專利名稱：D－丙氨酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用絲狀菌同化DL-丙氨酸中含有的L-丙氨酸，生產(chǎn)D-丙氨酸的方法。
背景技術(shù)：
D-丙氨酸是非天然型氨基酸，是有望用作醫(yī)藥或食品添加劑原料等的化合物。作為D-丙氨酸的制造方法，有例如有機(jī)的不對稱合成法、發(fā)酵法和酶法等由D-丙氨酸以外的化合物制造D-丙氨酸的方法，以及以DL-丙氨酸為原料，利用色譜法的光學(xué)拆分法，外消旋體的分級結(jié)晶法，利用選擇同化法僅回收D-丙氨酸的方法，由于選擇同化法能夠以廉價的DL-丙氨酸為原料簡便地進(jìn)行批量生產(chǎn)，因此選擇同化法的開發(fā)進(jìn)展顯著。
作為選擇同化法，例如，在特公昭42-20683號公報中公開了一種制造光學(xué)活性丙氨酸和丙酮酸的方法，該方法利用具有L-丙氨酸氧化能力的微生物，由DL-丙氨酸生成D-丙氨酸和丙酮酸，然后將其分離。作為該公報中使用的具有L-丙氨酸氧化能力的微生物，使用了除地衣芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、嗜油棒桿菌、凝聚微球菌、克羅斯韋假單胞菌以外，黑曲霉、產(chǎn)黃青霉和熱帶假絲酵母、淺白色隱球酵母、清酒糖酵母等屬于絲狀菌和酵母的菌株。實(shí)施例中，通過離心分離，除去發(fā)酵液中的菌體后，通過離子交換樹脂得到D-丙氨酸和丙酮酸。
此外，在特公平8-8878號公報中，公開了在含有DL-丙氨酸作為唯一碳源和唯一氮源的培養(yǎng)基中，利用酵母同化L-丙氨酸，收集D-丙氨酸的方法。通過用特定碳源和特定氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)特定的酵母，能夠以數(shù)10g/L以上的蓄積濃度制造D-丙氨酸。
另外，作為用酵母選擇同化的方法，特公平2-49598號公報中公開了一種D-丙氨酸的制造方法，用能夠不經(jīng)過丙酮酸而選擇性地僅分解DL-丙氨酸中的L-丙氨酸的微生物進(jìn)行同化。
但是，按照特公昭42-20683號公報中記載的方法，用黑曲霉等絲狀菌同化L-丙氨酸可得到D-丙氨酸，但是由于在同化的同時生成丙酮酸，因此為了僅分離出D-丙氨酸，其它的分離手段是必需的。特別是，按照該公報的方法進(jìn)行了堿中和，因此副產(chǎn)物丙酮酸作為不穩(wěn)定的丙酮酸鹽共存，從而產(chǎn)生分解物。而且，使用絲狀菌的場合，蓄積濃度的值非常低，為約9g/L。
此外，特公平8-8878號公報和特開平2-49598號記載的方法都使用了酵母，因此要將發(fā)酵液中的酵母分離出來，有必要進(jìn)行精密過濾、超濾、高速離心分離的步驟，實(shí)際上也并不容易。
一般來說，酵母的菌體大小為1～5μm左右，由于酵母菌體可通過濾紙，所以不能使用固液分離中所用的過濾法從發(fā)酵液中分離酵母菌體，需要進(jìn)行精密過濾或超濾等使用具有微細(xì)孔徑的特殊分離膜進(jìn)行處理，或采用高速離心分離等步驟。與普通的過濾方法相比，使用特殊分離膜的方法透過速度慢，所以處理時間長。此外，用特殊分離膜分離培養(yǎng)液中的菌體時，菌體以外的懸浮微粒、蛋白質(zhì)、各種微生物代謝物等成分堆積在膜的表面，導(dǎo)致過濾效率降低，此外也會降低價格昂貴的過濾膜的壽命。而且，采用高速離心分離時，裝置本身一般較昂貴，而且由于要在高速下進(jìn)行處理，動力成本必然也很高。
在這種狀況下，希望開發(fā)一種更簡便，而且收率高的制造D-丙氨酸的選擇同化法。
發(fā)明公開本發(fā)明對采用選擇同化法制造D-丙氨酸的方法進(jìn)行了詳細(xì)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用絲狀菌能夠以高收率僅同化L-氨基酸，而實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸，而且由于使用絲狀菌，培養(yǎng)基的確定、培養(yǎng)條件、以及菌體的分離都非常簡便，由于培養(yǎng)基的組成簡單且菌體分離容易，所以通過隨后的D-丙氨酸的精制步驟，即可得到高純度的目的物，從而完成了本發(fā)明。亦即，本發(fā)明提供一種D-丙氨酸的制造方法，其特征在于，使絲狀菌作用于含DL-丙氨酸的溶液，同化L-丙氨酸，而實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸。
