專利名稱：一種高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一種高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因與其在培育抗逆性提高的植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在受到高鹽、低溫及干旱等逆境脅迫時，會引起細(xì)胞缺水。缺水信號經(jīng)過一系列傳遞，從而引發(fā)許多與植物抗性相關(guān)基因的表達(dá)。Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki在對逆境應(yīng)答基因rd29A基因的啟動子區(qū)域的研究中，發(fā)現(xiàn)了一個逆境脅迫應(yīng)答順勢作用元件，即干旱應(yīng)答元件(DRE，drought-responsive element)。此后，發(fā)現(xiàn)許多逆境應(yīng)答基因啟動子區(qū)域含有DRE元件。劉強(qiáng)等運(yùn)用酵母單雜交方法(yeast one-hybrid method)又克隆出與DRE元件結(jié)合的反式作用因子編碼基因，即轉(zhuǎn)錄因子干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(DREB，drought-responsive element bindingprotein)基因。該DREB基因表達(dá)的產(chǎn)物與順式作用元件DRE(普遍存在于植物體中)結(jié)合后，可激活一系列與植物抗性相關(guān)基因的表達(dá)。自從對DREB轉(zhuǎn)錄因子的研究工作開展以來，對其結(jié)構(gòu)和功能的研究已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)已從擬南芥、棉花、玉米、小麥、水稻、油菜、番茄和大豆中分離到類似于DREB的基因，且這些基因都具有類似的功能，但是對草坪草有關(guān)DREB基因的研究鮮為報(bào)道。
DREB類轉(zhuǎn)錄因子是AP2家族中EREBP-like亞家族中的一個成員。DREB類轉(zhuǎn)錄因子含有一段非常保守的由58個左右氨基酸組成的DNA結(jié)合區(qū)域(EREBP/AP2結(jié)構(gòu)域)。EREBP/AP2結(jié)構(gòu)域的第14位氨基酸是纈氨酸(V14)，第19位氨基酸是谷氨酸(E19)，這兩個氨基酸被認(rèn)為是DREB轉(zhuǎn)錄因子與DRE順式作用元件特異性結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。
近年來，我國草坪業(yè)發(fā)展迅速，其中，西部大開發(fā)的計(jì)劃之一就是改善西部惡劣的生態(tài)環(huán)境，因而更加迫切需要抗旱、抗寒、耐鹽堿的優(yōu)良草種。高羊茅(Festucaarundinacea Schreb.)是近年來廣泛種植的優(yōu)良草坪草，但其抗寒性和耐鹽堿性較低限制了其在環(huán)境較惡劣的西部的推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，名稱為FaDREB2，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控高羊茅抗逆性的蛋白質(zhì)。
其中，序列表中的SEQ ID №1由264個氨基酸殘基組成，自氨基端第62-119位為AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基序列，其中自氨基端第75位和第80位氨基酸分別為纈氨酸和谷氨酸。
上述高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白的編碼基因(FaDREB2)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №2由1087個堿基組成，其編碼序列為自5’端第29到第823位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；自5’端第212到第385位堿基為AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域的編碼序列，編碼58個氨基酸，自5’端第251到第253位堿基為纈氨酸的編碼序列，自5’端第266到第268位堿基為谷氨酸的編碼序列。
含有所述高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白基因的植物表達(dá)載體，細(xì)胞系，宿主菌以及擴(kuò)增本發(fā)明所述基因中任一片段的引物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白FaDREB2序列具有DREB轉(zhuǎn)錄因子家族共有的特征具有一個含有58個氨基酸的AP2/EREBP保守區(qū)，其中第14位和第19位的氨基酸序列分別為纈氨酸和谷氨酸。酵母單雜交實(shí)驗(yàn)證明該DREB轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活功能。此外，用Real time RT-PCR方法，分析了的FaDREB2基因在低溫、干旱、高鹽及脫落酸ABA處理下的表達(dá)模式，結(jié)果表明FaDREB2基因明顯受高鹽和低溫誘導(dǎo)表達(dá)，對干旱和ABA處理沒有明顯反應(yīng)。
