專利名稱：人表皮干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人表皮干細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的原始細(xì)胞，可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。干細(xì)胞具有自我更新及無限增殖能力、能夠產(chǎn)生高度分化的功能細(xì)胞。由于干細(xì)胞的特性，為人類在制備自體細(xì)胞、組織、器官，及在治療癌癥、先天免疫性疾病等疑難雜病的領(lǐng)域中提供一種新的思路。目前國際上干細(xì)胞的研究主要集中于胚胎干細(xì)胞建系及向成熟組織細(xì)胞誘導(dǎo)的機(jī)理；成體干細(xì)胞橫向分化的誘導(dǎo)；各種組織成體干細(xì)胞庫的建立；干細(xì)胞的臨床試驗及細(xì)胞移植的免疫排斥的研究。
最近研究表明，在成體組織及器官中普遍存在著特異的成體干細(xì)胞，問題是如何尋找和分離各種特異性成體干細(xì)胞。且成體干細(xì)胞經(jīng)常位于特定的微環(huán)境中，該環(huán)境內(nèi)存在一系列的生長因子或配體，使干細(xì)胞與鄰近細(xì)胞相互作用，控制干細(xì)胞的更新和分化。
表皮干細(xì)胞存在于皮膚與粘膜的基底層中，在維持皮膚與粘膜正常組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用。目前，基因治療成為熱點，在遺傳性皮膚病的治療中，要達(dá)到基因治療目的，必須把目的基因?qū)氡砥じ杉?xì)胞中，才能在患者整個機(jī)體皮膚中得到該基因的產(chǎn)物。另外隨著發(fā)育生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)在受損皮膚和粘膜功能與結(jié)構(gòu)的重建方面，表皮干細(xì)胞也有著極其重要的作用。
研究表明，表皮干細(xì)胞在體外培養(yǎng)中仍然存在，且性質(zhì)與在體內(nèi)時相類似。表皮干細(xì)胞目前雖無特異性標(biāo)識分子，但相對特異性表達(dá)角蛋白19并高表達(dá)β1整合素。該類細(xì)胞對IV型膠原、纖維粘連素及細(xì)胞外基質(zhì)的粘附速度要比表皮中其它類型細(xì)胞快，現(xiàn)在對表皮干細(xì)胞的鑒別多利用β1整合素的高水平表達(dá)，及對細(xì)胞外基質(zhì)的快速粘附特性的特點進(jìn)行。Graziella P等利用纖維蛋白原及凝血酶作為底物分離人表皮干細(xì)胞(J Transplan，1999，68(6)1-12)，Jone PH等利用上述方法從人包皮(Cell，1993，73713-724)或尸體皮(Cell，1995，8083-93)中，利用IV型膠原做底物分離表皮干細(xì)胞，所選用底物價格昂貴，不適合大規(guī)?；蜷L期培養(yǎng)；Van Rossum MM等(JImmunol Methods，2002，267109-17)從人的小塊活檢組織中得到角朊細(xì)胞(也稱表皮細(xì)胞)，利用流式細(xì)胞儀分離，選用方法復(fù)雜且技術(shù)要求高，不便于推廣，且培養(yǎng)中都使用鼠的3T3細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，由于兩種細(xì)胞不同種屬，不能很好保證人表皮干細(xì)胞所處的微環(huán)境，并有可能為以后的應(yīng)用增加外源性危險因素。另外，在長期培養(yǎng)小鼠的表皮干細(xì)胞方面，Hagar B等人(JInvest Dermatol，1999，112971-976)及Dunnwald M等人(Exp Dermatol，2001，1045-54)利用50％DMEM、50％低鈣離子鼠成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基，不用滋養(yǎng)層細(xì)胞。但有研究發(fā)現(xiàn)若表皮干細(xì)胞與基底膜脫離，則會進(jìn)入分化周期，分化為過渡性擴(kuò)充細(xì)胞，因而對基底膜的高粘附性有可能是維持表皮干細(xì)胞特性的基本條件之一。所以如果不利用滋養(yǎng)層，有可能不能保證長期培養(yǎng)過程中表皮干細(xì)胞的干細(xì)胞特性。迄今為止，體外長期培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞在國內(nèi)外鮮見報道。