專利名稱：熱穩(wěn)定的葡糖淀粉酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種適合于例如淀粉轉化(例如由淀粉生產(chǎn)葡萄糖)的熱穩(wěn)定的葡糖淀粉酶。本發(fā)明還涉及所說的熱穩(wěn)定葡糖淀粉酶在各種方法中的用途，尤其是在淀粉傳統(tǒng)方法中的糖化步驟中的用途。
背景技術：
葡糖淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是催化由淀粉或有關寡糖和多糖分子的非還原端釋放出D-葡萄糖的酶。
葡糖淀粉酶是由包括黑色曲霉和泡盛曲霉在內的幾種絲狀真菌和酵母生產(chǎn)的。
在商業(yè)上，將葡糖淀粉酶用于轉化已由α-淀粉酶部分水解為葡萄糖的玉米淀粉。通過葡糖異構酶可以將葡萄糖進一步轉化成幾乎由等量的葡萄糖和果糖組成的混合物。這種混合物、或者進一步富集了果糖的混合物是在全世界商品化的通常使用的高果糖玉米糖漿。這種糖漿是世界上由酶促方法生產(chǎn)的最大噸位的產(chǎn)品。參與淀粉轉化為果糖的三種酶屬于所生產(chǎn)的最重要的工業(yè)酶之列。
就葡糖淀粉酶的商業(yè)用途而言，在高果糖玉米糖漿的生產(chǎn)中存在的主要問題之一為葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性相當差，比如可以通過商業(yè)途徑得到的黑色曲霉的葡糖淀粉酶(即由Novo Nordisk A/S銷售的AMG)。商用的曲霉屬葡糖淀粉酶不如α-淀粉酶或葡糖異構酶那樣具有熱穩(wěn)定性，并且在較低的pH值下它比α-淀粉酶或葡糖異構酶的活性更大和更穩(wěn)定。因此，必須在更低的溫度和pH下在獨立的容器中使用它。
美國專利4，247，637描述了一種分子量約為31，000 Da的熱穩(wěn)定葡糖淀粉酶，它來源于Talaromyces duponti并適合于將液化的淀粉溶液糖化為糖漿。當在70℃、pH4.5下保持10分鐘時，指出該葡糖淀粉酶保留了其最初葡糖淀粉酶活性的至少約90％。
美國專利4，587，215公開了一種來源于嗜熱踝節(jié)菌的種的分子量約為45，000 Da的熱穩(wěn)定淀粉葡糖苷酶。這種公開的淀粉葡糖苷酶(或葡糖淀粉酶)在兩個不同的階段喪失了其酶活性，即迅速衰減的最初階段、接下來是緩慢衰減的階段。在70℃(pH=5.0)下，迅速衰減的半衰期約為18分鐘，而在衰減的第二階段在1小時內沒有測量到活性的喪失。Bunni L等人(1989)《(酶微生物學技術》第11卷第370-375頁涉及由Talaromyces emersonii CBS814.70生產(chǎn)的至少一種形式的α-淀粉酶和一種形式的α-葡糖苷酶組成的胞外淀粉分解系統(tǒng)的生產(chǎn)、分離和部分鑒定。只分離、純化和鑒定了α-淀粉酶。
發(fā)明的簡要公開內容本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了一種適用于例如淀粉轉化過程中的糖化步驟的新的熱穩(wěn)定葡糖淀粉酶。
術語“葡糖淀粉酶”和“AMG”在以下是可互換使用的。
采用以下“材料與方法”部分中所述的方法，以T1／2(半衰期)測量本發(fā)明葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)從Talaromyces emersonii的一個菌株中分離、純化并鑒定了一種熱穩(wěn)定葡糖淀粉酶，該菌株目前以編號CBS 793.97保藏在真菌菌種保藏中心。
當應用于蛋白質時，術語“分離的”是指在并非其天然環(huán)境的條件下發(fā)現(xiàn)蛋白質。在一個優(yōu)選的形式中，分離的蛋白質基本上不含其它的蛋白質，特別是不含其它同源蛋白質(即“同源雜質”(見下文))。
優(yōu)選提供呈大于40％純度形式的蛋白質，更優(yōu)選呈大于60％純度形式的蛋白質。甚至更優(yōu)選的是優(yōu)選提供呈高度純化形式的蛋白質，即純度大于80％、更優(yōu)選純度大于95％并且甚至更優(yōu)選純度大于99％，其中純度是由SDS-PAGE測定的。
另外，術語“分離的酶”也可以稱作“純化的酶”。
術語“同源雜質”意指起源于同源細胞的任何雜質(例如，不是本發(fā)明多肽的另一種多肽)，其中本發(fā)明的多肽最初是從所述同源細胞中獲得的。
與諸如黑色曲霉葡糖淀粉酶(可以從Novo Nordisk A/S以商品名AMG購得)之類的現(xiàn)有技術中的葡糖淀粉酶相比，分離的葡糖淀粉酶具有非常高的熱穩(wěn)定性。正如以下實施例2中所述的那樣，測定70℃(pH 4.5)下T1/2(半衰期)約為120分鐘。正如實施例12中所述的那樣，測定在酵母中表達的重組T．emersonii AMG的T1/2約為110分鐘。
因此，在第一方面，本發(fā)明涉及一種具有葡糖淀粉酶活性的分離的酶，該酶在50 mM NaOAc，0.2 AGU/ml，pH 4.5，70℃下具有至少100分鐘的T1/2(半衰期)。
在第二方面，本發(fā)明涉及一種具有葡糖淀粉酶活性的包括SEQID Nos.1-6所示的一個或多個部分序列的酶，或SEQIDNO7中所示全長的酶，或者一種具有葡糖淀粉酶活性的與其基本同源的酶。
術語“部分序列”是指在較長的多肽序列中包含的部分多肽序列，其中所說的較長的多肽序列具有感興趣的活性。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明葡糖淀粉酶的克隆的DNA序列。
而且，本發(fā)明還涉及一種轉化淀粉或者部分水解淀粉成含有例如葡萄糖的糖漿的方法，所說的方法包括在本發(fā)明葡糖淀粉酶存在下糖化淀粉水解產(chǎn)物的步驟。
本發(fā)明的一個目的在于提供一種使液化淀粉溶液糖化的方法，其中酶促糖化作用是采用本發(fā)明的葡糖淀粉酶來實現(xiàn)的。
此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的葡糖淀粉酶在淀粉轉化過程、如在連續(xù)淀粉轉化過程中的用途。在連續(xù)淀粉轉化過程的一個實施方案中，它包括連續(xù)的糖化步驟。
本發(fā)明的葡糖淀粉酶也可以用于生產(chǎn)寡糖或特制糖漿的方法中。
最后，本發(fā)明涉及微生物Talaromyces emersonii CBS 793.97或其能夠生產(chǎn)本發(fā)明葡糖淀粉酶的突變體的分離的純培養(yǎng)物。
附圖的簡要描述

圖1顯示出用于測定本發(fā)明純化的Talaromyces emersonii CBS 793.97葡糖淀粉酶分子量(Mw)的SDS-PAGE凝膠(用考馬斯藍染色)。
1標準標記物2Q Sepharose匯集物(1.操作)3S Sepharose匯集物；圖2顯示出在60℃下在0.5％麥芽糖中Talaromyces emersonii與黑色曲霉的葡糖淀粉酶(AMG)的pH活性分布；圖3顯示出Talaromyces emersonii CBS 793.97葡糖淀粉酶相對于黑色曲霉葡糖淀粉酶(AMG)的溫度活性分布；圖4顯示出用于測定在50 mM NaOAc、0.2 AGU/ml、pH 4.5中在70℃下Talaromyces emersonii CBS 793.97葡糖淀粉酶相對于黑色曲霉葡糖淀粉酶(AMG)的T1／2(半衰期)的曲線。
圖5顯示出Talaromyces emersonii AMG基因座的序列。預測的氨基酸序列示于核苷酸序列的下面。以小寫字母表示4個內含子。在共有內含子序列下加有下劃線。在推定的信號肽和前肽的下面分別加有雙下劃線和虛線。
圖6顯示出黑色曲霉AMG(An_amg-1.pro)、米曲霉AMG(Ao_AMG.pro)和Talaromyces emersonii AMG(Tal-AMG.pro)的氨基酸序列的序列對比/比較。相同的氨基酸殘基用星號*表示。信號肽和前肽的下面分別加有單線和雙線的下劃線；圖7顯示出實施例5中所用的曲霉屬的表達盒pCaHj483；圖8顯示出用于Talaromyces emersonii AMG基因的曲霉屬表達質粒pJa1518；圖9顯示出黑色曲霉破裂(disruption)質粒的構建；圖10顯示出表達本發(fā)明Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶的兩種轉化體JaL228#5.77和HowB112#8.10的SDS-PAGE凝膠。JaL228和HowB112是未轉化的親代菌株。MWPromega’s蛋白分子；圖11顯示出在50mM NaOAc、pH 4.5、70℃和0.2 AGU/ml下測定的由黑色曲霉HowB112菌株生產(chǎn)的T．emersonii AMG的熱穩(wěn)定性(測定的T1/2為20分鐘)；圖12比較了酵母中生產(chǎn)酵母中表達的T．emersonii AMG和黑色曲霉AMG的發(fā)酵肉湯在68℃下的熱穩(wěn)定性。
圖13顯示出在70℃、pH 4.5和0.2 AGU/ml下測定酵母中產(chǎn)生的重組Talaromyces emersonii AMG之熱穩(wěn)定性的測試結果。測得T1/2約為110℃。
發(fā)明詳細公開的內容本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了一種適用于例如淀粉轉化過程中的糖化步驟中的新的熱穩(wěn)定葡糖淀粉酶。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)從Talaromyces emersonii CBS 793.97的菌株中分離、純化和鑒定了一種葡糖淀粉酶。與現(xiàn)有技術中的葡糖淀粉酶相比，這種葡糖淀粉酶證明具有非常高的熱穩(wěn)定性。
因此，在第一方面，本發(fā)明涉及一種具有葡糖淀粉酶活性的分離的酶，其中在50mM NaOAc、0.2 AGU/ml、pH 4.5中在70℃下所述酶的T1/2(半衰期)至少為100分鐘，比如介于100和140分鐘之間。
如實施例2所述，在70℃下測得分離的Talaromyces emersonii CBS793.97葡糖淀粉酶的T1/2(半衰期)約為120分鐘，而如實施例12所述酵母中生產(chǎn)的T．emersonii葡糖淀粉酶的T1/2約為110分鐘。
據(jù)發(fā)現(xiàn)分離的葡糖淀粉酶的分子量經(jīng)SDS-PAGE測定約為70 kDa。而且，采用等電聚焦測得所說酶的pI小于3.5。
等電點pI定義為這樣的一個pH值，其中在該pH值下酶分子復合物(具有可選擇地附著的金屬或其它離子)呈中性，即在該復合物上的靜電荷總數(shù)(凈的靜電荷，NEC)等于零。在該總數(shù)中，當然必須考慮到靜電荷的正電或負電的性質。
據(jù)預計具有相同有利特性的基本同源的酶可以從其它微生物中得到，其中尤其是真菌生物體如絲狀真菌，特別是可以從踝節(jié)菌屬的另一菌株中得到，其中尤其是Talaromyees emersonii的另一菌株。
保藏的微生物在以下所示的日期里，已經(jīng)將從中已分離出本發(fā)明葡糖淀粉酶的絲狀真菌菌株的分離物保藏在位于荷蘭3740 AG Baarn、郵政信箱為273的用于專利程序目的的真菌菌種保藏中心中。根據(jù)布達佩斯條約第9條，作為所說條約中的國際保藏單位的CBS足以承擔起保藏的工作。
保藏日 1997年6月2日保藏者參考號NN049253CBS的命名 CBS 793.97在確保當本專利申請未定時由授權的專利商標局官員根據(jù)37 C.F.R.§1.14與35 U.S.C§122確定的人們可以得到分離的真菌的條件下，已經(jīng)保藏了絲狀真菌Talaromyces emersonii CBS No.793.97的分離物。該保藏物代表著分離的真菌基本上純的培養(yǎng)物。當在提交了所述主題申請的副本或其后續(xù)申請的國家中外國專利法有需要時，該保藏物也是可以得到的。但是，應當了解的是在廢除由政府行為授予的專利權中，保藏物的可用性并不構成對實施所述主題發(fā)明的許可。
Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶的氨基酸序列正如以下實施例3中將要進一步描述的那樣，本發(fā)明人已經(jīng)測定了來源于Talaromyces emersonii CBS 793.97的熱穩(wěn)定葡糖淀粉酶的序列。根據(jù)本發(fā)明，踝節(jié)菌屬的AMG可能具有Asp145Asn(或D145N)的取代(采用SEQ IDNO7的編號)。
因此，本發(fā)明還涉及一種具有葡糖淀粉酶活性的包括一個或多個SEQIDNos.1-6中所示部分序列或SEQ IDNO7中所示全長序列的分離的酶，或者一種具有葡糖淀粉酶活性的與其基本同源的酶。SEQ ID NO34顯示出包括從第1位至第27位氨基酸的信號肽和前肽在內的全長序列。
蛋白質序列的同源性兩種葡糖淀粉酶之間的同源性確定為表明由第二個序列衍生出第一個序列的兩個蛋白質序列間相同的程度。通過在現(xiàn)有技術中公知的計算機程序，比如GCG程序包中提供的缺口(gap)程序(威斯康星軟件包程序手冊，第8版，1994年8月，遺傳學計算機小組，575科學道，麥迪遜市，威斯康星州，美國53711)(Needleman，S.B.與Wunsch，C.D.，(1970)《分子生物學雜志》48443-453)，可以適當?shù)販y定同源性。通過用于多肽序列比較的下列設置來使用缺口程序缺口產(chǎn)生罰分(penalty)為3.0且缺口延伸罰分為0.1。
根據(jù)本發(fā)明，“基本同源的”氨基酸序列顯示出與SEQ ID NO1-6或SEQ ID NO7中所示的部分氨基酸序列之間相同的程度優(yōu)選至少為80％、至少為90％、更優(yōu)選至少為95％、更優(yōu)選至少為97％、且最優(yōu)選至少為99％。
克隆的Talaromyces emersonii的DNA序列本發(fā)明還涉及一種編碼顯示出本發(fā)明葡糖淀粉酶活性的酶的克隆DNA序列，該DNA序列包括(a)SEQID NO33中所示DNA序列的葡糖淀粉酶編碼部分；(b)SEQID NO33中第649-2724位中所示的DNA序列或其互補鏈；(c)(a)或(b)中定義的DNA序列的類似物，所述類似物與所說DNA序列之間至少有80％是同源的；(d)在嚴格性差的條件下與包括SEQ ID NO33中第649-2724位中所示序列的雙鏈DNA探針雜交的DNA序列；(e)一種DNA序列，其中由于遺傳密碼的簡并性，該DNA序列與(b)或(f)的序列不雜交，但卻編碼與這些DNA序列之任一編碼的多肽之間具有完全相同氨基酸序列的多肽；或
(g)作為(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中詳細說明的DNA序列片段的DNA序列。
本發(fā)明AMG的成熟部分是由SEQ ID NO33的第728-2724位中的DNA序列編碼的。當在酵母(例如釀酒酵母YNG318)中表達本發(fā)明的AMG時，如實施例7中所述必須切下內含子。
