGlycine-HCl緩沖液(×)。圖3是表示來自本發(fā)明KNK269的酶的熱穩(wěn)定性的圖。圖4是表示來自本發(fā)明KNK058的酶的反應最適宜溫度的圖。圖5是表示來自本發(fā)明KNK058的酶的反應最適宜pH的圖。作為緩沖液，使用了0.1MMacIlvine緩沖液(●)、0.1M磷酸緩沖液(○)、或0.1MTricine緩沖液(×)。實施發(fā)明的最佳方案本發(fā)明的乙二醛向乙醛酸的變換反應示于式1及式2。(式1)(式2)上述式1所表示的反應是有氧化酶或含有該氧化酶的微生物存在的情況，上述式2所表示的反應是有脫氫酶或含有該脫氫酶的微生物存在的情況。在本說明書中，由乙二醛向乙醛酸的變換，也包含著按照上述式1以及式2所示的任一個反應的變換。因此，所說的具有由乙二醛向乙醛酸變換能力的氧化還原酶，是意指氧化酶或脫氫酶，只要是將醛變換為羧酸的酶均可。特別是，在蓄積乙醛酸這點上，優(yōu)選對乙醛酸不具有活性、或只具有低活性的酶。另外，使用含有能夠產(chǎn)生上述氧化還原酶的微生物的培養(yǎng)液、培養(yǎng)液上清、細胞以及細胞處理物中的任意1種或者其中2種或2種以上物質的混合物，可以由乙二醛向乙醛酸進行變換。反應由脫氫酶進行催化時(式2)，除基質以外，需要輔酶(例如，NAD(煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸)或NADP(煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸磷酸))。另一方面，反應由氧化酶進行催化時(式1)，由于除了作為基質的乙二醛以外只要有氧即可進行反應，從成本的觀點來看，使用氧化酶是有利的。反應由氧化酶進行催化時，除了乙醛酸以外，還生成過氧化氫，通過檢測出此過氧化氫，就能夠容易地檢測出目標的氧化酶活性。本發(fā)明中的目標的氧化酶活性的檢出、定量，如圖1所示，可以通過使氧化反應生成的過氧化氫與4-氨基安替比林(以下4-AA)和N-乙基-(2-羥基-3-磺丙基)間甲苯胺(以下TOOS)反應，檢出、定量生成的醌亞胺色素來進行。具體地，在0.9ml含有以下組份的100mM磷酸緩沖液(pH7)中，添加0.1ml細胞懸浮液或酶液，通過在30℃、波長555nm測定吸光度的增加來進行。在本發(fā)明中，將在1分鐘生成1μmol的H2O2的酶活性定義為1單位。(組成)乙二醛20mM4-AA0.67mMTOOS1.09mM來自辣根的過氧化物酶(以下POD)2U/mL另外，乙二醛以及乙醛酸的定量，可以通過高效液相色譜法進行。通過高效液相色譜法的分析，可以使用例如バイオラツド·アミネツクスHPX-87H(7.8mm×300mm)柱，溶劑使用5mM的H2SO4水溶液，在流速0.4ml/分下進行。檢出是通過測定230nm的吸光度或示差屈折率來進行。按照本條件，乙二醛在16分鐘、乙醛酸在15分鐘被洗脫出來。具有目的氧化酶活性的微生物，可以通過例如以下的篩選取得。作為碳源，在含有乙二醛、乙二醇、丙二醇或羥基乙醛10g、硝酸銨2g、磷酸氫二鉀1g、磷酸二氫鈉、酵母提取物0.1g、硫酸鎂7水合物0.2g、氯化鈣二水合物0.1g(均為1L中)的、經(jīng)高壓蒸汽滅菌(121℃、20分鐘)的S培養(yǎng)基(pH7)5ml中，加入懸浮于10ml生理鹽水中的從日本國內(nèi)采集的土壤樣品各2g后的上清液0.2ml，在28℃進行3～7天的集聚培養(yǎng)。將細菌繁殖的培養(yǎng)液以各0.1ml涂布于含有2％瓊脂的S培養(yǎng)基板上，在28℃進行3～7天培養(yǎng)。然后，將繁殖的菌落再次在含有2％瓊脂的培養(yǎng)基的S培養(yǎng)基板上進行靜置培養(yǎng)，將確認其生長的菌株定義為作為各碳源的同化性菌株(資化性菌)。然后，研究這些同化性菌的由乙二醛向乙醛酸變換的活性。將各種細胞在試管中以S培養(yǎng)基5ml在28℃、進行3～5天的振蕩培養(yǎng)后，通過離心分離收集細胞，用生理鹽水洗凈后，懸浮于0.5ml的100mMTris-HCl緩沖液(pH8)中。將0.1ml該細胞懸浮液添加到含有50mM乙二醛的100mMTriS-HCl緩沖液(pH8)0.2ml中，在28℃振蕩6～12小時。之后，離心分離反應液，將上清液通過高效液相色譜進行分析，進行乙醛酸的生成的確認以及定量。另外，乙二醛的氧化由上述氧化酶催化時，由于在生成乙醛酸的同時產(chǎn)生過氧化氫，通過檢出反應時生成的過氧化氫就可以發(fā)現(xiàn)氧化酶保有菌。即，將在上述S培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的細胞的細胞懸浮液0.1ml添加到含有50mM乙二醛、1.34mM4-AA、2.18mMTOOS、4U/ml過氧化物酶的100mM磷酸緩沖液0.1ml中，在28℃振蕩2小時，反應液變?yōu)樽仙奈镔|，即通過分選與乙二醛反應而產(chǎn)生過氧化氫的菌株，可以獲得具有乙二醛氧化酶活性的菌株。作為具有將乙二醛變換為乙醛酸能力的微生物，可以舉出屬于寡養(yǎng)單胞菌屬、鏈霉菌屬、假單胞菌屬、微桿菌屬、無色桿菌屬、纖維單胞菌屬、Cellulosimicrobium屬、摩根氏菌屬等的微生物。在這些當中，作為代表性的微生物，可以舉出，寡養(yǎng)單胞菌種KNK235(FERMP-19002)、鏈霉菌種KNK269(FERMBP-08556)、假單胞菌種KNK058(FERMBP-08555)、假單胞菌種KNK254(FERMP-19003)、微桿菌種KNK011(FERMBP-08554)、無色桿菌種IFO13495、纖維單胞菌種JCM2471、渾濁纖維單胞菌(Cellulomonasturbata)IFO15012、渾濁纖維單胞菌IFO15014、渾濁纖維單胞菌IFO15015、CellulosimicrobiumcellulansIFO15013、CellulosimicrobiumcellulansIFO15516、CellulosimicrobiumcellulansJCM6201、摩氏摩根氏菌IFO3848等。這些微生物中，公知IFO13495、IFO15012、IFO15014、IFO15015、IFO15013、IFO15516、IFO3848，可以從獨立行政法人制品評價技術基盤機構生物技術本部·生物遺傳資源部門(NBRC)(292-0818日本國千葉縣木更津市かずさ鎌足2-5-8)容易地得到。JCM2471以及JCM6201也是公知的，可以從獨立行政法人理化學研究所微生物系統(tǒng)保存施設(JCM)(351-0198日本國埼玉縣和光市廣沢2-1)容易地得到。其它的微生物，由本發(fā)明者從土壤中新分離·鑒定，分別保藏于上述保藏號的獨立法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所專利微生物保藏中心(305-8566日本國茨城縣つくば市東1丁目1番地1中央第6)。上述寡養(yǎng)單胞菌種KNK235(以下，也有只稱為KNK235的情況)、假單胞菌種KNK058(以下，也有只稱為KNK058的情況)、假單胞菌種KNK254(以下，也有只稱為KNK254的情況)以及微桿菌種KNK011(以下，也有只稱為KNK011的情況)的細菌學的性質示于表1。表1<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="828">KNK235KNK254KNK058KNK101細胞的形態(tài)革蘭氏染色孢子形成運動性菌落的形態(tài)培養(yǎng)溫度過氧化氫酶氧化酶OF試驗(葡萄糖)硝酸鹽還原吡嗪酰胺酶芽孢桿菌(0.8×2.0～3.0μM)--+圓形四周光滑低凸狀有光澤黃色+(37℃)-(45℃)+---芽孢桿菌(0.7～0.8×2.0～2.5μM)--+圓形四周光滑低凸狀有光澤黃色-(37℃)-(45℃)++--芽孢桿菌(0.8×1.5～2.0μM)--+圓形四周光滑低凸狀有光澤黃色+(37℃)-(45℃)+---芽孢桿菌(0.7～0.8×1.0～1.2μM)+--圓形四周光滑低凸狀有光澤黃色+(37℃)-(45℃)+---+</table></tables>鏈霉菌種KNK269(以下，也有只稱為KNK269的情況)的鑒定基于以下眾所周知的方法進行。將該菌株的16S核糖體RNA基因(16SrDNA)之中5‘末端側約500bp的領域用PCR進行擴大，確定核苷酸序列，并使用MicroSeqBacterial500libraryv.0023(AppliedBiosystems社、CA，USA)數(shù)據(jù)庫進行同源性檢索，制備分子系統(tǒng)樹的方法來進行。上述醛氧化酶為鏈霉菌屬微生物產(chǎn)生的醛氧化酶時，優(yōu)選具有以下(1)～(3)的物理化學性質。(1)最適宜pH6～9(2)熱穩(wěn)定性在pH7.2、60℃處理20分鐘后，保持90％或90％以上的活性(3)分子量經(jīng)凝膠過濾分析為約11萬，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時，具有約2.5萬、約3.5萬、約8萬的3個亞單元蛋白質另外，在鏈霉菌屬微生物之中，優(yōu)選鏈霉菌種KNK269(FERMBP-08556)。上述醛氧化酶為屬于假單胞菌屬的微生物產(chǎn)生的醛氧化酶時，優(yōu)選具有以下(1)～(3)的物理化學性質。(1)分子量經(jīng)凝膠過濾分析為約15萬(2)反應最適宜溫度60～70℃(3)反應最適宜pH5～7另外，在假單胞菌屬微生物之中，優(yōu)選假單胞菌種KNK058(FERMBP-08555)。上述醛氧化酶為微桿菌屬微生物在細胞內(nèi)以及細胞外產(chǎn)生的醛氧化酶時，優(yōu)選具有以下的物理化學性質。分子量在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時，為約11萬的單一蛋白質另外，在微桿菌屬微生物之中，優(yōu)選微桿菌種KNK011(FERMBP-08554)。上述醛氧化酶為Cellulosimicrobium屬微生物在細胞內(nèi)以及細胞外產(chǎn)生的醛氧化酶時，優(yōu)選具有以下的物理化學性質。分子量在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時，為約9～10萬的單一蛋白質另外，在Cellulosimicrobium屬微生物之中，優(yōu)選CellulosimicrobiumcellulansIFO15516。在本發(fā)明中，用于培養(yǎng)具有能夠產(chǎn)生氧化還原酶能力的微生物的培養(yǎng)基，只要是微生物能夠增殖的即可，沒有特別的限定，所述氧化還原酶具有將乙二醛變換為乙醛酸的能力。例如，作為碳源，可以使用葡萄糖以及蔗糖等糖類，乙醇、甘油、乙二醇以及丙二醇等醇類，乙二醛等醛類，油酸以及硬脂酸等脂肪酸及其酯類，菜籽油以及大豆油等油類；作為氮源，可以使用硫酸銨、硝酸鈉、胨、酪蛋白水解物、酵母提取物、肉提取物以及玉米漿等；作為無機鹽類、可以使用硫酸鎂、氯化鈉、碳酸鈣、磷酸一氫鉀以及磷酸二氫鉀等；其它的還可以使用含有麥芽提取物、肉提取物等的通常的液體培養(yǎng)基。按照本發(fā)明的乙醛酸的制備方法，其特征在于，使上述氧化還原酶、或具有能夠產(chǎn)生該氧化還原酶能力的微生物的培養(yǎng)液、從培養(yǎng)液分離的微生物細胞、微生物細胞處理物、甚至在微生物細胞外也產(chǎn)生上述氧化酶時的培養(yǎng)液上清的任意一種作用于乙二醛，變換積蓄為乙醛酸。在此，所說的微生物細胞處理物是意指例如冷凍乾燥細胞、丙酮乾燥細胞、這些細胞的破碎物、或粗酶液等。在用語“粗酶液”中包含通過例如使用細胞玻璃珠等物理破碎方法、使用酶等生物化學方法進行了破碎或溶解的溶液，進一步通過離心分離等將該溶液中的固體物質除去，得到的無細胞提取液。另外，還有包含本領域的研究人員通常使用的方法，例如單獨或組合使用透析、硫酸銨沉淀、色譜法，將上述無細胞提取液部分精制的酶也包含于“粗酶液”中。另外，微生物細胞處理物可以用公知的手段進行固定化而使用。固定化可以用本領域的研究人員周知的方法(例如，交聯(lián)法、物理吸附法、包括法等)進行。反應條件雖然根據(jù)使用的酶、微生物或其處理物有所差異，但作為最適宜的反應條件，溫度為10～80℃，從熱穩(wěn)定性的觀點看，優(yōu)選20～40℃的范圍、pH為pH4～12，從pH穩(wěn)定性的觀點看，優(yōu)選pH6～10的范圍。反應優(yōu)選在振蕩、攪拌條件下實施。反應由氧化酶催化時，在反應體系中生成過氧化氫。雖然過氧化氫有使酶失活、或將乙醛酸分解為甲酸的情況，但通過添加過氧化氫酶，分解除去由反應產(chǎn)生的過氧化氫，可以防止酶的失活或乙醛酸的分解。作為本發(fā)明的酶，希望是對乙醛酸只顯示低活性的物質。具體是，本發(fā)明的酶，相對于乙醛酸的活性，優(yōu)選為相對于乙二醛的活性的1/10倍或1/10倍以下的酶，更加優(yōu)選1/20倍或1/20倍以下，特別優(yōu)選1/100倍或1/100倍以下。氧化酶相對于乙醛酸的活性，如果超過相對于乙二醛的活性的1/10倍，由于乙二醛被氧化生成的乙醛酸進一步被氧化，在反應體系中，有乙醛酸不被蓄積，或蓄積量降低的傾向。這樣，本發(fā)明的氧化酶的特征在于，不僅將乙二醛變換為乙醛酸，而且對于乙醛酸的活性低。已知的對于乙二醛顯示活性的木材腐蝕型真菌產(chǎn)生的乙二醛氧化酶，即使是對于乙醛酸也顯示出高的活性。在表2示出了本發(fā)明酶與木材腐蝕型真菌產(chǎn)生的酶對乙二醛和乙醛酸分別的活性。本發(fā)明酶，與乙二醛相比，對乙醛酸只顯示非常低的活性。表2另外，本發(fā)明涉及編碼上述醛氧化酶的DNA，其可以為了有效率地重組生產(chǎn)上述醛氧化酶而使用。詳細地講，本發(fā)明涉及編碼含有序列號4、5或6核苷酸序列的醛氧化酶亞單元的DNA，另外，只要包含以由上述DNA編碼的蛋白質作為亞單元的蛋白質具有將乙二醛變換為乙醛酸的活性，在嚴格條件下同含有這樣的核苷酸序列的DNA雜交的DNA也包含于本發(fā)明的DNA中，其中所述這樣的核苷酸序列互補于具有上述核苷酸序列的DNA。另外，本發(fā)明還涉及編碼含有序列號9、10、13或14核苷酸序列的醛氧化酶的DNA，另外，在嚴格條件下同含有互補于上述核苷酸序列所組成DNA的核苷酸序列的DNA雜交的DNA，只要由該DNA編碼的蛋白質具有將乙二醛變換為乙醛酸的活性，也包含于本發(fā)明的DNA中。另外，編碼含有在序列號1、2或3所示的氨基酸序列中，缺失、置換或添加了1個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列中的任意一個而形成的蛋白質的DNA，只要作為亞單元包含由該DNA編碼的蛋白質的蛋白質，具有將乙二醛變換為乙醛酸的活性，也包含于本發(fā)明的DNA中。