專利名稱：一種快速鑒定草坪型高羊茅耐熱性大小的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于冷季型草坪草抗性鑒定生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速鑒定草坪型高羊茅耐熱性大小的新方法。
背景技術(shù)：
草坪型高羊茅(Festuca arundinacea)是禾本科羊茅屬的多年生草本植物，叢生型，須根發(fā)達(dá)，植株強(qiáng)健，具有廣泛的適應(yīng)性，是冷季型禾本科草坪草中抗熱性和抗旱性最好的草種(徐勝等，2004)。通過育種不斷改良品種，當(dāng)前的草坪型高羊茅耐寒、耐熱、耐踐踏、抗病能力強(qiáng)，耐酸、耐鹽堿、耐干旱、耐澇、性喜光又耐蔭，耐修剪，綠期長，管理方便，建坪成本低，所以廣泛用于城市綠化，足球場，高爾夫球場，以及養(yǎng)護(hù)管理粗放的飛機(jī)場、賽馬場，和公路護(hù)坡等(余高鏡等，2005)。
在美國，高羊茅是應(yīng)用最為廣泛的冷季型草種。20世紀(jì)90年代以后高羊茅在我國草坪中的應(yīng)用開始迅速增加。目前在亞熱帶地區(qū)，一些地方在綠化草種混合播種時，高羊茅的比例甚至能達(dá)到80％。據(jù)不完全統(tǒng)計，到1998年，我國進(jìn)口草坪型高羊茅幾乎占全部進(jìn)口的冷季型草坪草種子的35％以上(余高鏡等，2005)。雖然草坪型高羊茅在我國種植面積的擴(kuò)大，對種子的需求大大增加，但目前國內(nèi)尚無專門的草坪型高羊茅種子生產(chǎn)基地，大多從美國進(jìn)口。
近年來國際上培育的草坪型高羊茅品種已有二百多種，而且每年都會相繼推出很多新品種。在亞熱帶地區(qū)，人們選用草坪型高羊茅品種時參照的最主要的指標(biāo)是品種的耐熱性大小。到目前為止，這種選擇主要依賴于育種商和推廣商的宣傳材料，但這些宣傳材料全是描述性的，沒有具體的參數(shù)或指標(biāo)能證明他們所提供的草坪型高羊茅品種在同類高羊茅中耐熱性大小。從育種商和推廣商的宣傳材料來看，當(dāng)前的絕大多數(shù)草坪型高羊茅品種耐熱性都很高。但在我們實(shí)際種植和養(yǎng)護(hù)管理過程中發(fā)現(xiàn)，不同的草坪型高羊茅品種之間的耐熱性大小存在明顯差異，而且個別品種之間差異極大。如果按照原有的辦法來確定我們即將選用的草坪型高羊茅品種的耐熱性大小，就需要將這些高羊茅品種在春天或秋天大田播種一直精細(xì)養(yǎng)護(hù)管理至越夏后。觀察它們越夏后的生長狀況，最終可以確定它們的耐熱性大小。這種方法雖然可行，但需要4-10個月的時間。同時在這個過程還需要花費(fèi)很多的人力和物力。為此，我們通過大量實(shí)驗(yàn)比較，試圖從一系列能鑒定高羊茅耐熱性大小的方法中，找出一種鑒定快速，操作過程簡單易行，實(shí)驗(yàn)成本低，儀器要求簡單，易推廣的方法。
首先，我們對引自美國以及荷蘭等地的的30種具有代表性的草坪型高羊茅在2004年4月大田播種養(yǎng)護(hù)管理至8月底后觀察它們的生長狀況，根據(jù)它們的生長表現(xiàn)大體把它們分為三類耐熱性高的草坪型高羊茅，耐熱性中等的草坪型高羊茅和耐熱性低的草坪型高羊茅。而后又將這30種具有代表性的草坪型高羊茅常溫下播種18天后，放入白天溫度為35℃，晚上溫度為30℃，光照量子為150μmol m-2s-1，相對濕度為70％的人工氣候箱中培育3天。3天后通過一系列試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下草坪型高羊茅的凈光合速率，光系統(tǒng)II功能，熱激蛋白表達(dá)，細(xì)胞抗氧化體系和葉片葉綠素的變化都能充分鑒定草坪型高羊茅的耐熱性大小。但通過對比，測定葉綠素的變化程度大小來準(zhǔn)確鑒定草坪型高羊茅耐熱性大小操作最為簡單，實(shí)驗(yàn)成本也低，而且儀器要求簡便易行。