根據(jù)本發(fā)明，能夠使用絲狀菌由DL-丙氨酸有效地制造D-丙氨酸。特別是由于絲狀菌的菌體容易分離，因此目的物D-丙氨酸的分離也就簡便。此外，同化L-丙氨酸時不產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸，所以不需要與D-丙氨酸分離的操作。
發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明的第一個方面是一種D-丙氨酸的制造方法，其特征在于，使絲狀菌作用于含DL-丙氨酸的溶液，同化L-丙氨酸，而實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸。本發(fā)明的特征在于，用絲狀菌作用于含DL-丙氨酸的溶液。這是因?yàn)榻z狀菌營養(yǎng)缺陷性少，而且如其名稱所示，在培養(yǎng)的條件下形成菌絲，因此能夠以小丸狀、塊狀培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含有的菌體比較容易分離。此外，由于實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸，即使中和培養(yǎng)液，也不會存在不穩(wěn)定的丙酮酸鹽，隨后的D-丙氨酸的分離也就容易。
首先，作為底物的DL-丙氨酸并不限于含有等量的D-丙氨酸和L-丙氨酸的場合，只要含有D-丙氨酸，兩者的比例不限。但是，由于選擇同化法將L-丙氨酸同化，僅殘留D-丙氨酸，因此優(yōu)選使用D-丙氨酸含量高的底物。
作為本發(fā)明中優(yōu)選使用的絲狀菌，是屬于曲霉屬、青霉屬、毛霉屬、根霉屬、卷霉屬、枝孢屬、木霉屬、散囊菌屬(Eurotium)、毛殼霉屬、短柄霉屬、地霉屬、以及擬青霉屬，在特定培養(yǎng)條件下作用于DL-丙氨酸，同化L-丙氨酸，且不產(chǎn)生丙酮酸的絲狀菌。作為這種絲狀菌，優(yōu)選黑曲霉(Aspergillus niger)IAM 2561、溜曲霉(Aspergillus tamarii)IFO 4099、家蠅卷霉(Circinella muscae)IFO 4457、芽枝狀枝孢(Cladosporium cladosporioides)IFO 4459、總狀毛霉(Mucor racemosus f.sp.Racemosus)IFO 4581、reesei木霉(Trichoderma reesei)IFO 31326、米根霉(Rhizopus oryzae)、黃曲霉(Aspergillus flavus)IFO 7599、OI-164、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)IFO 4626、IFO 4640、IFO 6223、IFO32030、不明毛霉(Mucor ambiguus)IFO 8092、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)IFO 4574。本發(fā)明中，可以單獨(dú)使用這些絲狀菌中的1種，也可以2種以上混合使用。
使這些絲狀菌作用于DL-丙氨酸同化L-丙氨酸時，通過選擇特定的培養(yǎng)基，能夠不產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸，而只分離出D-丙氨酸。
作為上述絲狀菌的營養(yǎng)源，可以使用通常使用的碳水化合物、氮源、無機(jī)物等可同化的營養(yǎng)源。例如，作為碳源，可以單獨(dú)使用或者作為混合物使用玉米淀粉、玉米面、淀粉、糊精、麥芽、葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜等。作為氮源，可以單獨(dú)使用或者作為混合物使用硫酸銨、硝酸鈉、大豆粉、玉米漿、谷膠粉、肉汁、脂肉骨粉、酵母提取物、干酵母、棉籽粉、蛋白胨、聚蛋白胨、小麥胚芽、魚粉、肉粉、脫脂米糠、脫脂肉骨粉、麥芽提取物、玉米谷膠粉等無機(jī)或有機(jī)氮源。作為無機(jī)鹽，可以單獨(dú)使用或作為混合物使用碳酸鈣、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、溴化鈉、硼酸鈉、或磷酸二氫鉀、硫酸鋅、硫酸鎂等各種無機(jī)鹽。此外，根據(jù)需要，也可以添加微量的鐵、錳、鋅、鈷、鉬酸等重金屬。另外，為了抑制加熱滅菌時和培養(yǎng)過程中的發(fā)泡，也可添加大豆油、亞麻子油等植物油，十八烷醇等高級醇類，各種硅等消泡劑。對如上所述的營養(yǎng)源的配合比例沒有特別的限定，而且可以在寬范圍內(nèi)變動，通過簡單的小規(guī)模實(shí)驗(yàn)，可以容易地根據(jù)使用條件決定最適的營養(yǎng)源的組成及配合比例。