而表皮干細(xì)胞生物學(xué)性能，可以做到增進(jìn)功能、避免潛在有害基因及對表皮干細(xì)胞不同分化方向選擇，在基因治療及損傷粘膜和皮膚修復(fù)、組織工程皮膚的構(gòu)建方面等均有重要的指導(dǎo)意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對本發(fā)明技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種人表皮干細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)的方法，并使獲得的表皮干細(xì)胞克服以上缺陷。
本發(fā)明方法包括有細(xì)胞外基質(zhì)覆蓋平皿的預(yù)備，表皮細(xì)胞的分離，滋養(yǎng)層細(xì)胞的制備，表皮干細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)；上述細(xì)胞外基質(zhì)、表皮干細(xì)胞中所需的表皮細(xì)胞以及用作滋養(yǎng)層細(xì)胞的成纖維細(xì)胞都來源于同一個體的皮膚；表皮細(xì)胞是將所得皮膚用酶消化和機(jī)械分離方法獲得。具體過程是將皮膚組織用含抗菌素的磷酸鹽緩沖液清洗；置蛋白酶液中消化；剝離表皮與真皮層；收集表皮皮片，置0.25％胰酶/0.02％EDTA(1∶1)混合液中消化，終止消化后，稍加吹打，過濾后收集表皮細(xì)胞懸液，所得表皮細(xì)胞一部分用作制備細(xì)胞外基質(zhì)，一部分用于篩選表皮干細(xì)胞。成纖維細(xì)胞的獲取是同時收集真皮皮片，置于膠原酶液中，消化后收集成纖維細(xì)胞懸液，用于滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)；本發(fā)明的特征在于1.所述細(xì)胞外基質(zhì)覆蓋平皿預(yù)備的具體步驟為將所得表皮細(xì)胞接種于平皿內(nèi)，培養(yǎng)至匯合，吸去培養(yǎng)液；加入乙二胺四乙酸(EDTA)和三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris HCL)和曲拉通(Triton)混合液，置37℃孵育至鏡下可見細(xì)胞裂解；用PBS緩沖液清洗平皿；加入變性后的牛血清白蛋白，置37℃孵箱60-90分鐘，以封閉非特異性粘附；PBS清洗平皿，加入無血清培養(yǎng)液，置孵箱中直至應(yīng)用；
2.所述滋養(yǎng)層細(xì)胞的制備的具體步驟為取同一個體皮膚的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至匯合，加絲裂霉素C至終濃度為10-6mol/L，37℃孵育過夜，用0.25％胰酶消化，終止消化，離心棄上清，重懸細(xì)胞，備用；3.所述表皮干細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)的具體步驟為取準(zhǔn)備好的覆蓋有細(xì)胞外基質(zhì)的平皿，加入新鮮分離的表皮細(xì)胞懸液(濃度0.5～2×103/ml)，置37℃孵箱10-30分鐘，吸棄液體，PBS清洗至無細(xì)胞懸浮，其中貼壁細(xì)胞為表皮干細(xì)胞；加入滋養(yǎng)層細(xì)胞(密度0.3～1×104/cm2)和KSC培養(yǎng)液培養(yǎng)，第2天換液，以后每3天換液一次；細(xì)胞長至匯合，以0.25％胰酶/0.02％EDTA消化傳代。其中KSC培養(yǎng)液含有胎牛血清和堿性成纖維生長因子。
4.檢測表皮干細(xì)胞的特征體外培養(yǎng)觀察到細(xì)胞呈克隆性生長，生長周期長，有明顯的接觸生長抑制；流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞周期，結(jié)果表明大部分細(xì)胞在G0/G1期，處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，符合干細(xì)胞特性。最后需要進(jìn)行的是免疫組化檢測，其方法是取篩選的細(xì)胞及穩(wěn)定培養(yǎng)10、20、60、120 PD的細(xì)胞做甩片，分別滴加一抗(角蛋白19單抗、β1整合素單抗、角蛋白10單抗、抗波形絲蛋白單抗)，結(jié)果顯示β1整合素單抗100％陽性、角蛋白19單抗約為94％-97％陽性，角蛋白10單抗、抗波形絲蛋白單抗均為陰性，呈現(xiàn)表皮干細(xì)胞特征。