經(jīng)檢索國家專利網(wǎng)(www.sipo.gov.cn)，查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和大量調(diào)研后，尚未見有關(guān)類似快速鑒定草坪型高羊茅草坪草耐熱性大小的報道，該方法有著廣泛的推廣應(yīng)用前景和實(shí)際應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是研發(fā)一種鑒定快速，操作過程簡單易行，實(shí)驗(yàn)成本低，儀器要求簡單，易推廣的鑒定草坪型高羊茅耐熱性大小的新方法。
本發(fā)明通過測定草坪型高羊茅葉片葉綠素的含量變化來準(zhǔn)確鑒定高羊茅耐熱性大小。具體技術(shù)方案由以下四個步驟組成1.材料培育把要鑒定的草坪型高羊茅品種的優(yōu)質(zhì)種子播種在裝有普通沙子、粘土和營養(yǎng)土(體積比1∶3∶3)的盆中，在常溫下培育18天后，部分植株移入白天溫度為35±0.5℃，夜間溫度為30±0.5℃，光照量子為150-200μmol m-2s-1，相對濕度為65-70％的人工氣候箱中培育3天。在培育過程中不施加任何養(yǎng)分。種子出苗前隔天噴灑少量水，出苗后常溫下培育時植株隔天澆一次透水，高溫脅迫時每天澆一次透水。
2.樣品采集和分析分別隨機(jī)采集并稱取0.1克常溫下和高溫脅迫下培育的健康葉片，擦凈表面污物，剪碎，放入研缽中，加入少量石英沙用80％丙酮研成勻漿，提取液體用定性濾紙過濾后定容至10毫升用可見光分光光度計在663、646nm下比色測吸光值，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定四次。
3.結(jié)果計算以上測定結(jié)果根據(jù)以下公式計算葉綠素a、b的濃度
葉綠素a在提取液中的濃度Ca＝12.21A663-2.81A646葉綠素b在提取液中的濃度Cb＝20.13A646-5.03A663上式中CA和Cb單位為mg/L，A646和A663分別代表葉綠素提取液在波長646nm和663nm下的吸光值。再根據(jù)以下公式計算組織中單位鮮重的葉綠素a、b的含量 上式中葉片組織中單位鮮重的葉綠素的含量單位為mg/g，色素的濃度為Ca或Cb，提取液體積為10毫升，樣品鮮重為0.1克。而后再計算出相應(yīng)的葉片組織中單位鮮重的葉綠素a+b含量。
4.品種耐熱性大小鑒定在計算出相應(yīng)的葉片組織中單位鮮重的葉綠素a+b含量后，再根據(jù)以下公式計算，得出的結(jié)果與以下參數(shù)相比即可鑒定出所要鑒定品種的耐熱性大小，公式葉片脅迫下葉綠素a+b含量/常溫下a+b含量比值當(dāng)此比值大于0.815為耐熱性高的草坪型高羊茅品種，介于0.760-0.815之間的為耐熱性中等的草坪型高羊茅品種，小于0.760的為耐熱性低的草坪型高羊茅品種。
本發(fā)明有益效果是1.鑒定快速，時間短。如果按照原有的辦法，需要將所要鑒定的草坪型高羊茅品種種子在春天或秋天播種一直精細(xì)養(yǎng)護(hù)管理至越夏后觀察生長狀況，整個過程需要4-10個月的時間。如果種子播種，培育到處理21天后，測定植株體內(nèi)熱激蛋白表達(dá)和細(xì)胞抗氧化體系則還需要20天到40天，總共時間需要40-60天左右。而我們所提出的這種新方法從種子播種，培育到處理需要21天，測定葉綠素含量變化每個樣品只需5分鐘，總共時間不到22天，大大縮短了測定時間。
2.鑒定操作過程簡單易行。如果通過測定草坪型高羊茅葉片凈光合速率和光系統(tǒng)II功能來鑒定草坪型高羊茅耐熱性大小，則不僅需要花費(fèi)很長時間來熟悉操作和調(diào)試程序復(fù)雜的光合作用測定儀和光合作用效率分析儀，同時測定時小環(huán)境內(nèi)的空氣流動、光線等因素都很容易影響到測定結(jié)果。如果通過測定草坪型高羊茅葉片熱激蛋白表達(dá)和細(xì)胞抗氧化體系來鑒定草坪型高羊茅耐熱性大小，不僅需要操作的人具有相當(dāng)專業(yè)知識背景和較高的實(shí)驗(yàn)技能，更為復(fù)雜的是需要花很多的時間在溶液配制、蛋白提取純化甚至抗原抗體的獲得等程序上，另外測定時小環(huán)境內(nèi)的溫度等因素對酶和蛋白的影響及其巨大。而我們所提出的這種新方法只需分別隨機(jī)采集0.1克想要鑒定的高羊茅草坪草幼苗的常溫下和高溫脅迫下培育的健康葉片，用10ml80％丙酮研磨提取后，提取液在操作簡便的可見光分光光度計下測定即可，測定時小環(huán)境因素對測定結(jié)果影響很小，而且對操作的人的專業(yè)知識背景和實(shí)驗(yàn)技能要求極低。