DNA序列的同源性把以上提到的DNA序列的同源性確定為表明由第二個序列衍生出第一個序列的兩個序列間相同的程度。通過現(xiàn)有技術中公知的計算機程序可以適當?shù)販y定同源性，比如GCG程序包中提供的缺口程序(威斯康星軟件包程序手冊，第8版，1994年8月，遺傳學計算機小組，575科學道，麥迪遜市，威斯康星州，美國53711)(Needleman，S.B與Wunsch，C.D.，(1970)《分子生物學雜志》48，443-453)。通過用于DNA序列比較的下列設置來使用缺口程序缺口產(chǎn)生罰分為5.0，缺口延伸罰分為0.3，以上提到的類似的DNA序列編碼區(qū)與SEQID NO33中所示DNA序列的AMG編碼部分或者含有或不含內含子的葡糖淀粉酶編碼部分之間表現(xiàn)出相同的程度優(yōu)選至少為80％、更優(yōu)選至少為90％、更優(yōu)選至少為95％、更優(yōu)選至少為97％。
雜交下面詳細地描述了以上提到的定義如以上d)中限定的類似DNA序列的雜交條件，其中至少在嚴格性差的條件下、但優(yōu)選在中等或高度嚴格的條件下，所述的DNA序列與包括SEQIDNO33中第649-2748位所示序列(即AMG編碼部分)的雙鏈DNA探針進行雜交。
用于測定核苷酸探針與同源的DNA或RNA序列之間在低、中等或高度嚴格下雜交的合適實驗條件涉及預先浸泡含所述DNA片段或RNA的過濾器以便在5×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉，Sambrook等人，1989)中雜交10分鐘，在5×SSC、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等人，1989)、0.5％SDS和100μg／ml超聲處理變性的鮭精DNA(Sambrook等人，1989)的溶液中使過濾器預雜交，接下來在大約45℃下在含有濃度為10ng/ml隨機引發(fā)的(Feinberg，A.P.與Vogelstein，B.(1983)《分析生物化學》1326-13)32P-dCTP標記(比活性＞1×109cpm/μg)探針的相同溶液中雜交12小時。然后，在大約55℃下(嚴格性差)、更優(yōu)選在大約60℃下(中等嚴格)、更優(yōu)選在大約65℃下(中等/高度嚴格)、甚至更優(yōu)選在大約70℃下(高度嚴格)并且甚至更優(yōu)選在大約75℃下(非常嚴格)，在2×SSC、0.5％SDS中洗滌過濾器2次30分鐘。
采用X-光片檢測在這些條件下與寡核苷酸探針雜交的分子。
淀粉的轉化本發(fā)明提供了一種采用本發(fā)明的熱穩(wěn)定葡糖淀粉酶由淀粉生產(chǎn)葡萄糖等的方法。一般說來，該方法包括下列步驟在α-淀粉酶存在下部分水解前體淀粉，然后在葡糖淀粉酶的存在下通過斷裂開α-(1→4)和α-(1→6)糖苷鍵進一步由淀粉或有關寡糖和多糖分子的非還原端水解釋放出D-葡萄糖。
利用α-淀粉酶部分水解前體淀粉通過水解內部α-(1→4)-鍵提供了對淀粉分子的初步破壞。在商業(yè)應用中，在大約105℃的溫度下進行采用α-淀粉酶的初步水解。加工濃度非常高的淀粉，通常為30％至40％的固體。在這一升高的溫度下，通常初步水解5分鐘。然后，可以把部分水解的淀粉轉移到第二個罐中，并且在85℃至90℃的溫度下培養(yǎng)約1小時，以便產(chǎn)生10至15當量的葡萄糖(D.E.)。
一般在獨立的罐中在介于30℃與60℃之間降低的溫度下進行在葡糖淀粉酶存在下由淀粉或有關寡糖和多糖分子的非還原端進一步水解釋放D-葡萄糖的步驟。優(yōu)選地，將底物液體的溫度降至55℃與60℃之間。把溶液的pH由6至6.5降低到3與5.5之間。優(yōu)選地，溶液的pH為4至4.5。將葡糖淀粉酶加入溶液中并且反應24-72小時、優(yōu)選36-48小時。
通過使用本發(fā)明的熱穩(wěn)定葡糖淀粉酶，可以在比傳統(tǒng)分批糖化步驟更高的溫度下進行糖化步驟。根據(jù)本發(fā)明，可以在60-80℃以上的溫度范圍內進行糖化，其中優(yōu)選63-75℃。這既適用于傳統(tǒng)的分批過程(上述)，又適用于連續(xù)的糖化過程。
實際上，必須在60℃以上的溫度進行包括一個或多個膜分離步驟(即過濾步驟)的連續(xù)糖化過程，以便能夠維持相當高的垮膜通量。因此，本發(fā)明的熱穩(wěn)定葡糖淀粉酶在工業(yè)糖化過程可接受的時間段內以合理的價格提供了進行大規(guī)模連續(xù)糖化過程的可能性。根據(jù)本發(fā)明，甚至可以縮短糖化時間。
通常，本發(fā)明葡糖淀粉酶的活性在60℃-80℃的溫度下基本上要高于在傳統(tǒng)采用的30-60℃溫度下的酶活性。因此，通過升高葡糖淀粉酶工作的溫度，可以在更短的時間段內完成糖化過程，或者可以采用劑量更少的酶來完成該過程。
由于例如與可以通過商業(yè)途徑得到的黑色曲霉葡糖淀粉酶(即AMG)相比，本發(fā)明葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性是非常高的，因此在糖化過程中需要加入更少量的葡糖淀粉酶以替換掉正被滅活的葡糖淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明，在糖化過程中更多的葡糖淀粉酶保持為有活性的。此外，當在63℃以上的溫度進行糖化過程時，也減少了微生物污染的危險。
通過使用比活性(以針對麥芽糖的活性進行測量)增加了的葡糖淀粉酶，在糖化過程中可能需要更少劑量的酶。
其中可以有利地使用本發(fā)明葡糖淀粉酶的糖化過程的例子包括JP3-224493；JP1-191693；JP62-272987；和EP452，238中所述的過程。
另一方面，本發(fā)明涉及一種糖化液化淀粉溶液的方法，該方法包括采用本發(fā)明葡糖淀粉酶的酶促糖化步驟。
在本發(fā)明的方法中，可以與僅僅水解含有至少4個葡糖殘基的分子中α-(1→6)-糖苷鍵的酶結合使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶。優(yōu)選地，與支鏈淀粉酶或異淀粉酶結合使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶。在G.M.A.van Beynum等人的《淀粉轉化技術》(Marcel Dekker，紐約，1985，101-142)中列舉了用于脫支的異淀粉酶和支鏈淀粉酶的用途、所述酶的分子性質以及結合葡糖淀粉酶的所述酶潛在的用途。
另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的葡糖淀粉酶在淀粉轉化過程中的用途。
此外，可以在包括連續(xù)糖化步驟在內的連續(xù)淀粉轉化過程中使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶。
也可以以固定化的形式使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶。這適合于并且經(jīng)常用于生產(chǎn)特制糖漿(如麥芽糖糖漿)，并且進一步與果糖糖漿的生產(chǎn)相結合用來產(chǎn)生寡糖的殘液流。
也可以在生產(chǎn)用于燃料或飲料的乙醇的方法中使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶，或者可以在用于生產(chǎn)有機化合物(諸如檸檬酸、抗壞血酸、賴氨酸、谷氨酸)的發(fā)酵方法中使用所述的酶。
材料與方法材料酶
在以下所示的日期里，已經(jīng)將來源于保藏的絲狀真菌Talaromycesemersonii CBS No.793.97之葡糖淀粉酶保藏在荷蘭3740 AG Baarn、郵政信箱為273的用于專利程序目的的真菌菌種保藏中心中。根據(jù)布達佩斯條約第9條，作為所說條約中的國際保藏單位的CBS足以承擔起保藏的工作。
保藏日 1997年6月2日保藏者參考號NN049253CBS的命名 CBS 793.97來源于Boel等人在《EMBO J.》(1984)3(5)1097-1102中公開的黑色曲霉的葡糖淀粉酶G1可以從Novo Nordisk得到并且示于SEQ ID NO9中。
菌株JaL228；在WO98/12300中描述了該菌株的構建SMO110；在實施例6中描述了該菌株的構建酵母菌株釀酒酵母YNG318MATa leu2-D2 ura3-52 his4-539 pep4-D1[cir+]。
基因在SEQID NO8中顯示出黑色曲霉G1葡糖淀粉酶的基因在圖5和SEQ ID NO33中顯示出帶有內含子的T．emersonii葡糖淀粉酶的基因。在圖5中顯示出內含子。
質粒pJSO026(釀酒酵母的表達質粒)(J.S.Okkels，(1996)“pYES載體中URA3-啟動子的缺失提高了釀酒酵母中真菌脂肪酶的表達水平”；重組DNA生物技術Ⅲ生物與工程科學的結合，紐約科學院年報第782期)。更具體地講，通過用來自釀酒酵母的組成型表達的TPI(丙糖磷酸異構酶)-啟動子(Albert與Karwasaki(1982)《J.Mol.Appl Genet.》1，419-434)置換pYES 2.0的誘導型GAL1-啟動子，并缺失掉URA3啟動子的一部分，由pYES 2.0衍生出表達質粒pJSO26。
pJaL497；在實施例5中描述了該質粒的構建pJaL507；在實施例5中描述了該質粒的構建pJaL510；在實施例5中描述了該質粒的構建pJaL511；在實施例5中描述了該質粒的構建
pJaL518；在實施例6中描述了該質粒的構建pCaHj483；在實施例6中描述了該質粒的構建pJRoy10；在實施例6中描述了該質粒的構建pJRoy17；在實施例6中描述了該質粒的構建pSMO127；在實施例6中描述了該質粒的構建pCRTMⅡ；可以由美國加利福尼亞州圣地亞哥市的Invitrogen公司得到。
設備自動DNA測序儀(377型Applied Biosystems)培養(yǎng)基SC-ura培養(yǎng)基酵母氮w/o ami 7.5gBemsteinsaure(Ravsyre)11.3gNaOH 6.8g酪蛋白氨基酸w/o vit 5.6g色氨酸0.1g蒸餾水1000ml在121℃下高壓滅菌20分鐘。
與100ml無菌的20％葡萄糖溶液一起，將4ml來自5％蘇氨酸的無菌原溶液加至900ml的體積中。
YPD培養(yǎng)基酵母提取物 10g胨 20g蒸餾水 1000ml在121℃下高壓滅菌20分鐘。
將100ml無菌的20％葡萄糖溶液加入900ml中。
方法AGU活性的測定將1個Novo淀粉葡糖苷酶單位(AGU)定義為在下列標準條件下每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量
底物…………麥芽糖溫度…………25℃pH……………4.3(醋酸鹽緩沖液)反應時間……30分鐘當需要時，分析方法(AF22)的詳細描述是可以得到的。
PUN活性的測定將PUN定義為水解支鏈淀粉(0.2％支鏈淀粉、40℃、pH5.0)的酶量，其中以每分鐘釋放出相當于1微摩爾葡萄糖的具有還原本領的還原糖為準。
AFAU活性的測定以在pH2.5、40℃和0.17g/l淀粉的條件下淀粉濃度的減小而計算出的AFAU來測定活性，并且通過碘-淀粉反應來測定。
AMG熱穩(wěn)定性Ⅰ(T1/2(半衰期))的測定采用下列方法測試葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性(以T1/2(半衰期)進行測定)在70℃下將950微升50mM醋酸鈉緩沖液(pH4.5)(NaOAc)保溫5分鐘。加入50微升酶的緩沖液(4 AGU/ml)。在0至360分鐘之間固定的時段處取出2×40微升的樣品，并在冰上進行冷卻冰凍。在冷凍樣品后，采用AGU測定(上述)測量剩余的酶活性。
把培養(yǎng)前(0分鐘)測量的活性(AGU/ml)用作參考值(100％)。T1/2為直到相對活性的百分數(shù)降至50％時經(jīng)歷的時間段。
熱穩(wěn)定性Ⅱ的測定混合1600微升的上清液與400微升0.5M的NaAC(pH4.5)。
在68℃或70℃下，將各含250微升混合物的7只Eppendorph管在Perkin Elmer循環(huán)變溫加熱器中保溫0，5，10，20，30，45和60分鐘。
在微量滴定孔中，將100微升的各混合物與100微升5mM的CNPG3(來自genzyme的2-氯-4-硝基苯基-α-麥芽三糖苷(maltotrioside))混合。在37℃下保溫30分鐘后，在405nm下測量吸光度。
葡糖淀粉酶比活性的測定在選擇的溫度下，比如在37℃、60℃或70℃下，將750微升的底物保溫5分鐘。
加入50微升在醋酸鈉中稀釋的酶，并采用上述AGU標準方法測定活性。動力學參數(shù)通過向預熱的750微升底物中加入50微升在醋酸鈉中稀釋的酶，在45℃下測量Kcat和Km。在0，3，6，9和12分鐘后取出100微升的等分試樣，并將其轉移到100微升0.4M的氫氧化鈉中以終止反應。包括一個空白試樣。
將20微升轉移到微量滴定板上并加入200微升GOD-Perid溶液。在室溫下保溫30分鐘后，在650nm下測量吸光度。把葡萄糖用作標準樣品，并把比活性計算為Kcat(秒-1)。
米曲霉的轉化(通用步驟)以米曲霉的孢子接種100ml YPD培養(yǎng)基(Sherman等人，(1981)《酵母遺傳學中的方法》冷泉港實驗室)，并且振蕩培養(yǎng)約24小時。通過穿過miracloth的過濾收獲菌絲體，并用200ml的0.6M MgSO4洗滌。把菌絲體懸浮在15ml的1.2M MgSO4、10mM NaH2PO4(pH5.8)中。在冰上冷卻懸浮液，并加入含120mg NovozymTM234的1ml緩沖液。5分鐘后，加入1ml 12mg／ml的BSA(Sigma H25型)，并且在37℃下在輕微的攪拌下持續(xù)培養(yǎng)1.5-2.5小時，直到在顯微鏡下檢查的樣品中可以看到大量的原生質體為止。
將懸浮液通過miracloth進行過濾，把濾液轉移至無菌試管中，并以5ml0.6M山梨醇、100mM Tris-HCl(pH7.0)覆蓋。在1000g下離心15分鐘，并從MgSO4墊層的頂部收集原生質體。將2體積的STC(1.2M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl2)加入到原生質體懸浮液中，并在1000g下離心該混合物5分鐘。將原生質體小片重新懸浮到3ml的STC中并再次形成小片。重復這一步驟。最后，將原生質體重新懸浮到0.2-1ml的STC中。
把100μl的原生質體懸浮液與溶于10μl STC中的5-25μg p3SR2(攜帶在下列文獻中所述質粒的構巢曲霉amdS基因Hynes等人《分子與細胞生物學》第3卷第8期，1430-1439，1983年8月)混合在一起。在室溫下保持該混合物25分鐘。加入0.2 ml的60％PEG 4000(BDH 29576)、10mM CaCl2和10mM Tris-HCl(pH 7.5)并仔細地混合(兩次)，最后加入0.85ml相同的溶液并仔細地混合。在室溫下保持該混合物25分鐘，在2.500g下旋轉15分鐘并將小片重新懸浮到2ml的1.2M山梨醇中。在一次或多次沉積之后，把原生質體涂布到含1.0M蔗糖、pH7.0、作為氮源的10mM乙酰胺和20mM CsCl的基本平板培養(yǎng)基上(Cove，(1966)《生物化學與生物物理學學報》113，51-56)，以便抑制背景的生長。在37℃下培養(yǎng)4-7天后，挑取孢子，將孢子懸浮到無菌水中并進行涂布以獲得單個的菌落。重復這一步驟，并把第二次重新分離后單個菌落的孢子作為所定義的轉化體儲存起來。
