專利名稱：抑制纖連蛋白表達(dá)的反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程藥物領(lǐng)域，具體地說是一種靶向纖連蛋白(fibronectin)治療乙型肝炎病毒(HBV)感染的反義寡核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列、結(jié)構(gòu)及其治療藥物。
背景資料HBV感染嚴(yán)重威脅人類的健康，是導(dǎo)致肝炎、肝硬化、肝癌的重要原因。目前仍然缺乏特別有效的治療藥物，因此新型抗HBV藥物具有重大的社會和經(jīng)濟(jì)效益。
國外文獻(xiàn)報(bào)道人肝中的纖連蛋白在體內(nèi)可能以一種種屬限制性的方式與HBV通過前S2區(qū)編碼的抗原決定簇結(jié)合(Budkowska A，Bedossa P，Groh F.；J Virol 1995 Feb；69(2)840-8)；P.A.Norton等發(fā)現(xiàn)HBxAg可激活fibronectin的表達(dá)(P.A.Norton，H.M.G.P.V.Reis，Journal of Viral Hepatitis，2004，11，332-341)。本實(shí)驗(yàn)室通過篩選和驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)fibronectin在抗HBV感染中具有很好的特異性和可藥性，可發(fā)展成為抗HBV治療的潛在作用靶點(diǎn)。
ASODN是一類經(jīng)過人工合成的寡核苷酸片段，長度多為15～30個(gè)核苷酸。通過堿基互補(bǔ)的原理，干擾相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，或者整個(gè)基因組的復(fù)制，其優(yōu)點(diǎn)在于其理論上的高度靶特異性，是一種理想的具有精確選擇性的基因靶向治療藥物。由于ASODN作用的高度特異性，因此被認(rèn)為是極具潛力的抗腫瘤和抗病毒新藥。國外已有一些著名制藥企業(yè)已將反義藥物作為其新藥研究開發(fā)的重點(diǎn)方向之一。
本發(fā)明的目的是，根據(jù)已公開的fibronectin基因mRNA序列，設(shè)計(jì)針對fibronectin的ASODN，通過抑制fibronectin的表達(dá)，阻止HBV感染，抑制HBV復(fù)制和表達(dá)，為治療慢性HBV感染提供新的特效的藥物。
主要內(nèi)容本發(fā)明的主要內(nèi)容是，通過檢索GeneBank中的核酸序列數(shù)據(jù)庫，選擇NCBI公布的fibronectin mRNA參考序列X02761，對其進(jìn)行RNA二級結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模擬，選擇了5個(gè)不穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)作為ASODN的作用靶點(diǎn)。通過與GeneBank聯(lián)機(jī)blast序列比對，所選擇的靶序列均具有很好的特異性，不會干擾人類其它正常基因的表達(dá)。在自動DNA合成儀上合成硫代反義寡核苷酸序列(S-ASODN)。采用轉(zhuǎn)染有HBV DNA，可穩(wěn)定表達(dá)HBV蛋白和完整Dane氏顆粒的HepG2.2.15細(xì)胞模型，對上述ASODNs進(jìn)行活性篩選和評價(jià)。結(jié)果顯示5條ASODNs中，F(xiàn)N1，F(xiàn)N5在0.8μmol/L時(shí)對HBV DNA，HBsAg，HBeAg，fibronectin蛋白具有明顯的抑制作用，且對HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制活性大于拉米夫定的抑制活性。在0.2-0.8μmol/L濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)N1，F(xiàn)N5對HBV DNA，HBsAg，HBeAg以及fibronectin蛋白具有特異性的劑量依賴性抑制活性。
硫代反義寡核苷酸序列及性質(zhì)編號 名稱 靶位(nt) 長度(nt) 性質(zhì)反義序列(5’-3’)1 FN12188-2207 20AGCT CAT CTC CCT CCT CAC TC2 FN26478-6497 20ATTC GTT CCC ACT CAT CTC CA3 FN320-40 20ACTG GGG CTG AAC CAT TTG CT4 FN44704-4723 20AGCC TTC AAT AGT CAT TTC TG5 FN56607-6626 20AGAC GGT CCC ACT TCT CTC CA6 FN1s 2188-2207 20SGAG TGA GGA GGG AGA TGA GC7 FN5s 6607-6626 20STG GAG AGA AGT GGG ACC GTCA反義；S正義根據(jù)本發(fā)明，抑制fibronectin的表達(dá)可特異性抑制乙肝病毒的復(fù)制和表達(dá)，fibronectin有可能成為治療及預(yù)防HBV相關(guān)疾病的新型藥物作用靶點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明，針對fibronectin mRNA的ASODNs能特異性抑制乙肝病毒的復(fù)制和表達(dá)，有可能成為治療及預(yù)防HBV相關(guān)疾病的新型生物工程藥物。