上述方法中所述的KSC培養(yǎng)液所含有的必須成份有商用最低必需培養(yǎng)液DMEM、商用培養(yǎng)液Ham’s F12、胎牛血清、氫化可的松、霍亂毒素、腺嘌呤、青霉素或鏈霉素、堿性成纖維細(xì)胞生長因子。所述的KSC培養(yǎng)液可以添加的成份有氯化鈣、轉(zhuǎn)鐵蛋白。


圖1為本發(fā)明的人表皮干細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中形成的克隆顯微照片。
圖2為本發(fā)明的人表皮干細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果圖。
附圖1表示本發(fā)明的人表皮干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中形成的細(xì)胞克隆，圖中右上部分是形成的細(xì)胞克隆，可見細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞胞體較小，呈多角形；而周邊較稀疏的呈長梭形者是滋養(yǎng)層細(xì)胞。
附圖2是本發(fā)明的人表皮干細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果，表明大部分的細(xì)胞處于G0/G1期，具慢周期性特點。
具體實施例方式
取(人)健康男性包皮環(huán)切術(shù)后的包皮皮膚，制備表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。
1.表皮細(xì)胞(角朊細(xì)胞)的分離取1-2cm長、2mm左右寬的皮膚，以含抗菌素的PBS清洗3次；置蛋白酶液中，4℃消化16小時；取出皮膚，剝離表皮與真皮層；收集表皮皮片，置0.25％胰酶/0.02％EDTA(1∶1)混合液中，37℃消化10-15分鐘，終止消化，稍加吹打后過濾，收集細(xì)胞懸液，離心棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×103/ml。
2.滋養(yǎng)層細(xì)胞的制備收集上述表皮與真皮層剝離后的真皮皮片，置于625U/ml膠原酶液中，消化后收集成纖維細(xì)胞懸液，將成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至鋪展80％左右，加絲裂霉素C至終濃度為10-6mol/L。37℃孵育12小時取出，用0.25％胰酶37℃消化3-5分鐘，終止消化，離心5分鐘(800-1000r/分鐘)，棄上清，重懸細(xì)胞，備用。
3.細(xì)胞外基質(zhì)覆蓋平皿的預(yù)備在平皿內(nèi)將上述表皮細(xì)胞(也稱角朊細(xì)胞)培養(yǎng)至匯合(約10-14天)；表皮細(xì)胞匯合后，吸去培養(yǎng)液，用無菌PBS清洗；加入乙二胺四乙酸(10mmol/L)和三羥甲基氨基甲烷鹽酸(25mmol/L)和曲拉通(1％(w/v))混合液，37℃孵育(30分鐘)至鏡下可見細(xì)胞裂解；用PBS清洗；再加入0.5mg/ml變性的牛血清白蛋白，置37℃孵育1小時，以封閉非特異性粘附；PBS清洗，加入無血清培養(yǎng)液，置37℃孵箱至應(yīng)用。
4.表皮干細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)取預(yù)備好的覆蓋有細(xì)胞外基質(zhì)的平皿，加入2ml表皮細(xì)胞懸液，37℃培養(yǎng)10分鐘取出，吸棄液體，PBS清洗至無細(xì)胞懸浮，貼壁細(xì)胞為表皮干細(xì)胞。加入滋養(yǎng)層細(xì)胞(4×103/cm2)，用KSC培養(yǎng)液培養(yǎng)，第2天換液，后每3天換液一次。其中KSC培養(yǎng)液含5％胎牛血清和1ng/ml堿性成纖維生長因子。本發(fā)明中，表皮干細(xì)胞的培養(yǎng)在不同階段中，所用KSC培養(yǎng)液中胎牛血清的含量可以調(diào)整，并添加不同的生長因子。
5.傳代培養(yǎng)上述表皮干細(xì)胞長至匯合，以0.25％胰酶/0.02％EDTA(1∶1)混合液，37℃消化3-6分鐘，終止消化；收集細(xì)胞懸液入離心管，離心5分鐘，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，以2×105/ml的密度接種于預(yù)先鋪加有滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，置37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)。
