一種風(fēng)干污泥菌劑調(diào)控高羊茅初期生長(zhǎng)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種風(fēng)干污泥菌劑調(diào)控高羊茅初期生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定雙菌種復(fù)合菌劑對(duì)高羊茅表現(xiàn)出顯著的促生效果。將污泥微生物菌劑應(yīng)用于高羊茅初期建植，能顯著促進(jìn)其生長(zhǎng)，提高光合效率，促進(jìn)葉綠素的合成。并且接種3菌種和施氏假單胞菌+里氏木霉的雙菌種復(fù)合微生物菌劑后，植株生長(zhǎng)能力、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和葉綠素的含量都明顯優(yōu)于其它菌劑處理。特別是污泥有益微生物菌種的最佳復(fù)配比例為施氏假單胞菌+里氏木霉=1:1。
【專利說(shuō)明】一種風(fēng)干污泥菌劑調(diào)控高羊茅初期生長(zhǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及風(fēng)干污泥菌劑調(diào)控高羊茅初期生長(zhǎng)的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]草坪指多年生低矮草本植物在天然形成或人工建植后經(jīng)養(yǎng)護(hù)管理而形成的相對(duì)勻稱平整并能夠提供人們休閑、游樂(lè)和適度體育運(yùn)動(dòng)的坪狀草地。草坪綠地是衡量現(xiàn)代化城市的標(biāo)準(zhǔn)之一，也是衡量經(jīng)濟(jì)發(fā)展程度的標(biāo)準(zhǔn)之一，草坪的數(shù)量與質(zhì)量在一定程度上反映了一個(gè)城市的面貌。草坪綠化規(guī)模與水平已成為衡量現(xiàn)代化城市環(huán)境質(zhì)量的重要客觀標(biāo)準(zhǔn)。目前，草坪業(yè)作為一個(gè)迅速發(fā)展的行業(yè)，越來(lái)越為社會(huì)各界所關(guān)注。
[0003]草坪作為城市園林綠化的重要組成部分，其發(fā)揮的生態(tài)效益和存在的經(jīng)濟(jì)效益已逐漸被人們所熟知。 首先，草坪作為一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)，它是一個(gè)龐大的碳源貯存庫(kù)，草坪植被可以同化大氣中的CO2，而草坪土壤同樣可以吸大氣中的CO2。有研究表明，世界上草地土壤每年可以吸收沉積0.01-0.3Gt碳。因此減少了空氣中CO2，在一定程度上減輕溫室效應(yīng)。其次，草坪所形成的致密的地表覆蓋層和草根層具有良好的防治土壤侵蝕的作用。第三，草坪具有吸附空氣中SO2及NO2等有毒害的氣體同時(shí)釋放出供人類呼吸的氧氣。第四，草坪能減緩地表的日光輻射，太陽(yáng)射到地面的熱量50%左右可以被綠色植物的蒸騰作用所吸收。第五，草坪還具有降低噪聲的作用。一塊20m寬的草坪，能減弱噪聲2分貝左右。最后，城市草坪是人類文明的產(chǎn)物，它既可以美化環(huán)境，又可以不為人們提供休息、娛樂(lè)和競(jìng)技的場(chǎng)所等重要功能。
[0004]草坪建植體系構(gòu)建是現(xiàn)代城市生態(tài)建設(shè)中必須考慮的重要內(nèi)容之一，是現(xiàn)代城市社會(huì)發(fā)展與經(jīng)濟(jì)實(shí)力的一個(gè)有力體現(xiàn)，草坪建植體系的構(gòu)建對(duì)于改善城市投資環(huán)境、吸引外資、促進(jìn)旅游等各個(gè)方面都起著不可忽略的作用，而城市中草坪綠化質(zhì)量及面積也已成為評(píng)價(jià)城市環(huán)境質(zhì)量的重要客觀標(biāo)準(zhǔn)。草坪綠化也日益受到人們的重視。