根據(jù)本發(fā)明，反義寡核苷酸的長度與其細(xì)胞通透性，與靶序列結(jié)合親和性及作用特異性等因素相關(guān)，F(xiàn)N1，F(xiàn)N5的長度根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定，本發(fā)明包含了與FN1，F(xiàn)N5具有相同序列的任何長度寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，為增強(qiáng)反義寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及組織靶向性等，本發(fā)明包含了FN1，F(xiàn)N5的硫代修飾。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物可按本領(lǐng)域已知方法配成非腸道給藥的制劑。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物治療組成可應(yīng)用單獨(dú)的有效成分或組合物形式包括聯(lián)合其他反義寡核苷酸及其衍生物形式。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的治療組成，依不同情況包括特定藥物的藥物動力學(xué)、藥代動力學(xué)、給藥模式、給藥途徑、受者的年齡、體重、肝腎功能狀態(tài)、疾病的性質(zhì)、程度及治療時(shí)限等，以適宜的劑量給藥。
本發(fā)明的實(shí)施對嚴(yán)重危害人類健康的乙型肝炎及其相關(guān)疾病的治療具有重要的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
結(jié)合圖表
本發(fā)明的具體實(shí)施方法圖1 fibronectin mRNA在HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞以及HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)藥物處理前后的表達(dá)變化情況圖2 fibronectin蛋白在HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞以及HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)藥物處理前后的表達(dá)變化情況圖3硫代fibronectin反義寡核苷酸序列對HepG2.2.15細(xì)胞中HBV DNA的抑制作用圖4硫代fibronectin反義寡核苷酸序列對HepG2.2.15細(xì)胞中HBsAg的抑制作用圖5硫代fibronectin反義寡核苷酸序列對HepG2.2.15細(xì)胞中HBeAg的抑制作用圖6硫代fibronectin反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5對HepG2.2.15細(xì)胞中fibronectin蛋白的抑制作用圖7硫代fibronectin反義寡核苷酸序列FN1對HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響圖8硫代fibronectin反義寡核苷酸序列FN5對HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響圖9硫代fibronectin反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5及其正義序列對HepG2.2.15細(xì)胞中fibronectin蛋白的抑制作用圖10硫代fibronectin反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5及其正義序列對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用圖11硫代fibronectin反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5及其正義序列對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制作用圖12硫代fibronectin反義寡核苷酸序列FN1對HepG2.2.15細(xì)胞中fibronectin蛋白的抑制作用呈劑量依賴性圖13硫代fibronectin反義寡核苷酸序列FN5對HepG2.2.15細(xì)胞中fibronectin蛋白的抑制作用呈劑量依賴性圖14硫代fibronectin反義寡核苷酸序列FN1對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制作用呈劑量依賴性圖15硫代fibronectin反義寡核苷酸序列FN5對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制作用呈劑量依賴性圖16 5條硫代fibronectin反義寡核苷酸序列及性質(zhì)圖17硫代反義寡核苷酸FN1，F(xiàn)N5的正義序列及性質(zhì)
實(shí)施例一材料與方法1.藥物配制拉米夫定用PBS溶解至終濃度為10mmol/L；阿地福韋藥物用DMSO溶解至終濃度為100mmol/L，加藥時(shí)用培養(yǎng)液稀釋至1mmol/L，以保證DMSO在培養(yǎng)液中的濃度不高于0.1％；IBE5用DMSO溶解至終濃度為250mg/mL。