本發(fā)明的高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白FaDREB2是一個受高鹽、低溫特異誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，可與多個逆境應(yīng)答基因啟動子共有的DRE調(diào)控元件特異結(jié)合，誘導(dǎo)這些基因表達(dá)，從而激活植物體內(nèi)的多條逆境脅迫途徑，提高抗逆能力。在實(shí)際應(yīng)用中，可將本發(fā)明的含有高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白基因的表達(dá)載體導(dǎo)入植物(如高羊茅)中，調(diào)控植物(如高羊茅)的抗逆性(如抗寒耐鹽堿特性)。
本發(fā)明的干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白FaDREB2可同時激活一系列抗性相關(guān)基因的表達(dá)，克服了傳統(tǒng)植物抗逆基因工程中用單個功能基因提高抗逆性的局限性，使植物抗逆特性的大幅度提高成為可能。因此FaDREB2為基因工程改良植物耐逆性提供了一條全新的技術(shù)途徑，尤其在草坪草抗逆性的綜合改良過程中具有廣泛的應(yīng)用前景和巨大的經(jīng)濟(jì)價值。


圖1為冷處理下高羊茅總RNA的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果圖2為鹽處理下高羊茅總RNA的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果圖3為干旱處理下高羊茅總RNA的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果圖4為ABA處理下高羊茅總RNA的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果圖5為冷處理下高羊茅FaDREB2 RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果圖5a為冷處理下高羊茅actin RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果圖6為鹽處理下高羊茅FaDREB2 RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果圖6a為鹽處理下高羊茅actin RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果圖7為干旱處理下高羊茅FaDREB2 RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果圖7a為干旱處理下高羊茅actin RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果圖8為脫落酸ABA處理下高羊茅FaDREB2 RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果圖8a為脫落酸ABA處理下高羊茅actin RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果圖9為0mM 3-AT條件下，高羊茅FaDEREB2酵母單雜交功能鑒定結(jié)果圖10為20mM 3-AT條件下，高羊茅FaDEREB2酵母單雜交功能鑒定結(jié)果圖11為30mM 3-AT條件下，高羊茅FaDEREB2酵母單雜交功能鑒定結(jié)果圖12為40mM 3-AT條件下，高羊茅FaDEREB2酵母單雜交功能鑒定結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，詳見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)。
實(shí)施例1、從受鹽誘導(dǎo)的高羊茅cDNA文庫中釣取FaDREB包括如下步驟1、高羊茅鹽誘導(dǎo)cDNA文庫的構(gòu)建1)將禾本科植物高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)的種子浸泡于1％次氯酸鈉溶液中消毒20分鐘后，用無菌水洗三遍；
2)將消毒后的高羊茅種子播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基(pH5.8)中，在25℃、16小時/8小時(光/暗)的條件下培養(yǎng)14天，取幼苗洗凈，將其根部置于250mM NaCl溶液中處理5小時，然后將經(jīng)過處理的幼苗立即用液氮速凍，-80℃保存用于提取總RNA。
3)用Trizol法(Trizol液購于GIBCO公司)提取步驟2)保存的受鹽誘導(dǎo)5小時的高羊茅植株的總RNA，用PolyATtract mRNA Isolation Systems(Promega公司)從上述高羊茅植株的總RNA中分離出mRNA；再以此mRNA為模板，用ZAP Express cDNASynthesis Kit(Stratagene公司)合成其cDNA；最后，將獲得的cDNA兩端分別加上EcoR I和Xho I接頭后，將其插入到λ-ZAP載體(Stratagene)的EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)之間，再用ZAP Express cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Stratagene公司，參見試劑盒說明書中的Gigapack III Gold封裝混合法)構(gòu)建出受鹽誘導(dǎo)的高羊茅cDNA文庫。