本發(fā)明中，作為預(yù)培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，雖然根據(jù)使用的絲狀菌及其后的培養(yǎng)條件而不同，但優(yōu)選使用碳源為0～100g/L，更優(yōu)選為20～80g/L；氮源為0.5～50g/L，更優(yōu)選為1～15g/L；無機(jī)物質(zhì)為0.5～5g/L，更優(yōu)選為0.6～2g/L的培養(yǎng)液。
其次，如上所述增殖的絲狀菌隨后接種于主培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中，制造D-丙氨酸。作為該主培養(yǎng)用的培養(yǎng)基組成，為DL-丙氨酸10～150g/L，含L-丙氨酸的氮源5.0～75g/L，無機(jī)鹽類0.1～5g/L。即，本發(fā)明雖然在預(yù)培養(yǎng)中使絲狀菌在添加了糖類的培養(yǎng)基中增殖，但在主培養(yǎng)中，可以完全不添加糖類，而制造D-丙氨酸。如果添加糖類，成本增加，而且還必須進(jìn)行分離糖分的步驟，這是不利的。但是，本發(fā)明能夠用上述組成進(jìn)行主培養(yǎng)，因此可以簡化精制步驟，而且還可降低配制培養(yǎng)基所需的費(fèi)用。特別優(yōu)選用實(shí)質(zhì)上僅以L-丙氨酸作為碳源和氮源，并在其中添加少量無機(jī)鹽的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)然，也可以添加上述預(yù)培養(yǎng)中所用的營養(yǎng)源，但添加葡萄糖等糖作為碳源的埸合，由于絲狀菌在生長中對該糖的利用優(yōu)先于L-丙氨酸，所以存在實(shí)質(zhì)上延遲L-丙氨酸的同化的趨勢。此外，由于通過菌的糖代謝生成了副產(chǎn)物，且殘留有未同化的糖，有時以后的精制會變得困難。另外，雖然也可以添加上述預(yù)培養(yǎng)中所示的氮源，但這些氮源一般較昂貴，而且會造成培養(yǎng)液的著色，而使以后的精制變得困難。即，優(yōu)選用實(shí)質(zhì)上僅以L-丙氨酸作為碳源和氮源，并在其中添加少量無機(jī)鹽的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，為了更好地進(jìn)行培養(yǎng)，在不出現(xiàn)上述問題的范圍內(nèi)，也可以添加少量的營養(yǎng)源。這樣，通過利用適合于特定培養(yǎng)基的絲狀菌，由于菌在生長中實(shí)質(zhì)上只利用L-丙氨酸作為碳源和氮源，所以不生成丙酮酸等副產(chǎn)物，即使生成，也控制在極少量，這樣就能夠得到實(shí)質(zhì)上只含D-丙氨酸的培養(yǎng)液，可以簡化精制步驟，使配制培養(yǎng)基所需的費(fèi)用降低。
另外，作為在主培養(yǎng)的培養(yǎng)基中可以添加的碳源，可以使用玉米淀粉、淀粉、葡萄糖、蔗糖、糖蜜等的1種或2種以上。作為氮源，可以僅使用L-丙氨酸，但也可以使用大豆粉、玉米漿、谷膠粉、肉汁、脂肉骨粉、酵母提取物、干酵母、蛋白胨、聚蛋白胨、小麥胚芽等的1種或2種以上。以上的碳源、氮源不一定必須加入。優(yōu)選添加的無機(jī)鹽，有磷酸二氫鉀、硫酸鎂。
此外，主培養(yǎng)用的培養(yǎng)基優(yōu)選在培養(yǎng)前用酸或堿調(diào)節(jié)pH，使滅菌后的pH為5～7左右。
作為本發(fā)明的絲狀菌的孢子的接種方法，沒有特別的限定，通常可以采用將上述孢子懸浮在下述液體中，然后將所得的懸浮液直接接種到發(fā)酵用的液體培養(yǎng)基中等進(jìn)行接種的方法等。
