專利名稱：制備哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在Fusarium venenatum宿主菌株中制備哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的方法。
背景技術(shù)：
蛋白水解酶具有廣泛的商業(yè)應(yīng)用，并成功地在工業(yè)中實(shí)現(xiàn)，諸如清潔劑，皮革，化學(xué)，農(nóng)業(yè)，藥物，食物和乳制品工業(yè)。
胰蛋白酶是哺乳動(dòng)物來源的蛋白水解酶，并可用于商業(yè)。例如來自豬胰腺的胰腺胰蛋白酶，可用于食品功能性(functionality)工業(yè)以及皮革工業(yè)中在中性和堿性條件下軟化生皮(hide)和皮膚(skin)。
胰蛋白酶優(yōu)選在賴氨酸和精氨酸的L-異構(gòu)體的肽鍵C-末端側(cè)進(jìn)行切割。胰蛋白酶被合成為已知具有氨基-末端信號(hào)肽以指導(dǎo)分泌胰蛋白酶原的前體，以及沉默酶活性直到其經(jīng)過蛋白水解被去除并同時(shí)活化酶的原肽。所述原肽的切割需要高度特異性絲氨酸蛋白內(nèi)切酶即腸激酶(enterokinase)(腸肽酶(enteropeptidase))的活化，所述腸激酶通過切割序列(Asp)4-Lys活化胰蛋白酶原(Lavallie等，1993，Journal of Biological Chemistry2682331-23317)。
美國專利5,945,328公開了豬胰蛋白酶在米曲霉宿主菌株中的表達(dá)。WO 01/55429公開了在大腸桿菌和酵母中制備和純化重組人胰蛋白酶原以及胰蛋白酶的方法。WO 00/17332公開了在大腸桿菌中重組產(chǎn)生的胰蛋白酶和胰蛋白酶原類似物以及其核酸，所述核酸含有胰蛋白酶原前導(dǎo)序列的修飾，使得所述胰蛋白酶原不能被胰蛋白酶或胰蛋白酶-樣酶切割。WO99/10503公開了大腸桿菌中將胰蛋白酶原作為包涵體進(jìn)行重組制備的方法，其中所述胰蛋白酶原包含不天然存在但被胰蛋白酶的活性形式識(shí)別的自我切割位點(diǎn)。然而，微生物系統(tǒng)中哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的表達(dá)未在商業(yè)水平實(shí)現(xiàn)，且因此本領(lǐng)域需要提供微生物中更適宜的表達(dá)系統(tǒng)來制備商業(yè)量的哺乳動(dòng)物胰蛋白酶。
本發(fā)明的目的是提供在Fusarium venenatum宿主中制備哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及制備哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的方法，所述方法包括(a)在適宜表達(dá)所述哺乳動(dòng)物胰蛋白酶并將其分泌到培養(yǎng)基中的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述Fusarium venenatum宿主菌株，其中所述Fusariumvenenatum宿主菌株包含含有核酸序列的核酸構(gòu)建體，所述核酸序列編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的成熟編碼序列并與編碼Fusarium oxysporum胰蛋白酶原的信號(hào)肽和原肽的SEQ ID NO1的核苷酸58-129可操作連接；和(b)從所述培養(yǎng)基中回收所述哺乳動(dòng)物胰蛋白酶。
本發(fā)明還涉及核酸序列的構(gòu)建體，所述核酸序列編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的成熟編碼序列并與編碼Fusarium oxysporum胰蛋白酶原的信號(hào)肽和原肽的SEQ ID NO1的核苷酸58-129可操作地連接、以及涉及包含所述構(gòu)建體的載體和Fusarium venenatum宿主菌株。
附圖簡述

圖1A和1B顯示基因組DNA序列以及Fusarium oxysporum胰蛋白酶原-樣蛋白(分別為SEQID NOS1和2)的推定的氨基酸序列。
圖2A，2B和2C顯示豬胰蛋白酶原的cDNA序列和推定的氨基酸序列(分別為SEQ ID NOS3和4)。
圖3顯示pCaHj522的限制酶切圖譜。
圖4顯示pRaMB58的限制酶切圖譜。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及在Fusarium venenatum宿主菌株中制備哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的方法，所述方法包括(a)在適宜表達(dá)所述哺乳動(dòng)物胰蛋白酶并將其分泌到培養(yǎng)基中的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述Fusarium venenatum宿主菌株，其中所述Fusarium venenatum宿主菌株包含含有核酸序列的核酸構(gòu)建體，所述核酸序列編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的成熟編碼序列，并且其與編碼Fusariumoxysporum胰蛋白酶原的信號(hào)肽和原肽的SEQ ID NO1的核苷酸58-129可操作連接；和(b)從所述培養(yǎng)基中回收所述哺乳動(dòng)物胰蛋白酶。
本發(fā)明優(yōu)選提供在絲狀真菌(filamentous fungal)宿主菌株中制備哺乳動(dòng)物胰蛋白酶特別是豬胰蛋白酶的方法，其中該酶的原前(prepro)形式被正確加工成成熟的活性胰蛋白酶。
術(shù)語“胰蛋白酶”定義為催化羧酸酰胺水解的內(nèi)切肽酶，其優(yōu)選在Arg或Lys(E.C.3.4.21.4)L-異構(gòu)體的C末端進(jìn)行切割。本發(fā)明術(shù)語“胰蛋白酶”指成熟酶，即活性胰蛋白酶而無氨基末端信號(hào)肽和原肽。胰蛋白酶可作為具有指導(dǎo)分泌的氨基-末端信號(hào)肽以及原肽被分泌，所述原肽沉默酶活性直到其被去除并同時(shí)活化酶。該酶的前體形式已知為胰蛋白酶原。
為本發(fā)明的目的，胰蛋白酶活性利用N-α-苯甲酰-L-精氨酸對(duì)硝基苯胺hydrochloride作為底物根據(jù)Gaertner和Puigserver，1992，Enzyme Microb.Technol.14150的方法，在25℃利用2mg N-α--苯甲酰-L-精氨酸對(duì)硝基苯胺hydrochloride每ml 100mM MOPS緩沖液，4mMCaCl2，0.01％TritonX-100，pH7.5測定。所述活性在405nm監(jiān)測。一個(gè)單位的胰蛋白酶活性定義為25℃，pH6.5時(shí)每分鐘水解1.0μ摩爾N-α-苯甲酰-L-精氨酸。
哺乳動(dòng)物胰蛋白酶/胰蛋白酶原本發(fā)明，編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶或胰蛋白酶原的核酸序列可獲自任何哺乳動(dòng)物來源。與給定來源一起使用的術(shù)語“獲自”指核酸序列編碼的胰蛋白酶通過該來源或插入了來自所述來源的核酸序列的細(xì)胞來制備。
用于分離或克隆編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶或胰蛋白酶原的核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括從基因DNA分離，從cDNA制備或其組合。多種技術(shù)可得，包括例如雜交，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，或DNA重新合成(de novo DNA synthesis)。所述核酸序列可為基因組，cDNA，RNA，半合成，合成來源或其任何組合。
所述克隆方法可涉及切除并分離所需的核酸片段，所述核酸片段包含編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶或胰蛋白酶原的核酸序列，將所述片段插入載體分子，以及將所述重組載體摻入Fusarium venenatum宿主菌株，在所述宿主菌株中多拷貝或克隆的核酸序列將被復(fù)制。
靶向胰蛋白酶原基因的任何適宜區(qū)的寡核苷酸引物可用于基因的PCR擴(kuò)增。見例如Innis等，1990，PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplication，Academic Press，New York。所述PCR擴(kuò)增包含模板DNA，適宜的酶，引物和緩沖液，并在DNA熱循環(huán)儀中方便地進(jìn)行。cDNA可分離自從任何哺乳動(dòng)物組織構(gòu)建的文庫，所述組織表達(dá)胰蛋白酶原基因。在適宜載體諸如質(zhì)?；蚴删w構(gòu)建cDNA文庫以便在原核或真核細(xì)胞中增殖的方法是本領(lǐng)域已知的。(見例如Sambrook，1989，上文)。例如，自適宜的組織分離mRNA，并合成第一條cDNA鏈。第二輪(round)DNA鏈合成用于產(chǎn)生第二條鏈。所述雙鏈cDNA可克隆入任何適宜的載體，例如質(zhì)粒等，從而形成cDNA文庫。