補料分批發(fā)酵在包括麥芽糖糊精作為碳源、脲作為氮源以及酵母提取物的培養(yǎng)基中進行補料分批發(fā)酵。通過把所述真菌宿主細胞的搖瓶培養(yǎng)物接種到包括3.5％碳源和0.5％氮源的培養(yǎng)基中，進行所述的補料分批發(fā)酵。在pH5.0和34℃下培養(yǎng)24小時后，開始連續(xù)地供應額外的碳源和氮源。保持碳源作為限制因素，并且保證氧過量存在。繼續(xù)補料分批培養(yǎng)4天，之后可以通過離心、起濾、澄清過濾以及微生物過濾回收所述的酶。通過本領域公知的陰離子交換層析法可以進行進一步的純化。
釀酒酵母YNG318的轉化混合所述的DNA片段與公開的載體，并通過標準的方法將其轉化到釀酒酵母YNG318中。
實施例實施例1純化將3500ml來自野生型發(fā)酵且具有0.05 AGU/ml的T.emersonii培養(yǎng)肉湯在9000rpm下離心，隨后通過濾紙真空過濾并最終進行空白過濾。然后采用下列步驟來純化所述的酶苯基Sepharose(250ml)1.3M AMS/10mM Tris/2mM CaCl2，pH7；用10mM Tris/2mM CaCl2，pH7洗脫。
透析20mM NaAc，2mM CaCl2，pH5。
Q Sepharose(100 ml)20mM NaAc，2mM CaCl2，pH5；用0-0.4MNaCl的線性梯度以10個柱的體積進行洗脫。
透析20mM NaAc，2mM CaCl2，pH5。
顏色的去除0.5％的炭處理10分鐘。
Q Sepharose(20ml)20mM NaAc，2mM CaCl2，pH4.5；用0-0.4MNaCl的線性梯度以10個柱的體積進行洗脫。
透析20mM NaAc，2mM CaCl2，pH5。
SSepharose(1ml)5mM檸檬酸，pH2.9；用0-0.3M NaCl的線性梯度以10個柱的體積進行洗脫。
在SSepharose步驟之后得到純度超過90％的酶。
實施例2Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶的鑒定將純化的Talaromyces emersonii CBS 793.97的葡糖淀粉酶用于進行鑒定。
分子量(Mw)如圖1中所示，通過SDS-PAGE測定分子量約為70 kDa。
等電點通過等電聚焦(來自Pharmacia的Amploline PAG，pH3.5-9.5)測得等電點小于3.5。
pH的分布測定Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶的pH-活性依賴性并與黑色曲霉葡糖淀粉酶的分布進行比較。在60℃下在0.1M醋酸鈉中，采用0.5％的麥芽糖為底物測定pH的活性分布。在包括0.1-1 AGU/ml的雙份樣品中測量pH。在圖2中顯示出測試的結果。
溫度的分布測定本發(fā)明Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶的溫度-活性依賴性并與黑色曲霉葡糖淀粉酶的分布進行比較。在37，50，60，70，75，80以及90℃下培養(yǎng)200μl 0.5％的麥芽糖(pH4.3)，并且通過加入10μl的酶(0.25 AGU/ml)使反應開始；反應時間為10分鐘。在圖3中顯示出測試的結果。
溫度穩(wěn)定性-T1/2(半衰期)測定Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性并與黑色曲霉葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性進行比較。
所用的方法在以上“材料與方法”部分中的“AMG熱穩(wěn)定性I(T1/2(半衰期))的測定”進行了描述。
在70℃下測得Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶的T1/2約為120分鐘。在相同的條件下，測得黑色曲霉葡糖淀粉酶的T1/2為7分鐘(參見圖4)。
比活性基于280nm下的吸光度和蛋白質濃度，測得延伸系數(shù)為ε=2.44ml/mg*cm。然后計算出37℃下針對麥芽糖的比活性為7.3 AGU/mg。樣品的純度約為90％，從而校正的比活性為8.0 AGU/mg。測量出下列比活性
*)對純的酶進行的評價實施例3T.emersonii葡糖淀粉酶的N-末端序列測定根據(jù)SDS-PAGE以及在PVDF-膜上的電印跡來測定T.emersonii葡糖淀粉酶的N-末端氨基酸序列。通過用賴氨?；禺愋缘鞍酌盖懈?，由還原的并進行了S-羧甲基化的葡糖淀粉酶衍生出肽。在進行N-末端序列測定之前，采用RP-HPLC對得到的肽進行分級分離和再次的純化。
N-端序列(SEQID NO1)Ala Asn Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Xaa Pro Ile AlaLeu Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly肽1(SEQ ID NO 2)Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Thr Gly Gly LeuGly Glu Pro Lys肽2(SEQ ID NO 3)Xaa Asn Val Asn Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Xaa Gly Arg Pro GlnArg Asp Gly Pro Ala Leu肽3(SEQ ID NO4)Asp Val ASn Ser Ile Leu Gly SeR Ile His Thr Phe Asp Pro Ala GlyGly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu AlaAsn His Lys肽4(SEQ ID NO5)Thr Xaa Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys肽5(SEQ ID NO6)Ala Gln Thr Asp Gly Thr Ile Val Trp Glu Asp Asp Pro Asn Arg SerTyr Thr Val Pro Ala Tyr Cys Gly Gln Thr Thr Ala Ile Leu Asp AspSeR Trp Gln
Xaa表示無法命名的殘基。
實施例4全長的T.emersonii葡糖淀粉酶采用標準的方法鑒定出SEQIDNO7中所示全長的T.emersonii葡糖淀粉酶的氨基酸序列。
實施例5Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶基因的克隆和測序Talaromyces emersonii AMG基因的PCR克隆部分為了克隆Talaromyces emersonii的AMG基因，針對AMG基因一部分的PCR擴增設計出表1中所示的簡并引物。
表1
從通過標準步驟[例如參見Christensen等人《生物技術》1989 6 1419-1422]制得的原生質體制備來自Talaromyces emersonii的基因組DNA，并且在PCR反應中用作模板。在體積為100μl的體系中進行擴增反應，所述體系含有2.5單位的Taq-聚合酶、100ng的米曲霉基因組DNA、50mMKCl、10mM Tris-HClpH 8.0、1.5mM MgCl2、各250nM的dNTP、以及各100pM的下列引物對102434/117360，102434/117361，102435/117360，102434/117361，102434/127420，和102434/127420。
在Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480中進行擴增，并且所述擴增由94℃下3分鐘的1次循環(huán)、接下來在94℃下1分鐘、40℃下30秒鐘和72℃下1分鐘的30次循環(huán)組成。只有PCR反應102434/117360得到了產(chǎn)物。檢測出具有下列尺寸的4個條帶1400，800，650和525 bp。純化所有的4個條帶并將其克隆到載體pCR_2.1(Invitrogen_)中。對各條帶的幾個克隆的測序以及與黑色曲霉AMG的序列比較表明來自650 bp條帶的克隆編碼Talaromyces emersonii AMG的N-末端部分。把該克隆命名為pJaL497。
為了獲得更多的基因，從克隆pJaL497的序列制備出特異性引物(1230365’-GTGAGCCCAAGTTCAATGTG-3’(SEQ ID NO15))。在Talaromyces基因組DNA的基礎上將引物對123036/127420用于PCR反應，并獲得1500 bp的單一片段。將PCR片段克隆到載體pCR_2.1中并進行測序。通過測序，證實該克隆編碼Talaromyces emersonii AMG的C-末端部分。把該克隆命名為pJaL507。
基因組限制酶切作圖與基因組克隆的克隆合起來看，兩個克隆pJaL497和pJaL507覆蓋了AMG基因的大約95％。為了克隆出AMG基因丟失的部分，通過采用所述兩個PCR片段作探針以便對用單一或混合的多種限制酶消化的Talaromyces emersonii基因組DNA進行Southern印跡分析來構建基因組的限制圖。這表明Talaromycesemersonii的AMG基因分別位于大約5.6 kb和6.3 kb的兩個EcoRI片段上。
用EcoRI消化Talaromyces emersonii的基因組DNA，將大小介于4-7 kb之間的片段純化并用于在如廠家說明(Stratagene)所述的λZAP Ⅱ中構建部分基因組文庫。首先，采用來自pJaL497的0.7 kb EcoRI片段(編碼AMG基因的N-末端部分(half))作探針來篩選文庫，以便得到AMG基因的起點。得到一個克隆并命名為pJaL511。在第二次篩選文庫的過程中，為了得到AMG基因的C-末端，采用來自pJaL507的0.75 kb EcoRV片段(編碼AMG基因的C-末端部分(half))作探針。得到一個克隆并命名為pJaL510。
Talaromyces emersonii的AMG基因的序列分析通過采用針對pUC的標準的反向和正向引物，根據(jù)質粒pJaL497、pJaL507、pJaL510與pJaL511及其亞克隆的測序，獲得了AMG基因的序列。通過采用特異性寡核苷酸作引物封閉了剩余的凹口(gabs)。
通過把所述序列與曲霉屬中內含子的共有序列以及黑色曲霉的AMG序列進行比較，發(fā)現(xiàn)了潛在的內含子。Talaromyces emersonii AMG的核苷酸序列在第618位氨基酸處具有一個編碼蛋白質的開放讀框，其分別被57bp，55bp，48bp和59bp的四個內含子間斷。在圖5中顯示出核苷酸序列(帶內含子)和推導的氨基酸序列。在SEQ ID NO33中也顯示出DNA序列(帶內含子)，而在SEQ ID NO34中顯示出Talaromyces emersonii AMG的序列(帶有由第1至27位的信號序列)。對米曲霉AMG和黑色曲霉AMG推導的氨基酸序列的比較表明分別有60.1％和60.5％的同一性。圖6中所示的氨基酸序列的對比表明Talaromyces的AMG在催化域和淀粉結合域之間具有非常短的絞鏈，這在米曲霉的AMG中也觀察得到。
實施例6曲霉屬載體pCaHj483的構建在圖7中描繪了pCaHj483的構建。所說的質粒是由下列片段構建成的a)用EcoRI和XbaI切割的載體pToC65(WO 91/17243)；b)來自攜帶amdS基因的構巢曲霉的2.7 kb XbaI片段(C.M.Corrick等人《基因》53，(1987)，63-71)。在真菌的轉化中將amdS基因用作選擇標記。已經(jīng)修飾了amdS基因，以便破壞通常存在于該基因中的BamHI位點。通過采用下列引物引入沉默點突變已經(jīng)完成了這一操作5’-AGAAATCGGGTATCCTITCAG-3’(SEQID NO16)c)攜帶黑色曲霉NA2啟動子的0.6 kb EcoRI/BamHI片段，其中所述NA2啟動子與編碼構巢曲霉tpi基因的mRNA 5’非翻譯端之序列的60 bpDNA片段融合。從質粒pNA2中分離出NA2啟動子(在WO 89/01969中進行了描述)，并通過PCR與60bp的tpi序列融合。編碼60bp tpi序列的引物具有如下序列5′-GCTCCTCATGGTGGATCCCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGAGGAAGGAAGAGAAGTGTGGATAGAGGTAAATTGAGTTGGAAACTCCAAGCATGGCATCCTTGC-3′(SEQ IDNO17)d)攜帶黑色曲霉葡糖淀粉酶轉錄終止子的675 bp XbaI片段。該片段是從質粒pICAMG/Term中分離出來的(在EP 0238 023中進行了描述)。
通過pIC19R接頭在位于片段d上的轉錄終止子之前，把片段c的BamHI位點連接到XbaI位點上(BamHI至XbaI)。
AMG表達質粒pJaL518的構建通過PCR采用下列兩個寡核苷酸引物擴增出Talaromyees emersoniiAMG基因的編碼區(qū)引物1397465’-GACAGATCTCCACCATGGCGTCCCTCGTTG 3’(SEQ ID NO18)；和引物1397475’-GACCTCGAGTCACTGCCAACTATCGTC 3’(SEQID NO19)。帶下劃線的區(qū)域表示在Talaromyces emersonii AMG基因中存在的序列。為了便于克隆，將限制酶位點插入各引物的5’端；引物139746含有1個BglII位點，引物139747含有1個XhoI位點。
在PCR反應中，將Talaromyces emersonii的基因組DNA用作模板。在50mM KCl、10 mM Tris-HCl pH 8.0、1.5mM MgCl2的反應緩沖液中，在含有2.5單位Taq聚合酶、100 ng pSO2、250nM各dNTP以及各10pmol上述兩種引物的體積為100μl的體系中進行反應。
在Perkin-Elmer Cetus DNATermal 480中進行擴增，并且所述擴增由94℃下3分鐘的1次循環(huán)、接下來在94℃下1分鐘、55℃下30秒鐘和72℃下1分鐘的25次循環(huán)組成。PCR反應產(chǎn)生了單一的長度為2099 bp的DNA片段。用BglII和XhoI消化該片段，通過凝膠電泳分離、純化，并克隆到用BamHI和XhoI消化的pCaHj483中，結果產(chǎn)生了命名為pJaL518的質粒。于是，質粒pJaL518的構建產(chǎn)生了用于Talaromyces emersonii AMG基因的真菌表達質粒(圖8)。