6.細(xì)胞檢測免疫組化檢測結(jié)果細(xì)胞甩片β1整合素100％表達(dá)、角蛋白19有95％表達(dá)，角蛋白10、抗波形絲蛋白陰性；透射電鏡結(jié)果培養(yǎng)的細(xì)胞，胞體較小，核漿比大，核仁明顯，游離核糖體多，細(xì)胞器發(fā)育不成熟，相對稀少；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明G0/G1期細(xì)胞所占比例為77.2％。將表皮干細(xì)胞以1×107/ml的濃度種植在含有同一個體成纖維細(xì)胞的膠原凝膠的表面，進(jìn)行器官培養(yǎng)，病理切片觀察證實可以形成全層分化表皮。在動物體內(nèi)實驗中，以2×107細(xì)胞接種于裸鼠皮下4-8周，無腫瘤形成。
本發(fā)明的表皮干細(xì)胞及其制備方法具有以下優(yōu)點(1)特異性強(qiáng)，通過免疫組化檢測、透射電鏡觀察及流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果表明本發(fā)明的表皮干細(xì)胞純度較高；(2)實用有效，利用同一個體角朊細(xì)胞裂解，產(chǎn)生以纖維粘連素為主要成分的細(xì)胞外基質(zhì)對表皮干細(xì)胞進(jìn)行篩選，方法簡單經(jīng)濟(jì)；利用篩選的表皮干細(xì)胞在器官培養(yǎng)中可以形成成熟的全層分化表皮。另外，利用同一個體成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，分泌生長因子及細(xì)胞間的相互作用，可以創(chuàng)造一更近似于體內(nèi)的微環(huán)境，同時避免了以后應(yīng)用于臨床的異源性危險因素。
表皮干細(xì)胞由于其自身特性，具有多方面的應(yīng)用前景，其中包括(1)、組織工程皮膚構(gòu)建中的應(yīng)用皮膚直接與外界環(huán)境接觸，是人體的屏障，由外傷、嚴(yán)重?zé)齻?、大面積瘢痕切除等所致大面積缺損時，致機(jī)體不能保持正常自穩(wěn)狀態(tài)，甚至能導(dǎo)致死亡，因此需要其類似物早期覆蓋創(chuàng)面，恢復(fù)皮膚的屏障功能。隨著組織工程學(xué)的興起，可利用培養(yǎng)的表皮細(xì)胞進(jìn)行自體或異體皮片覆蓋創(chuàng)面，但目前培養(yǎng)的皮片有耗時、抗拉力差、抗感染力差以及費用高等缺點影響臨床應(yīng)用，且同時由于角朊細(xì)胞增殖能力有限，會影響到愈后皮膚的正常功能并以受到外界因素的損傷。如果利用表皮干細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生皮片，其中的表皮干細(xì)胞可仍保持自我更新能力，維持更新，并有一定的分化潛能(可向全層分化表皮、毛囊、皮脂腺方向分化)，有利于促進(jìn)更好的修復(fù)。
(2)、創(chuàng)傷修復(fù)中的應(yīng)用由于表皮干細(xì)胞具有自我更新能力和強(qiáng)的增殖能力，也可直接應(yīng)用于皮膚及口腔粘膜創(chuàng)面，促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合修復(fù)；另外，由于角膜細(xì)胞是由角膜干細(xì)胞(屬于表皮干細(xì)胞)分化而來，在維持角膜的形態(tài)及功能中起重要作用，因而表皮干細(xì)胞在對角膜的創(chuàng)傷修復(fù)中也可能會起到一定的作用。
(3)、在基因研究方面由于表皮干細(xì)胞的終生存在性，在研究基因的作用及某些皮膚病的基因機(jī)制方面，可起到重要作用。
(4)、遺傳性疾病的治療可利用基因轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞，對其進(jìn)行基因水平的改造，對遺傳性皮膚病進(jìn)行基因治療。另外在某些全身遺傳性疾病的治療中，也會起到一定作用，比如糖尿病的治療，轉(zhuǎn)基因后構(gòu)建組織工程皮膚應(yīng)用于糖尿病潰瘍的覆蓋治療，同時可釋放一定的治療因子，對糖尿病起到一定的治療作用。
(5)、細(xì)胞譜系的研究表皮干細(xì)胞首先向過渡擴(kuò)充性細(xì)胞分化，繼而分化為分裂后細(xì)胞、終末分化細(xì)胞，可為研究細(xì)胞譜系提供便利的模型。