另外，編碼含有在序列號7、8、11或12所示的氨基酸序列中，缺失、置換或添加了1個或數(shù)個氨基酸所形成的任意氨基酸序列的蛋白質的DNA，只要由該DNA編碼的蛋白質具有將乙二醛變換為乙醛酸的活性，也包含于本發(fā)明的DNA中。本發(fā)明還涉及含有由含有序列號4、5或6核苷酸序列的DNA編碼的蛋白質作為亞單元的醛氧化酶、或由含有序列號9、10、13或14核苷酸序列的DNA編碼的醛氧化酶。另外，含有下述DNA編碼的蛋白質作為亞單元的醛氧化酶，所述DNA與含有這樣的核苷酸序列的任意DNA在嚴格條件下雜交，所述這樣的核苷酸序列互補于含有序列號4、5或6所示核苷酸序列的DNA；由下述DNA編碼的醛氧化酶，所述DNA與含有這樣的核苷酸序列的任意DNA在嚴格條件下雜交，所述這樣的核苷酸序列互補于含有序列號9、10、13或14所示核苷酸序列的DNA，只要它們具有將乙二醛變換為乙醛酸的活性，都包含在本發(fā)明醛氧化酶中。雜交可以按照本領域的研究人員周知的操作實施。例如，具體地可以以通過切口平移法獲得的具有序列號4、5、6、9、10、13或14所示核苷酸序列的32P末端標記的雙鏈DNA作為探針DNA，通過Southern雜交來實施(MolecularCloning第3版2001年(參照ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NewYork、USA)，Vol.1、第6章，50～55)。將從任意的生物、微生物制備的染色體DNA、基因組DNA、質粒DNA、人工制備的載體DNA、或者將這些DNA用適當?shù)南拗泼赶玫腄NA片段用瓊脂糖凝膠電泳分離，固定在硝酸纖維素過濾膜上，通過放射自顯影術檢出與上述探針DNA結合的DNA，可以檢出可在本發(fā)明中使用的醛氧化酶的基因。作為在雜交中的嚴格條件，可以是將固定在硝酸纖維素過濾膜上的DNA和標記探針DNA在含有6×SSC、5×登納特(デンハルト)試劑、0.5％SDS、1μg/mPoly(A)、100μg/ml鮭精DNA的緩沖液中，在68℃雜交，用含有2×SSC、0.5％SDS的緩沖液沖洗后，使用含有2×SSC、0.1％SDS的緩沖液，在30℃進行2次30分鐘的洗滌的情況，另外，作為在雜交中的嚴格條件，也可以是使用含有1×SSC、0.5％SDS的緩沖液，在65℃進行4次每次30分鐘的洗滌的情況。1×SSC為含有0.15M的氯化鈉、0.015M的檸檬酸鈉的水溶液，1×デンハルト試劑包含0.02％FiColl400(Sigma-AldrichCorporation制)、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白(Sigma-AldrichCorporation制、FractionV)。另外，本發(fā)明還涉及具有含有序列號1、2或3所示氨基酸序列的蛋白質作為亞單元的醛氧化酶、或含有序列號7、8、11或12表示的氨基酸序列的醛氧化酶。另外，只要含有該蛋白質作為亞單元的蛋白質具有將乙二醛變換為乙醛酸的活性，含有下述氨基酸序列的蛋白質也包含于本發(fā)明的氧化酶中，所述氨基酸序列是在序列號1、2或3表示的醛氧化酶的亞單元γ、β或α的任意氨基酸序列中缺失、置換或添加了1個或數(shù)個氨基酸的所產(chǎn)生的÷的蛋白質，。另外，含有在序列號7、8、11或12所示氨基酸序列中缺失、置換或添加了1個或數(shù)個氨基酸所得氨基酸序列的蛋白質，只要具有將乙二醛變換為乙醛酸的活性，也包含于本發(fā)明的氧化酶中。作為缺失、置換或添加具體的氨基酸的方法，可以使用常規(guī)方法。所述常規(guī)方法的實例包括利用合成DNA引物的PCR，所述引物具有這樣的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含具體氨基酸密碼子的缺失，其它氨基酸密碼子的取代或其它氨基酸密碼子的加入；和這樣的方法，其中將通過已知方法諸如化學DNA合成法制備的酶基因連接入基因表達載體，并允許其在諸如大腸桿菌的宿主中通過遺傳重組而表達。這些方法可由本領域技術人員輕易實施。現(xiàn)已知，分泌到微生物細胞外的酶，一般地，在從基因起始密碼子的相當于數(shù)十氨基的部分編碼分泌信號序列，在細胞內(nèi)合成的酶蛋白質分泌到所述細胞外的過程中，已知所述分泌信號序列被切斷細胞細胞而成為成熟型的酶。在本發(fā)明中所述的數(shù)種酶的情況中，細胞活性的酶也被分泌到細胞外，但在這些酶的重組生產(chǎn)時，通過使用將其分泌信號序列人為地除去的基因，可以使酶蛋白質在作為宿主的微生物細胞內(nèi)產(chǎn)生。本發(fā)明還提供用于此目的的、其分泌信號序列已被去除的酶基因(序列號10以及14)。另外，在另一方面，在酶的重組表達時，為了在宿主微生物細胞外生產(chǎn)酶這一目的，可以使用含有分泌信號序列的基因(序列號9以及13)。另外，本領域的研究人員也可以按照已知的方法，制備并使用將其中本來的分泌信號序列置換成適合于宿主微生物的分泌信號序列的嵌合體基因。在本發(fā)明中可以使用的酶基因可以通過以下述方法獲得。即，從產(chǎn)生將乙二醛變換為乙醛酸的酶的微生物細胞或培養(yǎng)液中純化的酶蛋白質，使用由蛋白水解酶消化酶蛋白質而得到的肽，確定部分氨基酸序列。接著，按照眾所周知的方法，利用基于這些部分氨基酸序列合成的引物，將染色體組DNA作為模板進行PCR，將酶基因的一部分擴增，從而可以確定基因內(nèi)部的核苷酸序列。使用由N-末端氨基酸序列、或C-末端附近的氨基酸序列合成的DNA引物，通過進行逆向PCR可以確定信號序列、N-末端氨基酸序列以及C-末端氨基酸序列等(CellScience1990、vol.6No.5370-376)。使用PCR可以容易地取得確定了核苷酸序列的醛氧化酶的基因。另外，按照公知的方法，利用基因的一部分的序列，可以從微生物的染色體DNA或染色體組DNA中獲得所述醛氧化酶基因。在本發(fā)明中使用的酶，既可以是天然酶，另外也可以是通過重組技術得到的酶。作為重組技術的方法，例如，將酶的基因插入到質粒載體、噬細胞載體等中；轉化大腸桿菌等細菌，酵母或霉等微生物，動物、植物、或動植物的細胞等宿主的方法等都是有效的。以下，通過實施例對本發(fā)明進行更加詳細的說明，但本發(fā)明并不是僅僅局限于這些實施例。(實施例1)將含有10g乙二醇、1g酵母提取物、8gNUTRIENTBROTH(Difco社制)、3g磷酸二氫鉀、7g磷酸氫二鉀(均為每1L中)的液體培養(yǎng)基(EG-NB培養(yǎng)基(pH7))5ml傾倒到大型試管中，在121℃進行20分鐘的高壓蒸汽滅菌。在無菌條件下，利用接種環(huán)向此培養(yǎng)基中接種表3所示的微生物，在28℃培養(yǎng)2天，得到前培養(yǎng)液。接著，向在500ml容量坂口燒瓶中100ml滅菌處理后的EG-NB培養(yǎng)基中，接種1ml得到的前培養(yǎng)液，在28℃培養(yǎng)3天。將100ml得到的培養(yǎng)液通過離心分離收集細胞，用100mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)洗凈后，懸浮于5ml相同的緩沖液(pH8.0)中。將細胞細胞懸浮液用微型擺動沖擊式破碎機(BIOSPEC社制)破碎后，通過離心分離得到上清液(無細胞提取液)。在得到的無細胞提取液0.8ml中，添加0.1ml的500mM乙二醛水溶液、0.1ml50,000U/ml的過氧化氫酶溶液，在試管中，于28℃振蕩4小時進行反應，得到的反應液通過高效液相色譜法進行分析。乙醛酸的生成量歸納于表3中。表3(實施例2)向0.1ml的實施例1制備的表3所述的微生物無細胞提取液中，在試管中添加含有4-AA1.34mM、TOOS2.19mM、POD6U/ml的0.1M磷酸緩沖液(pH7)0.05ml。再添加100mM乙二醛水溶液或水0.05ml，在28℃振蕩2分鐘，觀察反應液顏色的變化。其結果示于表4。在使用了任意上述微生物的所有反應中，雖然添加了乙二醛水溶液的試驗的反應液顏色為深紫色，但代替乙二醛水溶液而添加水時，反應液不變色?？芍谝叶┭趸磻獣r生成了過氧化氫，由此可以判明催化乙二醛的氧化反應的酶為氧化酶。表4(實施例3)將用與實施例1同樣的方法制備的假單胞菌種KNK254、微桿菌種KNK011、渾濁纖維單胞菌IFO15015以及纖維單胞菌種JCM2471的培養(yǎng)液100ml通過離心分離收集細胞，用0.1mM磷酸緩沖液(pH7)洗凈后，懸浮于5ml的相同的緩沖液中。于試管中，在0.45ml細胞細胞懸浮液中添加500mM乙二醛水溶液0.05ml，振蕩4小時進行反應。將反應后的上清通過HPLC進行分析，算出生成的乙醛酸。其結果為，在假單胞菌種KNK254中生成20mM的乙醛酸、在微桿菌種KNK011中生成14mM的乙醛酸、在渾濁纖維單胞菌IFO15015中生成30mM的乙醛酸、在纖維單胞菌種JCM2471中生成33mM的乙醛酸。(實施例4)按照以下的方法，自鏈霉菌種KNK269，純化具有將乙二醛變換為乙醛酸活性的醛氧化酶。將含有10g乙二醇、3g酵母提取物、8g的NutrientBroth、3g磷酸二氫鉀、7g磷酸氫二鉀(均為每1L中)的組成的液體培養(yǎng)基(pH7)50ml加入到500ml容量坂口燒瓶中，高壓蒸汽滅菌后，利用接種環(huán)接種鏈霉菌種KNK269，在28℃振蕩培養(yǎng)3天，得到前培養(yǎng)液。接著，在10升微型瓶中加入上述組成培養(yǎng)基6L，高壓蒸汽滅菌后，接種50ml前培養(yǎng)液，在28℃、通氣0.5vvm、攪拌300rpm進行2天的培養(yǎng)。重復所述微型瓶培養(yǎng)，取得95L的培養(yǎng)液，接著，將95L得到的培養(yǎng)液通過離心分離收集細胞，并懸浮于0.05M磷酸緩沖液(pH7)3L中。將得到的細胞懸浮液用ダイノミル(Dyno-Mill社制)破碎后，通過離心分離除去細胞殘渣，得到無細胞提取液2.5L。一邊在冰上冷卻的條件下用攪拌器攪拌，一邊向2.5L得到的無細胞提取液中添加規(guī)定量的硫酸銨，在硫酸銨30-55％飽和時通過離心分離收集沉淀的蛋白質。將得到的蛋白質溶解于0.05M磷酸緩沖液(pH7)中，通過相同的緩沖液進行透析后，加載到用此相同緩沖液預先平衡化的DEAE-トヨパ一ル650M(東ソ-株式會社制)柱(130ml)中，除去流過的級分后，用含有0.5M氯化鈉的0.05M磷酸緩沖液(pH7)洗脫，收集活性級分。在得到的酶液中，添加硫酸銨直至達到0.6M，再加載到用含有0.6M硫酸銨的0.05M磷酸緩沖液預先平衡化的Phenyl-トヨパ一ル650M(東ソ-株式會社制)柱(300ml)中，通過0.6～0.1M的硫酸銨線性濃度梯度洗脫，收集活性級分。將得到的酶液通過0.05M磷酸緩沖液(pH7)進行透析，加載到預先用相同的緩沖液平衡化的DEAE-トヨパ一ル650M柱(130ml)中，用0～0.25M的氯化鈉通過線性濃度梯度進行洗脫，收集活性級分后，添加硫酸銨使之達到60％飽和，通過離心分離，收集沉淀的蛋白質，用0.05M磷酸緩沖液(pH7)溶解，通過相同的緩沖液進行透析。接著，將此透析后的酶液，加載到用0.05M磷酸緩沖液(pH7)預先平衡化的BenzamidineSepharose(AmershamPharmaciaBiotech社制)柱(10ml)中，通過0～0.1M的氯化鈉線性濃度梯度進行洗脫，收集活性級分。將本酶液通過超濾法進行濃縮，加載到用含有0.15M氯化鈉的0.05M磷酸緩沖液(pH7)預先平衡化的Superdex200HR16/60(AmershamPharmaciaBiotech社制)柱(120ml)中，用相同的緩沖液進行洗脫。在分子量相當于17萬的級分中，得到了與280nm的蛋白質吸收活性一致的洗脫峰。將本活性級分提供給未變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，形成了單一帶。另外，將本酶提供給SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時，形成了分子量相當于約2.5萬、3.5萬、8萬的3個蛋白質帶。由此可知，本酶具有分子量約2.5萬、3.5萬、8萬的亞單元結構。(實施例5)按照以下的方法，通過微桿菌種KNK011，進行具有將乙二醛變換為乙醛酸活性的醛氧化酶的純化。將50ml含有5g酵母提取物、2g硝酸銨、2g磷酸氫二鉀、1g磷酸二氫鈉二水合物、0.2g硫酸鎂七水合物、0.1g氯化鈣二水合物(均為每1L中)的組成的培養(yǎng)基(pH7)加入到500ml中，高壓蒸汽滅菌后，接種一接種環(huán)微桿菌種KNK011，在28℃振蕩培養(yǎng)3天，得到前培養(yǎng)液。接著，在5升微型瓶中，加入3L上述組成的培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌后，接種30ml前培養(yǎng)液，在28℃、通氣0.5vvm、攪拌400rrm下進行28小時培養(yǎng)。重復所述微型瓶培養(yǎng)，取得69L的培養(yǎng)液，接著，將69L得到的培養(yǎng)液通過離心分離收集細胞，然后懸浮于0.05M磷酸緩沖液(pH7)中。將得到的細胞懸浮液用ダイノミル(Dyno-Mill社制)破碎后，通過離心分離除去細胞殘渣，得到無細胞提取液2L。一邊在冰上冷卻的條件下用攪拌器攪拌，一邊向2L得到的無細胞提取液中添加規(guī)定量的硫酸銨，在硫酸銨20-40％飽和時通過離心分離收集沉淀的蛋白質。將得到的蛋白質溶解于0.05M磷酸緩沖液(pH7)中，通過相同的緩沖液進行透析后，加載到用此相同的緩沖液預先平衡化的DEAE-トヨパ一ル650M柱(300ml)中，通過0～0.6M的氯化鈉線性濃度梯度洗脫，收集活性級分。在此活性級分中添加規(guī)定量的硫酸銨，使硫酸銨濃度達到0.7M，再加載到用含有0.7M硫酸銨的0.05M磷酸緩沖液(pH7)預先平衡化的Phenyl-トヨパ一ル650M柱(160ml)中后，通過0.7～0M的硫酸銨線性濃度梯度進行洗脫，收集活性級分。將得到的酶液通過0.05M磷酸緩沖液(pH7)進行透析。接著，將此透析后的酶液加載到用0.05M磷酸緩沖液預先平衡化的ResouceQ(AmershamPharmaciaBiotech社制)柱(6ml)中，通過0.15～0.45M的氯化鈉線性濃度梯度進行洗脫，收集活性級分。將得到的酶液通過超濾法進行濃縮，添加硫酸銨直至達到0.3M濃度后，加載到用含有0.3M硫酸銨的0.05M磷酸緩沖液(pH7)預先平衡化的ResoucePhe(AmershamPharmaciaBiotech社制)柱(6ml)中，通過0.3～0M的硫酸銨線性濃度梯度進行洗脫，收集活性級分。將得到的酶液提供給SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時，形成分子量相當于約11萬的單一的蛋白質帶。(實施例6)按照以下的方法，通過假單胞菌種KNK058，進行將乙二醛變換為乙醛酸的醛氧化酶的純化。