黑色曲霉菌株SMO110的構建1.黑色曲霉pyrG基因的克隆如廠家說明所述，在EMBL4中建立黑色曲霉BO-1的文庫。用DIG標記的寡核苷酸(PyrG5’-CCCTCACCAGGGGAATGCTGCAGTTGATG-3’(SEQ ID NO20))篩選文庫，其中的寡核苷酸是從出版的黑色曲霉序列(Wilson等人《核酸研究》16，(1988)，2339-2339)中設計出來的。從BO-1文庫中分離出與DIG探針雜交的陽性EMBL4克隆，由EMBL4克隆亞克隆含pyrG基因的3.9 kb Xba1片段并克隆到pUC118中以產(chǎn)生pJRoy10。
2．黑色曲霉葡糖淀粉酶(AMG)基因的克隆用DIG標記的PCR片段篩選以上黑色曲霉BO-1的文庫，其中所述的PCR片段是通過采用下列寡核苷酸在黑色曲霉的基因組DNA上進行擴增產(chǎn)生的寡核苷酸9508475’-CGCCATTCTCGGCGACTT-3’(SEQID NO21)，和寡核苷酸9512165’-CGCCGCGGTATTCTGCAG-3’(SEQ ID NO22)，該寡核苷酸是從出版的黑色曲霉序列(Boel等人《EMBO J.》3，(1984)，1581-1585)中設計出來的。從BO-1文庫中分離出與DIG探針雜交的陽性EMBL4克隆，由EMBL4克隆亞克隆含AMG基因的4.0 kb SpeI片段并克隆到pBluescriptSK+中以產(chǎn)生質粒pJRoy17a。
3．黑色曲霉AMG破裂盒的構建從pJRoy10中凝膠分離出含pyrG的2.3 kb SpeI-XhoI片段，并用Klenow聚合酶補平限制末端。將該片段插入pJRoy17的BglII位點中，其在AMG基因內部切割產(chǎn)生了質粒pSMO127(圖9)。在pSMO127a的兩個SpeI位點之間包含著2.3 kb的pyrG基因，所述pyrG基因兩側分別為2.2 kb和2.3 kb的5’和3’AMG。
4．對AMG而言破裂的黑色曲霉菌株SMO110的構建黑色曲霉JRoyP3為黑色曲霉BO-1的自發(fā)pyrG變株，該菌株是針對在含有5’-氟代-乳清酸(5’-FOA)的平板上的生長加以選擇的。pyrG基因編碼乳清酸核苷5’-磷酸羧化酶，并且其缺陷型變株可以表征為尿苷營養(yǎng)缺陷體。通過在基本培養(yǎng)基上生長的互補性驗證了pyrG變體與構巢曲霉pyrG基因的同一性。
用SpeI消化20微克的質粒pSMO127。在0.8％的瓊脂糖凝膠上分離DNA，并且通過凝膠分離出由線性破裂盒組成的6kb片段。把線性DNA轉化到菌株JRoyP3中。
從200個轉化體中制備基因組DNA，然后用SpeI消化。把凝膠分離的DNA轉移到hybond尼龍過濾器上，并與由AMG開放讀框組成的非放射性DIG探針雜交。破裂盒的基因置換到AMG基因座中將導致野生型4kb的AMG條帶增加至6.3kb，其中的增加是由于2.3kb的pyrG基因導致的。選出具有以上特征的一個轉化體#110用于進一步的分析。
在含有YPM培養(yǎng)基的25ml搖瓶中培養(yǎng)轉化體#110。作為AMG生產(chǎn)的對照物，培養(yǎng)菌株BO-1和親代菌株JRoyP3。3天后，在8-16％的SDSPAGE Novex凝膠上操作30μl澄清的上清液。在轉化體#110中沒有觀察到AMG的條帶，而在陽性對照菌株BO-1和親代菌株JRoyP3中卻產(chǎn)生了AMG的大條帶。把轉化體#110命名為SMO110。
Talaromyces emersonii AMG在米曲霉和黑色曲霉中的表達如Christensen等人在《生物技術》1988 6 1419-1422中所述，用pJaL518轉化菌株JaL228和SMO110。一般說來，在營養(yǎng)豐富的肉湯中培養(yǎng)米曲霉的菌絲體。通過過濾從肉湯中分離菌絲體。把酶制劑Novozyme_(NovoNordisk)加入處于滲透穩(wěn)定緩沖液(諸如用磷酸鈉緩沖至pH 5.0的1.2 MMgSO4溶液)中的菌絲體中。在37℃下攪拌培養(yǎng)懸浮液60分鐘。通過mira-cloth過濾出原生質體，以便除去菌絲體碎片。收獲原生質體并用STC(1.2 M山梨醇，10mM CaCl2，10mM Tris-HCl pH7.5)洗滌兩次。最后把原生質體重新懸浮在200-1000μl的STC中。
為了進行轉化，將5μgDNA加入到100μl原生質體懸浮液中，然后加入200μl PEG溶液(60％PEG 4000，10 mM CaCl2，10mM Tris-HCl pH7.5)，并且在室溫下培養(yǎng)混合物20分鐘。收獲原生質體并用1.2M山梨醇洗滌兩次。最后將原生質體重新懸浮在200μl 1.2M山梨醇中，把該懸浮液平鋪在選擇平板(基本培養(yǎng)基+10g/l Bacto-瓊脂(Difco))上并在37℃下培養(yǎng)。在37℃下生長3-4天后，穩(wěn)定的轉化體呈現(xiàn)為茁壯生長的并且形成了孢子的菌落。將轉化體的孢子分離兩次。
在搖瓶中于30℃下在100ml YPM培養(yǎng)基(2g/l酵母提取物，2g/l胨，和2％的麥芽糖)中培養(yǎng)轉化體4天。如上所述測試上清液的AMG活性，并在SDS-PAGE凝膠上進行分析(圖10)。
實施例7為了在酵母中進行表達，從Talaromyces emersonii AMG的DNA序列中除去4個內含子對每個外顯子來說，用含有重疊區(qū)的引物進行PCR反應以獲得下一個外顯子。Tal 1和Tal 4含有與酵母載體pJSO026的重疊區(qū)。
外顯子1將Tal 1用作5’引物，Tal 5用作3’引物，并將編碼AMG的基因組序列用作模板。外顯子2將Tal 6用作5’引物，Tal 7用作3’引物，并將編碼AMG的基因組序列用作模板。外顯子3將Tal 8用作5’引物，Tal 9用作3’引物，并將編碼AMG的基因組序列用作模板。外顯子4將Tal10用作5’引物，Tal11用作3’引物，并將編碼AMG的基因組序列用作模板。外顯子5將Tal 12用作5’引物，Tal 4用作3’引物，并將編碼AMG的基因組序列用作模板。
進行最后的PCR反應，以便將所述5個外顯子結合到含有完全編碼序列的序列中。在這一PCR反應中，將來自首次PCR反應的5個片段用作模板，并且將Tal 1用作5’引物，Tal 4用作3’引物。
在酵母的體內重組中，將含有編碼區(qū)的這一最后的PCR片段與用限制酶SmaI(或BamHI)和XbaI切割的pJSO026一起使用(以便除去編碼區(qū)，與此同時在每個末端各建立一段大約20 bp的重疊區(qū)，從而使重組事件成為可能)。Tal 15′-CAA TAT AAA CGA CGG TAC CCG GGA GAT CTC CAC CATG GCGTCC CTC GTT G-3′ (SEQ ID NO23)；Tal 45′-CTA ATT ACA TCA TGC GGC CCT CTA GAT CAC TGC CAA CTATCG TC-3′ (SEQ ID NO24)；Tal 55′-AAT TTG GGT CGC TCC TGC TCG-3′ (SEQ ID NO25)；Tal 65′-CGA GCA GGA GCG ACC CAA ATT ATT TCT ACT CCT GGA CACG-3′ (SEQ ID NO 26)；Tal 75′-GAT GAG ATA GTT CGC ATA CG-3′ (SEQ ID NO 27)；Tal 85′-CGT ATG CGA ACT ATC TCA TCG ACA ACG GCG AGG CTT CGACTG C-3′ (SEQ ID NO28)；Tal 95′-CGA AGG TGG ATG AGT TCC AG-3′ (SEQ ID NO 29)；Tal 105′-CTG GAA CTC ATC CAC CTT CGA CCT CTG GGA AGA AGT AGAAGG-3′ (SEQ ID NO 30)Tal 115′-GAC AAT ACT C AG ATA TCC ATC-3′ (SEQ ID NO 31)Tal 125′-GAT GGA TAT CTG AGT ATT GTC GAG AAA TAT ACT CCC TCAGAC G-3′ (SEQ ID NO 32)實施例8Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶在酵母中的表達為了在釀酒酵母YNG318中表達Talaromyces emersonii的AMG，如以上在“材料與方法”部分中所述構建酵母表達載體pJSO26。
通過標準的方法(參見Sambrooks等人(1989)《分子克隆實驗指南》第2版，冷泉港)，將包括編碼Talaromyces AMG的DNA序列的pJSO26轉化到酵母中。
在Se-ura培養(yǎng)基中于30℃下培養(yǎng)酵母細胞3天，隨后在YPD中生長3天。然后離心培養(yǎng)物，并且將上清液用于在“材料與方法”部分所述的熱穩(wěn)定性測定中。
在酵母中表達的Talaromyces AMG在68℃下的熱穩(wěn)定性采用在上述“熱穩(wěn)定性Ⅱ的測定”中的方法，將在酵母(釀酒酵母YNG318)中表達的Talaromyces emersonii AMG的發(fā)酵肉湯用于測定在68℃下的熱穩(wěn)定性。在圖12中顯示出測試結果。
實施例9使用黑色曲霉HowB112生產(chǎn)的重組Talaromyces AMG的純化在9000 rpm下離心來自攜帶Talaromyces emersonii基因的黑色曲霉HowB112發(fā)酵的200ml培養(yǎng)肉湯，并在20mM NaOAc，pH5中透析過夜。然后，將該溶液上樣于事先在20mM NaOAc，pH5中平衡過的S Sepharose柱(200ml)中。在流出物中收集葡糖淀粉酶，并上樣于事先在20mM NaOAc，pH4.5中平衡的Q Sepharose柱(50ml)中。從柱中洗出未結合的物質，并采用溶于20mM NaOAc的0-0.3 M NaCl的線性梯度以10個柱的體積洗脫葡糖淀粉酶。通過SDS-PAGE檢測葡糖淀粉酶級分的純度，并且僅觀察到一條單一的條帶。再次發(fā)現(xiàn)其分子量約為70kDa，這與野生型葡糖淀粉酶觀察到的一樣。測量出針對麥芽糖的比活性，發(fā)現(xiàn)比活性為8.0 AGU/mg(37℃)與21.0 AGU/mg(60℃)，這與野生型酶的數(shù)據(jù)是一致的。
實施例10動力學參數(shù)下面列舉了由黑色曲霉AMG以及在黑色曲霉中表達的重組Talaromyces emersonii AMG水解麥芽糖和異麥芽糖的動力學參數(shù)。麥芽糖 kcat(s-1)aKm(mM) kcat/Km(s-1mM-1)Talaromyces emersonii 30.6 3.88.1黑色曲霉 10.7 1.28.8a在45℃下采用0.05M NaOAc，pH4.5異麥芽糖 kcat(s-1)aKm(mM) kcat/Km(s-1mM-1)Talaromyces emersonii 2.70 53.6 0.050黑色曲霉 0.41 19.8 0.021a在45℃下采用0.05M NaOAc，pH4.5
實施例11在黑色曲霉中產(chǎn)生的重組Talaromyces emersonii AMG的糖化性能在不同的溫度下，在添加和不添加酸性α-淀粉酶和支鏈淀粉酶的情況下，測試Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶的糖化性能。在下列條件下進行糖化底物10 DE麥芽糖糊精，約30％DS(w/w)溫度60，65或70℃最初pH 4.5酶劑量在黑色曲霉中產(chǎn)生的重組Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶0.24或0.32 AGU/g DS來源于黑色曲霉的酸性α-淀粉酶0.020 AFAU/g DS來源于芽孢桿菌屬的支鏈淀粉酶0.03 PUN/g DS當單獨使用時，以高劑量(0.32 AGU/g DS)加入Talaromyces AMG，否則以低劑量、即0.24AGU/gDS加入。
糖化通過在沸騰的Millli-Q水中溶解麥芽糖糊精(由普通的玉米制得)并且將干物質調節(jié)到大約30％(w/w)，制備用于糖化的底物。將pH調節(jié)到4.5(在60℃下測量)。把對應于150g干燥固體的底物的等分試樣轉移到500ml藍蓋玻璃燒瓶中并放入在各溫度下進行攪拌的水浴中。加入酶，并且如果需要的話重新調節(jié)pH(在培養(yǎng)溫度下測量)。定期地取出樣品，并且在HPLC中分析測定糖的組成。
在下表中給出了糖化過程中產(chǎn)生的葡萄糖，頭三欄表示用葡糖淀粉酶、酸性α-淀粉酶和支鏈淀粉酶進行的糖化，后三欄表示單獨用葡糖淀粉酶進行的糖化。數(shù)值為基于DS的％DP1。
使用相當于0.03 mg/g DS的0.24 AGU/g DS的酶劑量，在72小時后獲得了95％以上的葡萄糖產(chǎn)量。黑色曲霉AMG的典型劑量為相當于0.09mg/g DS的0.18 AGU/g DS，從而得到了95-96％的葡萄糖。由于T.emersoniiAMG的比活性高，因此與黑色曲霉AMG相比，在糖化過程中需要基于每毫克酶蛋白而言明顯低得多的Talaromyces AMG的酶劑量。
實施例12熱穩(wěn)定性-在酵母中表達的重組Talaromyces emersonii AMG的T1/2(半衰期)采用以上在“材料與方法”部分中如“AMG熱穩(wěn)定性Ⅰ(T1/2(半衰期))的測定”所述的方法，在70℃、pH 4.5以及0.2 AGU/ml下測定在酵母中表達的重組Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶(采用實施例9中所述的方法純化)的熱穩(wěn)定性。