分離的核酸序列可通過直接化學(xué)合成制備，諸如Narang等，1979，Methods of Enzymology 6890-99的磷酸三酯法；Brown等，1979，Methods ofEnzymology 68109-151的磷酸二酯法；Beaucage等，1981，TetrahedronLetters 221859-1862的二乙基亞啉酰胺(diethylphophoramdite)法；以及Beaucage and Carothers，1981，Tetrahedron Letters 221859-1862的固相磷酰胺三酯法?；瘜W(xué)合成通常產(chǎn)生單鏈寡核苷酸，其可通過與互補(bǔ)序列雜交或通過利用單鏈作為模板與DNA聚合酶發(fā)生聚合而被轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶或胰蛋白酶原的核酸序列可以是，但不限于下組之一胰蛋白酶/胰蛋白酶原登錄號(hào)牛胰腺胰蛋白酶原 Genbank X54703母牛胰腺胰蛋白酶原 Genbank AF453325狗胰腺胰蛋白酶原 Genbank M11589，M11590人胰蛋白酶原I Swissprot P07477人胰腺胰蛋白酶IGenbank M22612人胰腺胰蛋白酶II Genbank M27602人胰腺胰蛋白酶原IIIGenbankX15505人胰腺胰蛋白酶原Va Genbank X72781人胰腺胰蛋白酶原IVbGenbank X71345小鼠胰腺胰蛋白酶 GenbankAB017030，AB017032豬胰蛋白酶原 GenbankAAT49878大鼠胰腺胰蛋白酶原IGenbankV01273大鼠胰腺胰蛋白酶原II GenbankV01274大鼠胰腺胰蛋白酶 GenbankJ00778
大鼠胰蛋白酶VaGenbank X59012大鼠胰蛋白酶VbGenbank X59013在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼的哺乳動(dòng)物胰蛋白酶或胰蛋白酶原是豬胰蛋白酶原或胰蛋白酶。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所編碼的哺乳動(dòng)物胰蛋白酶或胰蛋白酶原是豬胰蛋白酶原(Geneseqn AAT49878)。
Fusarium venenatum宿主菌株本發(fā)明的方法中，任何Fusarium venenatum菌株可用作制備哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的宿主菌株。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)usarium venenatum宿主菌株是Fusariumvenenatum A3/5以及Fusarium venenatum的分類學(xué)對(duì)等物(無論它們現(xiàn)在已知的種類名稱是什么)，F(xiàn)usarium venenatum A3/5最初保藏為Fusariumgraminearum ATCC 20334，并且最近由Yoder和Christianson，1998，F(xiàn)ungalGenetics and Biology 2362-80以及O’Donnell等，1998，F(xiàn)ungal Genetics andBiology 2357-67分類為Fusarium venenatum。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)usarium venenatum宿主菌株是Fusariumvenenatum A3/5或Fusarium venenatum ATCC 20334的形態(tài)突變體，如WO97/26330所公開那樣。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)usarium venenatum宿主菌株是單端孢霉烯(trichothecene)缺陷的Fusarium venenatum宿主菌株。見例如美國專利6,180,366。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)usarium venenatum宿主菌株是cyclohexadepsipepie缺陷的Fusarium venenatum宿主菌株。見例如WO00/42203。
核酸構(gòu)建體本文的“核酸構(gòu)建體”定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然基因或經(jīng)修飾含有結(jié)合或相鄰的核酸片段(所述核酸片段不以其它形式出現(xiàn)在天然環(huán)境)。術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語表達(dá)盒同義，條件是所述核酸構(gòu)建體含有所有表達(dá)編碼序列所需的控制序列。本文術(shù)語“編碼序列”是被轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成多肽的序列。所述基因組編碼序列的邊界通常由ATG起始密碼子到終止子來確定，所述起始密碼子位于mRNA 5’末端的開放可讀框起始處，所述終止密碼子后面是恰好位于該mRNA 3’末端的開放可讀框的下游的轉(zhuǎn)錄終止序列。編碼序列包括，但不限于，基因組，cDNA，RNA，半合成，合成，重組或其任何組合。
本發(fā)明的方法中，所述核酸構(gòu)建體包含核酸序列，所述核酸序列編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的成熟編碼序列并與編碼Fusarium oxysporum胰蛋白酶原的信號(hào)肽(核苷酸58-111)和原肽(核苷酸112-129)的SEQ ID NO1的核苷酸58-129可操作連接。所述SEQ ID NO1的序列可獲自Fusariumoxysporum DSM 2672(美國專利5,693,520)。
原肽區(qū)位于哺乳動(dòng)物胰蛋白酶成熟編碼序列的氨基末端，且所述信號(hào)肽區(qū)與所述原肽區(qū)的氨基末端相鄰。
所述原肽編碼區(qū)(核苷酸112-129)編碼氨基酸序列(SEQ ID NO2的氨基酸18-24)，所述氨基酸序列在翻譯可讀框中與成熟哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的氨基末端相連。產(chǎn)生的多肽已知為原酶或原多肽。原多肽通常無活性，并可通過原肽從所述原多肽的催化或自身催化性裂解而轉(zhuǎn)化成成熟的活性多肽基因。本發(fā)明的Fusarium oxysporum原肽編碼區(qū)取代哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的天然原肽編碼區(qū)以通過Fusarium venenatum宿主菌株中的內(nèi)源蛋白酶活性對(duì)胰蛋白酶前體進(jìn)行適當(dāng)加工。
信號(hào)肽編碼區(qū)(SEQ ID NO1核苷酸58-129)編碼氨基酸序列(SEQID NO2的氨基酸1-17)，所述氨基酸序列在翻譯可讀框內(nèi)與原肽編碼區(qū)的氨基末端相連，并將胰蛋白酶原導(dǎo)入微生物的分泌途徑。本發(fā)明中，F(xiàn)usarium oxysporum信號(hào)肽編碼區(qū)取代哺乳動(dòng)物胰蛋白酶原的天然信號(hào)肽編碼區(qū)，從而將該分子指導(dǎo)入Fusarium venenatum宿主菌株的分泌途徑。
編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的分離核酸序列可通過多種方式進(jìn)一步操作，以在Fusarium venenatum宿主菌株中表達(dá)哺乳動(dòng)物胰蛋白酶。將理解所述表達(dá)涉及哺乳動(dòng)物胰蛋白酶制備中的任何步驟，包括但不限于，轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后修飾，翻譯，翻譯后修飾以及分泌。在將所述核酸序列插入載體前對(duì)其進(jìn)行操作根據(jù)所述表達(dá)載體為所需或必要的。利用克隆法修飾核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。
本文術(shù)語“控制序列”包括表達(dá)哺乳動(dòng)物胰蛋白酶所需的任何必要或有利組分。每種控制序列對(duì)于編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的核酸序列而言為天然或外來的。除了上述原肽序列和信號(hào)序列以外，控制序列還包括，但不限于前導(dǎo)序列，多腺苷酸序列，啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子。所述控制序列至少包括啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄和翻譯起始或終止信號(hào)。所述控制序列可包含接頭，以導(dǎo)入特定限制性位點(diǎn)從而易于將所述控制序列與編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的核酸序列進(jìn)行接合。本文術(shù)語“可操作地連接”表示一種結(jié)構(gòu)，其中控制序列位于相對(duì)DNA序列的編碼序列而言適當(dāng)?shù)奈恢茫沟盟隹刂菩蛄兄笇?dǎo)哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的生成。