2.細(xì)胞培養(yǎng)所用細(xì)胞為肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞株以及轉(zhuǎn)染有HBV DNA的HepG2.2.15細(xì)胞株。HepG2.2.15細(xì)胞來源于HepG2細(xì)胞，含有整合的HBV DNA，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中可持續(xù)穩(wěn)定地向培養(yǎng)液中分泌Dane氏顆粒以及HBsAg，HBV DNA等。HepG2細(xì)胞用含有10％胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，HepG2.2.15細(xì)胞用含有10％胎牛血清，380μg/mlG418(Promega)的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。
3.細(xì)胞加藥待HepG2.2.15細(xì)胞長滿后1∶3傳代，48小時(shí)后換用含2％FBS的MEM培養(yǎng)液，同時(shí)加入拉米夫定，阿地福韋或IBE5。拉米夫定終濃度為25μmol/L，阿地福韋終濃度為1μmol/L，IBE5終濃度為250μg/ml，同時(shí)設(shè)立相應(yīng)的對照組細(xì)胞。加藥后4天換含有等濃度藥物的細(xì)胞培養(yǎng)液，第8天收集細(xì)胞。
4.RT-PCR檢測fibronectin mRNA在HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞以及經(jīng)藥物處理的HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)情況待HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞長滿或HepG2.2.15細(xì)胞加藥后第8天，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗兩遍后，按照Trizol試劑盒(Invitrogen)說明書提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量，OD260/280在1.8-2.0之間，RNA甲醛變性電泳顯示無降解。然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，具體方法如下各取總RNA 1μg，OligodT(15)0.5μg，RNA酶抑制劑(40U)0.1μl，共10.3μl，混勻，70℃溫育10min，立即冰上冷卻。加入第一鏈反應(yīng)緩沖液5μl，DTT 2.5μl，RNA酶抑制劑0.7μl，dNTP(A、G、C、T10mM)1.0μl，混勻，42℃反應(yīng)2min，加入逆轉(zhuǎn)錄酶superscriptII0.5μl，42℃溫育1h，最后70℃變性15min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物取0.5μl作為PCR擴(kuò)增的模板，以看家基因GAPDH作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行雙重PCR。靶基因fibronectin上游引物為5’TAGCCCTGTCCAGGAGTTCA3’，下游引物為5’CTGCAAGCCTTCAATAGTCA3’，擴(kuò)增片斷為307bp。GAPDH的上游引物為5’ACCACAGTCCATGCCATCAC3’，下游引物為5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’，擴(kuò)增片斷449bp。PCR反應(yīng)體系總體積20μl，上下游引物終濃度為1μM，Mg2+濃度1.5mM，加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.5μl，Taq 1U。PCR循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性2min，94℃20s，61℃30s，72℃20s，循環(huán)22次，最后72℃延伸2min。2％瓊脂糖凝膠(Sigma)電泳檢測。
5.Western印跡方法檢測fibronectin在HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞以及經(jīng)藥物處理的HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)情況待HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞長滿或HepG2.2.15細(xì)胞加藥后第8天，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗兩遍后，RIPA-PICT(Pharmacia)法提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后將各提取物調(diào)至相同濃度。每孔30-50μg總蛋白，10％聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(PROTRANBA-S 83 Reinforced NC，Schleicher & Schuell)上。4℃封閉過夜，封閉液組成10％脫脂奶粉，1×TBST。然后與鼠抗人fibronectin抗體(Santa cruz)或鼠抗人β-actin抗體(Sigma)結(jié)合1h，TBST洗膜3次，每次10min，再與辣根過氧化酶標(biāo)記的抗鼠二抗(中山)結(jié)合1h，TBST洗膜3次，每次10min，ECL(Pharmacia)顯色系統(tǒng)顯色，X光片曝光。
