專利名稱：：木欖中新黃酮類化合物的分離鑒定及其抗腫瘤用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及天然藥物化學領(lǐng)域，具體涉及一種新的黃酮類化合物的分離和鑒定及其抗子宮頸癌Hela細胞的活性。
背景技術(shù)：
：木欖[A/i/^^'era^w7化力ha(L.)]是紅樹科木欖屬的一種植物，廣泛分布于熱帶、亞熱帶潮間帶，如:非洲大陸、東南亞、美洲的加勒比海以及我國的廣西、廣東、海南、臺灣和福建沿海等。長期以來的民間應(yīng)用實踐證明木欖具有潛在的藥用價值，主要表現(xiàn)在清熱解毒、止瀉、收斂、止血及截瘧等方面，被廣泛應(yīng)用于治療發(fā)燒、腹瀉、止血、眼疾、咽喉腫痛及對抗瘧原蟲等，但很少有藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的報道。黃酮類化合物是植物中廣泛分布的一類次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗菌、消炎、抗腫瘤以及抗病毒等藥理活性，黃酮類化合物已成為新藥研究過程中重要的先導(dǎo)化合物來源而備受研究人員的關(guān)注。本發(fā)明通過研究木欖化學成分，并對所獲得的一種新的黃酮類化合物進行抗腫瘤活性檢測，旨在獲得顯效的活性化合物或先導(dǎo)化合物。(^草_#;2005,3:465-467,ife;grom5朋c/5^tifer5力e5,1998,2,133-148."a"ta#et//ca，1996,62:67-69.&'ocAe/zu'ca7/%a777aca<^7，2006,72:1439-1452.5j'oo/^朋j'c&Jfec/i"'/7aJC/艦'stry2006，14:2966-2971./淑腦7尸/W〃c"'1997，60:884-888.)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明對木欖設(shè)計、分離得到了一種黃酮類新化合物，新化合物結(jié)構(gòu)式為命名為7，3、，4、，5'-四羥基-5-甲氧基黃酮(3、，4、，5、-trihydroxy-7-hydroxy-5-methoxyfl3vone)本發(fā)明采用MTT法對此新化合物進行了抗腫瘤活性檢測，實驗結(jié)果顯示此化合物具有抑制子宮頸癌Hela細胞生長的活性，它的ICs。為80.5ng/ml。具體實施例方式實施例1新化合物的提取、分離和鑒定一實驗材料與方法1樣品木欖樣品采自海南省文昌市頭苑鎮(zhèn)，由海南省東寨港自然保護區(qū)鐘才榮老師鑒定。2儀器和試劑上海申順生物科技有限公司R—501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；NicoletImpact410型紅外分光光度計測定(KBr壓片)；BrukerAV-300型核磁共振儀；薄層層析及柱層析硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品；工業(yè)酒精；其它試劑均為分析純。3提取與分離木欖葉片濕重50kg，用85%乙醇(100Lx5)提取，濃縮至無醇味后溶于水中，過濾棄去黑色沉淀，過濾液濃縮至無乙醇味后用乙酸乙酯萃取，濃縮得浸膏242.0g，以乙醇溶解，加100200目硅膠350g拌樣，通風櫥中揮干。以氯仿甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，500ml/瓶接收。經(jīng)TLC檢査，合并相同的組分。80%氯仿/甲醇洗脫部分再經(jīng)80%氯仿/甲醇硅膠(200-300目)柱層析、S印hadexLH20純化，得到新化合物。二新化合的物理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)及結(jié)構(gòu)確定黃色針狀晶體(Me0H)，IR(KBr)Vmax3346，1631cnf'，'H-NMR(Me0D303KAV-300)13C-麗R(Me0D303KAV-300)，見Tablel;Formular:C16H1207(ESI-MS:m/z[M+H]+317.0，[M+Na]+339.0;冊ESIMS:m/z[M+H]+317.0664);Table1:'NMR(500MHz,JinHz)and13CNMR(125MHz)spectroscopicdataforthecompoundinMeODpositionHC2160.236.24s107.34175.55160.866.44d(J=2.1Hz)96.67162.586.36d(J=2.1Hz)95.19159.110106.11，121.02，6.95s105.13，146.44，137.05，146.46，6.95s105.15-0CH33.85s56.4AssignmentsbasedonHMQCandHMBC.利用轉(zhuǎn)移試劑進行UV光譜分析表明是這個黃酮C-7和C-3',C-4'羥基化。IR光譜表明有羥基(3346cm—1)和羰基(1631cm—1)。'HNMR光譜(Tablel)表明化合物1存在四個酚羥基質(zhì)子[S9.2和S10.6]，一個AB耦合體系[S6.36和6.44(J=2.lHz)]，一個&耦合體系[S6.95(2H,s)]，一個芳香環(huán)上的甲氧取代基[三個質(zhì)子的單線(S3.85)]。