圖13顯示出測試的結果。經(jīng)測定在酵母中表達的重組Talaromycesemersonii葡糖淀粉酶的T1/2在70℃下約為110分鐘。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國家丹麥(F)郵政編碼(ZIP)DK 2880(G)電話+45 4444 8888(H)電傳+45 4449 3256(ⅱ)發(fā)明名稱熱穩(wěn)定的葡糖淀粉酶(ⅲ)序列數(shù)6(ⅳ)計算機可讀形式(A)存儲介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，#1.30版(EPO)(2)SEQ ID N01的信息(ⅰ)序列特征(A)長度25個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)最初來源(B)菌株Talaromyces emersonii CBS 793.97(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO1Ala Asn Gly ser Leu Aap ser Phe Leu Ala Thr Glu Xaa Pro Ile Ala1 5 10 15Leu Gln Gly Val Leu Asn Ile Gly20 25(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)最初來源(B)菌株Talaromyces emersonii CBS 793.97(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Thr Gly Gly Leu15 10 15Gly Glu Pro Lys20(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)最初來源(B)菌株Talaromyces emersonii CBS 793.97(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3Xaa ASn Val Asn Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Xaa Gly Arg Pro Gln15 10 15Arg Asp Gly Pro Ala Leu20(2)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度35個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)最初來源(B)菌株Talaromyces emersonii CBS 793.97(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Gly1 5 10 15Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu Ala20 25 30Asn His Lys35(2)SEQ ID NO5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)最初來源(B)菌株Talaromyces emersonii CBS 793.97(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5Thr xaa Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys15 10 15(2)SEQ ID NO6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度35個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)最初來源(B)菌株Talaromyces emersonii CBS 793.97(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6Ala Gln Thr Asp Gly Thr Ile Val Trp Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser1 5 10 15Tyr Thr Val Pro Ala Tyr Cys Gly Gln Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp20 25 30Ser Trp Gln35(2)SEQ ID NO7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度591個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)最初來源(B)菌株Talaromyces emersonii CBS 793.97(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7Ala Thr Gly Ser Leu ASp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala1 5 10 15Leu Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala20 25 30Gly Ala Ser Ala Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro35 40 45Asn Tyr Phe Tyr Ser Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr50 55 60Leu Val Asp Ala Phe Asn Arg Gly Asn Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile65 70 75 80Gln Gln Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Lys Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro85 90 95Ser Gly Asp Leu Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val100 105 110Asn Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly115 120 125Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile130 135 140Asp Asn Gly Glu Ala Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val145 150 155 160Gln Asn Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe165 170 175Asp Leu Trp Glu Glu Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val180 185 190Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn195 200 205His Thr Cys Ser Asn Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe210 215 220Leu Gln Ser Tyr Trp Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly225 230 235 240Ser Gly Arg Ser Gly Lys Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His245 250 255Thr Phe Asp Pro Ala Gly Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys260 265 270Ser Ala Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg275 280 285Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala290 295 300Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr305 310 315 320Leu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln325 330 335Trp Lys Lys Ile Gly Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe340 345 350Phe Gln Asp Ile Tyr Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly355 360 365Ser Thr Thr Phe Asn Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp370 375 380Gly Tyr Leu Ser Ile Val Glu Lys Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu385 390 395 400Thr Glu Gln Phe Ser Arg Thr Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala405 410 415Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln420 425 430Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Leu435 440 445Ala Val Cys Ser Ala Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr450 455 460Asn Thr Val Trp Pro Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser465 470 475 480Ser Ala Pro Cys Thr Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu485 490 495Ile Val Ser Thr Ser Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile500 505 510Pro Glu Leu Gly Asn Trp Ser Thr Ala Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala515 520 525Asp Ala Tyr Thr Asn Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu530 535 540Pro pro Gly Thr Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp545 550 555 560Gly Thr Ile Val Trp Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro565 570 575Ala Tyr Cys Gly Gln Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp Ser Trp Gln580 585 590(2)SEQ ID NO8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1605個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“cDNA”(ⅵ)最初來源(B)菌株黑色曲霉(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞sig_肽(B)位置1.72(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞mat_肽(B)位置73..1602(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..1602(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO8ATG TCG TTC CGA TCT CTA CTC GCC CTG AGC GGC CTC GTC TGC ACA GGG 48Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly-24 -20 -15 -10TTG GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC GCG ACC TTG GAT TCA TGG TTG AGC 96Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser-5 1 5AAC GAA GCG ACC GTG GCT CGT ACT GCC ATC CTG AAT AAC ATC GGG GCG 144Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala10 15 20GAC GGT GCT TGG GTG TCG GGC GCG GAC TCT GGC ATT GTC GTT GCT AGT 192Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser25 30 35 40CCC AGC ACG GAT AAC CCG GAC TAC TTC TAC ACC TGG ACT CGC GAC TCT 240Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser45 50 55GGT CTC GTC CTC AAG ACC CTC GTC GAT CTC TTC CGA AAT GGA GAT ACC 288Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr60 65 70AGT CTC CTC TCC ACC ATT GAG AAC TAC ATC TCC GCC C AG GCA ATT GTC 336Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val75 80 85CAG GGT ATC AGT AAC CCC TCT GGT GAT CTG TCC AGC GGC GCT GGT CTC384Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu90 95 100GGT GAA CCC AAG TTC AAT GTC GAT GAG ACT GCC TAC ACT GGT TCT TGG432Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp105 110 115 120GGA CGG CCG CAG CGA GAT GGT CCG GCT CTG AGA GCA ACT GCT ATG ATC480Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile125 130 135GGC TTC GGG CAG TGG CTG CTT GAC AAT GGC TAC ACC AGC ACC GCA ACG528Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr140 