結(jié)果1.Fibronectin mRNA在HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞以及經(jīng)藥物處理的HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)情況等量的HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄PCR后，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測表達(dá)情況，看家基因GAPDH作為內(nèi)標(biāo)。結(jié)果如圖1中所示，在HepG2細(xì)胞中幾乎檢測不到fibronectin mRNA的表達(dá)，而在HepG2.2.15細(xì)胞中其表達(dá)水平與GAPDH表達(dá)水平接近。在25μmol/L拉米夫定以及250μg/ml IBE5處理后，HepG2.2.15細(xì)胞中fibronectin mRNA表達(dá)明顯下調(diào)。但在1μM阿地福韋處理后HepG2.2.15細(xì)胞中fibronectin mRNA表達(dá)只發(fā)生微弱下調(diào)。圖1中control代表fibronectin mRNA在對照組細(xì)胞中的相對表達(dá)情況；lamivudine、adefovir以及IBE5代表fibronectin mRNA分別在三種藥物處理組細(xì)胞中的相對表達(dá)情況；HepG2、HepG2.2.15代表fibronectin mRNA在HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞中的相對表達(dá)情況。
2.Fibronectin蛋白在HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞以及經(jīng)藥物處理的HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)情況圖2中顯示，fibronectin蛋白在HepG2.2.15細(xì)胞中相對表達(dá)量較高，而在HepG2細(xì)胞中幾乎檢測不到Fibronectin蛋白的表達(dá)。25μmol/L拉米夫定以及250μg/mlIBE5處理HepG2.2.15細(xì)胞后Fibronectin蛋白明顯下調(diào)，1μmol/L阿地福韋處理后HepG2.2.15細(xì)胞中Fibronectin蛋白表達(dá)微弱下調(diào)。
結(jié)論Fibronectin在HBV感染后表達(dá)上調(diào)，而在藥物干預(yù)后表達(dá)明顯下調(diào)，因此可能成為治療及預(yù)防HBV相關(guān)疾病的新型藥物作用靶點(diǎn)。
實(shí)施例二材料與方法1.S-ASODN的設(shè)計(jì)和合成檢索GeneBank中的核酸序列數(shù)據(jù)庫，選擇NCBI公布的fibronectin mRNA參考序列X02761，通過對其進(jìn)行基于多預(yù)測RNA二級結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，選擇了5個(gè)不穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)作為ASODN的作用靶點(diǎn)。通過與GeneBank聯(lián)機(jī)blast序列比對，所選擇的靶序列均具有很好的特異性，不會干擾人類其它正常基因的表達(dá)(見圖16)。所有寡核苷酸均采用ABI8909型自動DNA合成儀合成并在合成時(shí)進(jìn)行硫代修飾，過程如下將硫代試劑(Beaucage regent，Transgenomic)溶于無水乙腈中使其終濃度為1g/100ml，置于DNA合成儀的AUX位置處，采用合成儀上提供的DNA硫化程序進(jìn)行自動合成硫代寡核苷酸。合成完畢濃氨水55℃切割并脫保護(hù)15小時(shí)后，經(jīng)Micro Pure II反相純化柱(Oligo Prep OP120，SAVANT)純化，紫外定量后真空干燥，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>
2.ASODN轉(zhuǎn)染Hep2.2.15細(xì)胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培養(yǎng)液中，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將Hep2.2.15細(xì)胞接種6孔板，1.5×105細(xì)胞/孔，37℃，5％CO2孵育48-72小時(shí)，待長至40-60％細(xì)胞匯合后，在無血清狀態(tài)下，采用脂質(zhì)體Lipofectin(Invitrogen，1mg/ml)試劑并參照說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染。反義寡核苷酸的濃度分別為0.2μM、0.4μM、0.8μM并設(shè)細(xì)胞對照、脂質(zhì)體對照。轉(zhuǎn)染22小時(shí)后，換正常細(xì)胞培養(yǎng)液(含10％FBS的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液)，37℃，5％CO2孵育72小時(shí)。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，-20℃保存?zhèn)溆?。提取Hep2.2.15細(xì)胞總RNA(Trizol RNA提取試劑盒，Invitrogen)以及Hep2.2.15細(xì)胞總蛋白，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>