將5ml含有10g乙二醇、8g的NUTRIENTBROTH、7g磷酸氫二鉀、3g磷酸二氫鉀(均為每1L中)的組成的培養(yǎng)基(pH7)在大型試管中高壓蒸汽滅菌后，利用接種環(huán)接種假單胞菌種KNK058，在28℃培養(yǎng)2天后，將本培養(yǎng)液接種到含有500ml滅菌過的上述培養(yǎng)基的2L振蕩燒瓶中，在28℃、振蕩培養(yǎng)18小時，得到前培養(yǎng)液。接著，接種于含有60L滅菌過的上述培養(yǎng)基的罐發(fā)酵器中，在28℃、通氣1vvm、攪拌200rpm下進行40小時培養(yǎng)。將60L得到的培養(yǎng)液通過離心分離收集細胞，懸浮于0.02M磷酸緩沖液(pH7)中。將得到的細胞懸浮液通過Inconator201M超音波破碎裝置(株式會社久保田制作所制)破碎60分鐘后，通過離心分離除去細胞殘渣，得到無細胞提取液。一邊在冷卻下用攪拌器攪拌，一邊向得到的無細胞提取液添加規(guī)定量的硫酸銨，在硫酸銨20-60％飽和時，通過離心分離收集沉淀的蛋白質。將得到的蛋白質溶解于0.02M磷酸緩沖液(pH7)中，通過相同的緩沖液進行透析后，在該酶液中添加1.5L的DEAE-Sephacel樹脂，在4℃攪拌1小時后，將未吸附的蛋白質液通過濾過除去后，用1M氯化鈉洗脫吸附在樹脂上的酶蛋白質。將得到的酶液用0.02M磷酸緩沖液(pH7)透析后，加載到用0.02M磷酸緩沖液(pH7)平衡化的Hiprep16/10-Q-XL(AmershamPharmaciaBioscience社制)柱(16ml)中，通過0～1M的氯化鈉的線性濃度梯度法進行洗脫，收集活性級分。在此活性級分中加入規(guī)定量的硫酸銨，使硫酸銨濃度達到1.2M，然后加載到預先用含有1.2M的硫酸銨的0.02M磷酸緩沖液(pH7)平衡化的PhenylSuperoseHR10/10(AmershamPharmaciaBioscience社制)柱(10ml)中，通過1.2～0M的硫酸銨的線性濃度梯度法進行洗脫，收集活性級分。接著，將得到的酶液用0.02M磷酸緩沖液透析后，加載到用相同的緩沖液平衡化的MonoQHR10/10(AmershamPharmaciaBioscience社制)柱(10ml)中，通過氯化鈉的線性濃度梯度法進行洗脫，收集活性級分。將得到的酶液再加載到用含有0.02M的氯化鈉的0.02M磷酸緩沖液平衡化的HiprepSephacrylS-20016/60(AmershamPharmaciaBioscience社制)柱(60ml)中，用相同的緩沖液進行洗脫，收集活性級分，將其用0.005M磷酸緩沖液(pH7)透析，加載到用相同的緩沖液預先平衡化的羥磷灰石(生物化學工業(yè)株式會社制)柱(10ml)中，通過0.005～0.5M磷酸緩沖液的線性濃度梯度法進行洗脫，收集活性級分，將其用0.005mM磷酸緩沖液透析，加載到用相同的緩沖液平衡化的Bio-ScaleCHT5-I(Bio-Rad社制)柱(6.4ml)中，通過0.005～0.5M磷酸緩沖液的線性濃度梯度法進行洗脫，收集活性級分。當將本活性級分提供給未變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，形成了單一帶。(實施例7)按照以下的方法，從CellulosimicrobiumcellulansIFO15516的培養(yǎng)上清液，進行將乙二醛變換為乙醛酸的醛氧化酶的純化。將60ml的含有10g酵母提取物、2g硫酸銨、1g磷酸氫二鉀、1g磷酸二氫鈉、0.2g硫酸鎂7水合物、0.1g氯化鈣2水合物(均為每1L中)的組成的培養(yǎng)基(pH7)加入到500ml容量坂口燒瓶中高壓蒸汽滅菌后，接種一接種環(huán)CellulosimicrobiumcellulansNBRC15516，在28℃振蕩培養(yǎng)2天，得到前培養(yǎng)液。接著，在5L微型瓶中加入3L上述組成的培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌后，接種60ml的前培養(yǎng)液，在28℃、通氣0.5vvm、攪拌400rpm下進行27小時培養(yǎng)。反復同樣的培養(yǎng)，將得到的合計45L的培養(yǎng)液調(diào)整pH至pH7，通過離心分離得到45L的培養(yǎng)上清液。將得到的培養(yǎng)上清液用攪拌型ウルトラホルダ一-UHP150(アドバンテツク東洋株式會社制)濃縮至2.4L后，在冰冷卻下，一邊攪拌一邊添加規(guī)定量的硫酸銨，在硫酸銨0～60％飽和的范圍，通過離心分離，收集沉淀的蛋白質。將得到的蛋白質溶解于20mM磷酸鉀緩沖液(pH7)中，用充分量的相同的緩沖液進行透析后，加載到用相同的緩沖液預先平衡化的DEAE-トヨパ一ル650M柱(300ml)中，在氯化鈉0～0.5M的濃度梯度進行洗脫，收集活性級分。在此活性級分中添加硫酸銨使終濃度達到1M，再加載到預先用含有1M硫酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液pH7平衡化的Phenyl-トヨパ一ル650M(60ml)中，用硫酸銨1～0.5M的線性濃度梯度進行洗脫，收集活性級分。將得到的酶液在20mM磷酸鉀緩沖液pH7中透析，接著，加載到預先用相同的緩沖液平衡化的ResourceQ(AmershamPharmaciaBiotech社制)柱(6ml)中，用含有氯化鈉0.35M的相同的緩沖液洗凈后，用氯化鈉0.35～0.5M的線性濃度梯度進行洗脫，收集活性級分。將得到的酶液用超濾法濃縮，加載到用含有0.15M氯化鈉的20mM磷酸鉀緩沖液pH7平衡化的Superdex200HR柱(24ml)(AmershamPharmaciaBiotech社制)中，用相同的緩沖液進行洗脫。使用得到的活性級分，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果，形成分子量9～10萬的單一帶。(實施例8)將按照實施例1所述的方法得到的KNK235、KNK058的無細胞提取液加載到用0.05M磷酸緩沖液(pH7)預先平衡化的ResouceQ柱(6ml)中，通過0～0.5M的氯化鈉線性濃度梯度進行洗脫，收集活性級分。使用這些KNK235以及KNK058的粗純化酶液與從實施例4、5以及7得到的鏈霉菌種KNK269、微桿菌種KNK011以及CellulosimicrobiumcellulansIFO15516得到的純化酶，測定了它們的相對于乙二醛、乙醛酸的氧化酶活性。酶活性測定是通過在100mM磷酸緩沖液(pH7)中，使含有乙二醛或乙醛酸10mM、4-AA0.67mM、TOOS1.09mM、POD2U/ml、及KNK235以及KNK058的粗純化酶或從實施例4、5以及7中取得的KNK269、KNK011以及IFO15516的純化酶的1.0ml的反應液在30℃反應，測定在波長555nm處吸光度的增加來進行。各種酶的對于乙二醛和乙醛酸的活性的比較示于表5中。表5各種酶對乙醛酸的活性，與乙二醛相比，均只顯示低活性。(實施例9)對由實施例4中得到的鏈霉菌種KNK269得到的酶的物理化學性質進行了研究。酶活性的測定，基本上是按照實施例8所述的方法進行的。(最適宜pH)在pH5～9的范圍，使用乙二醛作為基質進行了活性測定。其結果示于圖2中。最適宜pH為6～9。(熱穩(wěn)定性)0.05M磷酸緩沖液(pH7.2)中、在30～70℃的各溫度下進行20分鐘處理后，將乙二醛作為基質進行本酶的殘存活性測定。其結果示于圖3中。在70℃處理時，殘存了90％或90％以上的活性。(實施例10)對由實施例6得到的假單胞菌種KNK058得到的酶的物理化學性質進行了研究。酶活性的測定，基本上是按照實施例8所述的方法進行的。(分子量)本酶的分子量，在使用TSK-G3000SW柱(東ソ-株式會社制)進行測定時，為約15萬。(最適宜溫度)使用乙二醛作為基質，在溫度25～75℃的范圍進行了活性測定。其結果示于圖4中。在60～70℃的范圍顯示了高活性。(最適宜pH)作為緩沖液，使用McIlvine緩沖液、磷酸緩沖液或Tricine緩沖液，在pH4～9的范圍使用乙二醛作為基質，進行了活性測定。其結果示于圖5。在pH5～7的范圍顯示了高活性。(實施例11)使用實施例4、5、6以及7得到的來自鏈霉菌種KNK269的酶、來自微桿菌種KNK011的酶、來自假單胞菌種KNK058的酶、以及來自CellulosimicrobiumcellulansIFO15516的酶，將乙二醛作為基質進行反應。將含有來自各菌的酶0.2U/ml、乙二醛50mM、過氧化氫酶5000U/ml的100mMtris-HCl緩沖液1ml加入到試管中，在30℃，進行3小時的振蕩反應。反應后，用高效液相色譜法進行分析時，來自KNK269的酶生成7.6mM的乙醛酸、來自KNK011的酶生成25mM的乙醛酸、來自KNK058的酶生成5.7mM的乙醛酸、來自IFO15516的酶生成26mM的乙醛酸。(實施例12)按照以下的方法，測定了渾濁纖維單胞菌IFO15012、渾濁纖維單胞菌IFO15014、CellulosimicrobiumcellulansIFO15013、CellulosimicrobiumcellulansIFO15516、CellulosimicrobiumcellulansJCM6201、微桿菌種KNK011的培養(yǎng)細胞的醛氧化酶活性。將5ml的含有2g硝酸銨、1g磷酸氫二鉀、1.3g磷酸二氫鈉、5g酵母提取物、0.2g硫酸鎂7水合物、0.1g氯化鈣(均為每1L中)pH7的組成的培養(yǎng)基注入到大型試管中，高壓蒸汽滅菌。用接種環(huán)接種上述的菌，在28℃進行2天的前培養(yǎng)。接著，在500ml容量坂口燒瓶中的60ml的相同的培養(yǎng)基中，接種1ml的得到的前培養(yǎng)液，在28℃培養(yǎng)2天。將得到的培養(yǎng)液通過離心分離收集細胞，用100mM磷酸鉀緩沖液pH7洗凈2次后，懸浮于5.0ml的相同的緩沖液中。在1.0ml所述細胞懸浮液中，添加133mM乙二醛水溶液0.45ml、50,000U/ml的過氧化氫酶溶液0.05ml，在試管中，于28℃進行4小時的振蕩反應，將得到的反應液通過高效液相色譜法進行分析。其結果，任意的菌都由乙二醛生成了乙醛酸。另外，將0.1ml的細胞懸浮液添加到含有50mM乙二醛、1.34mM4-AA，2.18mMTOOS、4U/ml過氧化物酶的100mM磷酸鉀緩沖液0.1ml中，在28℃振蕩2小時，通過目視反應液呈色的方法進行氧化酶活性的判定。作為對照，同時進行了不添加乙二醛的同一反應系。其結果，在任意的菌株中，只是在添加乙二醛時，觀察到了由氧化酶活性產(chǎn)生的呈色，明確了乙二醛通過氧化酶被氧化。其結果歸納于表6中。表6(實施例13)使用實施例12中制備的微桿菌種KNK011、CellulosimicrobiumcellulansIFO15516的培養(yǎng)液上清，確認了醛氧化酶向細胞外的分泌。離心培養(yǎng)液，將除去了細胞的培養(yǎng)上清液通過使用了アミコンCentriplusYM-10(MILLIPORE社制)的超濾法濃縮，將緩沖液交換為100mM磷酸鉀緩沖液pH7，配制了12倍濃縮液。使用0.1ml這樣得到的培養(yǎng)上清液濃縮液，與實施例12同樣地，將乙二醛作為基質通過染色評估氧化酶活性。其結果，如表7所示，培養(yǎng)上清液顯示了與細胞懸浮液同等的酶活性。表7(實施例14)在實施例4中純化的鏈霉菌種KNK269的醛氧化酶的氨基酸序列用以下的方法確定。為了分離構成酶的3種類的亞單元，使用了逆相HPLC。柱使用YMC-PackPROTEIN-RP柱(250×4.6mm)(YMC社制)，在移動相使用0.1％三氟乙酸，加載300μg純化酶后，用乙腈0～56％(流速1ml/分、110分)的線性濃度梯度洗脫的方法分離亞單元。在保持時間約85分鐘時，分子量2.5萬(以下亞單元γ)、約90分鐘時，分子量3.5萬(以下亞單元β)、約92分鐘時，分子量8萬(以下亞單元α)被洗脫。使用制備的各亞單元蛋白質的1/10，用使用了ProteinSequencingSystem490Procise(AppliedBiosystems社制)的エドマン分解法確定了N末端氨基酸序列。接著，確確定了各亞單元蛋白質的內(nèi)部氨基酸序列。將各亞單元蛋白質的殘余全量用9M尿素變性的后，將緩沖液交換為0.3Mtris鹽酸緩沖液pH9.0，用賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶在30℃消化19小時。將分解物使用YMC-PackPROTEIN-RP柱通過逆相HPLC法進行了純化。移動相使用0.1％三氟乙酸，用乙腈10～48％的線性濃度梯度洗脫肽。分配洗脫的各峰，用同樣的方法確定了亞單元內(nèi)部的氨基酸序列。得到的氨基酸序列中，主要的物質示于序列號15～20中。(實施例15)以確定的部分氨基酸序列為基礎合成混合DNA引物(序列號21～26)，將鏈霉菌種KNK269的基因組DNA作為模板，使用TAKARALATaqDNA聚合酶(寶酒造株式會社制)，在GC緩沖液(寶酒造株式會社制)中進行了PCR。將得到的經(jīng)擴增的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAquickGelExtraction試劑盒(QIAGEN社制)，提取形成了帶的DNA。使用得到的DNA，直接序列測定、或在TA克隆入pT7Blue-2(Novagen社制)中之后，使用質粒進行DNA序列測定，確定核苷酸序列。用序列號21～26所示的引物(1)和(2)、(3)和(4)以及(5)和(6)的組合進行PCR，將得到的經(jīng)擴增的DNA的序列變換為氨基酸，相對于實施例14中確定的氨基酸序列進行檢測、比對。結果發(fā)現(xiàn)，編碼3種類亞單元的基因從上游以γ、α、β的順序鄰接在基因組上，或一部分重復存在。用同樣的方法，使用周邊的核苷酸序列作為引物，確定確定混合引物部分的核苷酸序列確定。這樣，編碼亞單元γ、α、β的全基因的基因組領域中，確定確定了除亞單元γ的N末端附近和亞單元α的C末端附近序列以外的全部核苷酸序列。獲自得到的核苷酸序列的氨基酸序列與實施例14中得到的各亞單元的部分氨基酸序列完全一致。確定確定的亞單元γ、α、β的氨基酸序列示于序列號1～3中、核苷酸序列示于序列號4～6中。序列號1以及4，分別表示亞單元γ的純化蛋白質的N末端以后的氨基酸序列、以及從Glu12到終止密碼的核苷酸序列。序列號2以及5，分別表示亞單元β的全部氨基酸序列、以及從起始密碼到終止密碼的全部核苷酸序列。序列號3以及6，分別表示從亞單元α的Met1到Thr693的氨基酸序列、以及從起始密碼到Arg685的核苷酸序列。根據(jù)基因排列，確定在序列號18中示出的純化了的來自KNK269的酶的亞單元α的N末端氨基酸序列，其是從由基因序列確定的序列號3的氨基酸序列的Ala5開始。(實施例16)確定了實施例5中純化的微桿菌種KNK011醛氧化酶的氨基酸序列。用超濾膜，使用10μg脫鹽的純化酶，用在實施例14中使用的同樣的方法確定了N末端氨基酸序列。接著，為了確定蛋白質內(nèi)部的氨基酸序列，進行了純化酶的蛋白水解酶消化肽的氨基酸序列確定。