專利名稱：哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)小干擾核糖核酸small interfering RNA，siRNA的制備工藝。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
1)根據(jù)人源性U6啟動(dòng)子的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)正向引物5′GCGATCTAGAAAGGTCGGGCAGGAAGAG3′；反向引物5′GCGAGGTACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)；2)擴(kuò)增目的基因用胰酶消化處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞在800-1000rpm離心3-5分鐘收集2×106-5×106個(gè)細(xì)胞；以200μL的磷酸鹽緩沖液重懸收集的細(xì)胞，再依次加入20μL的蛋白酶K和200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AL，震蕩混勻，在70℃下放置10分鐘，再加入200μL濃度為96％-100％的乙醇，震蕩混勻后，加入到2×106-5×106個(gè)DNeasyTMTissue Kit離心柱中，在8000-10000rpm離心1-2分鐘后，再次加入500μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AW1，以8000-10000rpm離心1-2分鐘，加入500μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AW2，在13000-14000rpm離心3-5分鐘，將DNeasyTMTissue Kit離心柱放到一個(gè)干凈的1.5mL-2mL的離心管中，加入200μL的DNeasyTMTissueKit緩沖液AE，室溫下放置1-3分鐘，在8000-10000rpm離心1-2分鐘，再向DNeasyTMTissue Kit離心柱中加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE，室溫下放置1-3分鐘，在8000-10000rpm離心1-2分鐘，得到HepG2細(xì)胞的基因組DNA；在PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中加入5μl的10×PCR Buffer、3μl濃度為25mmol/L的MgCl2、4μl濃度為2.5mmol/L的dNTP、1μl的Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、5μl的HepG2細(xì)胞的基因組DNA和30μl的純水，在94℃下5分鐘后，于94℃下30秒、55-65℃下30秒、再于72℃延伸1-10分鐘，共循環(huán)25-40次，然后在72℃延伸7-10分鐘，得到PCR產(chǎn)物；
3)哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA Fragment Purification Kit純化回收，純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xba I和Kpn I酶切后，與同樣經(jīng)Xba I和Kpn I酶切的pUC18在T4連接酶作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10gold株，以質(zhì)粒純化試劑盒純化重組質(zhì)粒，用Xba I和Kpn I酶切鑒定，挑選酶切鑒定陽性的質(zhì)粒測序，序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動(dòng)序列測定儀進(jìn)行，構(gòu)建成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體命名為pUC18U6。其圖譜和部分限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)見

圖1。
本發(fā)明磷酸鹽緩沖液包括0.14mol/L的NaCl、27mmol/L的KCl、101mmol/L的Na2HPO4和18mmol/L的KH2PO4其PH值為7.3。
本發(fā)明通過分子生物學(xué)的手段，構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體pUC18U6，本載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)小干擾核糖核酸，抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，從而可以用于研究相應(yīng)基因的功能；抑制病毒基因、癌基因等致病基因的表達(dá)，則可用于治療病毒性疾病和腫瘤等疾病。具體的應(yīng)用方式可參照目前已有的基因轉(zhuǎn)染或基因治療的方案。
圖中Ampr為氨芐青霉素抗性基因，Plac為乳糖啟動(dòng)子，U6為人源性U6啟動(dòng)子，EcoRI、XbaI、KpnI為相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，Bp為堿基對。
正向引物5′GCGATCTAGAAAGGTCGGGCAGGAAGAG3′；反向引物5′GCGAGGTACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)；1.2擴(kuò)增目的基因用胰酶消化處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞在1000rpm離心5分鐘，收集2×106個(gè)細(xì)胞，以200μL的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，再依次加入20μL蛋白酶K和200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AL，震蕩混勻，70℃放置10分鐘，再加入200μL濃度為100％的乙醇，震蕩混勻，加入到DNeasyTMTissue Kit離心柱中，在8000rpm離心1分鐘，加入500μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AW1，以8000rpm離心1分鐘，加入500μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AW2，在13000rpm離心3分鐘，將DNeasyTMTissue Kit離心柱放到一個(gè)干凈的1.5mL的離心管中，加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE，室溫下放置1分鐘，8000rpm離心1分鐘，再向DNeasyTMTissue