作為上述孢子的懸浮方法，例如，可以采用下述方法在瓊脂斜面培養(yǎng)基上生長，在形成了該孢子的絲狀菌的菌體中加入液體，進(jìn)行混合的方法。另外，作為上述液體，通常使用無菌水，但作為在生物化學(xué)領(lǐng)域中使用的液體，也可以使用例如添加了少量(例如，相對于液體總量，為0.01-0.1g/L)Tween-80(注冊商標(biāo))等Tween類表面活性劑、Triton X系列(注冊商標(biāo)等)等Triton類表面活性劑、酰基脫水山梨醇等的無菌水。這樣，可以更有效地將孢子分散在無菌水中，從而得到均勻的懸浮液。
用所述培養(yǎng)基培養(yǎng)本菌株，原則上可以按照一般制造D-氨基酸時通常使用的液體培養(yǎng)進(jìn)行。液體培養(yǎng)的場合，可以采用靜置培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)中的任何一種實(shí)施。本發(fā)明中，特別優(yōu)選振蕩培養(yǎng)、深部通氣攪拌培養(yǎng)。在培養(yǎng)中，優(yōu)選好氧培養(yǎng)，空氣的導(dǎo)入量優(yōu)選為0.1-2vvm；更優(yōu)選為0.5-1.2vvm。對于滿足這種條件的培養(yǎng)裝置，沒有特殊的限定，優(yōu)選用通入空氣或純氧氣，或者兩者的混合氣體的同時攪拌的攪拌式反應(yīng)器、或空氣提升式反應(yīng)器中的任意一種進(jìn)行培養(yǎng)。特別是空氣提升式反應(yīng)器，菌絲不會纏繞在攪拌葉片上，在防止菌絲本身破損的方面也很優(yōu)良。
而且，作為培養(yǎng)操作，可以通過導(dǎo)入空氣或氧氣進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)；每次用新的培養(yǎng)液進(jìn)行批式培養(yǎng)；或者供給新的培養(yǎng)液進(jìn)行半批式培養(yǎng)。
另一方面，底物DL-丙氨酸只要以20-400g/L，尤其是40-200g/L的濃度供給反應(yīng)液即可，可以在反應(yīng)開始時加入全量，也可以分次添加。在這種場合，底物的濃度為10-150g/L，更優(yōu)選為20-100g/L。如果降至10g/L以下，則會降低D-丙氨酸的生產(chǎn)效率，反之，如果濃度超過150g/L，會使絲狀菌的生長變得困難。
對培養(yǎng)的溫度沒有特定的限制，只要在同化L-丙氨酸，且實(shí)質(zhì)上不抑制本菌株增殖的范圍即可，一般來說，20-40℃，優(yōu)選30-50℃的范圍內(nèi)的溫度合適。
培養(yǎng)時間可以根據(jù)L-丙氨酸同化的時間推移、反應(yīng)器的種類等綜合判斷。例如，在上述曲霉屬、青霉屬、毛霉屬、根霉屬、卷霉屬、枝孢屬、木霉屬、散囊菌屬、毛殼霉屬、短柄霉屬、地霉屬、擬青霉屬的絲狀菌的場合，采用分批式實(shí)施時，L-丙氨酸在20-200小時，更優(yōu)選在40-120小時內(nèi)可以完全同化。另一方面，該絲狀菌即使經(jīng)過連續(xù)操作，L-丙氨酸同化活性的降低也很少，因此，可以在分批式、或半批式中再使用，或連續(xù)使用。連續(xù)使用時，可通過隨時間經(jīng)過檢查該菌的L-丙氨酸同化活性，適當(dāng)?shù)卣{(diào)整培養(yǎng)時間。
本發(fā)明中，使絲狀菌作用于含DL-丙氨酸的溶液，同化L-丙氨酸而實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸，可以得到含有D-丙氨酸的溶液。另一方面，伴隨著該L-丙氨酸的同化，L-丙氨酸分解為氨、二氧化碳、草酸、水等。因此，通過在用酸類中和同化所產(chǎn)生的氨的同時進(jìn)行，或者在用堿中和同化所產(chǎn)生的草酸的同時進(jìn)行，可將培養(yǎng)基的pH控制在適合于絲狀菌同化L-丙氨酸的中性附近，更具體是控制pH在4-8，更適合控制在5-7。因?yàn)楸景l(fā)明中使用的絲狀菌不產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸，上述副產(chǎn)物的中和處理實(shí)質(zhì)上是可以實(shí)現(xiàn)的。也就是說，正如由丙酮酸的結(jié)構(gòu)可知的那樣，因?yàn)樗且环N通過脫羧而非常容易分解的化合物，培養(yǎng)基中生成丙酮酸的場合，如果為了處理其他副產(chǎn)物而進(jìn)行中和處理等，則同時也中和處理了丙酮酸，而與氨和草酸的鹽共存。因?yàn)樵摫猁}很容易分解，在處理副產(chǎn)物鹽時也發(fā)生分解，所以實(shí)質(zhì)上不能將副產(chǎn)物從培養(yǎng)液中分離。即，按照本發(fā)明，使用了不產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸的絲狀菌，因此以后的D-丙氨酸的精制步驟非常容易，而且收率高。另外，本申請說明書中的“實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生副產(chǎn)物”丙酮酸是指完全不產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸，或該副產(chǎn)物的量相對于丙氨酸為0.1摩爾％以下。
其中，作為中和氨時可以使用的酸類，有硫酸、鹽酸、硝酸、醋酸、草酸、磷酸等，特別優(yōu)選使用硫酸、磷酸。通過硫酸和氨產(chǎn)生硫酸銨，該物質(zhì)可以通過離子交換樹脂或電透析除去。添加酸時，可將濃度調(diào)節(jié)為2.5-25質(zhì)量％，更優(yōu)選為5-20質(zhì)量％，可以在測定培養(yǎng)基中含有的氨量的同時，滴加入中和量的酸。也可以在培養(yǎng)過程中，通過用pH傳感器或pH控制器進(jìn)行添加，自動地將pH維持在適當(dāng)?shù)闹怠?br> 此外，產(chǎn)生副產(chǎn)物草酸的場合，作為中和該副產(chǎn)物所用的堿，有碳酸鈣、氫氧化鈉、氨水、氨氣，特別優(yōu)選使用氨水、氫氧化鈉。另外，為了達(dá)到此目的，也可以在培養(yǎng)基滅菌之前加入碳酸鈣，或者在培養(yǎng)過程中，用pH傳感器或pH控制器添加氫氧化鈉水溶液或者氨水或氨氣等，自動地將pH維持在適當(dāng)?shù)闹?。根?jù)絲狀菌的種類，在同時產(chǎn)生副產(chǎn)物草酸和氨的場合，由于該氨可中和草酸，所以通過添加不足量的氨中和草酸即可。
另外，本發(fā)明中的“中和”，是指通過在氨中加入酸類，或者在草酸中加入堿，而消除其堿性或酸性的操作，不一定意味著pH達(dá)到7。通過上述中和操怍，將培養(yǎng)基的pH控制在4-8，更優(yōu)選5-7。這樣，可以在適合所使用的絲狀菌同化L-丙氨酸的同時，將副產(chǎn)物與D-丙氨酸分離。
本發(fā)明中，從培養(yǎng)液分離菌體，可以用過濾、離心分離、壓濾等以前公知的菌體分離方法進(jìn)行。其中，對于分離浮游于培養(yǎng)液中的菌絲和菌體來說，過濾很簡便，因此優(yōu)選。
如上所述，本發(fā)明中，通過使絲狀菌作用于DL-丙氨酸，使L-丙氨酸分解為氨、二氧化碳、草酸、水等，而實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸。因此，從培養(yǎng)液中除去了菌體后的分離液中，以D-丙氨酸為主成分，還含有在制備培養(yǎng)基時使用且其分解后殘留的微量氨基酸等，所以之后的D-丙氨酸的精制分離非常容易。另外，該分離精制的容易性不單是指與丙酮酸分離的容易性。如上所述，丙酮酸是對熱等非常不穩(wěn)定的化合物，容易產(chǎn)生二氧化碳而分解，在L-丙氨酸同化的同時產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸的場合，必須設(shè)定丙酮酸和丙酮酸鹽的分離條件，并進(jìn)一步選擇這些物質(zhì)不分解的溫和條件，或者進(jìn)行這些物質(zhì)的分解物的分離操作。例如，如果副產(chǎn)物僅僅是氨，可以加熱分離液，將氨作為氣體除去，但含有丙酮酸的場合，就不能進(jìn)行這樣的加熱處理。而且，在不加熱的場合，即使用離子交換樹脂分離，丙酮酸也會在樹脂內(nèi)分解，使pH發(fā)生變化，導(dǎo)致與D-丙氨酸的分離能力劣化。但是，由于本發(fā)明中不含有丙酮酸，所以這種離子交換樹脂的分離能力降低也少。即，由于本發(fā)明中不產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸，菌體分離后的分離液以D-丙氨酸作為主要成分，從該分離液中分離收集D-丙氨酸也變得非常簡便，能夠高收率地制造D-丙氨酸。