將純化酶100μg用9M尿素進行變性的后，將緩沖液交換為0.2Mtris鹽酸緩沖液pH9.0，用賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶在30℃消化16小時。將這樣得到的消化肽混合物，使用YMC-PackPROTEIN-RP柱(250×4.6mm)通過逆相HPLC用與實施例14同樣的方法進行分離。分配洗脫的各峰，用同樣的方法確定氨基酸序列，確定了酶蛋白質的內(nèi)部部分氨基酸序列。得到的氨基酸的主要的物質示于序列號27～29中。(實施例17)以確定的部分氨基酸序列為基礎合成混合DNA引物(序列號30～33)，將微桿菌種KNK011的基因組DNA作為模板，用與實施例15同樣的方法進行PCR。將擴增DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAquickGelExtraction試劑盒(QIAGEN社制)，提取形成了帶的DNA，直接、或在TA克隆入PT7Blue-2中之后，進行DNA序列測定，確定了核苷酸序列。由序列號30～33的引物(1)和(2)、(3)和(4)的組合的PCR得到的核苷酸序列與氨基酸序列對照，按照與實施例15同樣的方法，確定了除純化酶的N末端與C末端周邊外約2.8kb的核苷酸序列。純化的酶的N末端和C末端周邊的核苷酸序列的確定，是通過逆向PCR法進行(參照CellScience1990、Vol.6No.5370-376)。將基因組DNA用各種的限制酶處理后，在終濃度2.5ng/ml進行自身連接，使用由各末端附近的核苷酸序列合成的引物進行PCR。將得到的經(jīng)擴增的DNA在pT7Blue-2中進行連接反應后，同樣地確定了核苷酸序列。由使用基因組DNAPvuI消化物的逆向PCR擴增得到的約650堿基帶，確定了從起始密碼上游到純化酶的N末端下游的序列，由在使用了ApaI消化物的逆向PCR中擴增得到的約1.9k堿基帶，確定了終止密碼周邊的核苷酸序列。這樣確定的起始密碼到終止密碼的基因全長為3348堿基，作為氨基酸序列為1115殘基。由此自核苷酸序列所得的氨基酸與用純化酶的氨基酸序列分析得到的氨基酸序列完全一致。另一方面，由細胞純化的酶的N末端，從起始密碼Met1數(shù)起，第47個為Val。微桿菌種KNK011由于培養(yǎng)液上清也產(chǎn)生相同的酶，所以明確了從Met1到Ala46之間的部分作為分泌信號序列在分泌過程中切斷。確定的酶蛋白質、酶基因的全部氨基酸序列、全部核苷酸序列示于序列號7、9中。分泌后的成熟型酶的全部氨基酸序列和編碼它的核苷酸序列示于序列號8、10中。(實施例18)將實施例17中確定了其基因序列的微桿菌種KNK011的醛氧化酶基因在表達用載體上進行克隆，進行了表達實驗。將Ala46的密碼置換為起始密碼Atg，使用添加了限制酶NdeI識別序列的合成引物(序列號34)和在終止密碼下游63～68堿基添加了限制酶EcoRI識別序列的互補序列的合成引物(序列號35)，將微桿菌種KNK011的基因組DNA作為模板進行PCR，得到約3.7kb的經(jīng)擴增的帶。將形成了此帶的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAquickGelExtraction試劑盒(QIAGEN社制)進行提取，用NdeI以及EcoRI進行消化。將消化DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，同樣地進行提取，在NdeI以及EcoRI消化的表達載體pUCNT(特開2003-116552)上進行連接反應，然后用所得產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α。將得到的轉化物用含有100μg氨芐西林(アンピシリン)的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，轉移入新鮮的相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，2小時后，添加1mM的IPTG，培養(yǎng)5小時后，對培養(yǎng)細胞進行SDS處理，進行全蛋白質的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果，在約11kDa的位置確認了酶蛋白質的帶。(實施例19)確定實施例7中得到的CellulosimicrobiumcellulansIFO15516的醛氧化酶的氨基酸序列。用超濾膜，使用10μg脫鹽的純化酶，用蛋白質序列測定系統(tǒng)モデル490プロサイズ(AppliedBiosystems社制)確定了氨基酸序列。接著，將100μg純化酶用9M尿素變性的后，將緩沖液換為0.2Mtris鹽酸緩沖液pH9.0，用賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶在30℃消化16小時。將分解物用YMC-PackPROTEIN-RP柱(YMC社制)通過逆相HPLC法進行了純化。移動相使用0.1％三氟乙酸，用乙腈10～55％的線性濃度梯度洗脫肽。分取洗脫的各峰，同樣地確定了蛋白質內(nèi)部的氨基酸序列。得到的氨基酸序列的主要物質示于序列號36～38中。(實施例20)使用以實施例19中確定的部分氨基酸序列為基礎合成的混合DNA引物(序列號39～41)、以及微桿菌種KNK011的醛氧化酶基因的2521～2545堿基組成的互補鏈DNA的混合DNA引物(序列號42)，將CellulosimicrobiumcellulansIFO15516的基因組DNA作為模板進行了PCR。將用序列號39～42的引物(1)和(2)、(3)和(4)的組合的PCR得到的擴增DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAquickGelExtraction試劑盒(QIAGEN社制)提取形成了帶的DNA。將這些DNA直接、或在TA克隆入pT7Blue-2后，進行DNA序列測定，確定了核苷酸序列。將得到的核苷酸序列與氨基酸序列對照，按照與實施例15同樣的方法，確定了除純化酶的N末端和C末端周邊序列外的約2.5kb的核苷酸序列。經(jīng)純化的酶N末端和C末端周邊的核苷酸序列的確定，是按照與實施例17同樣的逆向PCR法進行。將基因組DNA用各種限制酶處理之后，在終濃度2.5ng/ml下進行自身連接，使用由上述末端附近的核苷酸序列合成的引物進行了PCR。將得到的經(jīng)擴增的DNA連入pT7Blue-2后，同樣地確定了核苷酸序列。由使用了基因組DNA的NaeI消化物的逆向PCR得到的約1kb的經(jīng)擴增的帶，確定了從起始密碼上游到經(jīng)純化的酶的N末端下游的序列；由使用了NcoI消化物的逆向PCR得到的約1.1kb的經(jīng)擴增的帶，確定了終止密碼周邊的核苷酸序列。從這樣確定的起始密碼到終止密碼的基因全長為3324堿基，作為氨基酸序列為1107殘基。由此從上述核苷酸序列獲得的氨基酸，與用經(jīng)純化的酶的氨基酸序列分析得到的氨基酸序列完全一致。由細胞從細胞純化的酶的N末端，從起始密碼Met1數(shù)起，第39個為Asp。對于分泌到培養(yǎng)基中的酶，從Met1到Ala38作為分泌信號序列，在分泌過程中被切斷。確定了的酶蛋白質、酶基因的全部氨基酸序列、全部核苷酸序列示于序列號11、13中。分泌后的成熟型酶的全部氨基酸序列和編碼它的核苷酸序列分別示于序列號12、14中。產(chǎn)業(yè)利用性按照使用本發(fā)明的微生物、酶來由乙二醛制備乙醛酸的方法，可以在溫和的條件下制備乙醛酸，并且可以在不產(chǎn)生以前由硝酸氧化法等化學合成方法所帶來的問題如生成大量鹽類等的情況下制備乙醛酸。序列表說明序列號1醛氧化酶的亞單元γ的氨基酸序列序列號2醛氧化酶的亞單元β的氨基酸序列序列號3醛氧化酶的亞單元α的氨基酸序列序列號4醛氧化酶的亞單元γ的DNA序列序列號5醛氧化酶的亞單元β的DNA序列序列號6醛氧化酶的亞單元α的DNA序列序列號7含有信號肽的醛氧化酶的氨基酸序列序列號8醛氧化酶的氨基酸序列序列號9含有信號肽的醛氧化酶的DNA序列序列號10醛氧化酶的DNA序列序列號11含有信號肽的醛氧化酶的氨基酸序列序列號12醛氧化酶的氨基酸序列序列號13含有信號肽的醛氧化酶的DNA序列序列號14醛氧化酶的DNA序列序列號15醛氧化酶的亞單元γ的N末端氨基酸序列序列號16醛氧化酶的亞單元β的N末端氨基酸序列序列號17醛氧化酶的亞單元β的氨基酸序列(Ala231～Ala266)序列號18醛氧化酶的亞單元α的N末端氨基酸序列序列號19醛氧化酶的亞單元α的氨基酸序列(Leu261～Glu298)序列號20醛氧化酶的亞單元α的氨基酸序列(Gly659～Thr693)序列號21與鏈霉菌種KNK269的醛氧化酶的亞單元γ的N末端氨基酸序列相對應的混合DNA引物(1)序列號22與鏈霉菌種KNK269的醛氧化酶的亞單元β的氨基酸序列(Asp251～Ala258)相對應的互補的混合DNA引物(2)序列號23與鏈霉菌種KNK269的醛氧化酶的亞單元β的氨基酸序列(Asp251～Ala258)相對應的混合DNA引物(3)序列號24與鏈霉菌種KNK269的醛氧化酶的亞單元α的氨基酸序列(Leu274～Glu281)相對應的互補的混合DNA引物(4)序列號25與鏈霉菌種KNK269的醛氧化酶的亞單元α的氨基酸序列(Leu274～Glu281)相對應的混合DNA引物(5)序列號26與鏈霉菌種KNK269的醛氧化酶的亞單元α的氨基酸序列(Leu686～Glu693)相對應的互補的混合DNA引物(6)序列號27醛氧化酶的N末端氨基酸序列序列號28醛氧化酶的內(nèi)部氨基酸序列序列號29醛氧化酶的內(nèi)部氨基酸序列序列號30與微桿菌種KNK011來自微桿菌種KNK011的醛氧化酶的N末端氨基酸序列相對應的混合DNA引物(1)序列號31與微桿菌種KNK011來自微桿菌種KNK011的醛氧化酶的氨基酸序列(Asp513～Phe521)相對應的互補的混合DNA引物(2)序列號32與微桿菌種KNK011來自微桿菌種KNK011的醛氧化酶的氨基酸序列(Asp513～Phe521)相對應的混合DNA引物(3)序列號33與微桿菌種KNK011來自微桿菌種KNK011的醛氧化酶的氨基酸序列(Phe959～Thr969)相對應的互補的混合DNA引物(4)序列號34含有微桿菌種KNK011來自微桿菌種KNK011的醛氧化酶的、為了克隆NdeI限制部位的DNA引物序列號35含有微桿菌種KNK011來自微桿菌種KNK011的醛氧化酶的、為了克隆EcoRI限制部位的DNA引物序列號36醛氧化酶的N末端氨基酸序列序列號37醛氧化酶的內(nèi)部氨基酸序列序列號38醛氧化酶的內(nèi)部氨基酸序列序列號39與來自CellulosimicrobiumcellulansIFO15516的醛氧化酶的N末端氨基酸序列相對應的混合DNA引物(1)序列號40與來自CellulosimicrobiumcellulansIFO15516的醛氧化酶的氨基酸序列(Ile350～Val358)相對應的互補的混合DNA引物(2)序列號41與來自CellulosimicrobiumcellulansIFO15516的醛氧化酶的氨基酸序列(Thr176～Thr183)相對應的混合DNA引物(3)序列號42與來自微桿菌種KNK011的醛氧化酶的DNA序列(2521～2545)相對應的互補的混合DNA引物(4)序列表<110>株式會社鐘化(KanekaCorporation)<120>乙醛酸的生物化學制造方法<130>FP-8610PCT<150>JP2003-36303<151>2003-02-14<150>JP2003-336234<151>2003-09-26<160>42<210>1<211>189<212>PRT<213>鏈霉菌屬KNK269(Streptomycessp.KNK269)<223>醛氧化酶γ亞單元的氨基酸序列<400>1GlyAlaAspLeuGluProGluProValValAspGluHisSerThrVal151015ThrLeuAsnValAsnGlyAspProThrThrLeuThrValAspHisArg202530ThrThrValLeuGluThrLeuArgGluSerPheGlyLeuThrGlyAla354045LysLysGlyCysAspHisGlyGlnCysGlyAlaCysThrValLeuVal505560AspGlyArgArgValAsnSerCysLeuLeuLeuAlaValAlaGlnAsp65707580GlyAlaThrIleThrThrValGluGlyLeuAlaAspGlyGluAspLeu859095HisProValGlnArgAlaPheValGluArgAspAlaLeuGlnCysGly100105110PheCysThrProGlyGlnIleCysSerAlaValGlyMetLeuArgGlu115120125AlaAlaAspGlyHisProSerHisValThrGlyProAspThrAlaAla130135140GlyProAspAlaAlaThrGlyProGlyGlyProValAlaLeuAspAla145150155160AspGluIleArgGluArgMetSerGlyAsnIlePheArgCysGlyAla165170175TyrHisArgIleValGluAlaIleGluAspValIleGlu180185<210>2<211>333<212>PRT<213>鏈霉菌屬KNK269(Streptomycessp.KNK269)<223>醛氧化酶β亞單元的氨基酸序列<400>2MetLysProPheGlyTyrValArgProAlaSerProAspGluAlaVal151015ArgLeuCysAlaGluGlySerGlyAlaArgPheLeuGlyGlyGlyThr202530AsnLeuValAspLeuMetLysLeuGlyValGluAlaProArgValLeu354045IleAspValAlaGlyLeuProLeuAspArgValThrArgThrAlaAsp505560GlyGlyLeuAlaIleGlyAlaThrValArgAsnSerAspLeuAlaAla65707580HisProAspValThrAspArgTyrProValLeuSerGlnAlaLeuLeu859095AlaGlyAlaSerGlyGlnLeuArgAsnSerAlaThrThrGlyGlyAsn100105110LeuLeuGlnArgThrArgCysArgTyrPheGlnAspValSerLysPro115120125CysAsnLysArgLeuProGlySerGlyCysProAlaArgAspGlyThr130135140HisArgAspLeuAlaIleLeuGlyHisSerProGluCysValAlaThr145150