控制序列可以是適宜啟動(dòng)子序列，即Fusarium venenatum宿主菌株可識(shí)別以便表達(dá)編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的核酸序列的核酸序列。所述啟動(dòng)子序列含有轉(zhuǎn)錄控制序列，所述序列介導(dǎo)哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的表達(dá)。所述啟動(dòng)子可為任何在Fusarium venenatum宿主菌株中顯示轉(zhuǎn)錄活性的核酸序列，包括突變的，截短的和雜合的啟動(dòng)子，并可獲自編碼與細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因。所述啟動(dòng)子前方可為本領(lǐng)域已知的活化序列和增強(qiáng)子序列。
本發(fā)明方法中指導(dǎo)所述核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的適宜啟動(dòng)子的實(shí)例為獲自編碼米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶，米赫根毛霉(Thizomucormeihei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶，黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)，米赫根毛霉脂酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶，構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶，米曲霉乙酰胺酶，F(xiàn)usariumoxysporum胰蛋白酶樣蛋白酶，F(xiàn)usarium venenatum葡糖淀粉酶啟動(dòng)子，F(xiàn)usarium venenatum Daria啟動(dòng)子，F(xiàn)usarium venenatum Quinn啟動(dòng)子，及其突變、截短和雜合的啟動(dòng)子，以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來自編碼黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因的啟動(dòng)子雜合體)。優(yōu)選實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子獲自Fusarium oxysporum胰蛋白酶樣基因啟動(dòng)子，F(xiàn)usariumvenenatum葡糖淀粉酶基因啟動(dòng)子，F(xiàn)usarium venenatum Daria基因啟動(dòng)子或Fusarium venenatum Quinn基因啟動(dòng)子。
所述對(duì)照序列也可為適宜的轉(zhuǎn)錄終止子序列，F(xiàn)usarium venenatum宿主菌株所識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列可操作地連接于編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的核酸序列的3′末端。任何在Fusarium venenatum宿主菌株起作用的終止子可用于本發(fā)明。
優(yōu)選實(shí)施方案中，所述終止子獲自編碼米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，構(gòu)巢曲霉氨基苯甲酸鹽合酶，黑曲霉α-葡糖苷酶，或Fusariumoxysporum胰蛋白酶樣蛋白酶的基因。
所述控制序列可為適宜的前導(dǎo)序列，所述前導(dǎo)序列為mRNa的非翻譯區(qū)，其對(duì)于Fusarium venenatum宿主菌株進(jìn)行的翻譯是重要的。所述前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的核酸序列的5′末端。任何在Fusarium venenatum宿主菌株中起作用的前導(dǎo)序列可用于本發(fā)明。
優(yōu)選的前導(dǎo)序列獲自編碼米曲霉TAKA淀粉酶或構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因。
所述控制序列也可為多腺苷酸序列，所述多腺苷酸序列可操作地連接于核酸序列的3′末端并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)作為將多腺苷酸殘基添加到轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號(hào)而被Fusarium venenatum宿主菌株識(shí)別。任何在Fusariumvenenatum宿主菌株中起作用的多腺苷酸序列可用于本發(fā)明。
優(yōu)選的多腺苷酸序列獲自編碼米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，構(gòu)巢曲霉氨基苯甲酸鹽合酶，或黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。
所述核酸構(gòu)建體還可包含一或多種核酸序列，所述核酸序列編碼一或多種優(yōu)選指導(dǎo)哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的表達(dá)，諸如轉(zhuǎn)錄活化物(例如反式轉(zhuǎn)錄活化物)，伴侶分子以及加工型蛋白酶。任何在Fusarium venenatum宿主菌株中起作用的因子均可用于本發(fā)明。編碼所述一或多種因子的核酸不必與編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的核酸序列串聯(lián)。
優(yōu)選加入調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列允許相對(duì)于Fusarium venenatum宿主菌株的生長調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物胰蛋白酶表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是導(dǎo)致基因?qū)瘜W(xué)或物理刺激反應(yīng)而被打開或關(guān)閉的系統(tǒng)，包括調(diào)節(jié)性化合物的存在。TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子，黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子可用作調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是允許基因擴(kuò)增的那些，例如利用重金屬擴(kuò)增的金屬硫因基因。在這樣的情況下，編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的核酸序列與所述調(diào)節(jié)序列可操作地相連。
重組表達(dá)載體本文所述各種核酸和控制序列可連接在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述載體可包括一或多個(gè)方便的限制位點(diǎn)，以允許在所述位點(diǎn)插入或取代編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的核酸序列。可選，編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的核酸序列可通過將包含所述序列的序列或核酸構(gòu)建體插入適宜表達(dá)載體中來表達(dá)。在所述表達(dá)載體的產(chǎn)生中，編碼序列位于載體中使得所述編碼序列與表達(dá)和分泌的適當(dāng)控制序列可操作連接。
所述重組表達(dá)載體可為任何DNA或RNA分子(例如質(zhì)粒，線性片段，或病毒)，其可方便地進(jìn)行DNA重組，并使得編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的核酸序列在Fusarium venenatum宿主菌株中表達(dá)。載體選擇通常有賴于所述載體與該載體將導(dǎo)入的Fusarium venenatum宿主菌株的相容性。所述載體可為線性或閉合的環(huán)形質(zhì)粒。所述載體可為自主復(fù)制載體，其為染色體外實(shí)體存在且復(fù)制不依賴染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒，染色體外元件，微型染色體或人工染色體。所述載體可含有任何保證自我復(fù)制的工具。可選，所述載體在導(dǎo)入Fusarium venenatum宿主菌株中時(shí)整合到基因組并與其整合的染色體一起復(fù)制。所述載體系統(tǒng)可為單個(gè)載體或質(zhì)粒，或兩個(gè)或兩個(gè)以上的載體或質(zhì)粒(其共同包含要導(dǎo)入Fusarium venenatum宿主菌株的所有DNA)或轉(zhuǎn)座子。