3.ASODN對Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用檢測取細(xì)胞培養(yǎng)液，100℃煮沸15min，12000r/min離心10min，取上清作為熒光定量PCR的模板，實(shí)驗(yàn)過程按本實(shí)驗(yàn)室建立的復(fù)合探針PCR定量檢測HBV的方法操作(何云燕，王升啟等，中華肝臟病雜志，2001，V9N6376-377)。定量檢測HBV DNA的引物序列為P15’-GGAGTA TGG ATT CGC ACT CCT C-3’；P25’-TTG TTG TTG TAG GGG ACC TGC CT-3’；熒光探針序列F5’-ACT TCC GGA AAC TAC TGT TAG ACG A-3’；淬滅探針序列Q5’-GTA GTT TCCGGA AGT-3’。20μl反應(yīng)體系含200nmol/L引物，670nmol/L熒光探針F，180nmol/L淬滅探針，200μmol/LdNTP，4.0mmol/L的Mg2+，2μl模板，混勻后將各反應(yīng)管與標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)管一起放入iCycle自動PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后由電腦自動計(jì)算出定量結(jié)果。
4.ASODN對Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg，HBeAg的抑制作用檢測取收集好的細(xì)胞培養(yǎng)液，按照HBsAg，HBeAgELISA檢測試劑盒(華美公司)說明書操作步驟檢測。取50μl細(xì)胞培養(yǎng)液加入乙肝表面抗原或e抗原包被的96孔板中，每孔加入50μl表面抗原或e抗原對應(yīng)的酶標(biāo)結(jié)合物，37℃孵育1h后，用洗液洗板5次，加入顯色液A50μl，再加入顯色液B50μl，37℃孵育15min，加入終止液50μl，在多標(biāo)記檢酶聯(lián)免疫檢測儀(VICTORTMWallac 1420 Multilabel Counter，Wallac)上測定450nm處1s吸光值A(chǔ)。根據(jù)IR＝(A450對照-A450給藥)/A450對照計(jì)算抑制率。
5.ASODN對Hep2.2.15細(xì)胞中fibronectin蛋白的抑制作用檢測RIPA-PICT(Pharmacia)提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后將各提取物調(diào)至相同濃度。然后進(jìn)行western印跡實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法參考實(shí)施例一。
結(jié)果1.ASODN對Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用靶向ASGPR mRNA的五條反義序列FN1-FN5，分別以0.8μM給藥處理Hep2.2.15細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對照，脂質(zhì)體對照以及陽性藥拉米夫定對照組，72小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞中分泌的HBV DNA拷貝數(shù)，按照公式IR＝(C加藥組-C細(xì)胞對照組)/C細(xì)胞對照組計(jì)算抑制率，公式中IR代表抑制率，C代表檢測出的細(xì)胞培養(yǎng)液中HBV DNA拷貝數(shù)。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算抑制率的平均值。圖3中C代表細(xì)胞對照組，LIP代表脂質(zhì)體對照組，其對HBVDNA的抑制率接近0，沒有明顯的抑制作用。LAM10、LAM25分別代表10μM、25μM拉米夫定對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用。FN1-FN5代表五條反義序列在0.8μM時(shí)對HBVDNA的抑制作用，從圖中可顯示，F(xiàn)N1、FN5對HBV DNA的抑制作用大于等于25μM拉米夫定對細(xì)胞培養(yǎng)液中HBV DNA的抑制作用。
2.ASODN對Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用靶向ASGPR mRNA的五條反義序列FN1-FN5，分別以0.8μM加藥處理HepG2.2.15細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對照、脂質(zhì)體對照以及陽性藥拉米夫定對照組，72小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，HBsAgELISA檢測試劑盒檢測Hep2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg的表達(dá)情況，根據(jù)公式IR＝(A加藥組-A細(xì)胞對照組)/A細(xì)胞對照組計(jì)算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各檢測孔在450nm的吸光度。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算抑制率的平均值，見圖4。圖中LIP代表脂質(zhì)體對照組對細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用，顯示沒有明顯抑制作用。LAM代表25μM拉米夫定對細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用，抑制率大于50％。FN1-FN5代表五條反義序列對細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用，其中FN1，F(xiàn)N5的平均抑制率大于50％，且大于25μM拉米夫定對細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用。