[0005]草坪對(duì)人類賴以生存的環(huán)境起著美化、保護(hù)和改善的良好作用。但是草坪草是生存于自然界的開(kāi)放植物體系，雖然其地理分布范圍廣泛，如在高溫、干旱到寒冷潮濕環(huán)境中都有分布，但其生命周期中也常遭受不良環(huán)境的影響。其中水分是制約草坪草成坪、生長(zhǎng)及維持顏色青綠的主要環(huán)境因子。特別是在干旱、半干旱地區(qū)水資源數(shù)量有限，時(shí)空分布極不均勻，從而極大地限制了綠地草坪的建植，增加了保養(yǎng)難度，草坪水分管理不當(dāng)，使其失去本來(lái)的美麗，水分脅迫還可使草坪加速老化，縮短草坪使用年限。加之，城市人工培植草坪與天然草坪相比，前者的耐旱能力較差，其草坪根系淺，攝取土壤水分和養(yǎng)分的能力不足，需要進(jìn)行人工灌溉。研究表明，在我國(guó)北方城市，年灌水量大約為0.6-1.0 m3/m2。但是我國(guó)淡水資源匱乏，人均淡水資源擁有量居世界末位，我國(guó)大多數(shù)城市普遍存在水資源缺乏現(xiàn)象，這就進(jìn)一歩加重了草坪生產(chǎn)管理中的干旱脅迫。因而對(duì)草坪草抗旱性研究對(duì)節(jié)約草坪灌溉用水，緩解城市水資源危機(jī)就顯得至關(guān)重要。
[0006]草坪的數(shù)量和質(zhì)量是城市綠化水平的重要標(biāo)志。目前，國(guó)內(nèi)草坪建植的方式多種多樣，鋪設(shè)草皮雖然建坪成本高，但見(jiàn)效快，易操作，適用于所有草坪草，被廣大綠化工作者普遍接受。北京市園林綠化局曾在2007年的首屆京津地區(qū)草皮卷產(chǎn)業(yè)論壇上表示，到2020年，北京城市綠地率將達(dá)到44%至48%。天津泰達(dá)生態(tài)園林有限公司也在此介紹，濱海新區(qū)要建成宜居生態(tài)城區(qū)，規(guī)劃2010年綠化率達(dá)額到40%，綠地覆蓋率達(dá)到35%。因此，草皮卷市場(chǎng)空間非常大。冷季型草最適宜的播種時(shí)間是夏末初秋和早春，暖季型草坪草在春末夏初。在播種后40~50d后，草皮上的草坪草的覆蓋率達(dá)95%以上時(shí)即可移坪。所以一般在五、六月份第一批草皮卷才可上市。如果能夠縮短草皮生產(chǎn)的年周期，提早草皮上市時(shí)間，可大幅提高草皮卷的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，提高人們的經(jīng)濟(jì)收入。而低溫是限制草皮生產(chǎn)周期的主要因素。冬季低溫還影響草坪草的綠期應(yīng)用范圍，降低其觀賞價(jià)值。因此，要提早草皮卷上市時(shí)間以及建植高質(zhì)量的草坪就必須深入細(xì)致地研究其抗寒性以便更好地在園林綠化中發(fā)揮其作用。 [0007]針對(duì)以上問(wèn)題，目前研究集中于選取抗逆性強(qiáng)的草坪植物、應(yīng)用保水劑、施加化學(xué)改良劑、施肥等措施。而微生物菌劑作為一種高效、環(huán)保的生物肥料，其抗病促生作用已得到認(rèn)可，其抗逆作用方面也有一定研究。
[0008]復(fù)合微生物菌劑由兩種或兩種以上且互不拮抗的微生物菌種按合適比例共同培養(yǎng)，充分發(fā)揮群體的聯(lián)合作用優(yōu)勢(shì)，取得較佳應(yīng)用效果的一種微生物制劑，此類菌劑一般具有有種類全、配伍合理、見(jiàn)效快、投資少、操作簡(jiǎn)單、不造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)保等各個(gè)領(lǐng)域。
[0009]施肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及草坪養(yǎng)護(hù)管理中很重要的措施之一。在目前大部分選用的是無(wú)機(jī)肥。無(wú)機(jī)肥雖然能夠及時(shí)補(bǔ)充土壤養(yǎng)分，但是大量使用卻能對(duì)地表水、地下水以及空氣造成污染，對(duì)環(huán)境構(gòu)成威脅。施加微生物肥料是在較低的生態(tài)影響條件下維持較高產(chǎn)量的更加和諧的一種施肥方式.比如最經(jīng)典的菌根真菌、根瘤菌、根際促生細(xì)菌等。它的優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在:1.創(chuàng)造良好的根際生態(tài)環(huán)境。2.提高土壤以及空氣造成污染的供肥能力3.對(duì)環(huán)境資源的有效利用。4.降低作物對(duì)化肥的依賴。5.抑制病蟲(chóng)害的發(fā)生。其原因一是有益細(xì)菌的大量繁殖大植物根隙區(qū)域形成優(yōu)勢(shì)種群，抑制了病原微生物生長(zhǎng)繁殖，降低了植物酶、多酚氧化酶等，參與植物的防御反應(yīng)，提高植物的抗病蟲(chóng)害能力。6.減少農(nóng)藥污染等具有重要作用。同時(shí)，以城鄉(xiāng)有機(jī)廢棄物為基質(zhì)，采用現(xiàn)代化的工業(yè)技術(shù)，制造成具有多種功能(如固氮、解磷、活鉀等)再生型復(fù)合生物肥料，將對(duì)資源的循環(huán)利用，實(shí)現(xiàn)生態(tài)經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益一體化同樣具有重要意義。