本發(fā)明中，從除去了菌體的分離液中分離收集D-丙氨酸，可以采用電透析法、離子交換樹脂法、離子交換法·草酸鈣·硫酸鈣沉淀法等進(jìn)行，特別是用電透析或離子交換樹脂法能夠有效地分離收集D-丙氨酸。在本發(fā)明中，由于分離液中含有的氨基酸以D-丙氨酸為主要成分，通過電透析，透析膜內(nèi)僅殘留D-丙氨酸，所以能夠進(jìn)行分離。
此外，使用離子交換樹脂從分離液中分離D-丙氨酸的場合，特別優(yōu)選使用氨型離子交換樹脂，使D-丙氨酸吸附在該離子交換樹脂上后，用氨洗脫。這是因?yàn)樵诜蛛xD-丙氨酸的同時，能夠使離子交換樹脂恢復(fù)至氨型，便于再使用。優(yōu)選的離子交換樹脂有三菱化學(xué)公司生產(chǎn)的“Diaion SK1B”、Organo公司生產(chǎn)的“Amberlite IR-120B”、Dow化學(xué)公司生產(chǎn)的“DOWEX HGR”和“DOWEX HGR”等。
具體地說，以與電透析處理所用的發(fā)酵液相同的發(fā)酵液作為對象，在該發(fā)酵液中加入濃硫酸，將pH調(diào)至1。另一方面，使氨水通過充填在玻璃制柱內(nèi)的離子交換樹脂，使其成為NH4+型，然后用去離子水洗凈。樹脂量調(diào)整至交換基團(tuán)/丙氨酸的摩爾比為1-6，更優(yōu)選為2-5。使發(fā)酵液通過離子交換樹脂，此時的通液速度優(yōu)選空間速度為0.2-5，更優(yōu)選為0.4-4。使發(fā)酵液通過后，使水流過，使硫酸洗出。隨后，流過1摩爾的氨水，使吸附在樹脂上的丙氨酸洗脫出來，使過量的氨流過，能夠使樹脂再成為NH4+型。另外，洗脫液中含有的氨可以通過加熱除去。
此外，除去菌體后的分離液中所含的草酸鹽對水的溶解度低。因此，可以通過利用其與D-丙氨酸的溶解度差的分離方法進(jìn)行分離。具體而言，通過使草酸鹽沉淀，可以分離。另外，D-丙氨酸、L-丙氨酸的定量通過HPLC進(jìn)行。
實(shí)施例以下，用實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。另外，“％”表示“質(zhì)量％”。此外，D，L-丙氨酸的HPLC分析條件為柱住化分析中心生產(chǎn)的“OA-6100”；柱徑×柱長4.6mmφ×150mm；移動相1mM硫酸銅水溶液；流速1ml/min；檢測器UV檢測器；波長254nm。
(實(shí)施例1-5)將表1所示組成的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基分裝入規(guī)定容量的三角燒瓶中，121℃下高壓滅菌15分鐘后，用作預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基。將表2所示規(guī)定量的菌以一鉑金環(huán)或孢子懸浮液接種入該預(yù)培養(yǎng)基中，在表2所示的條件下，于旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)后，將預(yù)培養(yǎng)液按表4所示的規(guī)定量接種入表3所示的滅菌的主培養(yǎng)培養(yǎng)基(坂口氏燒瓶)中，用燒瓶進(jìn)行培養(yǎng)。使用的絲狀菌如表5所示。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液在3600rpm下離心分離10分鐘，除去菌體，將上清液稀釋至規(guī)定濃度，用HPLC進(jìn)行分析，分別求得D型和L型的殘留量。
各預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如表1所示；其預(yù)培養(yǎng)條件如表2所示；主培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成如表3所示；主培養(yǎng)條件如表4所示。此外，分離液的分析結(jié)果如表5所示。另外，表5中，左欄的數(shù)值表示實(shí)施例1-5；L型、D型的數(shù)值表示培養(yǎng)基中各自殘存的質(zhì)量(g/L)；培養(yǎng)一欄表示培養(yǎng)時間(hr)。
表1預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基

表2預(yù)培養(yǎng)條件

表3主培養(yǎng)培養(yǎng)基

表4主培養(yǎng)條件

表5