所述載體可含有一或多種可選標(biāo)記，使得容易選出轉(zhuǎn)化的Fusariumvenenatum宿主細(xì)胞。選擇標(biāo)記是基因，其提供殺生物或病毒抗性、重金屬抗性、原養(yǎng)型或營養(yǎng)缺陷型等。用于Fusarium venenatum宿主菌株的選擇標(biāo)記可選自包括但不限于以下標(biāo)記的組amdS(乙酰胺酶)，argy(鳥苷酸]氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(omithine carbamoyltransferase))，bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricin acetyltransferase))，hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycinphosphotransferase))，niaD(硝酸鹽還原酶)，pyrG(乳清酸核苷(orotidine)-5′-磷酸脫羧酶)，sC(硫酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(sulfate adenyltransferase))，andtrpC(氨基苯甲酸鹽合酶)以及來自其它物種的等價(jià)物。優(yōu)選用于Fusarium venenatum宿主菌株的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，黑曲霉或米曲霉的niaD基因，以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
所述載體優(yōu)選含有元件，所述元件允許所述載體穩(wěn)定整合到Fusariumvenenatum宿主菌株基因組或所述載體不依賴Fusarium venenatum宿主菌株基因組而在所述微生物中復(fù)制。
“導(dǎo)入”指將含有所述核酸序列的載體導(dǎo)入Fusarium venenatum宿主菌株，使得所述載體作為染色體整合體或自我復(fù)制的染色體外載體而保持。整合通常認(rèn)為有利，這是由于所述核酸序列很可能在Fusarium venenatum宿主菌株中穩(wěn)定保持。載體整合到染色體中通過同源重組，非同源重組或轉(zhuǎn)位實(shí)現(xiàn)。
將表達(dá)載體整合到Fusarium venenatum宿主菌株可涉及原生質(zhì)體形成，該原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，以及以已知方式整合細(xì)胞壁。轉(zhuǎn)化Fusarium種類的適宜方法見Malardier等，1989，Gene 78147-156和WO 96/00787。
為整合到Fusarium venenatum宿主菌株的基因組，所述載體有賴于編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的核酸序列或任何適宜通過同源或非同源重組將該載體整合到基因組中的其它元件?？蛇x，所述載體可包含其它核酸序列，以指導(dǎo)通過同源重組整合到Fusarium venenatum宿主菌株基因組中。所述其它核酸序列使得載體整合到所述基因組中染色體的精確位置。為增加在精確位置整合的可能性，所述整合元件優(yōu)選含有足量的核酸，諸如100-1,500堿基對(duì)，優(yōu)選400-1,500堿基對(duì)，最優(yōu)選800-1,500堿基對(duì)，所述核酸與對(duì)應(yīng)靶序列高度同源，以增強(qiáng)同源重組的可能性。所述整合元件可任何與Fusarium venenatum宿主菌株基因組的靶序列同源的序列。此外，所述整合元件可為非編碼型或編碼型核酸序列。另一方面，所述載體可通過非同源重組整合到細(xì)胞基因組。
為進(jìn)行自主復(fù)制，所述載體還可包含復(fù)制起點(diǎn)，使得該載體可在目的Fusarium venenatum宿主菌株中自主復(fù)制。所述復(fù)制起點(diǎn)可為在細(xì)胞中起作用的、介導(dǎo)自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。術(shù)語“復(fù)制起點(diǎn)”定義為使得質(zhì)?；蜉d體獨(dú)立于染色體復(fù)制而復(fù)制的序列。用于絲狀真菌細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例為AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 9861-67；Cullen等，1987，NucleicAcids Research 159163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分離和包含該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建可根據(jù)WO 00/24883公開的方法實(shí)現(xiàn)。
用于將本文所述元件進(jìn)行連接以構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域已知的(見例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatus，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor，New York)。
本發(fā)明另一方面，F(xiàn)usarium venenatum宿主菌株可含有一或多個(gè)基因的修飾，所述基因編碼對(duì)目的哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的制備，回收和/或應(yīng)用有害的蛋白。所述修飾減少或消除一或多種導(dǎo)致突變細(xì)胞的表達(dá)，所述突變細(xì)胞產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物胰蛋白酶比沒有所述基因的修飾并在相同條件下培養(yǎng)的突變細(xì)胞多。
所述基因可編碼任何蛋白或酶。例如，所述酶可以是氨基肽酶，淀粉酶，碳水化合物酶，羧肽酶，過氧化氫酶，纖維素酶，幾丁質(zhì)酶，角質(zhì)酶(cutinase)，環(huán)式糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，脫氧核糖核酸酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，轉(zhuǎn)化酶(invertase)，漆酶(laccase)，脂酶，甘露糖苷酶(mannosidase)，變位酶(mutanase)，氧化酶(oxidase)，溶果膠酶(pectinolytic enzyme)，過氧化物酶(peroxidase)，磷脂酶(phospholipase)，肌醇六磷酸酶(phytase)，多酚氧化酶(polyphenoloxidase)，蛋白水解酶，核糖核酸酶，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase)或木聚糖酶(xylanase)。
哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的制備和回收Fusarium venenatum宿主細(xì)胞培養(yǎng)在適宜用本發(fā)明的方法產(chǎn)生目的哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的培養(yǎng)基中。例如，所述細(xì)胞通過搖瓶培養(yǎng)或小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)，分批，補(bǔ)料分批，或固態(tài)發(fā)酵)在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐的適宜培養(yǎng)基中、并在允許哺乳動(dòng)物胰蛋白酶被表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。所述培養(yǎng)在包含碳源或氮源以及無機(jī)鹽的適宜培養(yǎng)基中，利用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。適宜培養(yǎng)基可根據(jù)公開的配方制備(例如在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)分類表中)。分泌的哺乳動(dòng)物胰蛋白酶可直接從培養(yǎng)基回收。
可利用本領(lǐng)域已知的具體用于胰蛋白酶的方法檢測哺乳動(dòng)物胰蛋白酶。這些檢測方法可包括利用特異性抗體，形成酶產(chǎn)物，酶底物的消失，SDS-PAGE或本領(lǐng)域已知任何其它方法。例如，可如本文所述利用酶實(shí)驗(yàn)測定哺乳動(dòng)物胰蛋白酶活性。
產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物胰蛋白酶可通過本領(lǐng)域已知方法分離。例如所述多肽可通過常規(guī)方法從培養(yǎng)基分離，所述方法包括，但不限于離心，過濾，提取，噴霧干燥(spray-drying)，蒸發(fā)或沉淀。分離的哺乳動(dòng)物胰蛋白酶隨后可利用本領(lǐng)域已知的各種方法純化，所述方法包括但不限于，層析(例如離子交換，親和，疏水，層析聚焦(chromatofocusing)，和大小排阻層析(sizeexclusion))，電泳(例如制備性等電子聚焦(isoelectric focusing))，差異溶解性(例如硫酸銨沉淀)，或提取(見例如，Protein Purification，J.-C.Janson andLars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。
用途根據(jù)本發(fā)明方法制備的哺乳動(dòng)物胰蛋白酶可用于多種工業(yè)中，包括清潔劑，皮革，化學(xué)，農(nóng)業(yè)，制藥，食品和乳制品工業(yè)。例如，哺乳動(dòng)物胰蛋白酶可作為清潔劑組合物的組分，如美國專利5,288,627，5,693,520和5,948,746所述。哺乳動(dòng)物胰蛋白酶也可用于食品工業(yè)的多種應(yīng)用中，例如見Owen R.Fennema，ed.，in Food Chemistry，Marcel Dekker，Inc.，New York，1985。哺乳動(dòng)物胰蛋白酶也可用作皮革工業(yè)中的軟化酶(bating enzyme)。哺乳動(dòng)物胰蛋白酶也可用于干酪制備，如美國專利5,948,746所述。