145 150GAC ATT GTT TGG CCC CTC GTT AGG AAC GAC CTG TCG TAT GTG GCT C AA576Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg ASn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln155 160 165TAC TGG AAC CAG ACA GGA TAT GAT CTC TGG GAA GAA GTC AAT GGC TCG624Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser170 175 180TCT TTC TTT ACG ATT GCT GTG CAA CAC CGC GCC CTT GTC GAA GGT AGT 672Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser185 190 195 200GCC TTC GCG ACG GCC GTC GGC TCG TCC TGC TCC TGG TGT GAT TCT CAG 720Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln205 210 215GCA CCC GAA ATT CTC TGC TAC CTG CAGG TCC TTC TGG ACC GGC AGC TTC 768Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe220 225 230ATT CTG GCC AAC TTC GAT AGC AGC CGT TCC GGC AAG GAC GCA AAC ACC 816Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr235 240 245CTC CTG GGA AGC ATC CAC ACC TTT GAT CCT GAG GCC GCA TGC GAC GAC 864Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp250 255 260TCC ACC TTC CAG CCC TGC TCC CCG CGC GCG CTC GCC AAC CAC AAG GAG 912Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu265 270 275 280GTT GTA GAC TCT TTC CGC TCA ATC TAT ACC CTC AAC GAT GGT CTC AGT 960Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser285 290 295GAC AGC GAG GCT GTT GCG GTG GGT CGG TAC CCT GAG GAC ACG TAC TAC 1008Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr300 305 310AAC GGC AAC CCG TGG TTC CTG TGC ACC TTG GCT GCC GCA GAG CAG TTG 1056Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu315 320 325TAC GAT GCT CTA TAC CAG TGG GAC AAG CAG GGG TCG TTG GAG GTC ACA 1104Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr330 335 340GAT GTG TCG CTG GAC TTC TTC AAG GCA CTG TAC AGC GAT 3CT GCT ACT 1152Asp Val Sar Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr345 350 355 360GGC ACC TAC TCT TCG TCC AGT TCG ACT TAT AGT AGC ATT GTA GAT GCC 1200Gly Thr Tyr Ser Ser ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala365 370375GTG AAG ACT TTC GCC GAT GGC TTC GTC TCT ATT GTG GAA ACT CAC GCC1248val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala380 385 390GCA AGC AAC GGC TCC ATG TCC GAG CAA TAC GAC AAG TCT GAT GGC GAG 1296Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu395 400 405CAG CTT TCC GCT CGC GAC CTG ACC TGG TCT TAT GCT GCT CTG CTG ACC 1344Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr410 415 420GCC AAC AAC CGT CGT AAC TCC GTC GTG CCT GCT TCT TGG GGC GAG ACC 1392Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr425 430 435 440TCT GCC AGC AGC GTG CCC GGC ACC TGT GCG GCC ACA TCT GCC ATT GGT 1440Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly445 450455ACC TAC AGC AGT GTG ACT GTC ACC TCG TGG CCG AGT ATC GTG GCT ACT 1488Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr460 465 470GGC GCC ACC ACT ACG ACG GCT ACC CCC ACT GGA TCC GGC AGC GTG ACC 1536Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr475 480 485TCG ACC AGC AAG ACC ACC GCG ACT GCT AGC AAG ACC AGC ACC ACG ACC 1584Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr490 495 500CGC TCT GGT ATG TCA CTG TGA 1605Arg Ser Gly Met Ser Leu505 510(2)SEQIDNO9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度534個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO9Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu A la Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly-24 -20 -15 -10Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser-5 1 5Ash Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala10 15 20Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly A la Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser25 30 35 40Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser45 50 55Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr60 65 70Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln A la Ile Val75 80 85Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser GlyAla Gly Leu90 95 100Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp105 110 115120Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile125 130 135Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr140 145 150Asp Ile val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln155 160 165Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser170 175 180Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser185 190 195 200Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln205 210 215Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe220 225 230Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr235 240 245Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp250 255 260Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu265 270 275 280Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ger285 290 295Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr300 305 310Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu315 320 325Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr330 335 340Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr345 350 355 360Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala365 370375Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala380 385 390Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu395 400 405Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr410 415 420Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr425 430 435 440Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly445 450 455Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr460 465 470Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr475 480 485Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr490 49S 500Arg Ser Gly Met Ser Leu505 510(2)SEQ ID NO10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“引物102434)”(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)位置3，6，9，12，15(D)其它信息/注釋N=A，G，C或TR=G或AY=C或TH=A，C或T(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO10GTNTTRAAYAAYATHGG17(2)SEQIDNO11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“引物102435)”(ⅸ)特征