(實(shí)施例6-9)按常規(guī)方法，將實(shí)施例1-5中使用的全部菌種進(jìn)行單孢子分離操作，選擇其中表現(xiàn)出優(yōu)良活性的菌株，用此菌株在3L的發(fā)酵缶中進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
將表6所示組成的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基分裝入規(guī)定容量的三角燒瓶中，121℃下高壓滅菌15分鐘后，用作預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基。將表7所示量的孢子接種入該預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)搖床上進(jìn)行表7所示的培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)后，在裝入表8所示的主培養(yǎng)培養(yǎng)基并滅菌的3L發(fā)酵缶中，接種入規(guī)定量的預(yù)培養(yǎng)液，在表9所示的條件下，通氣攪拌培養(yǎng)。使用的絲狀菌如表10所示。另外，在主培養(yǎng)期間，針對產(chǎn)生的氨，通過添加10％的硫酸水溶液；針對產(chǎn)生的副產(chǎn)物草酸，通過添加4重量％的氨水，調(diào)節(jié)pH，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液在3600rpm下離心分離10分鐘，除去菌體，將上清液稀釋至規(guī)定濃度，用HPLC進(jìn)行分析，分別求得D型和L型的殘留量。
各預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如表6所示；該預(yù)培養(yǎng)條件如表7所示；主培養(yǎng)培養(yǎng)基組成如表8所示；主培養(yǎng)條件如表9所示。另外，表10中，左欄的數(shù)值表示實(shí)施例6-9；L型、D型的數(shù)值表示培養(yǎng)基中各自殘存的質(zhì)量(g/L)；培養(yǎng)一欄表示培養(yǎng)時間(h)。
表6預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基

表7預(yù)培養(yǎng)條件

表8主培養(yǎng)培養(yǎng)基

表9主培養(yǎng)條件

表10

(實(shí)施例10)將含有50g/L淀粉，10g/L葡萄糖，5g/L聚蛋白胨，1g/L磷酸二氫鉀，0.5g/L硫酸鎂七水合物的培養(yǎng)基(pH6.0)110ml分裝入500ml錐形瓶內(nèi)，121℃下高壓滅菌15分鐘后用作預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基。將產(chǎn)黃青霉IFO 4626按1×106個/mL培養(yǎng)基的孢子濃度接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，使用旋轉(zhuǎn)振蕩器，在30℃，220rpm下培養(yǎng)21小時。另一方面，將含有150g/L DL-丙氨酸，1g/L酵母提取物，1g/L聚蛋白胨，1g/L磷酸二氫鉀，1g/L硫酸鎂七水合物，0.5ml/l消泡劑的培養(yǎng)基2L裝入3L的小型發(fā)酵缸內(nèi)，121℃下高壓滅菌15分鐘后用作主培養(yǎng)培養(yǎng)基。在該主培養(yǎng)培養(yǎng)基中，將先前的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基按5％接種，在30℃、1.0vvm下通氣攪拌培養(yǎng)。另外，在主培養(yǎng)過程中，在加入10％硫酸水溶液調(diào)節(jié)保持pH5.5的同時進(jìn)行培養(yǎng)。在120小時內(nèi)，使培養(yǎng)基中的L-丙氨酸完全同化，得到2.2L含有149g D-丙氨酸、81g硫酸銨的培養(yǎng)液。