2、從受鹽誘導(dǎo)的高羊茅cDNA文庫中釣取FaDREB21)根據(jù)已報(bào)道的DREB基因序列設(shè)計(jì)一對特異性兼并引物，引物序列為引物1(正向引物)5’-TGC(t)AAGTACCGA(c/t)GGTGTG-3’；引物2(反向引物)5’-CGAGAAGTTGACACGTGC-3’；2)以步驟1中受鹽誘導(dǎo)5小時的5ug高羊茅幼苗總RNA為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下，用RT-PCR的方法(RT-PCR Kit，TaKaRa)擴(kuò)增得到高羊茅DREB基因AP2保守區(qū)的cDNA片段；其中， 3)以步驟2)獲得的AP2保守區(qū)的cDNA片段作探針，用常規(guī)方法從步驟1構(gòu)建的鹽誘導(dǎo)cDNA文庫中篩選出多個陽性克隆，用377 DNA Sequencer(ABI PRISM)對獲得的多個陽性克隆進(jìn)行序列測定，與已報(bào)道的DREB基因序列進(jìn)行序列比對，從中得到高羊茅DREB的cDNA序列，該cDNA序列全長為1087bp，具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，5’端的非翻譯區(qū)長度為28bp，3’端的非翻譯區(qū)長度為264bp，其編碼序列(開放閱讀框架)長度為795 bp，是自SEQ ID №2的5’端的第29-823位堿基，其編碼序列編碼具有序列表中SEQ ID №1(264個氨基酸殘基)的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。將高羊茅的DREB基因命名為FaDREB2，編碼蛋白命名為FaDREB2。對FaDREB2進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明FaDREB2具有DREB蛋白家族的特征。其中自N端第62-119位為AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域；自N端第75位(AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域中的第14位)為纈氨酸；自N端第80位(AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域中的第19位)為谷氨酸。表明FaDREB2是一個DREB蛋白。
實(shí)施例2、冷、鹽、干旱和脫落酸ABA誘導(dǎo)處理下FaDREB2的表達(dá)模式實(shí)驗(yàn)過程包括如下步驟1、分別對實(shí)施例1培養(yǎng)的高羊茅幼苗進(jìn)行冷誘導(dǎo)、鹽誘導(dǎo)、干旱誘導(dǎo)及脫落酸ABA誘導(dǎo)處理，處理方法如下1)鹽誘導(dǎo)處理高羊茅幼苗的根部置于250mM NaCl溶液中進(jìn)行處理；2)冷誘導(dǎo)處理高羊茅幼苗置于4℃光照培養(yǎng)箱處理，其根部置于蒸餾水中；3)干旱誘導(dǎo)處理高羊茅幼苗置于超凈工作臺上風(fēng)干處理，濕度為50％；4)脫落酸ABA誘導(dǎo)處理高羊茅幼苗的根部置于100μM ABA溶液中進(jìn)行處理；分別于處理后0、1、2、4、8、12和24小時對經(jīng)上述不同方法誘導(dǎo)處理的高羊茅幼苗間隔取樣，然后將樣品立即用液氮速凍，-80℃保存用于提取總RNA。用Trizol法(Trizol液購于GIBCO公司)提取上述不同樣品的總RNA，并用1.0％瓊脂糖凝膠電泳對不同樣品的總RNA進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如圖1-4所示(泳道0、1、2、4、8、12和24分別表示第0、1、2、4、8、12和24小時采集的樣品的總RNA)。
2、用RT-PCR法分析冷、鹽、干旱和脫落酸ABA誘導(dǎo)條件下FaDREB2的表達(dá)模式分別以步驟1提取的不同樣品的總RNA為模板，在引物3(正向引物)5’-GTCTGGCTTTGTGACATGAATTTC-3’和引物4(反向引物)5’-CCCTCATATCATAACTAAGCCCTAA-3’的引導(dǎo)下，用One-step realtime RT-PCR kit(TaKaRa)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測在冷、鹽、干旱和脫落酸ABA誘導(dǎo)條件下FaDREB2的表達(dá)模式，并在引物5(正向引物)5’-CAACTGGGATGAC(t)ATGGAGA-3’和引物6(反向引物)5’-CCA(g)ATCCAGACACTGTACTTCC-3’引導(dǎo)下，用同樣的參數(shù)條件及反應(yīng)條件下PCR擴(kuò)增高羊茅的看家基因肌動蛋白actin基因(內(nèi)參)，RT-PCR反應(yīng)體系為RNase Free H2O 10.5ul，10×One step RNA PCR緩沖液2.5ul，dNTP混合物(各10mM)2.5ul，MgCl2(25mM)5ul，RNase Inhibitor(40U/ul)0.5ul，M-MLV RTase(25U/ul)0.5ul，TaKaRa Ex Taq HS(5U/ul)0.5ul，引物3和引物4(各10uM)各1ul，總RNA 1ug；反應(yīng)條件先50℃ 30分鐘，94℃ 2分鐘；再94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 60秒，進(jìn)行22個循環(huán)；最后72℃ 5分鐘。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖5-圖8a所示(泳道M為Marker，泳道0、1、2、4、8、12和24分別表示第0、1、2、4、8、12和24小時采集的樣品的RT-PCR產(chǎn)物，箭頭示目的條帶，表明FaDREB2在高鹽和低溫誘導(dǎo)下可明顯表達(dá)，但不受干旱和脫落酸ABA的誘導(dǎo)。