3.ASODN對Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制作用靶向ASGPR mRNA的五條反義序列FN1-FN5，分別以0.8μM給藥處理Hep2.2.15細(xì)胞，72小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，HBeAgELISA檢測試劑盒檢測Hep2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液中HBeAg的表達(dá)情況，根據(jù)公式IR＝(A加藥組-A細(xì)胞對照組)/A細(xì)胞對照組計(jì)算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各檢測孔在450nm的吸光度。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算抑制率的平均值，見圖5。圖中，LIP代表脂質(zhì)體對照組對細(xì)胞分泌HBeAg的抑制作用，顯示沒有明顯抑制作用。LAM代表25μM拉米夫定對細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用，抑制率大于50％。FN1-FN5代表五條反義序列對細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用，其中FN1，F(xiàn)N5的平均抑制率大于50％，且與25μM拉米夫定對細(xì)胞分泌HBsAg的抑制率接近。
4.ASODN對細(xì)胞fibronectin蛋白的抑制作用靶向fibronectin mRNA的五條反義序列FN1-FN5，分別以0.8μM給藥處理Hep2.2.15細(xì)胞，72h后提取總蛋白，10％聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以β-actin(43kD)為對照，通過Western Blot方法檢測硫代反義寡核苷酸對靶蛋白ASGPR表達(dá)量的影響。由圖6可見，F(xiàn)N1，F(xiàn)N5可顯著抑制fibronectin蛋白的表達(dá)，F(xiàn)N2，F(xiàn)N4對fibronectin蛋白無明顯抑制作用，F(xiàn)N3對fibronectin蛋白無抑制作用。
結(jié)論1.抑制fibronectin的表達(dá)可以抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV的復(fù)制和表達(dá)2.五條硫代fibronectin反義寡核苷酸序列中，F(xiàn)N1，F(xiàn)N5具有明顯的抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV復(fù)制和表達(dá)的作用。
實(shí)施例三材料與方法1.ASODN的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)實(shí)施例二結(jié)果，選擇效果較好的反義寡核苷酸序列FN1、FN5，合成其正義寡核苷酸(見圖17)。所有硫代寡核苷酸的合成同實(shí)施例二。
2.硫代反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5的細(xì)胞毒性檢測Hep2.2.15細(xì)胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，接種96孔板，0.75×105細(xì)胞/孔，37℃，5％CO2孵育48-72小時(shí)，待長至40-60％細(xì)胞匯合后，在無血清狀態(tài)下，采用脂質(zhì)體Lipofectin(Invitrogen，1mg/ml)試劑并參照說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染。反義寡核苷酸FN1，F(xiàn)N5的濃度分別為0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、10μM并設(shè)細(xì)胞對照，每濃度重復(fù)三孔。轉(zhuǎn)染22小時(shí)后，換正常細(xì)胞培養(yǎng)液(含10％FBS的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液)，37℃，5％CO2孵育72小時(shí)后，參照MTS(Promega)使用說明書，每孔加入MTS20μl/100μl培養(yǎng)液，37℃避光孵育1.5小時(shí)，在多標(biāo)記檢酶聯(lián)免疫檢測儀490nm檢測吸光度。同時(shí)，轉(zhuǎn)染ASODN后每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
3.硫代反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5的特異性考察硫代反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5及其正義序列FN1s，F(xiàn)N5s分別以0.8μM轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同實(shí)施例二。收集培養(yǎng)液，提取總RNA和總蛋白，參照實(shí)施例一、例二的方法，檢測FN1，F(xiàn)N5及其正義序列對細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg，HBeAg的抑制作用，F(xiàn)N1，F(xiàn)N5及其正義序列對fibronectin蛋白的抑制作用。