155160AsnProSerAspMetAlaValAlaLeuAlaAlaLeuAspAlaThrVal165170175ValLeuLeuGlyProGluGlyGluArgAlaValProLeuThrGluPhe180185190HisArgLeuProGlyGluAsnProAspGlnAspThrAlaIleArgThr195200205GlyGluLeuIleThrGluValValLeuProProProAlaProGlyAla210215220AlaThrArgTyrArgLysAlaArgAspArgAlaSerPheAlaPheAla225230235240LeuValSerValAlaAlaThrLeuArgValAspAlaGlyArgValGlu245250255HisAlaThrLeuAlaPheGlyGlyValAlaHisArgProTrpArgAla260265270ArgArgAlaGluAlaGluLeuArgGlyAlaProAlaThrProAlaVal275280285PheGlnHisAlaLeuIleAlaGluLeuAlaGluAlaArgProLeuArg290295300AspAsnValPheLysValAspLeuAlaArgArgLeuAlaLeuAspVal305310315320LeuGlyGluLeuThrGluArgGlnProThrArgThrGly325330<210>3<211>693<212>PRT<213>鏈霉菌屬KNK269(Streptomycessp.KNK269)<223>醛氧化酶α亞單元的氨基酸序列<400>3MetThrThrArgAlaProGlnPheProGlyAlaProValValArgArg151015GluAlaArgAspLysValThrGlyThrAlaArgTyrAlaAlaAspArg202530ThrProAlaGlyCysLeuTyrAlaTrpThrValProAlaAlaValAla354045AlaGlyArgValThrAlaValArgAlaValAspAlaLeuAlaValPro505560GlyValHisThrValLeuThrHisAspAsnAlaProGluLeuArgGlu65707580ProAspAspProIleLeuAlaValLeuGlnAspAspArgValProHis859095HisGlyTrpProIleAlaLeuValIleAlaGluSerProGluAlaAla100105110ArgThrGlyAlaGlyGluLeuHisValGluTyrAlaArgAspGluHis115120125AspValThrLeuThrGluAspHisProGlyLeuTyrThrProGluGlu130135140AlaAsnGlyGlyGluProAlaValArgValArgGlyAspValGluArg145150155160AlaLeuAlaAlaSerProValGlnValAspAlaThrTyrArgMetVal165170175AlaLeuHisAsnHisProMetGluProHisAlaAlaThrAlaValArg180185190AlaAspGlyHisLeuThrValHisAspSerSerGlnGlySerThrLys195200205ValArgGluSerLeuAlaGlnAlaPheGlyLeuAlaAlaAspArgIle210215220ThrValValSerGluHisValGlyGlyGlyPheGlySerLysGlyThr225230235240ThrArgProGlnGlyValLeuAlaAlaMetAlaAlaGlnHisThrGly245250255ArgProValLysLeuValPheProArgAlaGlnLeuAlaGluValVal260265270GlyHisArgAlaProThrIleGlnArgValArgLeuGlyAlaAspLeu275280285AspGlyValLeuThrAlaValSerHisGluValValThrGlnThrSer290295300ThrValLysGluPheValGluGlnAlaAlaValProAlaArgValMet305310315320TyrAlaSerProHisSerArgThrAlaHisArgValThrAlaLeuAsp325330335ValProSerProSerTrpMetArgAlaProGlyGluAlaSerGlyMet340345350TyrAlaLeuGluSerAlaMetAspValLeuAspSerAlaLeuGlyLeu355360365AspProValGluLeuArgLeuArgAsnGluProGluThrGluProAsp370375380SerGlyArgProPheSerSerArgGlyLeuAlaAlaCysLeuArgAsp385390395400GlyAlaAlaArgPheGlyTrpGlnAspArgAspProArgProAlaAla405410415ArgGlnGluGlyArgTrpLeuIleGlyThrGlyValAlaSerAlaThr420425430TyrProValLeuLeuSerArgSerThrAlaSerAlaHisAlaThrArg435440445AspGlyAspLeuSerIleAlaValAsnAlaThrAspIleGlyThrGly450455460AlaArgThrValLeuAlaGlnIleAlaAlaAspValLeuGlyValAla465470475480ProGluAlaLeuArgValAspIleGlySerThrAspLeuProAlaAla485490495ProLeuAlaGlyGlySerSerGlyThrAlaSerTrpGlyTrpSerVal500505510HisLysAlaAlaThrAlaLeuAlaAlaArgLeuAlaGluHisArgGly515520525ProLeuProAlaAspGlyIleThrThrThrAlaAspThrGlyGlnGlu530535540ThrGlyGluGluSerProTyrAlaArgHisAlaPheGlyAlaHisPhe545550555560AlaGluThrAlaValAspAlaValThrGlyGluValArgValArgArg565570575LeuLeuGlyValTyrAlaAlaGlyArgIleLeuAsnGluArgThrAla580585590ArgSerGlnPheThrGlyGlyMetValMetGlyIleGlyMetAlaLeu595600605ThrGluGlyCysGlyIleAspProGlyPheGlyAspPheThrAlaLys610615620AspLeuAlaSerTyrHisValProValCysAlaAspThrAlaAspIle625630635640GlnAlaHisTrpIleGluGluAspAspArgHisLeuAsnProMetGly645650655SerLysGlyIleGlyGluIleGlyIleValGlyThrAlaAlaAlaIle660665670GlyAsnAlaValArgHisAlaThrGlyAlaArgLeuArgGluLeuPro675680685LeuThrThrAspThr690<210>4<211>536<212>DNA<213>鏈霉菌屬KNK269(Streptomycessp.KNK269)<223>醛氧化酶γ亞單元的DNA序列<400>4gaacactccaccgtgaccctgaacgtcaacggcgacccgacgacgctg48accgtcgaccaccgcaccacggtcctggagacgctgcgcgagagcttc96gggctcaccggggccaagaagggctgcgaccacggccagtgcggggcc144tgcacggtcctcgtcgacgggcggcgggtcaacagctgcctgctgctc192gccgtcgcccaggacggcgccacgatcaccaccgtggaagggctcgcc240gacggcgaggacctgcacccggtgcagcgggcgttcgtcgagcgcgac288gccctccagtgcggcttctgcaccccgggccagatctgctcggccgtg336ggcatgctccgcgaggccgcggacggccacccctcgcacgtcaccgga384ccggacaccgccgccggaccggacgccgctaccggaccgggcgggccc432gtcgcactcgacgcggacgagatccgggaacggatgagcggcaacatc480ttccggtgcggggcctatcatcggatcgtagaagcgatcgaggacgtg528atcgagtga536<210>5<211>1002<212>DNA<213>鏈霉菌屬KNK269(Streptomycessp.KNK269)<223>醛氧化酶β亞單元的DNA序列<400>5gtgaaaccgttcggctatgtgcgccccgcctcccccgacgaggctgtc48cggctctgcgcggaaggctccggcgcccgcttcctgggcggcggcacc96aatctggtggacctgatgaagctcggcgtcgaggcgccccgggtcctc144atcgacgtcgcagggcttccgctggaccgggtgacccggacggccgac192ggcggcctcgccatcggcgccaccgtgcgcaacagcgacctcgccgcc240caccccgacgtgacggaccggtaccccgtgctgtcccaggcgctgctg288gccggggcctccggtcagctccgcaactccgccaccaccggcggcaac336ctgctccagcgcacccggtgccgctacttccaggacgtctccaagccc384tgcaacaaacggcttcccggctccggctgccccgcacgcgacggcact432caccgcgacctcgcgatcctcgggcactcgccggagtgcgtggccacc480aacccgtccgacatggccgtggccctcgccgcgctcgacgcgaccgtg528gtgctgctggggcccgagggcgaacgggccgtcccgctcaccgagttc576caccggttgccgggggagaaccccgaccaggacaccgcgatcaggacc624ggcgagctgatcaccgaggtggtgctgccgccgccggcgcccggggcg672gccacccgctaccgcaaggcccgcgaccgcgccagcttcgccttcgcg720ctcgtctccgtcgccgccacgctccgggtcgacgccggccgcgtcgag768cacgccaccctcgcgttcggcggcgtcgcccaccggccgtggcgggcc816cgcagggccgaggccgagctgcgcggcgccccggccacgcccgccgtg864ttccagcacgccctgatcgccgaactggccgaggcgcgaccgctgcgc912gacaacgtcttcaaggtggacctcgcccgccggctcgccctcgacgtg960ctcggcgaactcaccgagcggcaacccacccggaccggctga1002<210>6<211>2055<212>DNA<213>鏈霉菌屬KNK269(Streptomycessp.KNK269)<223>醛氧化酶α亞單元的DNA序列<400>6atgaccacccgagccccgcagttccccggtgcgcccgtcgtccgcaga48gaggcccgggacaaggtcaccggcaccgcccgctacgccgccgaccgc96acgcccgccggctgcctctacgcctggaccgtcccggccgccgtcgcc144gccggacgcgtcaccgccgtacgggccgtcgacgctctcgccgtcccc192ggcgtccacaccgtcctcacccacgacaacgcgcccgaactccgggag240cccgacgacccgatcctcgccgtgctccaggacgaccgggtcccgcac288cacggctggcccatcgccctcgtgatcgcggagtccccggaggccgcc336cggacaggggccggggagctccacgtcgaatacgcacgcgacgagcac384gacgtgaccctcaccgaagaccatccgggtctctacacgcccgaggag432gccaacggcggtgagcccgccgtccgggtgcgcggcgacgtggaacgg480gccctggcggcctcgcccgtccaggtcgacgccacttaccggatggtc528gcgctgcacaaccaccccatggaaccgcacgccgccaccgcggtgcgg576gccgacgggcacctcaccgtccacgactccagccagggctccaccaag624gtccgcgagagtctggcccaggcgttcggactggcggcggaccggatc672accgtggtctccgagcacgtcggcggcggcttcggctcgaagggcacc720acccgcccccagggagtcctggcggcgatggccgcccagcacaccggg768cggccggtgaagctggtgttcccccgcgcccagctggccgaggtcgtc816ggccaccgcgcccccaccatccagcgagtcaggctcggcgcggacctg864gacggggtgctcaccgcggtcagccacgaggtcgtcacccagacctcc912accgtgaaggagttcgtcgagcaggccgccgtgcccgcccgcgtcatg960tacgcctcgccgcacagccggaccgcgcaccgggtgaccgccctcgac1008gtccccagcccctcctggatgcgcgccccgggggaggcctccgggatg1056tacgccctggagtccgccatggacgtgctggactccgcactcggcctg1104gaccccgtcgagctgcggctccgcaacgaaccggagaccgaaccggac1152agcggccgccccttcagcagccggggcctcgccgcctgtctgcgcgac1200ggcgcggcccggttcggctggcaggaccgcgacccccggcccgcagcc1248cgccaggaaggccgctggctcatcggtacgggcgtggcctcggcgacc1296taccccgtcctcctctcccggtccaccgcgagcgcccacgccacccgg1344gacggtgacctgagcatcgccgtcaacgccaccgacatcggcaccggg1392gcccgcaccgtcctggcccagatcgccgccgacgtgctcggcgtcgcc1440ccggaggccctgcgcgtcgacatcggctccaccgacctgcccgccgcc1488ccgctggccggaggctcctccggcaccgcctcctggggctggtccgtg1536cacaaggcggcgaccgccctggccgcccgcctcgcggagcaccggggc1584cccctgcccgccgacgggatcaccaccaccgccgacaccggacaggag1632accggcgaggagtccccgtacgcccggcacgccttcggcgcgcacttc1680gccgagacggccgtcgacgccgtcacgggcgaggtgcgcgtacgccgc1728ctcctcggcgtgtacgccgccgggcggatcctcaacgagcgcaccgca1776cgctcccagttcaccggtggcatggtgatgggcatcggcatggccctc1824accgagggctgcggcatcgacccgggcttcggcgacttcaccgccaag1872gacctcgcctcctaccacgtgcccgtctgcgccgacacggccgacatc1920caggcgcactggatcgaggaggacgaccgccacctcaacccgatgggc1968agcaagggcatcggcgagatcgggatcgtcggcaccgccgccgccatt2016ggcaacgcggtccgccacgccaccggcgcccggctgcgc2055<210>7<211>1115<212>PRT<213>微桿菌屬KNK011(Microbacteriumsp.KNK011)<223>含有信號肽的醛氧化酶的氨基酸序列<400>7MetProValProAlaValLeuSerGlyProArgArgArgSerThrArg151015ValAlaArgThrLeuAlaAlaGlyLeuLeuGlyGlyAlaLeuValAla202530ThrGlyAlaIleLeuProAlaGlyAlaAlaValAlaProAlaValAsn354045ThrProAlaAspLeuProLysGlnGluProGlyValThrLeuArgThr505560TyrSerThrProProLeuThrGluLeuCysThrLeuLysSerGlyGln65707580ThrProAsnValAspLysLeuMetSerThrIleAspTrpArgThrAsp859095GluGlnPheGlyAlaGlyAspAsnPheIleThrHisAlaLeuAlaAsn100105110LeuThrValSerThrProGlyGlnTyrAlaPheArgLeuThrSerAsp115120125AspGlySerArgLeuThrLeuAspGlyThrGlnLeuIleAspAsnAsp130135140GlyLeuHisGlyAlaGluSerValGluGlyThrValThrLeuAspVal145150155160GlyValHisAspLeuPheValGluMetPheGluAlaThrAsnGlyGln165170175GlnLeuThrValGluTrpLysValProGlySerSerSerPheThrVal180185190IleProAsnSerValLeuSerThrGluAlaGlyValValArgValThr195200205AlaProGlyThrLysTyrCysGluGlySerThrAspSerAlaGlyAsp210215220GlyLeuArgLeuAspAlaValAsnProAsnTyrThrLeuValAsnLeu225230235240ArgProGluGlyPheThrProLysValSerGlyLeuAlaPheLeuGly245250255AsnGlyAspLeuAlaValLeuThrThrGlySerValAsnSerGlyGly260265270TrpAspThrSerThrProGlyLysValPheValLeuLysGlyAlaGln275280285AlaAlaAspGlyProGluAspValThrValValGluAlaAlaGlyGly290295300LeuLeuAsnProMetGlyIleAspValIleAspAspLysIleTyrVal305310315320SerGluArgTyrGlnLeuThrGluLeuSerAspThrAsnGlyAspGly325330335SerTyrGluThrLysArgLysValAlaGluTyrProSerGlyAsnAsn340345350PheHisGluPheAlaPheGlyLeuIleHisAspGluLysAsnPheTyr355360365ValAsnLeuSerValAlaIleAspAsnGlyGlyAlaThrThrAsnPro370375380GlnProAlaLysAsnArgGlyThrSerValLysIleAspArgAlaThr385390395400GlyAlaIleSerTyrValAlaGlyGlyLeuArgThrProAsnGlyVal405410415AlaPheGlyProGluAsnGluLeuPheAlaMetAspAsnGlnGlyAla420425430TrpLeuProAlaAsnLysLeuValAsnValLysGlnAspArgPhePhe435440445AsnHisTyrThrAsnProAlaGlyProPheAspGlnAsnProValThr450455460AlaProValValTrpIleProGlnAsnGluIleGlyAsnSerProSer465470475480ThrProIleMetLeuLysAspGlyProPheAlaGlyGlnMetMetPhe485490495GlyAspValThrTyrGlyGlyLeuGlnArgAlaPheLeuGluLysVal500505510AspGlyGluPheGlnGlyAlaValPheArgHisSerAlaGlyPheGlu515520525ValGlyValAsnArgValIleGluGlyProAspThrSerLeuTyrIle530535540GlyGlyThrGlyGluGlyGlyAsnTrpGlyGluAlaGlyLysLeuThr545550555560TyrGlyLeuGlnLysLeuValProAsnThrThrGlnAsnAlaPheAsp565570575MetLysSerMetLysValValGluGlyGlyPheGluIleGluTyrThr580585590GlnProLeuSerAspGluThrLeuAlaAsnLeuAlaSerAlaTyrArg595600605AlaGluGlnTrpArgTyrLeuProThrSerThrTyrGlyGlyProLys610615620ValAspGluGluIleLeuSerLeuThrGlyAlaThrAlaSerAlaAsp625630635640ArgLysThrValThrValSerPheAspGlyLeuLysGlnGlyArgVal645650655ValHisLeuArgSerProGlnProPheAlaAlaAlaSerGlyAspThr660665670LeuTrpSerThrGluAlaTrpTyrThrLeuAsnSerLeuProGlyTyr675680685ValSerProAlaAspGlnGlyTrpTyrGluAlaGluGluAlaArgLeu690695700IleGlyGlyAlaLysPheAspAlaGluHisSerGlyTyrSerGlyAla705710715720GlyPheAlaGlyGlyMetTrpGlnAlaGlySerAlaPheGluPheThr725730735ValAsnAlaGluThrAlaGlyThrValProValSerValArgTyrSer740745750AsnGlyProAsnProAlaProGlySerLysAspValAsnLeuTyrVal755760765AsnGlyGlnAsnLeuGlyLysTrpAspPheAlaSerThrGlyAspTrp770775780LysThrTrpAlaThrIleThrArgAspMetProLeuValAlaGlyThr785790795800AsnThrIleAlaLeuLysTyrGluThrGlyAsnLysGlyAsnIleAsn805810815ValAspValLeuSerIleGlyThrAlaAspIleCysAlaProSerGln820825830ValGluAspGlyTyrArgProLeuPheAspGlyThrLeuGluSerLeu835840845AsnAlaGlyTrpArgMetAlaGlyProGlyGlyPheGlyArgGlnAsn850855860AspCysSerIleArgGlyGluGlyGlyMetGlyLeuLeuTrpHisLys865870875880AlaGlnGluLeuAsnGluTyrSerLeuLysLeuAspTrpLysLeuIle885890895AlaAspHisAsnGlyGl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osimicrobiumcellulansIFO15516<223>含有信號肽的醛氧化酶的DNA序列<400>13atgctcgaacgcaccagcctgccggtgtcccgccggatcaggtaccga48cgcggcgcggccgccctgacccttggcgccgtggtcgtcgcgggctgg96gccgtccccgccgcggccgacctccccgagcaggagcccggcgtcacg144ctgcggaccttccagctcgcgcagaaccccggggcggtctgcaccctg192aagtccggccagacccccaacgtcgacaagctcatgccgaccatcgac240tggtcgacggccgagcagttcggcgcggaggacaacttcatctcgcag288gtgagcgcgaacctgcacgtccccgcggacggccagtaccagttccgc336gtgaccaacgacgacggcgcgctcgtctacatcgacggccagctcgtg384gtcgagaacgacggcccgaacgactcgacctccgtcgagggcagcgcg432acgctcaccgcgggcgtgcacgacctgcgggtcgactactacgagggc480agcgacaagcagcgcctcacgctcgcgtggaagacgccgggcagctcg528acgttcgaggtgatcccgacgtcggcgctcagcaccgaggcgggcgtc576gtgcgcgtgaccgcgcccggctacaagtactgcgagggcgcgaccgac624acggccggcgacggcctgcgtctcgacagcgtcaaccccaactacgac672ctcgtcgacctgcgccccgagggcttcgagcccaaggtctcgggcctg720gccttcacgccggacgagaagctcgccgtcgtgacgaccggcgaggtc768agctccggcgggtggcgccccgacccggtgtccggcgaggtgtacttc816ctcgacggcgtcctggacgcggacggccccgaggacgtcacggcgacg864aaggtcgcggacgagctgctcaacccgatgggcatcgaggtcgtcgag912gactcgatcttcgtctcggagcggtaccagctcacgcagctcaccgac960cctgacggcgacggcttctacgacacgcacacgaagatcgcggagtgg1008cccgacggcggcaacttccacgagttcgcgttcggcctgatccacgac1056gaggactacttctacgtcaacctctccgtggccatcaacaacggcggc1104gcgacgaccaacccgcagccggcggccaaccgcggcacgtcgatcaag1152atcgaccgcgagacgggtgaggtcacgtacgtcgcgggcggtctccgc1200acgccgaacggcatcggcttcggccccgaggacgagatcttcgcgacg1248gacaaccagggtgcctggctcccgtcgaacaagctcatccacatccag1296caggacaagttctacaaccactacacgaacccggccgggccgttcgac1344gcgaaccccgtcaccccgccggccgtgtggctcccgcagaacgagatc1392gccaactccccgggcaacccgatcctcgtcgaggacggcgagttcgcc1440ggccagatgctgctcggcgacgtgacctacggcggcatccagcgcgcg1488ttcctcgagaaggtcgacggcgagttccagggtgcggtcttccgccac1536accgcgggcctcgaggtcggcgtgaaccgtgtcatctacggtcccgac1584ggcgcgctctacgccggcggcaccggtgagggcggcaactggggcgag1632tccggcaagctccggtacggcctccagaagctcgtccccgtgaacgag1680gactccttcgacatgaaggagatgcgcgtggtcgagggcggcttcgag1728atcgagtacaccgacccggtgtccgacgaggtcgtcgagaagctggcc1776gacgcgtaccaggtcaagcagtggcgctacgtgccgacgcagcagtac1824ggcggcccgaaggtcgacgaggagcccctcttcgtcaccgacgccacc1872gtgtccgaggaccgcacgaccgtcacgctgacgatcgacggcctcaag1920cccgaccacgtcgtctacatccgctcgccgcgcccgttcgcgtccgcc1968gagggcaccgagctcctcagcaccgaggcctggtacacgctcaactcg2016ctgcccggctacgtcgccccggccgaccgcggctggtacgaggcggag2064ctggcccagccgctcggcagctcgagcatcggctcggaccacagcaac2112tactccggttcgggcttcgccgcgggcatgacgaacgtcggtgccggc2160cgcacgttctccgtgaccgtccccgaggcgggcacctacccggtcaac2208gtgcgctacgccaacggcatccacccgtacacgtcgctgcggtcgaag2256aacgtctcgctccacgtgaacggccaggacctgggccagtggaacttc2304cccaccacgggaagctggaaggactggggcgtgcagacgcgcgacctc2352cagctccaggccggcacgaacaccatcacgctcgcgtacgaggccggt2400gacgagggcaacatcaacatcgacgtcctgtcgatcggcgagaacccg2448gacatctgctccccgggcgaggtcgaggagggctacaccgcgatctac2496gacggcaccctcgcgagcctccaggagggctggcgcatggccggtccg2544ggtggcttcggccgccaggaggactgctcgatccgcggtgcgggtggc2592atgggcctgctctggtacgaccaggagctcggcgagaactacagcctg2640aagctcgactggaagctcacgaaggacgacaacggcggcgtgttcgtc2688gggttcccgaacccgggcgacgacccgtgggtggccgtcaacaagggc2736tacgagatccagatcgacgcgacggacgccgacgaccgcaccaccggc2784gcggtctacacgttccagggcgccgacgaggcagcgcgcgacgccgcc2832ctcaagccggtcgggcagtggaacgcgtacgacatccgtgtcgaggga2880gaccgcatccgcatctacctcaacgacgtgctcgtcaacgacttcacg2928agcaccgacccggcccggctggtgaacagcttcgtcggcatccagaac2976cacggcagcggcgagatggtcaactaccggaacatccggttcaaggag3024ctgaccgacgagccggtcgaggagctcgcgatctcgacgacggtccag3072acccgctgcctggcgggcaaggtctacgtcgcggtccgtgccacgaac3120gacgacacggtgccggcggacatcacgctgacgacgccgttcgggacg3168aagacggtgaccggcgtccagccgggtgcctccgcgtaccagtcgttc3216gcgtcgcgctcgacctcggtcgaggcgggcaccgcccaggtgtccgcg3264acgggcggcgacctgacgttccaggcggacgtcgcctacgaggccgcg3312tcctgcggctga3324<210>14<211>3210<212>DNA<213>CellulosimicrobiumcellulansIFO15516<223>醛氧化酶的DNA序列<400>14gacctccccgagcaggagcccggcgtcacgctgcggaccttccagctc48gcgcagaaccccggggcggtctgcaccctgaagtccggccagaccccc96aacgtcgacaagctcatgccgaccatcgactggtcgacggccgagcag144ttcggcgcggaggacaacttcatctcgcaggtgagcgcgaacctgcac192gtccccgcggacggccagtaccagttccgcgtgaccaacgacgacggc240gcgctcgtctacatcgacggccagctcgtggtcgagaacgacggcccg288aacgactcgacctccgtcgagggcagcgcgacgctcaccgcgggcgtg336cacgacctgcgggtcgactactacgagggcagcgacaagcagcgcctc384acgctcgcgtggaagacgccgggcagctcgacgttcgaggtgatcccg432acgtcggcgctcagcaccgaggcgggcgtcgtgcgcgtgaccgcgccc480ggctacaagtactgcgagggcgcgaccgacacggccggcgacggcctg528cgtctcgacagcgtcaaccccaactacgacctcgtcgacctgcgcccc576gagggcttcgagcccaaggtctcgggcctggccttcacgccggacgag624aagctcgccgtcgtgacgaccggcgaggtcagctccggcgggtggcgc672cccgacccggtgtccggcgaggtgtacttcctcgacggcgtcctggac720gcggacggccccgaggacgtcacggcgacgaaggtcgcggacgagctg768ctcaacccgatgggcatcgaggtcgtcgaggactcgatcttcgtctcg816gagcggtaccagctcacgcagctcaccgaccctgacggcgacggcttc864tacgacacgcacacgaagatcgcggagtggcccgacggcggcaacttc912cacgagttcgcgttcggcctgatccacgacgaggactacttctacgtc960aacctctccgtggccatcaacaacggcggcgcgacgaccaacccgcag1008ccggcggccaaccgcggcacgtcgatcaagatcgaccgcgagacgggt1056gaggtcacgtacgtcgcgggcggtctccgcacgccgaacggcatcggc1104ttcggccccgaggacgagatcttcgcgacggacaaccagggtgcctgg1152ctcccgtcgaacaagctcatccacatccagcaggacaagttctacaac1200cactacacgaacccggccgggccgttcgacgcgaaccccgtcaccccg1248ccggccgtgtggctcccgcagaacgagatcgccaactccccgggcaac1296ccgatcctcgtcgaggacggcgagttcgccggccagatgctgctcggc1344gacgtgacctacggcggcatccagcgcgcgttcctcgagaaggtcgac1392ggcgagttccagggtgcggtcttccgccacaccgcgggcctcgaggtc1440ggcgtgaaccgtgtcatctacggtcccgacggcgcgctctacgccggc1488ggcaccggtgagggcggcaactggggcgagtccggcaagctccggtac1536ggcctccagaagctcgtccccgtgaacgaggactccttcgacatgaag1584gagatgcgcgtggtcgagggcggcttcgagatcgagtacaccgacccg1632gtgtccgacgaggtcgtcgagaagctggccgacgcgtaccaggtcaag1680cagtggcgctacgtgccgacgcagcagtacggcggcccgaaggtcgac1728gaggagcccctcttcgtcaccgacgccaccgtgtccgaggaccgcacg1776accgtcacgctgacgatcgacggcctcaagcccgaccacgtcgtctac1824atccgctcgccgcgcccgttcgcgtccgccgagggcaccgagctcctc1872agcaccgaggcctggtacacgctcaactcgctgcccggctacgtcgcc1920ccggccgaccgcggctggtacgaggcggagctggcccagccgctcggc1968agctcgagcatcggctcggaccacagcaactactccggttcgggcttc2016gccgcgggcatgacgaacgtcggtgccggccgcacgttctccgtgacc2064gtccccgaggcgggcacctacccggtcaacgtgcgctacgccaacggc2112atccacccgtacacgtcgctgcggtcgaagaacgtctcgctccacgtg2160aacggccaggacctgggccagtggaacttccccaccacgggaagctgg2208aaggactggggcgtgcagacgcgcgacctccagctccaggccggcacg2256aacaccatcacgctcgcgtacgaggccggtgacgagggcaacatcaac2304atcgacgtcctgtcgatcggcgagaacccggacatctgctccccgggc2352gaggtcgaggagggctacaccgcgatctacgacggcaccctcgcgagc2400ctccaggagggctggcgcatggccggtccgggtggcttcggccgccag2448gaggactgctcgatccgcggtgcgggtggcatgggcctgctctggtac2496gaccaggagctcggcgagaactacagcctgaagctcgactggaagctc2544acgaaggacgacaacggcggcgtgttcgtcgggttcccgaacccgggc2592gacgacccgtgggtggccgtcaacaagggctacgagatccagatcgac2640gcgacggacgccgacgaccgcaccaccggcgcggtctacacgttccag2688ggcgccgacgaggcagcgcgcgacgccgccctcaagccggtcgggcag2736tggaacgcgtacgacatccgtgtcgagggagaccgcatccgcatctac2784ctcaacgacgtgctcgtcaacgacttcacgagcaccgacccggcccgg2832ctggtgaacagcttcgtcggcatccagaaccacggcagcggcgagatg2880gtcaactaccggaacatccggttcaaggagctgaccgacgagccggtc2928gaggagctcgcgatctcgacgacggtccagacccgctgcctggcgggc2976aaggtctacgtcgcggtccgtgccacgaacgacgacacggtgccggcg3024gacatcacgctgacgacgccgttcgggacgaagacggtgaccggcgtc3072cagccgggtgcctccgcgtaccagtcgttcgcgtcgcgctcgacctcg3120gtcgaggcgggcaccgcccaggtgtccgcgacgggcggcgacctgacg3168ttccaggcggacgtcgcctacgaggccgcgtcctgcggctga3210<210>15<211>27<212>PRT<213>鏈霉菌屬KNK269(Streptomycessp.KNK269)<223>醛氧化酶γ亞單元的N-末端氨基酸序列<400>15GlyAlaAspLeuGluProGluProValValAspGluHisSerThrVal151015ThrLeuAsnValAsnGlyAspProThrThrLeu2025<210>16<211>40<212>PRT<213>鏈霉菌屬KNK269(Streptomycessp.KNK269)<223>醛氧化酶β亞單元的N-末端氨基酸序列<400>16MetLysProPheGlyTyrValArgProAlaSerProAspGluAlaVal151015ArgLeuCysAlaGluGlySerGlyAlaArgPheLeuGlyGlyGlyThr202530AsnLeuValAspLeuMetLysLeu3540<210>17<211>36<212>PRT<213>鏈霉菌屬KNK269(Streptomycessp.KNK269)<223>醛氧化酶β亞單元的氨基酸序列(從Ala231到Ala266)<400>17AlaArgAspArgAlaSerPheAlaPheAlaLeuValSerValAlaAla151015ThrLeuArgValAspAlaGlyArgValGluHisAlaThrLeuAlaPhe202530GlyGlyValAla35<210>18<211>24<212>PRT<213>鏈霉菌屬KNK269(Streptomycessp.KNK269)<223>醛氧化酶α亞單元的N-末端氨基酸序列<400>18AlaProGlnPheProGlyAlaProValValArgArgGluAlaArgAsp151015LysValThrGlyThrAlaArgTyr20<210>19<211>38<212>PRT<213>鏈霉菌屬KNK269(Streptomycessp.KNK269)<223>醛氧化酶α亞單元的氨基酸序列(從Leu261到Glu298)<400>19LeuValPheProArgAlaGlnLeuAlaGluValValGlyHisArgAla151015ProThrIleGlnArgValArgLeuGlyAlaAspLeuAspGlyValLeu202530ThrAlaValSerHisGlu35<210>20<211>35<212>PRT<213>鏈霉菌屬KNK269(Streptomycessp.KNK269)<223>醛氧化酶α亞單元的氨基酸序列(從Gly659到Thr693)<400>20GlyIleGlyGluIleGlyIleValGlyThrAlaAlaAlaIleGlyAsn151015AlaValArgHisAlaThrGlyAlaArgLeuArgGluLeuProLeuThr202530ThrAspThr35<210>21<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>混合的DNA引物(1)對應于鏈霉菌屬KNK269醛氧化酶γ亞單元的N-末端氨基酸序列<400>21gacctsgarccsgarccsgtsgtsgacga29<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>互補的混合DNA引物(2)對應于鏈霉菌屬KNK269醛氧化酶β亞單位的氨基酸序列(從Asp251到Ala258)<400>22gcgtgytcsacscgbccsgcgtc23<210>23<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>混合的DNA引物(3)對應于鏈霉菌屬KNK269醛氧化酶β亞單位的氨基酸序列(從Asp251到Ala258)<400>23gacgcsggvcgsgtsgarcacgc23<210>24<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>互補的混合DNA引物(4)對應于鏈霉菌屬KNK269醛氧化酶α亞單位的氨基酸序列(從Leu274到Glu281)<400>24cgctggatsgtsggsgcscggtg23<210>25<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>混合DNA引物(5)對應于鏈霉菌屬KNK269醛氧化酶α亞單位的氨基酸序列(從Leu274到Glu281)<400>25caccgsgcsccsacsatccagcg23<210>26<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>互補的混合DNA引物(6)對應于鏈霉菌屬KNK269醛氧化酶α亞單位的氨基酸序列(從Leu686到Glu693)<400>26gtgtcsgtsgtsagsggsagytc23<210>27<211>10<212>PRT<213>微桿菌屬KNK011(Microbacteriumsp.KNK011)<223>醛氧化酶的N-末端氨基酸序列<400>27ValAsnThrProAlaAspLeuProLysGln1510<210>28<211>34<212>PRT<213>微桿菌屬KNK011(Microbacteriumsp.KNK011)<223>醛氧化酶的內(nèi)部氨基酸序列<400>28ValAspGlyGluPheGlnGlyAlaValPheArgHisSerAlaGlyPhe151015ThrValGlyValAsnArgValIleGluGlyProAspThrSerLeuTyr202530IleGly<210>29<211>19<212>PRT<213>微桿菌屬KNK011(Microbacteriumsp.KNK011)<223>醛氧化酶的內(nèi)部氨基酸序列<400>29IlePheLeuAsnGlyThrLeuValAsnAspPheThrSerValAspPro151015AlaArgGlu<210>30<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>混合的DNA引物(1)對應于微桿菌屬KNK011的醛氧化酶N-末端氨基酸序列<400>30gtcaacacsccsgcngayctbccsaarca29<210>31<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>互補的混合DNA引物(2)對應于微桿菌屬KNK011醛氧化酶的氨基酸序列(從Asp513到Phe521)<400>31aasacbgcsccctgraaytcnccrtc26<210>32<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>混合的DNA引物(3)對應于微桿菌屬KNK011醛氧化酶的氨基酸序列(從Asp513到Phe521)<400>32gacggsgarttccagggvgcngtntt26<210>33<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>互補的混合DNA引物(4)對應于微桿菌屬KNK011醛氧化酶的氨基酸序列(從Phe959到Thr969)<400>33gtgaagtcgttsacsagsgtgccrttnagraa32<210>34<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于克隆微桿菌屬KNK011醛氧化酶的DNA引物，其包含NdeI限制位點<400>34gtgccgccgtcgcccatatggtcaacaccccg32<210>35<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于克隆微桿菌屬KNK011醛氧化酶的DNA引物，其包含EcoRI限制位點<400>35ggagagcatggggaattctgggacatgag29<210>36<211>23<212>PRT<213>CellulosimicrobiumcellulansIFO15516<223>醛氧化酶的N-末端氨基酸序列<400>36AspLeuProGluGlnGluProGlyValThrLeuArgThrPheGlnLeu151015AlaGlnAsnProThrAlaVal20<210>37<211>31<212>PRT<213>CellulosimicrobiumcellulansIFO15516<223>醛氧化酶的內(nèi)部氨基酸序列<400>37LysThrProGlySerThrValPheGluValIleProThrSerAlaLeu151015SerThrGluAlaGlyValValTyrValThrAlaProGlyValLys202530<210>38<211>34<212>PRT<213>CellulosimicrobiumcellulansIFO15516<223>醛氧化酶的內(nèi)部氨基酸序列<400>38LysIleAlaGluTrpProAspGlyGlyAsnPheHisGluIleAlaPhe151015GluLeuIleHisAspGluAspTyrPheTyrValAsnLeuSerValAla202530IleAsn<210>39<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>混合的DNA引物(1)對應于CellulosimicrobiumcellulansIFO15516醛氧化酶的N-末端氨基酸序列<400>39acctsccsgagcaggagccsggsgt25<210>40<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>互補的混合DNA引物(2)對應于CellulosimicrobiumcellulansIFO15516醛氧化酶的氨基酸序列(從Ile350到Val358)<400>40acgtagaagtagtcctcgtcgtggat26<210>41<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>混合的DNA引物(3)對應于CellulosimicrobiumcellulansIFO15516醛氧化酶的氨基酸序列(從Thr176到Thr183)<400>41acsgtsttcgaggtsatcccsac23<210>42<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>互補的DNA引物(4)對應于微桿菌屬KNK011醛氧化酶的DNA序列(2521-2545)<400>42tcaggctctcgagcgtgccgtcgaa2權利要求1.一種乙醛酸的制備方法，其特征在于，允許能夠將乙二醛變換為乙醛酸的氧化還原酶、或產(chǎn)生該氧化還原酶的微生物的培養(yǎng)液、培養(yǎng)液上清、細胞以及經(jīng)加工的產(chǎn)物中任意1種或2種或者2種以上物質的混合物作用于乙二醛，從而使乙二醛變換為乙醛酸。2.按照權利要求1所述的乙醛酸的制備方法，其中，上述氧化還原酶為氧化酶。3.按照權利要求1或2所述的乙醛酸的制備方法，其中，上述氧化還原酶為由選自寡養(yǎng)單胞菌屬、鏈霉菌屬、假單胞菌屬、微桿菌屬、無色桿菌屬、纖維單胞菌屬、Cellulosimicrobium屬、摩根氏菌屬組成的組中的至少1種的微生物得到的酶。4.按照權利要求3所述的乙醛酸的制備方法，其中，上述微生物為寡養(yǎng)單胞菌種KNK235(FERMP-19002)、鏈霉菌種KNK269(FERMBP-08556)、假單胞菌種KNK058(FERMBP-08555)、假單胞菌種KNK254(FERMP-19003)、微桿菌種KNK011(FERMBP-08554)、無色桿菌種IFO13495、纖維單胞菌種JCM2471、渾濁纖維單胞菌(Cellulomonasturbata)IFO15012、渾濁纖維單胞菌IFO15014、渾濁纖維單胞菌IFO15015、CellulosimicrobiumcellularsIFO15013、CellulosimicrobiumcellulansIFO15516、CellulosimicrobiumcellulansJCM6201、摩氏摩根氏菌IFO3848。5.按照權利要求1所述的乙醛酸的制備方法，其中，在反應過程中使過氧化氫酶共存。6.一種來自微生物的醛氧化酶，其中，所述醛氧化酶作用于乙二醛從而生成乙醛酸。7.按照權利要求6所述的醛氧化酶，其中，所述醛氧化酶相對于乙醛酸的活性為其相對于乙二醛的活性的1/10倍或1/10倍以下。8.按照權利要求6或7所述的醛氧化酶，其中，上述醛氧化酶為選自寡養(yǎng)單胞菌屬、鏈霉菌屬、假單胞菌屬、微桿菌屬、無色桿菌屬、纖維單胞菌屬、Cellulosimicrobium屬、摩根氏菌屬組成的組中的至少1種的微生物產(chǎn)生的醛氧化酶。9.按照權利要求8所述的醛氧化酶，其中，上述微生物為寡養(yǎng)單胞菌種KNK235(FERMP-19002)、鏈霉菌種KNK269(FERMBP-08556)、假單胞菌種KNK058(FERMBP-08555)、假單胞菌種KNK254(FERMP-19003)、微桿菌種KNK011(FERMBP-08554)、無色桿菌種IFO13495、纖維單胞菌種JCM2471、渾濁纖維單胞菌(Cellulomonasturbata)IFO15012、渾濁纖維單胞菌IFO15014、渾濁纖維單胞菌IFO15015、CellulosimicrobiumcellulansIFO15013、CellulosimicrobiumcellulansIFO15516、CellulosimicrobiumcellulansJCM6201、摩氏摩根氏菌IFO3848。10.按照權利要求8所述的醛氧化酶，其為具有以下(1)～(3)的物理化學性質的鏈霉菌屬微生物產(chǎn)生的醛氧化酶(1)最適宜pH6～9(2)熱穩(wěn)定性在pH7.2、60℃下處理20分鐘后，保持90％或90％以上的活性(3)分子量經(jīng)凝膠過濾分析為約11萬，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時，具有約2.5萬、約3.5萬、約8萬的3個亞單元蛋白質。11.按照權利要求8所述的醛氧化酶，其為屬于具有以下(1)～(3)物理化學性質的假單胞菌屬的微生物所產(chǎn)生的醛氧化酶(1)分子量經(jīng)凝膠過濾分析為約15萬(2)反應最適宜溫度60～70℃(3)反應最適宜pH5～7。12.按照權利要求8所述的醛氧化酶，其為具有以下的物理化學性質的微桿菌屬微生物在細胞內(nèi)以及細胞外產(chǎn)生的醛氧化酶分子量在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時，為約11萬的單一蛋白質。13.按照權利要求8所述的醛氧化酶，其為具有以下的物理化學性質的Cellulosimicrobium屬微生物在細胞內(nèi)以及細胞外產(chǎn)生的醛氧化酶分子量在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時，為約9～10萬的單一蛋白質。14.按照權利要求10所述的醛氧化酶，其中，屬于鏈霉菌屬的微生物為鏈霉菌種KNK269(FERMBP-08556)。15.按照權利要求11所述的醛氧化酶，其中，屬于假單胞菌屬的微生物為假單胞菌種KNK058(FERMBP-08555)。16.按照權利要求12所述的醛氧化酶，其中，屬于微桿菌屬的微生物為微桿菌種KNK011(FERMBP-08554)。17.按照權利要求13所述的醛氧化酶，其中，屬于Cellulosimicrobium屬的微生物為CellulosimicrobiumcellulansIFO15516。18.按照權利要求6所述的醛氧化酶，其是具有以下的(a)或(b)的蛋白質作為亞單元的醛氧化酶(a)含有序列號1、2或3表示的氨基酸序列的蛋白質(b)蛋白質，其含有在氨基酸序列(a)中缺失、置換或添加了1個或數(shù)個氨基酸所得的氨基酸序列。19.按照權利要求6所述的醛氧化酶，其是具有由以下的(a)或(b)的DNA編碼的蛋白質作為亞單元的醛氧化酶(a)含有序列號4、5或6的核苷酸序列的DNA(b)與含有下述核苷酸序列的DNA中的任意1個在嚴格條件下雜交的DNA，所述核苷酸序列是與具有(a)核苷酸序列的DNA互補的核苷酸序列。20.按照權利要求6所述的醛氧化酶，其中，所述醛氧化酶含有以下的(a)或(b)的氨基酸序列(a)序列號7、8、11或12表示的氨基酸序列(b)氨基酸序列，其為在氨基酸序列(a)中缺失、置換或添加了1個或數(shù)個氨基酸所得的氨基酸序列。21.按照權利要求6所述的醛氧化酶，其中，所述醛氧化酶是被以下的(a)或(b)的DNA編碼的醛氧化酶(a)含有序列號9、10、13或14核苷酸序列的DNA(b)與含有下述核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交的DNA，所述核苷酸序列是與含有(a)的核苷酸序列的DNA互補的核苷酸序列。22.編碼權利要求6所述醛氧化酶的亞單元的DNA，其中，所述DNA是含有以下的(a)或(b)的任意一個而形成的(a)含有序列號4、5或6的核苷酸序列的DNA(b)與含有下述核苷酸序列的DNA中的任意一個在嚴格條件下雜交的DNA，所述核苷酸序列是與含有(a)的核苷酸序列的DNA互補的核苷酸序列。23.編碼權利要求6所述醛氧化酶的DNA，其中，所述DNA是含有以下的(a)或(b)的任意一個而形成的(a)含有序列號9、10、13或14的核苷酸序列的DNA(b)與含有下述核苷酸序列的DNA中的任意一個在嚴格條件下雜交的DNA，所述核苷酸序列是與含有(a)的核苷酸序列的DNA互補的核苷酸序列。24.編碼權利要求6所述醛氧化酶的亞單元的DNA，其中，所述DNA含有在序列號1、2或3表示的氨基酸序列中，缺失、置換或添加了1個或數(shù)個氨基酸所得的任意氨基酸序列。25.編碼權利要求6所述醛氧化酶的DNA，其中，所述DNA含有在序列號7、8、11或12表示的氨基酸序列中，缺失、置換或添加了1個或數(shù)個氨基酸所得的任意氨基酸序列。全文摘要本發(fā)明提供一種利于工業(yè)的從乙二醛到乙醛酸的生物化學的制備方法。詳細地說，提供一種乙醛酸的制備方法，其特征在于，使具有將乙二醛變換為乙醛酸能力的氧化酶以及脫氫酶等氧化還原酶作用于乙二醛，變換為乙醛酸。文檔編號C12N9/02GK1930286SQ20048000376公開日2007年3月14日申請日期2004年2月13日優(yōu)先權日2003年2月14日發(fā)明者巖崎晃,松本健彥,鷲田元久,渡辺裕,長谷川淳三,清水昌申請人:株式會社鐘化