[0010]自20世紀(jì)70年代以來(lái)，歐美日本等國(guó)家或地區(qū)都相繼研制成功了一些復(fù)合菌劑，很多已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)，并形成了系列化的產(chǎn)品，主要用于處理生活污水，工農(nóng)業(yè)廢水以及其他一些化合物污染的治理。我國(guó)國(guó)內(nèi)微生物發(fā)展?fàn)顩r經(jīng)歷了從50年代到90年代，從理論到實(shí)踐，從單一菌種的利用到多個(gè)的混合應(yīng)用，產(chǎn)品也從根瘤菌劑發(fā)展到復(fù)合微生物菌劑，相繼取得了一些成果。
[0011]目前多數(shù)研究已表明，微生物制劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，且無(wú)毒、無(wú)公害、無(wú)污染，能持久均衡地供給農(nóng)作物氮磷鉀元素的，被廣泛開(kāi)發(fā)用作生物肥料。目前研發(fā)的生物菌肥的熱點(diǎn)產(chǎn)品主要包括:有機(jī)物料腐熟菌劑(也稱發(fā)酵菌劑)、土壤修復(fù)菌劑、根瘤菌劑和溶磷菌劑、煙草等經(jīng)濟(jì)作物專用的功能菌劑、生物有機(jī)肥、抗旱菌劑等。美國(guó)哥斯達(dá)黎加大學(xué)應(yīng)用EM技術(shù)來(lái)種植香蕉，有效減小了香蕉葉斑病的發(fā)生和線蟲(chóng)類的侵襲，大大提高了其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生產(chǎn)效率。[0012]另外，復(fù)合微生物菌劑在畜禽養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖方面也有很明顯的作用。復(fù)合微生物菌劑能防病抗病，提高成活率，提高生產(chǎn)性能，降低飼養(yǎng)成本，增加經(jīng)濟(jì)效，改善產(chǎn)品品質(zhì)，生產(chǎn)綠色食品。倪永珍等對(duì)雞進(jìn)行400d的EM飼喂結(jié)果表明，與對(duì)照組比較雞的死亡率平均下降了 35.5%。據(jù)石專林報(bào)道，在飼糧中添加5%的EM發(fā)酵飼料，可使肉仔雞增重提高
10.3%，料肉比下降7.8%。劉華周等試驗(yàn)也表明，蛋雞日糧中EM發(fā)酵飼料占20%時(shí)，蛋殼厚度增加6.99%，蛋白哈氏單位提高10.31%，蛋黃顏色提高1.5羅氏級(jí)。
[0013]目前，給草坪草施加微生物菌劑已有報(bào)道。真菌可以改良高羊茅、黑麥草等草坪植物的抗逆作用，提高了其抗寒性、抗旱性、抗水分脅迫以及抵抗生物危害的影響。有研究發(fā)現(xiàn)接種菌根真菌可使多年生黑麥草根系受到侵染，并可明顯增加多年生黑麥草葉片中葉綠素含量，VA菌根可促進(jìn)黑麥草對(duì)P、F e、Cu、M g、K、B、S 1、S和N等礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收，但卻使黑麥草組織中M η的濃度降低。還研究表明，在干旱的條件下，叢枝菌根的侵染、菌絲的發(fā)育均良好，接種從枝菌根后，增強(qiáng)了白三葉草的抗旱能力。有也對(duì)五種押寶桿菌進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)施加過(guò)微生物菌劑的黑麥草與沒(méi)有施加菌劑的對(duì)照相比，其株高、干重、葉綠素含量、根系體積和總表面積、根系活力等都顯著升高。