13C麗R光譜(Tablel)表明化合物l為黃酮(16個碳信號)，A-環(huán)和B-環(huán)上的碳信號重疊，與文獻[1，2]—致。正位上被甲氧基取代(556.4)，在HMBC光譜中，C_2(S160.2)，Of(121.0)證明存在H-3;羰基證明甲氧基取代位置為5(S3.85)和H-3(S6.24);C-2(S160.2)，C-1、(121.0)證明存在2、，6、-H，C-7(S162.5)證明存在H-8，C-7(S162.5)禾卩C-5(S160.8)證明存在H-6。因此化合物為7，3'，4'，5、四羥基-5-甲氧基黃酮.實施例27，3'，4',5'-四羥基-5-甲氧基黃酮的抗腫瘤活性檢測一實驗材料與方法l.器材C02培養(yǎng)箱為上海?，斣O(shè)備有限公司產(chǎn)品，酶標儀為BIO-RAD公司產(chǎn)品，倒置生物顯微鏡為OLYMPUS公司產(chǎn)品。2.試劑受試藥物7，3'，4~，5'-四羥基-5-甲氧基黃酮RPMI1640培養(yǎng)基為GIBC0公司產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)基為HYCL0NE公司產(chǎn)品，小牛血清為HYCLONE公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為SIGMA公司產(chǎn)品，MTT為SIGMA公司產(chǎn)品，DMS0為SIGMA公司產(chǎn)品。3.細胞株及培養(yǎng)條件人宮頸癌細胞株Hela由中國藥科大學海洋藥用生物功能基因組學和蛋白質(zhì)組學實驗室保存。生長于含1(^小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，所用消化液為0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA溶液等體積混合。4.操作步驟(1)接種取處于指數(shù)生長期，狀態(tài)良好的細胞一瓶，加入0.25%胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細胞脫落，計數(shù)，并將細胞密度稀釋至4X104個/ml,制成細胞懸液。(2)培養(yǎng)取細胞懸液接種于96孔板上，180nl/L，將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入恒溫C02培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時。(3)加藥96孔板換液，加入受試藥物(100pg/ml)，20jxl/孔，每個濃度加三個孔，不加受試藥物的6個孔作為陰性對照，再培養(yǎng)48小時。(4)染色將MTT加入96孔板中，20ja1/孔，置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)4小時。小心吸棄孔內(nèi)上清液，晾干，加入DMS0，150pl/孔，置平板搖床上振搖10分鐘。(5)比色用酶標儀在波長為570nm處測定每孔的吸光值，計算細胞抑制率。4.數(shù)據(jù)處理細胞抑制率的計算陰性對照組0D值_藥敏組0D值細胞抑制率％=-X100%陰性對照組0D值一空白組OD值二實驗結(jié)果與分析本實驗所選陽性藥為長春新堿，其對腫瘤細胞抑制率見表2，新化合物ICs。為80.5yg/ml(table3)，對照抗腫瘤藥物篩選標準(table4)，此化合物具有抗Hela細胞的活性。陽性藥濃度"g/ml)細胞抑制率％均值SDIC500.138.3120.105152.9220.151長春新堿2.548.1600.0881.061566.6130.0181053.4090.113Table2長春新堿Hela細胞的抑制率CompoundConc(iig/ml)0DC腦ICso501.48028.983601.26939.1077，3'，4、，5、-四羥基-5-甲氧基黃酮70801.1440.90245.10656.71880.532901.12446.0651000.82060.653Table3:IC50tothecompoundofHelacell<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>Table4.Thestandardofanticancer—drugscreening權(quán)利要求1、新化合物7，3`，4`，5`-四羥基-5-甲氧基黃酮(3`，4`，5`-trihydroxy-7-hydroxy-5-methoxyflavone)7，3`，4`，5`-四羥基-5-甲氧基黃酮。全文摘要本發(fā)明對木欖設(shè)計、分離得到了一種黃酮類新化合物，新化合物結(jié)構(gòu)式為命名為7，3`，4`，5`-四羥基-5-甲氧基黃酮(3`，4`，5`-trihydroxy-7-hydroxy-5-methoxyflavone)本發(fā)明采用MTT法對此新化合物進行了抗腫瘤活性檢測，實驗結(jié)果顯示此化合物具有抑制子宮頸癌Hela細胞生長的活性，它的IC₅₀為80.5μg/ml。文檔編號A61K31/352GK101125842SQ200710022929公開日2008年2月20日申請日期2007年5月28日優(yōu)先權(quán)日2007年5月28日發(fā)明者葉波平,李偉光,旻王,穎王,胡曉立,鄭燕影申請人:中國藥科大學