實(shí)施例3、FaDREB2轉(zhuǎn)錄激活載體的構(gòu)建和FaDREB2蛋白轉(zhuǎn)錄激活功能的檢測包括如下步驟1、以實(shí)施例1的步驟1提取的高羊茅總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，在引物7(正向引物)5’-ATGTCCAGGAAGAAGAAAGTGC-3’和引物8(反向引物)5’-CTAATATGAGAAAAGACTAAACCCATC-3’的引導(dǎo)下，用高保真Pfu DNA聚合酶(Promega公司)通過PCR法獲得FaDREB2的編碼區(qū)；其中，PCR反應(yīng)體系為 反應(yīng)條件 2、將步驟1獲得的FaDREB2的編碼區(qū)片段與載體pGEM-T(Promega公司)用T4DNA連接酶連接，獲得重組載體，命名為FaDREB2/pGEM-T，再用限制性內(nèi)切酶SpeI I和NotI從重組載體FaDREB2/pGEM-T上切下FaDREB2的編碼區(qū)片段，并將其與用相同酶酶切的YEpGAP112(ATCC公司)連接獲得重組載體，命名為FaDREB2/YEpGAP112，經(jīng)檢測無誤后，將重組載體FaDREB2/YEpGAP112分別轉(zhuǎn)化到含雙報(bào)道子(HIS3和LacZ)的含野生型DRE元件酵母菌株4271和含突變型DRE元件酵母菌株4271(均購自Clontech公司)中，再將轉(zhuǎn)化有重組載體FaDREB2/YEpGAP112的重組酵母菌株涂于含有3-AT(分別加入濃度為0mM，20mM，30mM，40mM 3-AT進(jìn)行檢測)的SD-Agar三缺固體培養(yǎng)基(His-，Trp-，Ura-，Clontech公司)上檢測其生長情況。
同時以擬南芥DREB1A(Liu等Plant Cell，1998，10(8)1391-1406)為對照，將DREB1A的編碼區(qū)片段與載體pGEM-T(Promega公司)用T4DNA連接酶連接，獲得重組載體，命名為DREB1A/pGEM-T，再用限制性內(nèi)切酶SpeI I和NotI從重組載體DREB1A/pGEM-T上切下DREB1A的編碼區(qū)片段，并將其與用相同酶酶切的YEpGAP112(ATCC公司)連接獲得重組載體，命名為DREB1A/YEpGAP112，經(jīng)檢測無誤后，將重組載體DREB1A/YEpGAP112分別轉(zhuǎn)化到含雙報(bào)道子(HIS3和LacZ)的含野生型DRE元件酵母菌株4271和含突變型DRE元件酵母菌株4271(均購自Clontech公司)中，再將轉(zhuǎn)化有重組載體DREB1A/YEpGAP112的重組酵母菌株涂于含有3-AT(分別加入濃度為0mM，20mM，30mM，40mM 3-AT進(jìn)行檢測)的SD-Agar三缺固體培養(yǎng)基(His-，Trp-，Ura-，Clontech公司)上檢測其生長情況。
結(jié)果如圖9-12所示(1為擬南芥DREB1A在含野生型DRE元件酵母中；2為FaDRBEB2基因在含野生型DRE元件酵母中；3為野生型酵母對照；4為擬南芥DREB1A基因在含突變型DRE元件酵母中；5為FaDRBEB2基因在含突變型DRE元件酵母中；6為突變型酵母對照，結(jié)果表明含F(xiàn)aDREB2和野生型DRE元件的酵母菌株在3-AT-SD-Agar三缺培養(yǎng)基上生長良好，而含F(xiàn)aDREB2和突變型DRE元件的酵母菌株在3-AT-SD-Agar三缺培養(yǎng)基上不能生長。說明FaDREB2蛋白可特異結(jié)合DRE元件，從而激活下游目的基因的表達(dá)，具有調(diào)控草坪草高羊茅抗逆性應(yīng)答的功能。
序列表<210>1<211>264<212>PRT<213>高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)<400>1Met Ser Arg Lys Lys Lys Val Arg Arg Arg Ser Thr Gly Pro Asp Ser1 5 10 15Val Ser Glu Ile Ile Lys Lys Trp Lys Glu Gln Asn Gln Lys Leu Gln20 25 30Glu Glu Asn Gly Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly35 40 45Cys Met Ala Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Asn Cys Lys Tyr Arg50 55 60Gly Val Arg Gln Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu65 70 75 80Pro Asn Arg Gly Asn Arg Leu Trp Leu Gly Ser Phe Pro Thr Ala Val85 90 95Glu Ala Ala His Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Arg Ala Met Tyr Gly Ala100 105 110Thr Ala Arg Val Asn Phe Ser Glu Arg Ser Pro Asp Ala Asn Ser Gly115 120 125Cys Thr Ser Ala Pro Pro Val Leu Met Ser Asn Gly Pro Thr Ala Val130 135 140Ser His Leu Ala Asp Gly Lys Asp Glu Ser Glu Ser Pro Pro Ser Leu145 150 155 160Thr Ser Asp Ala Pro Thr Ala Thr Leu Asp Arg Ser Asp Ala Lys Asp165 170 175Glu Pro Glu Ser Ala Gly Thr Val Val His Glu Val Lys Thr Glu Val