(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)位置3，6，9，12，15(D)其它信息／注釋N=A，G，C或TY=C或TH=A，C或T(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11GTNCTNAAYA AYATHGG17(2)SEQ ID NO12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“引物117360)”(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)位置3，6，9，12，15(D)其它信息/注釋N=A，G，C或TR=G或AY=C或T(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO12CTRGANACCCTYCTYCA17(2)SEQID NO13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“引物117361)”(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)位置3，6，12，15(D)其它信息/注釋N=G或AY=C或T(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO13CTRAAYACCCTYCTYCA17(2)SEQID NO14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“引物127420)”(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)位置6，9，12，15(D)其它信息/注釋N=A，G，C或TR=G或AY=C或T(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO14ACCCTYCTRCTRGGNTT17(2)SEQ ID NO15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“引物123036”(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO15GTGAGCCCAAGTTCAATTGTG20(2)SEQ ID NO16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“引物1”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO16AGAAATCGGGTATCCTTICAG21(2)SEQID NO17的信息(ⅰ)序列特征(A)長度105個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“引物2”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO17GCTCCTCATG GTGGATCCCC AGTTGTGTAT ATAGAGGATTGAGGAAGGAA GAGAAGTGTG GATAGAGGTA AATTGAGTTGGAAACTCCA AGCATGGCATC CTTGC105(2)SEQID NO18的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“引物139746’(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO18GACAGATCTC CACCATGGCG TCCCTCGTTG30(2)SEQID NO19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征
(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“引物3”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO19GACCTCGAGT CACTGCCAAC TATCGTC27(2)SEQ ID NO20的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“引物4”(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO20CCCTCACCAG GGGAATGCTG CAGTTGATG29(2)SEQID NO21的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“引物950847”(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO21CGCCAITCTC GGCGACTT18(2)SEQID NO22的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“引物951216”(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO22CGCCGCGGTA TTCTGCAG18(2)SEQID NO23的信息(ⅰ)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“Tal 1”(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO23CAATATAAAC GACGGTACCC GGGAGATCTC CACCATGGCGTCCCTCGTTG50(2)SEQID NO24的信息(ⅰ)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“Tal 4”(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO24CTAATTACAT CATGCGGCCC TCTAGATCAC TGCCAACTATCGTC44(2)SEQID NO25的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“Tal 5”(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO25AATTTGGGTC GCTCCTGCTC G21(2)SEQID NO26的信息(ⅰ)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征
(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“Tal 6”(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO26CGAGCAGGAG CGACCCAAAT TATTTCTACTCCTGGACACG40(2)SEQID NO27的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“Tal 7”(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO27GATGAGAIAG TTCGCAIACG22(2)SEQID NO28的信息(ⅰ)序列特征(A)長度43個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“Tal 8”(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO28CGTATGCGAA CTATCTCATC GACAACGGCG AGGCTTCGACTGC43(2)SEQ ID NO29的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“Tal 9”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO29CGAAGGTGGA TGAGTTCCAG29(2)SEQ ID NO30的信息(ⅰ)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“Tal 10”(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO30CTGGAACTCA TCCACCTTCG ACCTCTGGGA AGAAGTAGGAGG42(2)SEQIDNO31的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“Tal 11)”(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO31GACAATACTC AGATATCCAT C21(2)SEQID NO32的信息(ⅰ)序列特征(A)長度43個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它信息/desc=“Tal12”(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO32GATGGATATC TGAGTATTGT CGAGAAATAT ACTCCCTCAGACG43(2)SEQID NO33的信息(ⅰ)序列特征(A)長度2748個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“cDNA”(ⅵ)最初來源(B)菌株Talaromyces emersonii(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO33acgagatgtg tatatactgt gaaccaaact agatgatgtc agttatgctg gtctgagaac 60tcatagaagc ccttgaaaat accccaagct agcactccaa ccctaactct gttgctctac 120tagatcaaga cgagtactct gattgagctg caggcttgga atatatgatt agcagaaaaa 180gggttaaaac ttgtatgaca atcagtttgt cagtactccg tagtgatgcc atgtctatag 240agtcgacact aaggcagcat gtgaatgagt cggaaatgac aggaagcaga ttccttaaca 300gtcatgttct ccgtgcctgc atccccacgt cacctgcaaa gatgcgacgc tactccacac 360cggcgccttg atgtctgctg ttcctggcct agtggagccc catgcgctgc tagctcgtgg 420tcttcgaata aatcagaata aaaaacggag taattaattg cgcccgcaac aaactaagca 480atgtaactca atgccaagct tccgctgatg ctcttgacat ctccgtagtg gcttctttcg 540taatttcaga cgtatatata gtagtaatgc ccagcaggcc gggataatga tggggatttc 600tgaactctca gcttccgtac gctgaacagt ttgcttgcgt tgtcaaccat ggcgtccctc 660gttgctggcg ctctctgcat cctgggcctg acgcctgctg catttgcacg agcgcccgtt 720gcagcgcgag ccaccggttc cctggactcc tttctcgcaa ccgaaactcc aattgccctc 780caaggcgtgc tgaacaacat cgggcccaat ggtgctgatg tggcaggagc aagcgccggc 840attgtggttg ccagtccgagcaggagcgac ccaaattgta ggttctttcc caccagaaat 900tacttattta aatcagccct ctgacaggtt gaagatttct actcctggac acgtgacgca 960gcgctcacgg ccaaatacct cgtcgacgcc ttcatcgcgg gcaacaagga cctagagcag 1020accatccagc agtacatcag cgcgcaggcg aaggtgcaaa ctatctccaa tccgtccgga 1080gatttatcca ccggtggctt aggtgagccc aagttcaatg tgaatgagac ggcttttacc 1140gggccctggg gtcgtccaca gagggacgga ccagcgttga gagcgacggc cctcattgcg 1200tatgcgaact atctcatcgt aagcttctgc tcgctgccct tctctctgct cgtatgctaa 1260gtagtcctgt caggacaacg gcgagcgcttc gactgccgat gagatcatct ggccgattgt 1320ccagaatgat ctgtcctaca tcacccaata ctggaactca tccaccttcg gtaggcaaat 1380gaatattccc gacacagcgt ggtactaatt tgattcagac ctctgggaag aagtagaagg 1440atcctcattc ttcacaaccg ccgtgcaaca ccgcgccctg gtcgaaggca atgcactggc 1500aacaaggctg aaccacacgt gctccaactg cgtctctcag gcccctcagg tcctgtgttt 1560cctgcagtca tactggaccg gatcgtatgt tctggccaac tttggtggca gcggtcgttc 1620cggcaaggac gtgaattcga ttctgggcag catccacacc tttgatccccg ccggaggctg 1680tgacgactcg accttccagc cgtgttcggc ccgtgccttg gcaaatcaca aggtggtcac 1740cgactcgttc cggagtatct atgcgatcaa ctcaggcatc gcagagggat ctgccgtggc 1800agtcggccgc taccctgagg atgtctacca gggcgggaac ccctggtacc tggccacagc 1860agcggctgca gagcagcttt acgacgccat ctaccagtgg aagaagatcg gctcgataag 1920tatcacggac gttagtctgc catttttcca ggatatctac ccttctgccg cggtgggcac 1980ctataactct ggctccacga ctttcaacga catcatctcg gccgtccaga cgtatggtga 2040tggatatctg agtattgtcg tacgttttgc cttagattct caggtgtaaa gaaaaaaatg 2100gaactaactc agttctagga gaaatatact ccctcagacg gctctcttac cgaacaattc 2160tcccgtacag acggcactcc gctttctgcc tctgccctga cttggtcgta cgcttctctc 2220ctaaccgctt cggcccgcag acagtccgtc gtccctgctt cctggggcga aagctccgca 2280agcagcgtcc ctgccgtctg ctctgccacc tctgccacgg gcccatacag cacggctacc 2340aacaccgtct ggccaagctc tggctctggc agctcaacaa ccaccagtag cgccccatgc 2400accactccta cctctgtggc tgtgaccttc gacgaaatcg tcagcaccag ttacggggag 2460acaatctacc tggccggctc