Kit離心柱加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE，室溫下放置1分鐘，在8000rpm離心1分鐘，得到HepG2細(xì)胞的基因組DNA；在PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中加入5μl的10×PCR Buffer、3μl濃度為25mmol/L的MgCl2、4μl濃度為2.5mmol/L的dNTP、1μl的Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、5μl的HepG2細(xì)胞的基因組DNA和30μl的純水，在94℃下5分鐘后，于94℃下30秒、60℃下30秒、再于72℃延伸1.5分鐘，共循環(huán)35次，然后72℃延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物；1.3哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA Fragment Purification Kit純化回收，純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xba I和Kpn I酶切后，與同樣經(jīng)Xba I和Kpn I酶切的pUC18在T4連接酶作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10gold株，以質(zhì)粒純化試劑盒純化重組質(zhì)粒，用Xba I和Kpn I酶切鑒定，挑選酶切鑒定陽性的質(zhì)粒測序，序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動(dòng)序列測定儀進(jìn)行。構(gòu)建成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體命名為pUC18U6。
實(shí)施例21.1根據(jù)人源性U6啟動(dòng)子的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)正向引物5′GCGATCTAGAAAGGTCGGGCAGGAAGAG3′；反向引物5′GCGAGGTACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)；1.2擴(kuò)增目的基因用胰酶消化處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，在800rpm離心3分鐘，收集5×106個(gè)細(xì)胞，以200μL的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，再依次加入20μL蛋白酶K和200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AL，震蕩混勻，70℃下放置10分鐘，再加入200μL濃度為96％的乙醇，震蕩混勻，加入到DNeasyTMTissueKit離心柱中，在10000rpm離心2分鐘，再次加入500μL的DNeasyTMTissueKit緩沖液AW1，在10000rpm離心2分鐘，加入500μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AW2，在14000rpm離心5分鐘，將DNeasyTMTissue Kit離心柱放到一個(gè)干凈的2mL的離心管中，加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE，室溫下放置3分鐘，的10000rpm離心2分鐘，再向DNeasyTMTissue Kit離心柱加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE，室溫下放置3分鐘，在10000rpm離心2分鐘，得到HepG2細(xì)胞的基因組DNA；在PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中加入5μl的10×PCR Buffer、3μl濃度為25mmol/L的MgCl2、4μl濃度為2.5mmol/L的dNTP、1μl的Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、5μl的HepG2細(xì)胞的基因組DNA和30μl的純水，94℃下5分鐘后，于94℃下30秒、55℃下30秒、再于72℃延伸10分鐘，共循環(huán)25次，然后72℃延伸10分鐘，得到PCR產(chǎn)物；1.3哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA Fragment Purification Kit純化回收，純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xba I和Kpn I酶切后，與同樣經(jīng)Xba I和Kpn I酶切的pUC18在T4連接酶作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10gold株，以質(zhì)粒純化試劑盒純化重組質(zhì)粒，用Xba I和Kpn I酶切鑒定，挑選酶切鑒定陽性的質(zhì)粒測序，序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動(dòng)序列測定儀進(jìn)行，構(gòu)建成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體命名為pUC18U6。
實(shí)施例31.1根據(jù)人源性U6啟動(dòng)子的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)正向引物5′GCGATCTAGAAAGGTCGGGCAGGAAGAG3′；反向引物5′GCGAGGTACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)；1.2擴(kuò)增目的基因用胰酶消化處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，在900rpm離心4分鐘，收集3×106個(gè)細(xì)胞，以200μL的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，再依次加入20μL蛋白酶K和200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AL，震蕩混勻，70℃下放置10分鐘，再加入200μL濃度為98％的乙醇，震蕩混勻，加入到DNeasyrTMTissueKit離心柱中，在9000rpm離心2分鐘，再次加入500μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AW1，以9000rpm離心2分鐘，加入500μL的緩沖液AW2，13000rpm離心4分鐘，將DNeasyTMTissue Kit離心柱放到一個(gè)干凈的1.5mL的離心管中，加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE，室溫下放置2分鐘，在9000rpm離心2分鐘，再向DNeasyTMTissue