3.實(shí)驗(yàn)成本低，儀器要求簡單，易推廣。雖然通過測定凈光合速率，光系統(tǒng)II功能，熱激蛋白表達(dá)和細(xì)胞抗氧化體系可以鑒定高羊茅草坪草的耐熱性大小，但這些方法需要使用光合作用測定儀，光合作用效率分析儀，蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)和酶標(biāo)儀等大型昂貴設(shè)備，而且所需藥品也異常昂貴。相比之下，我們提出的該方法所需試劑和實(shí)驗(yàn)儀器為價格低廉的80％丙酮和可見光分光光度計，試劑成本和儀器要求大大降低，很容易推廣。
具體實(shí)施例方式
1.實(shí)施例1“美洲虎3號”是耐熱性極高的草坪型高羊茅品種。選擇優(yōu)質(zhì)“美洲虎3號”種子播種在裝有普通沙子、粘土和營養(yǎng)土(體積比1∶3∶3)的盆中，在常溫下培育18天后，部分植株移入白天溫度為35±0.5℃，夜間溫度為30±0.5℃，光照量子為150μmol m-2s-1，相對濕度為70％的人工氣候箱中培育3天。在培育過程中不施加任何養(yǎng)分。種子出苗前隔天噴灑少量水，出苗后常溫下培育時植株隔天澆一次透水，高溫脅迫時每天澆一次透水。分別隨機(jī)采集并稱取0.1克常溫下和高溫脅迫下培育的健康葉片，擦凈表面污物，剪碎，放入研缽中，加入少量石英沙用80％丙酮研成勻漿，提取液體用定性濾紙過濾后定容至10毫升用可見光分光光度計在663、646nm下比色測吸光值，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定四次。測定的吸光值根據(jù)發(fā)明內(nèi)容中所述公式計算出的相應(yīng)結(jié)果如表1。
由表1可以看出，“美洲虎3號”葉片脅迫下葉綠素a+b含量/常溫下a+b含量比值為0.838，此值大于0.815，說明此品種為耐熱性高的高羊茅，這與其大田觀測實(shí)際表現(xiàn)一致。
表1常溫下和高溫脅迫下培育的的“美洲虎3號”草坪型高羊茅健康葉片葉綠素a和b的含量狀況*

*上表中A646和A663分別為色素提取液在波長646nm和663nm下的吸光值；Ca和Cb分別為葉綠素a和b在提取液中的濃度；葉綠素a含量，葉綠素b含量和葉綠素a+b含量分別為葉片組織中單位鮮重的葉綠素a，b和a+b的含量2.實(shí)施例2“TF 66”是耐熱性很低的草坪型高羊茅品種。選擇優(yōu)質(zhì)“TF 66”高羊茅種子播種在裝有普通沙子、粘土和營養(yǎng)土(體積比1∶3∶3)的盆中，在常溫下培育18天后，部分植株移入白天溫度為35±0.5℃，夜間溫度為30±0.5℃，光照量子為150μmol m-2s-1，相對濕度為70％的人工氣候箱中培育3天。在培育過程中不施加任何養(yǎng)分。種子出苗前隔天噴灑少量水，出苗后常溫下培育時植株隔天澆一次透水，高溫脅迫時每天澆一次透水。分別隨機(jī)采集并稱取0.1克常溫下和高溫脅迫下培育的健康葉片，擦凈表面污物，剪碎，放入研缽中，加入少量石英沙用80％丙酮研成勻漿，提取液體用定性濾紙過濾后定容至10毫升用可見光分光光度計在663、646nm下比色測吸光值，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定四次。測定的吸光值根據(jù)發(fā)明內(nèi)容中所提公式計算出的相應(yīng)結(jié)果如表2。