180 185 190Ser Asn Asp Ser Thr Ser Val Arg Glu Glu Arg Lys Ala Val Glu Val195 200 205Phe Gln Pro Glu Gly Lys Ala Leu Arg Lys Glu Glu Lys Val Ser Tyr210 215 220Asp Tyr Phe Asn Val Glu Glu Val Leu Asp Met Ile Ile Val Glu Leu225 230 235 240Ser Ala Asp Arg Lys Met Glu Val His Glu Glu Tyr Gln Asp Gly Asp245 250 255Asp Gly Phe Ser Leu Phe Ser Tyr260<210>2<211>1087<212>DNA<213>高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)<400>2gtctggcttt gtgacatgaa tttccttgat gtccaggaag aagaaagtgc ggaggagaag 60caccggtccc gattcggtgt ctgaaatcat caagaagtgg aaggagcaga accagaagct120ccaggaagag aatggagccc ggaaagcgcc ggccaagggt tcgaagaaag ggtgcatggc180agggaaaggt ggtccggaaa attcaaattg caagtaccga ggtgtgaggc agcggacgtg240gggcaaatgg gtggctgaga tccgcgagcc caaccgcggc aaccggctat ggcttggctc300gttccctact gcggtggaag ctgcacacgc gtacgacgag gcggcaaggg cgatgtatgg360cgccacagca cgtgtcaact tctcggagcg ttcgccggat gccaactctg gctgcacatc420ggcgcctcca gtgctgatgt ctaacgggcc aactgctgtg tcacatctgg ctgatgggaa480ggatgaatcg gaatctcctc cttctcttac gtcagacgcg ccgaccgcta cgttggatcg540gtctgatgcg aaggatgagc ctgaatctgc agggactgtg gtgcatgagg tcaaaacgga600agtgagcaat gactcgacaa gcgtccgtga ggagcgcaag gctgtggaag tatttcaacc660agaagggaaa gctttacgta aagaagagaa agtaagttac gattacttca atgtcgaaga720agttctcgac atgataattg tggaattgag tgctgataga aaaatggaag tacatgaaga780
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1.高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控高羊茅抗逆性的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述序列表中SEQ ID №1的自氨基端第62-119位為AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。
3.編碼權(quán)利要求1所述高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于它具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白基因的編碼序列為自序列1的5’端第29-823位核苷酸。
6.含有權(quán)利要求3或4或5所述高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白基因的植物表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求3或4或5所述高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白基因的細(xì)胞系。
8.含有權(quán)利要求3或4或5所述高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白基因的宿主菌。
9.擴(kuò)增權(quán)利要求3、4或5所述基因中任一片段的引物。
10.權(quán)利要求3、4或5所述的高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白基因在培育抗逆性提高的植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高羊茅干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該結(jié)合蛋白為具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或?yàn)閷⑿蛄斜碇蠸EQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控高羊茅抗逆性的蛋白質(zhì)。其編碼基因?yàn)樾蛄斜碇蠸EQ ID №2的DNA序列；或編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。該蛋白及其編碼基因可用于培育抗逆性提高的植物。
文檔編號C12N15/29GK1778814SQ200410096050
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月26日
發(fā)明者劉敬梅, 陽文龍, 周海夢 申請人:清華大學(xué)