Kit離心柱加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE，室溫下放置2分鐘，在9000rpm離心2分鐘，得到HepG2細(xì)胞的基因組DNA；在PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中加入5μl的10×PCR Buffer、3μl濃度為25mmol/L的MgCl2、4μl濃度為2.5mol/L的dNTP、1μl的Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、5μl的HepG2細(xì)胞的基因組DNA和30μl的純水，94℃下5分鐘后，于94℃下30秒、65℃下30秒、再于72℃延伸5分鐘，共循環(huán)40次，然后72℃延伸10分鐘，得到PCR產(chǎn)物；1.3哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA Fragment Purification Kit純化回收，純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xba I和Kpn I酶切后，與同樣經(jīng)Xba I和Kpn I酶切的pUC18在T4連接酶作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10gold株，以質(zhì)粒純化試劑盒純化重組質(zhì)粒，用Xba I和Kpn I酶切鑒定，挑選酶切鑒定陽性的質(zhì)粒測序，序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動(dòng)序列測定儀進(jìn)行，構(gòu)建成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體命名為pUC18U6。
本發(fā)明以pUC18質(zhì)粒為骨架，構(gòu)建成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體pUC18U6，可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)小干擾核糖核酸，抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，從而可以用于研究相應(yīng)基因的功能；抑制病毒基因、癌基因等致病基因的表達(dá)，則可用于治療病毒性疾病和腫瘤等疾病。與已有的其他載體相比，其特點(diǎn)①采用人源性的U6啟動(dòng)子，更適于人源性細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；②U6啟動(dòng)子下游的Kpn I和EcoR I位點(diǎn)便于定向克隆編碼siRNA的DNA序列。Kpn I位點(diǎn)中的堿基G作為轉(zhuǎn)錄起始的第一個(gè)堿基，不需要考慮轉(zhuǎn)錄起始堿基的問題。③以pUC18質(zhì)粒為骨架，該質(zhì)粒無常用的限制性內(nèi)切酶Xho I的識別位點(diǎn)，將編碼siRNA的DNA序列中的間隔序列設(shè)計(jì)為Xho I識別位點(diǎn)，然后以Xho I和U6啟動(dòng)子上游多克隆位點(diǎn)中的限制性內(nèi)切酶消化重組質(zhì)粒，可根據(jù)是否有約300 bp的片段來鑒定編碼siRNA的DNA序列是否克隆入表達(dá)載體中，避免由于插入的編碼DNA序列較短，限制性酶切和常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳不便鑒定的問題。
權(quán)利要求
1.一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的制備工藝，其特征在于1)根據(jù)人源性U6啟動(dòng)子的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)正向引物5′GCGATCTAGAAAGGTCGGGCAGGAAGAG3′；反向引物5′GCGAGGTACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)；2)擴(kuò)增目的基因用胰酶消化處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞在800-1000rpm轉(zhuǎn)速下離心3-5分鐘，收集2×106-5×106個(gè)細(xì)胞；以200μL的磷酸鹽緩沖液重懸收集的細(xì)胞，再依次加入20μL的蛋白酶K和200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AL，震蕩混勻，在70℃下放置10分鐘，再加入200μL濃度為96％-100％的乙醇，震蕩混勻后，加入到DNeasyTMTissue Kit離心柱中，在8000-10000rpm轉(zhuǎn)速下離心1-2分鐘后，再次加入500μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AW1，以8000-10000rpm轉(zhuǎn)速下離心1-2分鐘，加入500μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AW2，在13000-14000rpm轉(zhuǎn)速下離心3-5分鐘，將DNeasyTMTissue Kit離心柱放到一個(gè)干凈的1.5mL-2mL的離心管中，加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE，室溫下放置1-3分鐘，在8000-10000rpm轉(zhuǎn)速下離心1-2分鐘，再向DNeasyTMTissue Kit離心柱中加入200μL的DNeasyTMTissueKit緩沖液AE，室溫下放置1-3分鐘，在8000-10000rpm轉(zhuǎn)速下離心1-2分鐘，得到HepG2細(xì)胞的基因組DNA；在PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中加入5μl的10×PCR Buffer、3μl濃度為25mmol/L的MgCl2、4μl濃度為2.5mmol/L的dNTP、1μl的Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、5μl的HepG2細(xì)胞的基因組DNA和30μl的純水，在94℃延伸5分鐘后，于94℃延伸30秒、55-65℃延伸30秒、再于72℃延伸1-10分鐘，共循環(huán)25-40次，然后在72℃延伸7-10分鐘，得到PCR產(chǎn)物；3)哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA Fragment Purification Kit純化回收，純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xba I和Kpn I酶切后，與同樣經(jīng)Xba I和Kpn I酶切的pUC18在T4連接酶作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10gold株，以質(zhì)粒純化試劑盒純化重組質(zhì)粒，用Xba