由該培養(yǎng)液通過過濾(桐山制作所生產(chǎn)的濾紙No.5A，孔徑7.0μm)除去菌體。在所得的液體中加入硫酸，調(diào)節(jié)至pH1，以SV＝1通過充填有離子交換樹脂(三菱化學(xué)公司生產(chǎn)的Diaion SK-1B(NH4+型))的柱，使之吸附D-丙氨酸。用水將該柱充分洗滌后，用2％的氨水洗脫D-丙氨酸。該洗脫液用活性碳脫色，濃縮結(jié)晶后，得到147g精制的D-丙氨酸。所得的D-丙氨酸的光學(xué)純度為99.9％ee以上，化學(xué)純度為99.9％以上。
(實(shí)施例11)在按實(shí)施例10的條件進(jìn)行培養(yǎng)并除去菌體后的培養(yǎng)液中，添加28％的氨水，調(diào)節(jié)至丙氨酸的等電點(diǎn)pH6.0，然后進(jìn)行電透析，電導(dǎo)率充分降低后，回收樣品室中的液體，得到D-丙氨酸溶液。該溶液用活性碳脫色，濃縮結(jié)晶后，得到145g精制的D-丙氨酸。所得的D-丙氨酸的光學(xué)純度為99.9％ee以上，化學(xué)純度為99.9％以上。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明是用絲狀菌同化DL-丙氨酸中所含的L-丙氨酸，制造D-丙氨酸的方法，由于絲狀菌可簡便地與培養(yǎng)液分離，而且培養(yǎng)液中不含丙酮酸，因此能夠有效地制造D-丙氨酸。
權(quán)利要求
1.一種D-丙氨酸的制造方法，其特征在于，使絲狀菌作用于含有DL-丙氨酸的溶液，同化L-丙氨酸，而實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸。
2.一種D-丙氨酸的制造方法，該方法包括以下步驟使絲狀菌作用于含有DL-丙氨酸的溶液，同化L-丙氨酸，而實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸，獲得含有D-丙氨酸的溶液；分離該含有D-丙氨酸的溶液中所含的絲狀菌，得到分離液；以及從該分離液中分離收集D-丙氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制造方法，其中，獲得該含有D-丙氨酸的溶液的步驟是在用酸類中和同化產(chǎn)生的氨的同時進(jìn)行的步驟，或者是在用堿中和同化產(chǎn)生的草酸的同時進(jìn)行的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制造方法，其中，從該分離液中分離D-丙氨酸的步驟采用電透析或離子交換樹脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制造方法，其中，離子交換樹脂為氨型陽離子交換樹脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，絲狀菌為曲霉屬、青霉屬、毛霉屬、根霉屬、卷霉屬、枝孢屬、木霉屬、散囊菌屬、毛殼霉屬、短柄霉屬、地霉屬、擬青霉屬中的任意1種以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)所述的制造方法，其中，絲狀菌為黑曲霉(Aspergillus niger)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)、不明毛霉(Mucor ambiguus)、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、家蠅卷霉(Circinella muscae)中的任意1種以上。
全文摘要
本發(fā)明的特征在于是絲狀菌作用于含有DL－丙氨酸的溶液，同化L－丙氨酸，而不產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮酸。因?yàn)榻z狀菌能夠從培養(yǎng)液中簡便地分離，而且培養(yǎng)液中不含丙酮酸，所以能夠有效地制造D－丙氨酸。要從分離液中分離出D－丙氨酸，可以用離子交換樹脂等進(jìn)行處理。作為這種絲狀菌，可以使用市售的曲霉屬、青霉屬、毛霉屬、根霉屬、卷霉屬、枝孢屬、木霉屬、散囊菌屬、毛殼霉屬、短柄霉屬、地霉屬、擬青霉屬等。
文檔編號C12P41/00GK1599798SQ0282421
公開日2005年3月23日 申請日期2002年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月4日
發(fā)明者植田浩之 申請人:株式會社武藏野化學(xué)研究所