由表2可以看出，“TF 66”葉片脅迫下葉綠素a+b含量/常溫下a+b含量比值為0.738，此值小于0.760，說明此品種為耐熱性低的高羊茅，這與其大田觀測實(shí)際表現(xiàn)一致。
表2常溫下和高溫脅迫下培育的“TF 66”草坪型高羊茅健康葉片葉綠素a和b的含量狀況*

*上表中A646和A663分別為色素提取液在波長646nm和663nm下的吸光值；Ca和Cb分別為葉綠素a和b在提取液中的濃度葉綠素a含量，葉綠素b含量和葉綠素a+b含量分別為葉片組織中單位鮮重的葉綠素a，b和a+b的含量
權(quán)利要求
1.一種快速鑒定草坪型高羊茅耐熱性大小的方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成(1)材料培育 把要鑒定的草坪型高羊茅品種的優(yōu)質(zhì)種子播種常溫下培育一定時間后，部分植株在高溫脅迫下培育一定時間，在培育過程中不施加任何養(yǎng)分，種子出苗前隔天噴灑少量水，出苗后常溫下培育時植株隔天澆一次透水，高溫脅迫時每天澆一次透水；(2)樣品采集和分析 分別隨機(jī)采集常溫下和高溫脅迫下培育的草坪型高羊茅健康葉片，測定葉綠素提取液的吸光值；(3)結(jié)果計算 以上測定結(jié)果根據(jù)以下公式計算葉綠素a、b的濃度葉綠素a在提取液中的濃度Ca＝12.21A663-2.81A646葉綠素b在提取液中的濃度Cb＝20.13A646-5.03A663上式中Ca和Cb單位為mg/L，A646和A663分別代表葉綠素提取液在波長646nm和663nm下的吸光值，再根據(jù)以下公式計算組織中單位鮮重的葉綠素a和b的含量 上式中葉片組織中單位鮮重的葉綠素的含量單位為mg/g，色素的濃度為Ca或Cb，提取液體積為10毫升，樣品鮮重為0.1克；(4)品種耐熱性大小鑒定 根據(jù)一特定公式再計算出一比值，該比值與兩個固定參數(shù)相比即可鑒定草坪型高羊茅品種耐熱性大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒定草坪型高羊茅耐熱性大小的方法，其特征在于(1)中種子播種基質(zhì)為普通沙子、粘土和營養(yǎng)土，體積比1∶3∶3，常溫下培育時間為18天，高溫脅迫下培育條件為白天溫度為35±0.5℃，夜間溫度為30±0.5℃，光照量子為150-200μmol m-2s-1，相對濕度為65-70％，培育時間為3天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒定草坪型高羊茅耐熱性大小的方法，其特征在于(2)中所提的提取液為80％的丙酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒定草坪型高羊茅耐熱性大小的方法，其特征在于(4)中所指的特定公式為葉片脅迫下葉綠素a+b含量/常溫下a+b含量，兩個固定參數(shù)為0.760和0.815，當(dāng)葉片脅迫下葉綠素a+b含量/常溫下a+b含量比值，大于0.815為耐熱性高的草坪型高羊茅品種，介于0.760-0.815之間的為耐熱性中等的草坪型高羊茅品種，小于0.760的為耐熱性低的草坪型高羊茅品種。
全文摘要
本發(fā)明屬于冷季型草坪草抗性鑒定生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速鑒定草坪型高羊茅耐熱性大小的新方法。把要鑒定的草坪型高羊茅品種的優(yōu)質(zhì)種子播種在裝有普通沙子、粘土和營養(yǎng)土(體積比1∶3∶3)的盆中，常溫下培育18天后，部分植株移入白天溫度為35±0.5℃，夜間溫度為30±0.5℃，光照量子為150－200μmolm
文檔編號G01N33/00GK1804584SQ200610037840
公開日2006年7月19日 申請日期2006年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月17日
發(fā)明者崔浪軍, 李建龍, 朱明 , 王加真, 潘永年 申請人:南京大學(xué)