本發(fā)明進(jìn)一步通過以下實(shí)施例進(jìn)行說明，所述實(shí)施例不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例菌株和質(zhì)粒Fusarium venenatum宿主MLY-3是Fusarium venenatum菌株A3/5的形態(tài)突變體(Royer等，1999，F(xiàn)ungal Genet.Biol.2868-78)，所述MLY-3用作轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的受體菌株。Fusarium venenatumA3/5最初保藏為Fusariumgraminearum ATCC 20334，最近被Yoder and Christianson，1998，F(xiàn)ungalGenetics and Biology 2362-80and O′Donnell etaL，1998，F(xiàn)ungal Genetics ticsand Biology 2357-67重新分類為Fusarium venenatum。
核苷酸測序在Perkin-Elmer Biosystems Model 377 XL自動(dòng)DNA測許儀利用染料-終止子化學(xué)法進(jìn)行DNA測序。
介質(zhì)和溶液每升VN03RLMT包含20ml 50XVogels-24mM NaNO3，273.33g of蔗糖和15g LMT瓊脂糖。
每升50X Vogel′s含有125g檸檬酸鈉，250g KH2PO4，106.25g NaNO3，10g MgSO47H2O，5g CaCl22H2O，2.5ml生物素原液(5mg生物素，在100ml 50％乙醇中)，和5ml Vogels微量元素(trace element)溶液。
每升Vogels微量元素溶液包含50g檸檬酸，50g ZnSO4-7H2O(或2.4gZnCl2)，10g Fe(NH4)2(SO4)2-H2O(或0.68g FeCl3)，2.5g CuSO4·5H2O，0.5gMnSO4-H2O，0.5g H3BO3，和0.5g Na2MoO4-2H2O(或(NH4)2MoO4)。
BASTA top瓊脂糖包含COVE top瓊脂糖，其中補(bǔ)充了10mg/ml除莠劑Basta(Hoechst Schering，Rodovre，Denmark)。
每升RA孢子形成(sporulation)培養(yǎng)基包含50g琥珀酸，12.1g NaNO3，1g葡萄糖，20ml 50XVogels，和0.5ml 10mg/mlNaMoO4原液，pH6.0。
每升YEPG包含10g酵母提取物，20g肽胨，和20g葡萄糖。
STC包含0.8M山梨醇，25mM Tris pH8，25mMCaCl2。
SPTC波阿漢40％PEG 4000，0.8M山梨醇，25mM Tris pH8，25mMCaCl2。
每升M400培養(yǎng)基包含50g麥芽糊精，2g MgSO47H2O，2g of KH2PO4，4g檸檬酸，8g酵母提取物，2g尿素，0.5g CaCl2，和0.5ml AMG微量金屬溶液。
每升AMG微量金屬溶液包含14.3g ZnSO4-7H2O，2.5g CuSO45H2O，0.5g NiCl2，13.8g FeSO4，8.5g MnSO4，和3.0g檸檬酸。
實(shí)施例1構(gòu)建pCaHj522豬胰蛋白酶原DNA序列和推定的氨基酸序列顯示在圖2中(分別為SEQ ID NO3和4)。豬胰蛋白酶原基因作為質(zhì)粒p185上的cDNA基因克隆，如WO 97/00316所述。該cDNA基因在框內(nèi)與編碼TAKA淀粉酶信號(hào)序列的TAKA淀粉酶基因片段融合，并克隆入米曲霉表達(dá)質(zhì)粒。編碼TAKA淀粉酶信號(hào)序列的TAKA淀粉酶基因片段通過PCR從質(zhì)粒pTAKA17擴(kuò)增，見EP 0 238 023。所用曲霉表達(dá)載體pCaHj483描述于WO 98/00529。編碼TAKA淀粉酶信號(hào)序列的基因片段與編碼豬原胰蛋白酶的片段的融合利用通過重疊延伸進(jìn)行剪切來進(jìn)行(Horton等，1989，基因7761-68)。Pwo DNA聚合酶(Roche Molecular Biochemicals，Basel，Switzerland)用于根據(jù)生產(chǎn)商說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用pTAKA17質(zhì)粒制備物作為DNA模板擴(kuò)增編碼TAKA淀粉酶信號(hào)序列的PCR引物為1204645′-TTGGATCCTTTATGATGGTCGCGTGG-3′(SEQ ID NO5)1204625′-ATCCGTGGGGAAAGCCAAAGCAGGTGCCG-3′(SEQ IDNO6)利用p185質(zhì)粒作為DNA模板擴(kuò)增編碼豬原胰蛋白酶的PCR引物為1204615′-CCTGCTTTGGCTTTCCCCACGGATGATGAT-3′(SEQ ID NO7)
1204635′-TTCTCGAGTTAGTTGGCAGCGATGGT-3′(SEQ ID NO8)兩種PCR反應(yīng)加樣于1％瓊脂糖凝膠并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后從所述凝膠分離這兩種PCR產(chǎn)物?；旌螾CR產(chǎn)物并用作第三次PCR反應(yīng)中的模板，所述第三次PCR利用引物120464和120463。形成的PCR片段通過凝膠利用與另兩種PCR片段相同的方法純化。所述片段用限制酶BamHl和Xhol消化，并插入用相同酶消化的pCaHj483以形成pCaHj522(圖3)。
實(shí)施例2構(gòu)建表達(dá)載體pRaMB58構(gòu)建質(zhì)粒pRaMB58(圖4)以便在Fusarium venenatum中表達(dá)豬胰蛋白酶。首先，編碼Fusarium oxysporum胰蛋白酶原-樣蛋白的信號(hào)肽和原肽的的DNA片段(圖1；SEQ ID NO1的核苷酸58-129)利用pJRoy6(美國專利5,837,847)作為模板通過以下PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增引物9801735′-CTTCACCATGGTCAAGTTCGCT-3′(SEQ ID NO9)引物9801745′-GTTGGGGATCTCCTGAGGAGCG-3′(SEQ ID NO10)其次，圖2所示編碼成熟豬胰蛋白酶的cDNA片段(SEQ ID NO3的核苷酸75-744)利用pCaHj522和以下PCR引物擴(kuò)增引物9801755′-ATCGTCGGGGGTTACACCTGT-3′(SEQIDNO11)引物9801765′-CGTTAATTAATTCTTTAGTTGGCAGCGATGGTCTG-3′(SEQ ID NO12)所有PCR反應(yīng)利用高特異性(fidelity)Pwo DNA聚合酶并根據(jù)生產(chǎn)說明(Roche Molecular Biochemicals，Basel，Switzerland)進(jìn)行。第一PCR片段用Ncol消化，第二PCR產(chǎn)物用Pacl消化。兩種消化所得的片段通過制備性。瓊脂糖凝膠電泳利用1％瓊脂糖凝膠在50mM Tris-base-50mM硼酸鹽-1mMNa2-EDTA-2H2O(TBE)緩沖液分離，并利用Bio-Rad Prep-a-Gene Kit根據(jù)生產(chǎn)商說明(Bio-Rad，Hercules，CA)進(jìn)行純化。
純化的片段利用Ncol和Pacl消化的pSheB1(美國專利6,361,973)在三部分連接中結(jié)合。結(jié)合的混合物用于根據(jù)生產(chǎn)商說明轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10細(xì)胞(Invitrogen，San Diego，CA)，并用Ncol+Pacl消化來自轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA，然后在存在0.75kb胰蛋白酶編碼序列利用1％瓊脂糖凝膠在TBE緩沖液中進(jìn)行篩選。產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為pRaMB58(圖4)，其包含雜合編碼區(qū)，該區(qū)含F(xiàn)usarium oxysporum胰蛋白酶信號(hào)肽和原肽區(qū)以及成熟豬胰蛋白酶序列。
實(shí)施例3用pRaMB58轉(zhuǎn)化Fusarium venenatumFusarium venenatum MLY-3(Δtri5)如美國專利6,180,366所述獲得。Fusarium venenatum MLY-3的孢子的產(chǎn)生如下通過用來自補(bǔ)充了2.5％葡萄糖和2.5mM硝酸鈉的1X Vogels培養(yǎng)板(2.5％Noble瓊脂)的10個(gè)plug接種含有500ml RA孢子形成培養(yǎng)基的燒瓶，在28℃，150rpm保溫2-3天。通過MIRACLOTHTM(Calbiochem，San Diego，CA)收集孢子并在SorvallRC-5B離心機(jī)(E.I.DuPont De Nemours and Co.，Wilmington，DE)以7000rpm離心20分鐘。用無菌蒸餾水洗滌沉淀的孢子兩次，重懸于少量水中，并利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。