[0014]城市污泥是城市污水處理廠在各級(jí)污水處理凈化后所產(chǎn)生的含水量75%_99%的固體或者流體狀物質(zhì)。它包括污水中的泥砂、纖維、動(dòng)植物殘?bào)w等固體顆粒及其凝結(jié)的絮狀物，各種膠體、有機(jī)物及吸附的金屬元素、微生物、病菌、蟲(chóng)卵、雜草種子等綜合固體物質(zhì)。城市污泥中出現(xiàn)的微生物主要由細(xì)菌、放線菌、真菌以及原生動(dòng)物和后生動(dòng)物等，其中細(xì)菌是最主要成分，細(xì)菌主要有菌膠團(tuán)細(xì)菌和絲狀菌，數(shù)量可占污泥中微生物總量的90%-95%左右。
[0015]20世紀(jì)80年代之 前，活性污泥菌群的研究主要以傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法為主。該方法從活性污泥中發(fā)現(xiàn)的主要優(yōu)勢(shì)菌群有:動(dòng)膠桿菌屬、叢毛單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、螺菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、短桿菌屬、黃桿菌屬和假單胞菌屬等。但是后來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)，在活性污泥中經(jīng)典純培養(yǎng)方法能夠培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量只占活性污泥微生物總數(shù)的1%~15%。
[0016]20世紀(jì)80年代后期，隨著以16 S r RNA為主要基石的細(xì)菌分子分類學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)、電泳技術(shù)、克隆庫(kù)技術(shù)、熒光原位雜交和流式細(xì)胞術(shù)逐漸成為研究活性污泥菌群的主要手段，活性污泥中菌群的復(fù)雜性和多樣性也以驚人的速度被人們認(rèn)識(shí)，大量傳統(tǒng)檢測(cè)方法未能發(fā)現(xiàn)卻在活性污泥中起關(guān)鍵作用的微生物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如具有除磷作用的類紅環(huán)菌、小月菌、類Tetr asphaera的棒狀菌、俊片菌等；具有脫氮作用的反硝化生絲微菌屬、固氮弧菌屬相關(guān)菌、類硝化螺菌等；與污泥泡沫有關(guān)的諾卡氏菌形放線菌、絲狀菌和等。
[0017]復(fù)合微生物制劑是由兩種或多種微生物按合適比例共同培養(yǎng)，充分發(fā)揮群體的聯(lián)合作用優(yōu)勢(shì)，取得最佳應(yīng)用效果的一種微生物制劑。微生物制劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，且無(wú)環(huán)境污染，因此被廣泛開(kāi)發(fā)用作生物肥料。目前，利用微生物來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)的研究已有報(bào)道。王其傳等研究表明，育苗基質(zhì)中添加微生物菌劑能夠促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)，提聞產(chǎn)量。郭建斌發(fā)現(xiàn)，EM微生物制劑能增加油菜產(chǎn)量，提高葉綠素、維生素C、氨基酸以及速效磷的含量，并且能夠降低有機(jī)酸和硝態(tài)氮含量。Beneduzi和Pindi等也發(fā)現(xiàn)桿菌菌株可以促進(jìn)小麥和棉花的生長(zhǎng)。還有研究從垃圾堆肥中提取的枯草芽孢桿菌、酵母菌和放線菌對(duì)草坪植物也有很好的促生效果。
[0018]污泥是污水處理過(guò)程中產(chǎn)生的沉淀物質(zhì)，其微生物含量相當(dāng)豐富。但在復(fù)合微生物菌劑研究過(guò)程中，有關(guān)污泥內(nèi)部微生物菌種之間共生及相互影響關(guān)系，以及污泥微生物菌劑應(yīng)用對(duì)植物生長(zhǎng)和生理特性影響方面的研究較少；而在草坪植物中的應(yīng)用則更無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本技術(shù)通過(guò)提取和鑒定城市污泥中的微生物，篩選出合適的有益微生物菌株，配制成單菌種、雙菌種及三菌種的復(fù)合微生物菌劑，探索污泥微生物菌劑對(duì)高羊茅種子萌發(fā)及初期生長(zhǎng)的影響，為污泥微生物菌劑在草坪建植初期中的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明的目的在于提供一種風(fēng)干污泥菌劑調(diào)控高羊茅初期生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定雙菌種復(fù)合菌劑對(duì)高羊茅表現(xiàn)出顯著的促生效果。