4.硫代反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5的劑量依賴性檢測硫代反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5以0.2μM、0.4μM、0.8μM轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同實(shí)施例一。收集培養(yǎng)液，提取總蛋白，參照實(shí)施例一、例二的方法，檢測FN1，F(xiàn)N5不同濃度對細(xì)胞培養(yǎng)液中HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制作用以及對fibronectin蛋白的抑制作用。
結(jié)果1.硫代反義寡核苷酸FN1，F(xiàn)N5對HepG2.2.15細(xì)胞增值的影響硫代反義寡核苷酸FN1，F(xiàn)N5以0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、10μM處理細(xì)胞過程中，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，加藥組細(xì)胞形態(tài)與對照組細(xì)胞形態(tài)沒有顯著變化。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果見圖7、圖8。圖中顯示，在0.2μM-10μM范圍內(nèi)，F(xiàn)N1、FN5各劑量組OD值與正常細(xì)胞對照基本相同。
2.硫代反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5的特異性硫代反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5及其正義序列FN1s，F(xiàn)N5s分別以0.8μM轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，收集培養(yǎng)液，ELISA檢測試劑盒檢測培養(yǎng)液中HBsAg、HBeAg的表達(dá)情況，設(shè)對照細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg、HBeAg的含量為100％，實(shí)驗(yàn)組中HBsAg、HBeAg的含量則為A實(shí)驗(yàn)組/A細(xì)胞對照組×100％，其中A表示在450nm的吸光度。結(jié)果見圖10，11。圖中顯示FN1，F(xiàn)N5的正義硫代寡核苷酸序列(FN1s，F(xiàn)N5s)處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg、HBeAg與正常細(xì)胞對照無顯著差異(P≥0.05)。而硫代反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5具有很好的抑制作用(抑制率≥50％)。同樣，在硫代反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5及其正義序列FN1s，F(xiàn)N5s分別以0.8μM轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后72小時(shí)，提取總蛋白，western檢測結(jié)果顯示FN1s，F(xiàn)N5s處理細(xì)胞組fibronectin蛋白表達(dá)與對照組基本一致，而FN1，F(xiàn)N5顯示出很好的抑制fibronectin蛋白表達(dá)的作用(見圖9)。
3.硫代反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5對HBV復(fù)制和表達(dá)影響的劑量依賴性。
硫代反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5以0μM、0.2μM、0.4μM、0.8μM給藥處理HepG2.2.15細(xì)胞后，收集培養(yǎng)液，熒光定量PCR檢測培養(yǎng)液中HBV DNA的拷貝數(shù)，ELISA檢測試劑盒檢測培養(yǎng)液中HBsAg、HBeAg的表達(dá)情況，根據(jù)實(shí)施例二中的公式分別計(jì)算抑制率。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算抑制率的平均值。如圖14和圖15，F(xiàn)N1，F(xiàn)N5對細(xì)胞培養(yǎng)液中HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制作用隨著硫代反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5濃度的增加而遞減，顯示出很明顯的劑量依賴關(guān)系。同樣，在0μM、0.2μM、0.4μM、0.8μM FN1，F(xiàn)N5處理細(xì)胞后72小時(shí)，提取總蛋白，western印跡技術(shù)檢測fibronectin蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖12、13所示，隨著FN1，F(xiàn)N5濃度的增加，fibronectin蛋白表達(dá)量逐漸減少，0.8μM時(shí)，F(xiàn)N5處理細(xì)胞組幾乎檢測不到fibronectin蛋白的表達(dá)。