原生質(zhì)體的制備如下用4×107Fusarium venenatum MLY-3孢子接種100ml YEPG并在24℃、150rpm保溫16小時(shí)。以3500在Sorvall RT 6000D(E.I.DuPont De Nemours and Co.，Wilmington，DE)中離心7分鐘。用30ml 1MgSO4洗滌沉淀兩次，并重懸于1M MgSO4中的15ml 5mg/mlNOVOZYME234TM(batch PPM 4356，Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)。在24℃、150rpm保溫培養(yǎng)物至形成原生質(zhì)體。將35ml 2M山梨醇加入原生質(zhì)體消化物，并將混合物在2500rpm離心10分鐘。重懸沉淀，并用STC洗滌兩次，在2000rpm離心10分鐘以沉淀原生質(zhì)體。用血細(xì)胞儀計(jì)數(shù)原生質(zhì)體，并重懸于8∶2∶0.1的STC∶SPTC∶DMSO溶液，達(dá)終濃度1.25×107原生質(zhì)體/ml。所述原生質(zhì)體在Nalgene Cryo1℃Freezing Container(VWRScientific，Inc.，San Francisco，CA)中控速冷凍后保存在-80℃。
Fusarium venenatum MLY-3的冷凍的原生質(zhì)體在冰上解凍。將100gpRaMB58加入50ml無菌聚丙烯試管。將2ml原生質(zhì)體加入該試管，輕柔混合，并在冰上保溫30分鐘。加入220μl SPTC并在室溫保溫10分鐘，加入20ml SPTC并進(jìn)一步在室溫保溫10分鐘。加入500ml 40℃VN03RLMTtop瓊脂糖后，所述混合物導(dǎo)入直徑150ml的空板，并在室溫保溫過夜。24小時(shí)后，再將25ml 40℃VN03RLMT top瓊脂糖(含10mg BASTATM每毫升)導(dǎo)入所述板上，并在室溫保溫14天。除莠劑BASTATM中的活性成分是膦絲菌素。BASTATM得自AgrEvo(Hoechst Schering，Rodovre，Denmark)并用苯酚∶氯仿∶異戊基醇(25∶24∶1)提取兩次，并用氯仿∶異戊基醇(24∶1)提取一次，然后使用。
四個(gè)Fusarium venenatum轉(zhuǎn)化體用pRaMB58獲得。所述轉(zhuǎn)化體直接從選擇板(VN03RLMT underlay withVN03RLMT-BASTAT′覆蓋的)中選出加入125ml含25ml M400培養(yǎng)基的燒瓶并在28℃，200rpm、在平板搖床上保溫6天。也包含未轉(zhuǎn)化的受體菌株作為陰性對(duì)照。
在接種后4，5和6天時(shí)收獲1ml培養(yǎng)物上清等分試樣。利用N-α-苯甲酰-DL-精氨酸對(duì)硝基苯胺作為底物，通過微量滴定板實(shí)驗(yàn)測定各轉(zhuǎn)化體的無細(xì)胞上清液的胰蛋白酶活性。具體地，將N-α-苯甲酰-DL-精氨酸對(duì)硝基苯胺以100mg/ml溶于DMSO，并在100mM MOPS緩沖液，4mMCaCl2，0.01％Triton X-100，pH7.5(試驗(yàn)緩沖液)中以1∶50稀釋成2mg/ml溶液。水解速率利用Molecular Devices 96-孔板讀數(shù)儀(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在405nm、30℃、3分鐘通過動(dòng)力學(xué)測定。轉(zhuǎn)化體58c.1，58c.2，58c.3和58c.4產(chǎn)生明顯的胰蛋白酶活性。
表1顯示在pRaMB58轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物的胰蛋白酶活性，但所述活性未在沒有轉(zhuǎn)化的對(duì)照菌株中檢測到。最高的胰蛋白酶水平見于5天后，且其產(chǎn)量約130-200單位(每ml)。6天后，胰蛋白酶活性開始下降，提示時(shí)間較長的培養(yǎng)物的所述酶失活。
表1Fusarium venenatum轉(zhuǎn)化體搖瓶培養(yǎng)物中的胰蛋白酶表達(dá)

a一個(gè)胰蛋白單位定義為一微摩爾L-BAPNA每分鐘每ml培養(yǎng)液的水解。
來自轉(zhuǎn)化體58c.1，58c.2，58c.3和58c.4的培養(yǎng)液樣品(15μl)通過SDS-PAGE利用Novex XCellII微型儀器(Invitrogen，San Diego，CA)分析。15μl各上清樣品與等體積的Tris-甘氨酸樣品緩沖液一起(Invitrogen，SanDiego，CA)在95℃加熱5分鐘。變性的上清蛋白在10-20％Tris-甘氨酸梯度凝膠(Invitrogen，San Diego，CA)分離并用考馬斯藍(lán)染色。SDS-PAGE分析顯示轉(zhuǎn)化體58c.1，58c.2，58c.3和58c.4主要分泌表觀分子量大約23kDa(豬胰蛋白酶的預(yù)期大小)的蛋白。
實(shí)施例4Fusarium venenatum產(chǎn)生的胰蛋白酶的氨基末端測序變性的上清蛋白在10-20％Tricine SDSPAGE梯度凝膠(Invitrogen，SanDiego，CA)上分離，并利用10％甲醇，pH＝11.0中的10mM CAPS(3-[環(huán)己基氨基(cyclohexylamino)]-1-丙烷磺酸(propanesulfonic acid))、以25伏特、2小時(shí)電印跡到Novex測序級(jí)PVDF膜(Novex，San Diego，CA)。PVDF膜用40％MeOH/1％乙酸中的0.1％考馬斯藍(lán)R-250染色20秒，并在50％MeOH中脫色以觀察蛋白帶。SDS-PAGE分析顯示轉(zhuǎn)化體58c.1，58c.2，58c.3和58c.4主要分泌表觀分子量大約23kDa(豬胰蛋白酶的預(yù)期大小)的蛋白。
Fusarium venenatum轉(zhuǎn)化體58c.4的23kDa SDS-PAGE帶被切下并利用N-末端測序分析。切下蛋白的N-末端氨基酸測序在Applied Biosystems476A蛋白測序儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)上利用on-line HPLC和液相三氟乙酸(TFA)遞送進(jìn)行。乙內(nèi)酰苯硫脲(phenylthiohydantoin)-氨基酸的檢測在on-line HPLC利用緩沖液A(含3.5％四氫呋喃(tetrahydrofuran)水溶液)以及含乙酸，乙酸鈉和sodium hexanesulfonate的18ml Premix濃縮液(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)以及含乙腈的緩沖液B進(jìn)行。收集數(shù)據(jù)并用Applied Biosystems 610數(shù)據(jù)分析軟件用Macintosh llsi分析。通過對(duì)著光源觀察層析圖測定序列。
該帶的N-末端序列為IVGGYTXAAN(SEQ ID NO4的氨基酸1-10，對(duì)應(yīng)成熟豬胰蛋白酶的正確氨基酸序列)。成熟胰蛋白酶的前四個(gè)氨基酸IVGG與成熟Fusarium oxysporum胰蛋白酶-樣酶的前四個(gè)殘基(SEQ IDNO2的氨基酸25-28)相同。
本發(fā)明的描述和權(quán)利要求不受公開的具體實(shí)施方案限制，這些實(shí)施方案意圖作為本發(fā)明數(shù)個(gè)方面的說明。等同的實(shí)施方案意圖包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。事實(shí)上，除本文顯示和描述的內(nèi)容以外，本發(fā)明的各種修飾根據(jù)前述說明對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。所述修飾意圖包含在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)。如有沖突，以本發(fā)明的公開包括定義為準(zhǔn)。
本文所引用的各種參考文獻(xiàn)的內(nèi)容包含在本文作為參考。