將污泥微生物菌劑應(yīng)用于高羊茅初期建植，能顯著促進(jìn)其生長(zhǎng)，提高光合效率，促進(jìn)葉綠素的合成。并且接種3菌種和施氏假單胞菌+里氏木霉的雙菌種復(fù)合微生物菌劑后，植株生長(zhǎng)能力、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和葉綠素的含量都明顯優(yōu)于其它菌劑處理。污泥有益微生物菌種的最佳復(fù)配比例為施氏假單胞菌+里氏木霉=1:1。為實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案:
一種污泥微生物菌劑，其特征在于它包括下述原料的任意一種:
施氏假單胞菌+里氏木霉各7.5 mL,
施氏假單胞菌+鏈霉菌各7.5 mL,
木霉+鏈霉菌各7.5 mL,
施氏假單胞菌+里氏木霉+鏈霉菌各5 mL。
[0020]本發(fā)明優(yōu)選的原料為:假單胞菌+里氏木霉的重量份數(shù)比為1:1。
[0021]本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了污泥微生物菌劑在促進(jìn)高羊茅生長(zhǎng)方面的應(yīng)用以及在提高高羊茅光合效率、促進(jìn)葉綠素合成方面的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明同時(shí)也公開(kāi)了風(fēng)干污泥菌劑調(diào)控高羊茅初期生長(zhǎng)的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行:
(1)材料的選擇:
城市污泥取自污水處理廠；草坪草選擇高羊茅arundinacea L.);供試土壤取自5-15 cm表層土壤,土壤質(zhì)地為砂質(zhì)粘土，pH7.44,容重0.87 g/cm,有機(jī)質(zhì)含量4.68%,全氮0.21%，全磷0.15%，全鉀0.65%，有效磷22.03 mg/kg,飽和含水量0.58 mL/g ；
(2)菌株的培養(yǎng)
稱取新鮮污泥，采用稀釋分離法制備10_3、10_4、10_5、10_6的污泥懸浮液。根據(jù)所分離的微生物，取不同濃度的污泥懸浮液(真菌取10_3、10_4，放線菌取10_4、10_5，細(xì)菌取10_5、10_6)，搖勻后吸取0.2 mL加入到預(yù)先制好的平板中。真菌用馬丁氏瓊脂平板；放線菌用高氏一號(hào)瓊脂平板；細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨平板。用滅菌的涂布器涂抹均勻，每處理重復(fù)3次，28°C培養(yǎng)。根據(jù)平板內(nèi)菌落的形態(tài)、大小、色澤和生長(zhǎng)速度等特點(diǎn)，從每個(gè)樣品盡可能多的挑取單菌落劃線純化。依據(jù)菌落培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征對(duì)菌株進(jìn)行歸類并統(tǒng)計(jì)數(shù)量。確定優(yōu)勢(shì)菌株，進(jìn)行編號(hào)保存，待進(jìn)一步鑒定。
[0023](3)菌種的鑒定
鏡檢:細(xì)菌的鑒定采用革蘭氏染色法，放線菌采用印片法，絲狀真菌直接鏡下觀察。