I和Kpn I酶切鑒定，挑選酶切鑒定陽性的質(zhì)粒測序，序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動(dòng)序列測定儀進(jìn)行，構(gòu)建成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體命名為pUC18U6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的制備工藝，其特征在于所說的磷酸鹽緩沖液包括0.14mol/L的NaCl、27mmol/L的KCl、101mmol/L的Na2HPO4和18mmol/L的KH2PO4其PH值為7.3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的制備工藝，其特征在于1)根據(jù)人源性U6啟動(dòng)子的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)正向引物5′GCGATCTAGAAAGGTCGGGCAGGAAGAG3′；反向引物5′GCGAGGTACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)；2)擴(kuò)增目的基因用胰酶消化處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞在1000rpm轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，收集2×106個(gè)細(xì)胞，以200μL的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，再依次加入20μL蛋白酶K和200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AL，震蕩混勻，70℃放置10分鐘，再加入200μL濃度為100％的乙醇，震蕩混勻，加入到DNeasyTMTissueKit離心柱中，在8000rpm轉(zhuǎn)速下離心1分鐘，加入500μL的DNeasyTMTissueKk緩沖液AW1，以8000rpm轉(zhuǎn)速下離心1分鐘，加入500μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AW2，在13000rpm轉(zhuǎn)速下離心3分鐘，將DNeasyTMTissueKit離心柱放到一個(gè)干凈的1.5mL的離心管中，加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE，室溫下放置1分鐘，8000rpm轉(zhuǎn)速下離心1分鐘，再向DNeasyTMTissue Kit離心柱加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE，室溫下放置1分鐘，在8000rpm轉(zhuǎn)速下離心1分鐘，得到HepG2細(xì)胞的基因組DNA；在PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中加入5μl的10×PCR Buffer、3μl濃度為25mmol/L的MgCl2、4μl濃度為2.5mmol/L的dNTP、1μl的Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、5μl的HepG2細(xì)胞的基因組DNA和30μl的純水，在94℃延伸5分鐘后，于94℃延伸30秒、60℃延伸30秒、再于72℃延伸1.5分鐘，共循環(huán)35次，然后72℃延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物；3)哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA Fragment Purification Kit純化回收，純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xba I和Kpn I酶切后，與同樣經(jīng)Xba I和Kpn I酶切的pUC18在T4連接酶作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10gold株，以質(zhì)粒純化試劑盒純化重組質(zhì)粒，用Xba I和Kpn I酶切鑒定，挑選酶切鑒定陽性的質(zhì)粒測序，序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動(dòng)序列測定儀進(jìn)行。構(gòu)建成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體命名為pUC18U6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的制備工藝，其特征在于1)根據(jù)人源性U6啟動(dòng)子的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)正向引物5′GCGATCTAGAAAGGTCGGGCAGGAAGAG3′；反向引物5′GCGAGGTACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)；2)擴(kuò)增目的基因用胰酶消化處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，在800rpm轉(zhuǎn)速下離心3分鐘，收集5×106個(gè)細(xì)胞，以200μL的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，再依次加入20μL蛋白酶K和200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AL，震蕩混勻，70℃下放置10分鐘，再加入200μL濃度為96％的乙醇，震蕩混勻，加入到DNeasyTMTissue Kit離心柱中，在10000rpm轉(zhuǎn)速下離心2分鐘，再次加入500μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AW1，在10000rpm轉(zhuǎn)速下離心2分鐘，加入500μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AW2，在14000rpm轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，將DNeasyTMTissue Kit離心柱放到一個(gè)干凈的2mL的離心管中，加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE，室溫下放置3分鐘，的10000rpm轉(zhuǎn)速下離心2分鐘，再向DNeasyTMTissue Kit離心柱加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE，室溫下放置3分鐘，在10000rpm轉(zhuǎn)速下離心2分鐘，得到HepG2細(xì)胞的基因組DNA；在PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中加入5μl的10×PCR