gatccccgag ctgggcaact ggtccaccggc cagcgcgatc 2520cccctccgcg cggatgctta caccaacagc aacccgctct ggtacgtgac cgtcaatctg 2580ccccctggca ccagcttcga gtacaagttc ttcaagaacc agacggacgg gaccatcgtc 2640tgggaagacg accccgaaccg gtccgtacacg gtcccagcgt actgtgggca gactaccgcc2700attcttgaccg atagttggca gtgagataac atccaccctt ctgtttta 2748(2)SEQID NO34的信息(ⅰ)序列特征(A)長度618個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)最初來源(B)菌株Talaromyces emersonii(a)特征(b)名稱/關鍵詞SIGNAL(c)位置(1)…(27)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO34Met Ala Ser Leu Val Ala Gly Ala Leu Cys Ile Leu Gly Leu Thr Pro1 5 10 15Ala Ala Phe Ala Arg Ala Pro Val Ala Ala Arg Ala Thr Gly Ser Leu20 25 30Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Gln Gly Val Leu35 40 45Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala Gly Ala Ser Ala Gly50 55 60Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser65 70 75 80Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr Leu Val Asp Ala Phe85 90 95Ile AlaGly Asn Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile Gln Gln Tyr Ile Ser100 105 110Ala Gln Ala Lys Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser115 120 125Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn val Asn Glu Thr Ala Phe130 135 140Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala145 150 155 160Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Asp Asn Gly Glu Ala165 170 175Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val Gln Asn Asp Leu Ser180 185 190Tyr Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ger Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu195 200 205Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu210 215 220Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn His Thr Cys Ger Asn225 230 235 240Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp245 250255Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly Ser Gly Arg Ger Gly260 265 270Lys Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala275 280 285Gly Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu290 295 300Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile305 310 315 320Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro325 330 335Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Ala Ala340 345 350Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys Lys Ile Gly355 360 365Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe Phe Gln Asp Ile Tyr370 375 380Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly Ser Thr Thr Phe Asn385 390 395 400Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp Gly Tyr Leu Ser Ile405 410 415Val Glu Lys Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu Thr Glu Gln Phe Ser420 425 430Arg Thr Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Tyr435 440 445Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln Ser Val Val Pro Ala450 455 460Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro Ala val Cys Ser Ala465 470 475 480Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr Asn Thr Val Trp Pro485 490 495Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Ala Pro Cys Thr500 505 510Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu Ile Val Ser Thr Ser515 520 525Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile Pro Glu Leu Gly Asn530 535 540Trp Ser Thr Ala Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala Asp Ala Tyr Thr Asn545 550 555 560Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu Pro Pro Gly Thr Ser565 570 575Phe Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp Gly Thr Ile Val Trp580 585 590Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Ala Tyr Cys Gly Gln595 600 605Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp Ser Trp Gln610 61權利要求
1.一種具有葡糖淀粉酶活性的分離的酶，所述的酶在70℃下在50mMNaOAc、0.2 AGU/ml、pH 4.5中具有至少100分鐘的T1／2(半衰期)。
2.根據(jù)權利要求1的酶，所述的酶具有100-140分鐘的T1/2，具體地講具有大約120分鐘的T1/2。
3.一種具有葡糖淀粉酶活性的分離的酶，所述的酶與黑色曲霉AMG相比，在60℃下針對麥芽糖具有增加的比活性。
4.根據(jù)權利要求1-3之任一的酶，所述的酶具有由SDS-PAGE測定的大約70kDa的分子量。
5.根據(jù)權利要求1-4之任一的酶，所述的酶具有由等電聚焦測定的低于3.5的等電點。
6.根據(jù)權利要求1-5之任一的酶，所述的酶來源于真菌生物體、具體地講來源于絲狀真菌。
7.根據(jù)權利要求6的酶，其中所述的絲狀真菌為Talaromyces屬的菌株，具體地講為Talaromyces emersonii的菌株，尤其是Talaromyces emersoniiCBS 793.97。
8.一種具有葡糖淀粉酶活性的分離的酶，所述的酶包括一個或多個在SEQ ID NOS.1-6中所示的部分序列或在SEQ ID NO7中所示的全長序列，或者一種具有葡糖淀粉酶活性的與所述分離的酶基本同源的酶。
9.根據(jù)權利要求8的分離的酶，其中所述同源的酶與在SEQID NO1-6中所示部分氨基酸序列或在SEQID NO7中所示全長序列的成熟部分之間相同的程度至少為80％、至少為90％、更優(yōu)選至少為95％、更優(yōu)選至少為97％、且最優(yōu)選至少為99％。
10.根據(jù)權利要求8或9的分離的酶，所述的酶來源于真菌生物體，具體地講為絲狀真菌Talaromyces屬的菌株，具體地講為T．emersonii，尤其是保藏的T．emersonii CBS 793.97。
11.根據(jù)權利要求8-10之任一的分離的酶，其中所說的酶與在SEQIDNO9中所示的野生型黑色曲霉葡糖淀粉酶相比，具有改善的熱穩(wěn)定性和/或增加的比活性。
12.根據(jù)權利要求8-10之任一的分離的酶，所述的酶具有權利要求1-5之任一的特征。
13.一種克隆的DNA序列，所述DNA序列編碼表現(xiàn)出葡糖淀粉酶活性的酶，該DNA序列包括(a)在SEQ ID NO33中所示DNA序列的所述葡糖淀粉酶編碼部分；(b)在SEQ ID NO33中第649-2724位中所示的DNA序列或其互補鏈；(c)(a)或(b)中定義的DNA序列的類似物，所述類似物與所說的DNA序列之間至少有80％是同源的；(d)在嚴格性差的條件下，與包括SEQ ID NO33中第649-2724位中所示序列的雙鏈DNA探針雜交的DNA序列；(e)一種DNA序列，其中由于遺傳密碼的簡并性，該DNA序列與(b)或(f)的序列不雜交，但卻編碼與由這些DNA序列之任一編碼的多肽具有完全相同的氨基酸序列的多肽；或(g)作為(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中說明的DNA序列的片段的DNA序列。
14.權利要求13的DNA序列，其中所述的DNA序列來源于真菌生物體，具體地講為絲狀真菌Talaromyces屬的菌株，具體地講為T．emersonii，尤其是保藏的T．emersonii CBS 793.97。
15.一種用于將淀粉或部分水解的淀粉轉化為含有葡萄糖的糖漿的方法，所說的方法包括在根據(jù)權利要求1-12之任一的葡糖淀粉酶或者由權利要求13或14的DNA序列編碼的葡糖淀粉酶存在下糖化淀粉水解產(chǎn)物的步驟。
16.權利要求15的方法，其中所述葡糖淀粉酶的劑量是以每克干燥固體0.05至0.5AGU的量存在的。
17.權利要求15或16的方法，所述方法包括以干燥固體的重量計，至少30％的淀粉水解產(chǎn)物糖化的步驟。
18.前述權利要求之任一的方法，其中所述的糖化是在選自支鏈淀粉酶和異淀粉酶的脫支酶存在下進行的，其中優(yōu)選來源于Bacillusacidopullulyticus或Bacillus deramificans的支鏈淀粉酶或者來源于淀粉皮假單胞菌的異淀粉酶。
19.前述權利要求之任一的方法，其中在大約3-5.5的pH下以及在60-80℃的溫度下、優(yōu)選在63-75℃下進行所述的糖化24-72小時，優(yōu)選在4-4.5的pH下進行糖化36-48小時。
20.一種糖化液化淀粉溶液的方法，所述方法包括使用根據(jù)權利要求1-12之任一的葡糖淀粉酶或者由權利要求13或14的DNA序列編碼的葡糖淀粉酶的酶促糖化步驟。
21.根據(jù)權利要求1-12之任一的葡糖淀粉酶或者由權利要求13或14的DNA序列編碼的葡糖淀粉酶在淀粉轉化過程中的用途。
22.根據(jù)權利要求1-12之任一的葡糖淀粉酶或者由權利要求13或14的DNA序列編碼的葡糖淀粉酶在連續(xù)淀粉轉化過程中的用途。
23.根據(jù)權利要求1-12之任一的葡糖淀粉酶或者由權利要求13或14的DNA序列編碼的葡糖淀粉酶在用于生產(chǎn)寡糖的方法中的用途。
24.根據(jù)權利要求1-12之任一的葡糖淀粉酶或者由權利要求13或14的DNA序列編碼的葡糖淀粉酶在用于生產(chǎn)特種糖漿的方法中的用途。
25.根據(jù)權利要求1-12之任一的葡糖淀粉酶或者由權利要求13或14的DNA序列編碼的葡糖淀粉酶在生產(chǎn)用于燃料的乙醇的方法中的用途。
26.根據(jù)權利要求1-12之任一的葡糖淀粉酶或者由權利要求13或14的DNA序列編碼的葡糖淀粉酶在用于生產(chǎn)飲料的方法中的用途。
27.根據(jù)權利要求1-12之任一的葡糖淀粉酶或者由權利要求13或14的DNA序列編碼的葡糖淀粉酶在用于生產(chǎn)如檸檬酸、抗壞血酸、賴氨酸、谷氨酸之類的有機化合物的發(fā)酵方法中的用途。
28.一種微生物Talaromyces emersonii CBS 793.97的分離的純培養(yǎng)物或其能夠產(chǎn)生如權利要求1-12之任一定義的葡糖淀粉酶或者由權利要求13或14的DNA序列編碼的葡糖淀粉酶的突變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適合于淀粉轉化過程的來源于Talaromyces emersonii的分離的熱穩(wěn)定葡糖淀粉酶。
文檔編號C12N9/34GK1284129SQ98813338
公開日2001年2月14日 申請日期1998年11月26日 優(yōu)先權日1997年11月26日
發(fā)明者比賈恩·R·尼爾森, 魯比·I·尼爾森, 簡·萊姆貝克 申請人:諾沃挪第克公司