[0024]PCR鑒定:直接挑取單菌體溶于100 UL高純水中，沸水中煮10 min裂解菌體，使DNA釋放出來(lái)，直接作為PCR反應(yīng)的模版。細(xì)菌和放線菌采用通用引物27f (5’ 一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG—3，)和 1492R(5’一GGTTACCTTGTTACGACTT — 3，)進(jìn)行PCR擴(kuò)增 16SrRNA基因。真菌采用真菌核糖體18S rDNA的通用引物ITSl (5，一TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4 (5，— TCCTCCGCTTATTGATATGC 一3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序如下:940C 2 min,94°C I min,57°C I min,72°C I min，25 個(gè)循環(huán)；72°C 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上用BLAST軟件與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)種屬的16S rDNA和18S rDNA序列進(jìn)行同源性比較。
[0025](4)菌劑的配制
選取對(duì)植物生長(zhǎng)有利的細(xì)菌、真菌、放線菌各I種，分別為假單胞菌、木霉和鏈霉菌，將分離出的菌種純化培養(yǎng)2代，取活化菌種，接入裝有200 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min適溫培養(yǎng)，選用600 nm波長(zhǎng)進(jìn)行比濁測(cè)定，以菌懸液的0D600 nm值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制微生物的生長(zhǎng)曲線。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種，配制成菌劑。
[0026](5)菌劑的配制:
選取假單胞菌、木霉和鏈霉菌，配制成以下菌劑:①施氏假單胞菌15 mL，②里氏木霉15mL，③鏈霉菌15 mL，④施氏假單胞菌+里氏木霉各7.5 mL，⑤施氏假單胞菌+鏈霉菌各7.5mL，⑥里氏木霉+鏈霉菌 各7.5 mL，⑦施氏假單胞菌+里氏木霉+鏈霉菌各5 mL ；
(6)草坪建植:
在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中加入100 g滅菌土壤，均勻撒入0.5 g飽滿的高羊茅種子，室溫種植，每天早晚各澆I次水，待植物生長(zhǎng)到10 d后，將上述不同處理的微生物菌劑各15ml以澆灌的形式加入植物培養(yǎng)體系中，草坪植物培養(yǎng)期間，溫度為2(T25°C，相對(duì)濕度為35~50%，光照為透入室內(nèi)的自然光，持續(xù)處理30 d后測(cè)定各指標(biāo)。
[0027]本發(fā)明更加詳細(xì)的制備方法如下:
I研制材料與方法
1.1材料
城市污泥取自天津紀(jì)莊子污水處理廠；草坪草選擇高羊茅arundinaceaL.);供試土壤取自天津師范大學(xué)校園內(nèi)5-15 cm表層土壤,土壤質(zhì)地為砂質(zhì)粘土，pH7.44,容重0.87 g/cm,有機(jī)質(zhì)含量4.68%，全氮0.21%，全磷0.15%，全鉀0.65%，有效磷22.03 mg/kg，飽和含水量0.58 mL/g。
[0028]1.2菌株的培養(yǎng)
稱取新鮮污泥，采用稀釋分離法制備10_3、10_4、10_5、10_6的污泥懸浮液。根據(jù)所分離的微生物，取不同濃度的污泥懸浮液(真菌取10_3、10_4，放線菌取10_4、10_5，細(xì)菌取10_5、10_6)，搖勻后吸取0.2 mL加入到預(yù)先制好的平板中。真菌用馬丁氏瓊脂平板；放線菌用高氏一號(hào)瓊脂平板；細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨平板。用滅菌的涂布器涂抹均勻，每處理重復(fù)3次，28°C培養(yǎng)。根據(jù)平板內(nèi)菌落的形態(tài)、大小、色澤和生長(zhǎng)速度等特點(diǎn)，從每個(gè)樣品盡可能多的挑取單菌落劃線純化。依據(jù)菌落培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征對(duì)菌株進(jìn)行歸類并統(tǒng)計(jì)數(shù)量。確定優(yōu)勢(shì)菌株，進(jìn)行編號(hào)保存，待進(jìn)一步鑒定。
[0029]1.3菌種的鑒定
鏡檢:細(xì)菌的鑒定采用革蘭氏染色法，放線菌采用印片法，絲狀真菌直接鏡下觀察。