序列表<110>諾維信生物技術(shù)公司(Novozymes Biotech，Inc.)<120>制備哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的方法<130>10333.204-WO<150>60/407170<151>2002-08-30<160>12<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>998<212>DNA<213>Fusarium oxysporum<400>1atcatcaacc actcttcact cttcaactct cctctcttgg atatctatct cttcaccatg 60gtcaagttcg cttccgtcgt tgcacttgtt gctcccctgg ctgctgccgc tcctcaggag120atccccaaca ttgttggtgg cacttctgcc agcgctggcg actttccctt catcgtgagc180attagccgca acggtggccc ctggtgtgga ggttctctcc tcaacgccaa caccgtcttg240actgctgccc actgcgtttc cggatacgct cagagcggtt tccagattcg tgctggcagt300ctgtctcgca cttctggtgg tattacctcc tcgctttcct ccgtcagagt tcaccctagc360tacagcggaa acaacaacga tcttgctatt ctgaagctct ctacttccat cccctccggc420ggaaacatcg gctatgctcg cctggctgct tccggctctg accctgtcgc tggatcttct480gccactgttg ctggctgggg cgctacctct gagggcggca gctctactcc cgtcaacctt540ctgaaggtta ctgtccctat cgtctctcgt gctacctgcc gagctcagta cggcacctcc600gccatcacca accagatgtt ctgtgctggt gtttcttccg gtggcaagga ctcttgccag660ggtgacagcg gcggccccat cgtcgacagc tccaacactc ttatcggtgc tgtctcttgg720ggtaacggat gtgcccgacc caactactct ggtgtctatg ccagcgttgg tgctctccgc780tctttcattg acacctatgc ttaaatacct tgttggaagc gtcgagatgt tccttgaata840ttctctagct tgagtcttgg atacgaaacc tgtttgagaa ataggtttca acgagttaag900aagatatgag ttgatttcag ttggatctta gtcctggttg ctcgtaatag agcaatctag960atagcccaaa ttgaatatga aatttgatga aaatattc998<210>2<211>248
<212>PRT<213>Fusarium oxysporum<400>2Met Val Lys Phe Ala Ser Val Val Ala Leu Val Ala Pro Leu Ala Ala1 5 10 15Ala Ala Pro Gln Glu Ile Pro Asn Ile Val Gly Gly Thr Ser Ala Ser20 25 30Ala Gly Asp Phe Pro Phe Ile Val Ser Ile Ser Arg Asn Gly Gly Pro35 40 45Trp Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn Ala Asn Thr Val Leu Thr Ala Ala50 55 60His Cys Val Ser Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Phe Gln Ile Arg Ala Gly65 70 75 80Ser Leu Ser Arg Thr Ser Gly Gly Ile Thr Ser Ser Leu Ser Ser Val85 90 95Arg Val His Pro Ser Tyr Ser Gly Asn Asn Asn Asp Leu Ala Ile Leu100 105 110Lys Leu Ser Thr Ser Ile Pro Ser Gly Gly Asn Ile Gly Tyr Ala Arg115 120 125Leu Ala Ala Ser Gly Ser Asp Pro Val Ala Gly Ser Ser Ala Thr Val130 135 140Ala Gly Trp Gly Ala Thr Ser Glu Gly Gly Ser Ser Thr Pro Val Asn145 150 155 160Leu Leu Lys Val Thr Val Pro Ile Val Ser Arg Ala Thr Cys Arg Ala165 170 175Gln Tyr Gly Thr Ser Ala Ile Thr Asn Gln Met Phe Cys Ala Gly Val180 185 190Ser Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Ile195 200 205Val Asp Ser Ser Asn Thr Leu Ile Gly Ala Val Ser Trp Gly Asn Gly
210 215 220Cys Ala Arg Pro Asn Tyr Ser Gly Val Tyr Ala Ser Val Gly Ala Leu225 230 235 240Arg Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ala245<210>3<211>897<212>DNA<213>豬<400>3ggaattccga acacctttgt cttgcttgcg ctcctgggag ctgctgttgc tttccccacg 60gatgatgatg acaagatcgt cgggggttac acctgtgcag caaattccat tccctaccag120gtgtccctga attctggctc ccacttctgt ggtgggtccc tcatcaacag ccagtgggtg180gtgtctgctg ctcactgcta caagtcccga atccaggtgc gtctgggaga acacaacatc240gacgtccttg agggcaatga gcaattcatc aatgccgcca agatcatcac ccaccccaat300ttcaatggaa ataccttaga taacgacatc atgctgatta aactgagctc acctgccact360ctcaacagtc gagtagcaac tgtctcactg ccaagatctt gtgcagctgc tggtaccgag420tgtctcatct ctggctgggg caacaccaaa agcagtggct ccagctaccc ttcgctcctg480caatgcctga aggcccccgt cctaagtgac agttcttgca agagttccta cccaggccag540atcaccggaa acatgatctg tgtcggcttc ctggagggtg gtaaggattc ttgccaggga600gactctggtg gccccgtggt ctgcaatgga cagctccagg gtattgtctc ttggggctat660ggctgcgccc agaaaaacaa gcctggggtc tacaccaagg tctgcaacta tgtgaactgg720attcagcaga ccatcgctgc caactaaaga atttcatttc ttcatgactc ttccctttag780tcatcttcac cttcctccca tcctgcgaac agcatctaaa taaaaacatt ttgacctgta840ccagcatcta aataaaaaca ttttgagctg tacccaaaaa aaaaaaaaag gaattcc 897<210>4<211>247<212>PRT<213>豬<400>4Ile Pro Asn Thr Phe Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ala Ala Val Ala1 5 10 15
Phe Pro Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala20 25 30Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe35 40 45Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His50 55 60Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp65 70 75 80Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr85 90 95His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile100 105 110Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser115 120 125Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly130 135 140Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln145 150 155 160Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr165 170 175Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly180 185 190Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn195 200 205Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys210 215 220Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile225 230 235 240
Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn245<210>5<211>26<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<400>5ttggatcctt tatgatggtc gcgtgg 26<210>6<211>29<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<400>6atccgtgggg aaagccaaag caggtgccg 29<210>7<211>30<212>DNA<213>豬<400>7cctgctttgg ctttccccac ggatgatgat 30<210>8<211>26<212>DNA<213>豬<400>8ttctcgagtt agttggcagc gatggt 26<210>9<211>22<212>DNA<213>Fusarium oxysporum<400>9cttcaccatg gtcaagttcg ct 22<210>10<211>22<212>DNA<213>Fusarium oxysporum<400>10gttggggatc tcctgaggag cg 22
<210>11<211>21<212>DNA<213>豬<400>11atcgtcgggg gttacacctg t 21<210>12<211>35<212>DNA<213>豬<400>12cgttaattaa ttctttagtt ggcagcgatg gtctg3權(quán)利要求
1.制備哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的方法，所述方法包括(a)在適宜表達(dá)所述哺乳動(dòng)物胰蛋白酶并將其分泌到培養(yǎng)基中的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述Fusarium venenatum宿主菌株，其中所述Fusariumvenenatum宿主菌株包含含有核酸序列的核酸構(gòu)建體，所述核酸序列編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的成熟編碼序列，并且其與編碼Fusarium oxysporum胰蛋白酶原的信號(hào)肽和原肽的SEQ ID NO1核苷酸58-129可操作地連接；和(b)從所述培養(yǎng)基中回收所述哺乳動(dòng)物胰蛋白酶。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fusarium venenatum宿主菌株是Fusarium venenatum ATCC 20334。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fusarium venenatum宿主菌株是Fusarium venenatum ATCC 20334的形態(tài)突變體。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fusarium venenatum宿主菌株是單端孢霉烯-缺陷的Fusarium venenatum菌株。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fusarium venenatum宿主菌株是cyclohexadepsipeptide-缺陷的Fusarium venenatum菌株。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸構(gòu)建體還包含獲自選自下組的基因的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶，米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶，黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)，米赫根毛霉脂酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶，構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶，米曲霉乙酰胺酶，F(xiàn)usarium oxysporum胰蛋白酶-樣酶，F(xiàn)usarium venenatum AMG，F(xiàn)usarium venenatum Daria或Fusarium venenatumQuinn基因。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸構(gòu)建體還包含獲自Fusariumoxysporum胰蛋白酶樣基因的啟動(dòng)子。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸構(gòu)建體還包含獲自選自下組的基因的終止子米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，構(gòu)巢曲霉氨基苯甲酸鹽合酶，黑曲霉α-葡糖苷酶，或Fusarium oxysporum胰蛋白酶樣蛋白酶。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸構(gòu)建體還包含獲自Fusariumoxysporum胰蛋白酶樣基因的終止子。
10.權(quán)利要求1-9之一的方法，其中所述哺乳動(dòng)物胰蛋白酶是牛，母牛，狗，人，小鼠，豬，或大鼠胰蛋白酶.
11.權(quán)利要求1的方法，其中編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的成熟編碼序列的核酸序列是SEQ ID NO3的核苷酸75-744。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的成熟編碼序列編碼SEQ ID NO4的氨基酸25-247。
13.核酸構(gòu)建體，其包含核酸序列，所述核酸序列編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的成熟編碼序列并且其與編碼Fusarium oxysporum胰蛋白酶原的信號(hào)肽和原肽的SEQ ID NO1的核苷酸58-129可操作地連接。
14.權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建體，其中編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的成熟編碼序列的核酸序列是SEQ ID NO3的核苷酸75-744。
15.權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建體，其中所述哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的成熟編碼序列編碼SEQ ID NO4的氨基酸25-247。
16.重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建體。
17.重組Fusarium venenatum宿主菌株，其包含權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建體。
18.權(quán)利要求17的Fusarium venenatum宿主菌株，其中所述Fusariumvenenatum宿主菌株是Fusarium venenatum ATCC 20334.
19.權(quán)利要求17的Fusarium venenatum宿主菌株，其中所述Fusariumvenenatum宿主菌株是Fusarium venenatum ATCC 20334的形態(tài)突變體。
20.權(quán)利要求17的Fusarium venenatum宿主菌株，其中所述Fusariumvenenatum宿主菌株是單端孢霉烯-缺陷的，cyclohexadepsipeptide-缺陷的，或單端孢霉烯缺陷的和cyclohexadepsipeptide-缺陷的Fusarium venenatum菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及在Fusarium venenatum宿主菌株中制備哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的方法，包括(a)在適宜表達(dá)所述哺乳動(dòng)物胰蛋白酶并將其分泌到培養(yǎng)基中的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述Fusarium venenatum宿主菌株，其中所述Fusarium venenatum宿主菌株包含含有核酸序列的核酸構(gòu)建體，所述核酸序列編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的成熟編碼序列并與編碼Fusarium oxysporum胰蛋白酶原的信號(hào)肽和原肽的SEQ ID NO1的核苷酸58－129可操作連接；和(b)從所述培養(yǎng)基中回收所述哺乳動(dòng)物胰蛋白酶。本發(fā)明還涉及包含核酸序列的構(gòu)建體，所述核酸序列編碼哺乳動(dòng)物胰蛋白酶的成熟編碼序列、并與編碼Fusarium oxysporum胰蛋白酶原的信號(hào)肽和原肽的SEQ ID NO1的核苷酸58－129可操作地連接，以及涉及包含所述構(gòu)建體的載體和Fusarium venenatum宿主菌株。
文檔編號(hào)C12N9/76GK1694953SQ03824737
公開日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2003年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月30日
發(fā)明者蘭迪·伯卡, 金伯利·布朗 申請(qǐng)人:諾維信生物技術(shù)公司