結(jié)論1.硫代反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5對HepG2.2.15細(xì)胞的增殖沒有明顯的影響2.硫代反義寡核苷酸序列FN1，F(xiàn)N5具有序列特異的抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV的復(fù)制和表達(dá)的作用3.在0.2-0.8μmol/L濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)N1，F(xiàn)N5對HBV DNA，HBsAg，HBeAg以及fibronectin蛋白具有特異性的劑量依賴性抑制活性。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所<120>抑制纖連蛋白(fibronectin)表達(dá)的反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途<130>
<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>
<400>1gctcatctcc ctcctcactc 20<210>2<211>20<212>DNA<213>
<400>2ttcgttccca ctcatctcca 20<210>3<211>20<212>DNA<213>
<400>3ctggggctga accatttgct 20<210>4<211>20<212>DNA<213>
<400>4gccttcaata gtcatttctg 20<210>5<211>20<212>DNA<213>
<400>5gacggtccca cttctctcca 20
權(quán)利要求
1.纖連蛋白(fibronectin)為抗乙型肝炎病毒感染的藥物作用靶點(diǎn)
2.與fibronectin mRNA(GeneBank接受號X02761)互補(bǔ)的寡核苷酸，分布在5’非編碼區(qū)和編碼區(qū)，其長度是10-30個(gè)堿基并包含下列序列的寡核苷酸硫代反義寡核苷酸序列及性質(zhì)序號 名稱Fibronecti 長度 特性序列(5’-3’)n靶位(nt)(nt)1 FN1 2188-220720 AGCT CAT CTC CCT CCT CAC TC2 FN2 6478-649720 ATTC GTT CCC ACT CAT CTC CA3 FN3 20-4020 ACTG GGG CTG AAC CAT TTG CT4 FN4 4704-472320 AGCC TTC AAT AGT CAT TTC TG5 FN5 6607-662620 AGAC GGT CCC ACT TCT CTC CA
3.根據(jù)權(quán)利要求書2中的寡核苷酸，其最佳序列為FN1，F(xiàn)N5
4.根據(jù)權(quán)利要求書2中的寡核苷酸，經(jīng)不同化學(xué)修飾后，可以用于治療乙型肝炎及相關(guān)性疾病。
5.權(quán)利要求書3中的寡核苷酸化學(xué)修飾物可以是硫代修飾。
6.權(quán)利要求4中經(jīng)化學(xué)修飾后的寡核苷酸可以制成各種不同的劑型，通過不同的給藥途徑用于乙型肝炎及其相關(guān)性疾病的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的抗乙型肝炎病毒靶標(biāo)及相應(yīng)的反義寡核苷酸藥物的結(jié)構(gòu)和用途。具體說是靶向纖連蛋白(fibronectin)抗乙型肝炎病毒(HBV)反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途。Fibronectin是人肝臟竇狀隙的細(xì)胞外基質(zhì)成分，有文獻(xiàn)報(bào)道fibronectin可與乙肝病毒的前S2區(qū)以一種種屬特異性的方法結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選并通過驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)fibronectin具有較好的特異性和可藥性。因此，本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合成了靶向fibronectin的反義寡核苷酸，采用HepG2.2.15細(xì)胞，對5條反義寡核苷酸進(jìn)行了活性篩選及評價(jià)，首次發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)于fibronectin mRNA特定功能區(qū)域的寡核苷酸FN1，F(xiàn)N5在培養(yǎng)的HepG2.2.15細(xì)胞中能有效地抑制乙型肝炎的復(fù)制和表達(dá)。因此，本發(fā)明涉及到靶向fibronectin mRNA抗HBV感染的反義寡核苷酸的序列與結(jié)構(gòu)及其成為治療乙型肝炎病毒相關(guān)性疾病，減小乙型肝炎相關(guān)性疾病危害性的新型藥物。
文檔編號C12N15/12GK1651575SQ200410073618
公開日2005年8月10日 申請日期2004年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月2日
發(fā)明者王升啟, 楊靜, 伯曉晨, 丁曉然, 張敏麗 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所