[0030]PCR鑒定:直接挑取單菌體溶于100 UL高純水中，沸水中煮10 min裂解菌體，使DNA釋放出來(lái)，直接作為PCR反應(yīng)的模版。細(xì)菌和放線菌采用通用引物27f (5’ 一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG—3，)和 1492R(5’一GGTTACCTTGTTACGACTT — 3，)進(jìn)行PCR擴(kuò)增 16SrRNA基因。真菌采用真菌核糖體18S rDNA的通用引物ITSl (5，一TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4 (5，— TCCTCCGCTTATTGATATGC 一3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序如下:940C 2 min,94°C I min,57°C I min,72°C I min，25 個(gè)循環(huán)；72°C 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上用BLAST軟件與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)種屬的16S rDNA和18S rDNA序列進(jìn)行同源性比較。
[0031]1.4菌劑的配制
選取對(duì)植物生長(zhǎng)有利的細(xì)菌、真菌、放線菌各I種，分別為假單胞菌、木霉和鏈霉菌，將分離出的菌種純化培養(yǎng)2代，取活化菌種，接入裝有200 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min適溫培養(yǎng)，選用600 nm波長(zhǎng)進(jìn)行比濁測(cè)定，以菌懸液的0D600 nm值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制微生物的生長(zhǎng)曲線。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種，配制成以下菌劑:①假單胞菌15 mL，②木霉15 mL，③鏈霉菌15 mL，④假單胞菌+木霉各7.5 mL，⑤假單胞菌+鏈霉菌各7.5 mL,⑥木霉+鏈霉菌各7.5 mL,⑦假單胞菌+木霉+鏈霉菌各5 mL。
[0032]1.5草坪建植
在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中加入100 g滅菌土壤，均勻撒入0.5 g飽滿的高羊茅種子。室溫種植，每天早晚各澆I次水。待植物生長(zhǎng)到IOd后，將上述不同處理的微生物菌劑各15ml以澆灌的形式加入植物培養(yǎng)體系中，對(duì)照組加入相同量的無(wú)菌液體培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。草坪植物培養(yǎng)期間，溫度為2(T25°C，相對(duì)濕度為35~50%，光照為透入室內(nèi)的自然光，持續(xù)處理30 d后測(cè)定各指標(biāo)。 [0033]同時(shí)，另取鋪有濾紙的培養(yǎng)皿，加入上述不同處理的微生物菌劑，對(duì)照組加入相同量的清水。每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻撒入50粒飽滿的高羊茅種子，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，以測(cè)定種子的萌發(fā)率。
[0034]1.6指標(biāo)測(cè)定
1.6.1種子萌發(fā)指標(biāo)測(cè)定
萌發(fā)測(cè)定:發(fā)芽期間，每日記錄種子萌發(fā)情況以及發(fā)芽粒數(shù)(以當(dāng)天胚根、胚芽都達(dá)到種子本身長(zhǎng)度為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn))，測(cè)定發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)。發(fā)芽率:種子胚根長(zhǎng)出并超過(guò)種子長(zhǎng)度一半視為萌發(fā)，每天觀察種子萌發(fā)情況并進(jìn)行記錄，以發(fā)芽末期連續(xù)7d發(fā)芽不超過(guò)1%時(shí)為限。發(fā)芽率(ft?)=(每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))X 100%。萌發(fā)7 d測(cè)定發(fā)芽指數(shù)，發(fā)芽指數(shù)O Σ矽，其中為發(fā)芽指數(shù)，Gt為在t日的發(fā)芽種子數(shù)，/?為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。