上述結(jié)果表明，本發(fā)明的人表皮干細(xì)胞具有強(qiáng)的增殖能力，并可形成全層分化表皮。隨著對表皮干細(xì)胞認(rèn)識的進(jìn)一步深入，通過不斷的探索研究，其應(yīng)用前景將更加廣闊。
權(quán)利要求
1.一種人表皮干細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)方法，包括有細(xì)胞外基質(zhì)覆蓋平皿的預(yù)備，表皮細(xì)胞的分離，滋養(yǎng)層細(xì)胞的制備，表皮干細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)。所述細(xì)胞外基質(zhì)、表皮干細(xì)胞中所需的表皮細(xì)胞以及用作滋養(yǎng)層細(xì)胞的成纖維細(xì)胞都來源于同一個體皮膚；表皮細(xì)胞是將所得皮膚用酶消化和機(jī)械分離方法獲得，其特征在于所述細(xì)胞外基質(zhì)覆蓋平皿預(yù)備的步驟為將表皮細(xì)胞接種入平皿內(nèi)，培養(yǎng)至匯合，換液加入乙二胺四乙酸EDTA和三羥甲基氨基甲烷鹽酸和曲拉通混合液孵育；再換液加入變性的牛血清白蛋白孵育60-90分鐘，清洗后備用；所述滋養(yǎng)層細(xì)胞制備的步驟為取同一個體皮膚的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至匯合，加絲裂霉素C孵育；所述表皮干細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)具體步驟為預(yù)備好的覆蓋有細(xì)胞外基質(zhì)的平皿中，加入表皮細(xì)胞懸液，孵育后吸棄液體，用磷酸鹽緩沖液清洗，貼壁細(xì)胞為表皮干細(xì)胞；用滋養(yǎng)層細(xì)胞和KSC培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；用胰酶/EDTA混合液消化傳代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述表皮干細(xì)胞培養(yǎng)時，加入滋養(yǎng)層細(xì)胞的密度為0.3～1×104/cm2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人方法，其特征在于表皮干細(xì)胞的篩選過程中，所加入表皮細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度應(yīng)達(dá)到0.5～2×103/ml，并于37℃孵育10-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的KSC培養(yǎng)液所含有的必須成份有最低必需培養(yǎng)液DMEM、商用培養(yǎng)液Ham’s F12、胎牛血清、氫化可的松、霍亂毒素、腺嘌呤、青霉素或鏈霉素、堿性成纖維細(xì)胞生長因子；可以添加的成份有氯化鈣、轉(zhuǎn)鐵蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬生物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人表皮干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方法。方法特征包括細(xì)胞外基質(zhì)覆蓋平皿的預(yù)備；表皮細(xì)胞的分離；滋養(yǎng)層細(xì)胞的制備；表皮干細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)。目前用該法在體外已穩(wěn)定培養(yǎng)傳代超過120PD，經(jīng)體內(nèi)外實驗證實該細(xì)胞無致瘤性，具有強(qiáng)的增殖能力，并可以形成成熟的全層分化表皮，為有關(guān)表皮干細(xì)胞在科研、教學(xué)及臨床的應(yīng)用起到不可估量的作用，同時孕育著巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12N5/08GK1590538SQ03134538
公開日2005年3月9日 申請日期2003年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月2日
發(fā)明者金巖, 董蕊 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院