Buffer、3μl濃度為25mmol/L的MgCl2、4μl濃度為2.5mmol/L的dNTP、1μl的Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、5μl的HepG2細(xì)胞的基因組DNA和30μl的純水，94℃延伸5分鐘后，于94℃延伸30秒、55℃延伸30秒、再于72℃延伸10分鐘，共循環(huán)25次，然后72℃延伸10分鐘，得到PCR產(chǎn)物；3)哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA Fragment Purification Kit純化回收，純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xba I和Kpn I酶切后，與同樣經(jīng)XbaI和Kpn I酶切的pUC18在T4連接酶作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10gold株，以質(zhì)粒純化試劑盒純化重組質(zhì)粒，用Xba I和Kpn I酶切鑒定，挑選酶切鑒定陽性的質(zhì)粒測序，序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動(dòng)序列測定儀進(jìn)行，構(gòu)建成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體命名為pUC18U6。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的制備工藝，其特征在于1)根據(jù)人源性U6啟動(dòng)子的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)正向引物5′GCGATCTAGAAAGGTCGGGCAGGAAGAG3′；反向引物5′GCGAGGTACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)；2)擴(kuò)增目的基因用胰酶消化處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，在900rpm轉(zhuǎn)速下離心4分鐘，收集3×106個(gè)細(xì)胞，以200μL的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，再依次加入20μL蛋白酶K和200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AL，震蕩混勻，70℃下放置10分鐘，再加入200μL濃度為98％的乙醇，震蕩混勻，加入到DNeasyTMTissue Kit離心柱中，在9000rpm轉(zhuǎn)速下離心2分鐘，再次加入500μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AW1，以9000rpm轉(zhuǎn)速下離心2分鐘，加入500μL的緩沖液AW2，在13000rpm轉(zhuǎn)速下離心4分鐘，將DNeasyTMTissue Kit離心柱放到一個(gè)干凈的1.5mL的離心管中，加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE，室溫下放置2分鐘，在9000rpm轉(zhuǎn)速下離心2分鐘，再向DNeasyTMTissue Kit離心柱加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE，室溫下放置2分鐘，在9000rpm轉(zhuǎn)速下離心2分鐘，得到HepG2細(xì)胞的基因組DNA；在PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中加入5μl的10×PCR Buffer、3μl濃度為25mmol/L的MgCl2、4μl濃度為2.5mmol/L的dNTP、1μl的Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、5μl的HepG2細(xì)胞的基因組DNA和30μl的純水，94℃延伸5分鐘后，于94℃延伸30秒、65℃延伸30秒、再于72℃延伸5分鐘，共循環(huán)40次，然后72℃延伸10分鐘，得到PCR產(chǎn)物；3)哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA Fragment Purification Kit純化回收，純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xba I和Kpn I酶切后，與同樣經(jīng)Xba I和KpnI酶切的pUC18在T4連接酶作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10gold株，以質(zhì)粒純化試劑盒純化重組質(zhì)粒，用Xba I和Kpn I酶切鑒定，挑選酶切鑒定陽性的質(zhì)粒測序，序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動(dòng)序列測定儀進(jìn)行，構(gòu)建成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體命名為pUC18U6。
全文摘要
哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的制備工藝，根據(jù)人源性U6啟動(dòng)子的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，以HepG2細(xì)胞的基因組DNA為模板擴(kuò)增目的基因得到PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI和KpnI酶切后，與同樣經(jīng)XbaI和KpnI酶切的pUC18在T4連接酶作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL－10gold株，以質(zhì)粒純化試劑盒純化重組質(zhì)粒，用XbaI和KpnI酶切鑒定，挑選酶切鑒定陽性的質(zhì)粒測序，序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體pUC18U6，本載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)小干擾核糖核酸，抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，從而可以用于研究相應(yīng)基因的功能；抑制病毒基因、癌基因等致病基因的表達(dá)，則可用于治療病毒性疾病和腫瘤等疾病。
文檔編號C12P21/02GK1462803SQ0313425
公開日2003年12月24日 申請日期2003年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月5日
發(fā)明者劉軍, 郭穎, 薛采芳 申請人:劉軍, 郭穎, 薛采芳