[0035]1.6.2幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定
株高動(dòng)態(tài):接種菌劑處理10 d后，每5 d進(jìn)行一次株高測(cè)定，直至第30天收割進(jìn)行最后一次株高測(cè)量。
[0036]地上鮮重和干重、根長(zhǎng)、根干重測(cè)定方法:將草坪植物齊根剪下，用電子天平稱量鮮重，80°C烘干至恒重，測(cè)量地上部干重。每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)抽取10株的根，測(cè)量根長(zhǎng)，然后置烘箱中80°C烘至恒重，測(cè)量根干重；
葉綠素含量的測(cè)定:取0.1 g葉片，剪成1-2 mm碎片，浸泡于丙酮:乙醇(V:V=1:1)溶液中24小時(shí),浸泡液為待測(cè)液。用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)633 nm和645 nm下測(cè)量吸光值,并根據(jù)公式計(jì)算葉綠素含量。[0037]結(jié)果計(jì)算:
【權(quán)利要求】
1.一種污泥微生物菌劑，其特征在于它包括下述原料的任意一種: 施氏假單胞菌+里氏木霉各7.5 mL, 施氏假單胞菌+鏈霉菌各7.5 mL, 里氏木霉+鏈霉菌各7.5 mL, 施氏假單胞菌+里氏木霉+鏈霉菌各5 mL。
2.權(quán)利要求1所述的污泥微生物菌劑，其中所述的原料為:施氏假單胞菌:里氏木霉的重量份數(shù)比為1:1。
3.權(quán)利要求1所述污泥微生物菌劑在促進(jìn)高羊茅生長(zhǎng)方面的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述污泥微生物菌劑在提高高羊茅光合效率方面的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述污泥微生物菌劑在促進(jìn)葉綠素合成方面的應(yīng)用。
6.一種風(fēng)干污泥菌劑調(diào)控高羊茅初期生長(zhǎng)的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行: (1)材料的選擇: 城市污泥取自污水處理廠；草坪草選擇高羊茅arundinacea L.);供試土壤取自5-15 cm表層土壤,土壤質(zhì)地為砂質(zhì)粘土，pH7.44,容重0.87 g/cm,有機(jī)質(zhì)含量4.68%,全氮0.21%，全磷0.15%，全鉀0.65%，有效磷22.03 mg/kg,飽和含水量0.58 mL/g ； (2)菌劑的配制: 選取假單胞菌、木霉和鏈霉菌，配制成以下菌劑:①施氏假單胞菌15 mL，②里氏木霉15mL，③鏈霉菌15 mL，④施氏假單胞菌+里氏木霉各7.5 mL，⑤施氏假單胞菌+鏈霉菌各7.5mL，⑥里氏木霉+鏈霉菌各7.5 mL，⑦施氏假單胞菌+里氏木霉+鏈霉菌各5 mL ； (3)草坪建植: 在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中加入100 g滅菌土壤，均勻撒入0.5 g飽滿的高羊茅種子，室溫種植，每天早晚各澆I次水，待植物生長(zhǎng)到10 d后，將上述不同處理的微生物菌劑各15ml以澆灌的形式加入植物培養(yǎng)體系中，草坪植物培養(yǎng)期間，溫度為2(T25°C，相對(duì)濕度為35~50%，光照為透入室內(nèi)的自然光，持續(xù)處理30 d后測(cè)定各指標(biāo)。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103937730SQ201410191158
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月8日
【發(fā)明者】趙樹(shù)蘭, 多立安, 王志旭 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)