專(zhuān)利名稱(chēng)：：調(diào)節(jié)病毒載體所攜帶的基因的表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種方法，該方法通過(guò)使用非甾體類(lèi)抗炎藥物及諸如此類(lèi)的藥物，來(lái)調(diào)節(jié)病毒載體上所攜帶的基因的表達(dá)。
背景技術(shù)：
：病毒載體已被應(yīng)用于許多基因轉(zhuǎn)移的方法，包括基因治療，因?yàn)樗鼈兡軐⒒蚋咝мD(zhuǎn)入細(xì)胞中，并因此有助于轉(zhuǎn)入基因的高表達(dá)。但是，目前不知道哪些方法可用于調(diào)節(jié)通過(guò)病毒載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞的基因的表達(dá)。開(kāi)發(fā)用于調(diào)節(jié)病毒載體所攜帶的基因的表達(dá)，或是用于降低其細(xì)胞毒性的方法，是令人期待的。Chen等報(bào)告了阿司匹林(aspirin)抑制水泡性口炎病毒(VSV)的復(fù)制(Chen，N.等.，Virology276，44-51(2000))。但是，Chen等并沒(méi)有揭示阿司匹林對(duì)于VSV病毒上所攜帶的基因的表達(dá)的影響。同樣地，Chen等沒(méi)有建議應(yīng)用阿司匹林來(lái)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)移中所用載體上所攜帶的基因的表達(dá)，也沒(méi)有檢驗(yàn)去除阿司匹林時(shí)，是否可能可逆地調(diào)節(jié)病毒復(fù)制。在近幾年里，病毒的基因操作已經(jīng)促進(jìn)了能在腫瘤細(xì)胞中增殖、但在正常組織中無(wú)致病性的增殖型病毒載體的發(fā)展。在這些增殖型病毒中，單純皰疹病毒(HSV)，腺病毒和呼腸孤病毒正引起關(guān)注。免疫基因治療和自殺基因治療作為提高增殖型病毒充當(dāng)基因表達(dá)載體的效果的方法正在吸引關(guān)注。另有人研究了組織特異性啟動(dòng)子在提高增殖型載體的特異性方面的用途(Fujidou，N.，Genediagnosisandtherapyforbraintumors，F(xiàn)rontlinegenetherapyresearch，Braintumortreatmentusingmultipliableviralvectors，Nounokagaku(BrainScience)，Vol.23，No.5,379-387,2001)。作為一種載體，HSV的特點(diǎn)在于它可以瞬時(shí)表達(dá)目的基因，并且可以轉(zhuǎn)染進(jìn)非分裂細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞。HSV載體引起關(guān)注是因?yàn)樗挂韵赂黜?xiàng)成為可能1)應(yīng)用HSV破壞細(xì)胞的能力；2)使用攻擊特定腫瘤細(xì)胞的肝癌細(xì)胞特異性改良HSV病毒株；3)使用缺失型HSV病毒株，該病毒株使用擴(kuò)增子質(zhì)粒和輔助HSV(Miyatake，S.，Developmentandprospectsofviralvectorsusedforgenetherapy，HerpesSimplexVirusasavectorforgenetherapy，Virus，Vol.47，No.2239-246，1997)。病毒載體如單純皰疹病毒、腺病毒和呼腸孤病毒的優(yōu)點(diǎn)是可被積極地應(yīng)用于細(xì)胞毒治療中。但是，沒(méi)有細(xì)胞就不能生產(chǎn)出這些載體，并且因此，當(dāng)為了醫(yī)學(xué)應(yīng)用而大量生產(chǎn)時(shí)因?yàn)榕囵B(yǎng)細(xì)胞不能提供充足數(shù)量的這些病毒，它們的優(yōu)點(diǎn)就成了缺點(diǎn)。如果在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中可以使用調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性的藥物，那么添加藥物有望產(chǎn)生病毒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種方法，該方法使用非甾體類(lèi)抗炎藥物(NSAID)或/和肌肉松弛劑來(lái)調(diào)節(jié)病毒載體上所攜帶的基因的表達(dá)。本發(fā)明也提供了調(diào)節(jié)病毒載體上所攜帶的基因的表達(dá)的制劑。本發(fā)明人深入研究了將不同藥物應(yīng)用于哺乳動(dòng)物(包括人)對(duì)病毒載體所攜帶的基因表達(dá)的影響。令人驚訝的是，研究結(jié)果顯示NSAID和肌肉松弛劑具有顯著抑制病毒載體所攜帶的基因的表達(dá)的活性。在轉(zhuǎn)染有病毒載體的細(xì)胞中，顯示此載體所攜帶的基因的表達(dá)被所有試驗(yàn)的NSAID顯著抑制，包括阿司匹林、酮洛芬(ketoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、雙氯芬酸(diclofenacacid)和甲芬那酸(mefenamicacid)。罌粟堿(papaverin)，一種平滑肌松弛劑，也強(qiáng)烈抑制病毒載體所攜帶的基因的表達(dá)。這些制劑對(duì)由載體轉(zhuǎn)移造成的細(xì)胞毒性的影響作用，可以在已被病毒載體轉(zhuǎn)移的細(xì)胞中檢測(cè)。結(jié)果表明，在這些細(xì)胞中，阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬以及吲哚美辛在減少細(xì)胞損傷上非常有效。在上述藥物中，阿司匹林和酮洛芬在抑制細(xì)胞毒性方面尤其有效。對(duì)于病毒載體攜帶基因的表達(dá)抑制的深入研究揭示出，阿司匹林的抑制作用是暫時(shí)的，在停止用藥后的幾天內(nèi)消失。這說(shuō)明給藥本發(fā)明的制劑，可以可逆調(diào)節(jié)病毒載體攜帶基因的表達(dá)，或調(diào)節(jié)病毒載體的細(xì)胞毒性。因此，當(dāng)調(diào)節(jié)不再是必需的時(shí)候，對(duì)本發(fā)明制劑的給藥可以停止，繼而病毒載體表達(dá)的調(diào)節(jié)作用可以被逆轉(zhuǎn)。按要求停止使用該制劑，病毒載體攜帶基因的表達(dá)可以恢復(fù)。因此，采用本發(fā)明，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒載體所攜帶的基因的表達(dá)進(jìn)行的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。本發(fā)明的藥物可以快速調(diào)節(jié)病毒載體所攜帶的基因，如在臨床安排(如基因治療)中由病毒載體轉(zhuǎn)移的治療性基因的表達(dá)水平和細(xì)胞毒性。本發(fā)明涉及一種使用非甾類(lèi)抗炎癥藥物(NSAID)和/或肌肉松弛劑調(diào)節(jié)病毒載體所攜帶的基因的表達(dá)的方法，還涉及調(diào)節(jié)病毒載體所攜帶的基因的表達(dá)的藥物。更具體地，本發(fā)明涉及(1)一種抑制病毒所攜帶的基因的表達(dá)的方法，包括將非甾類(lèi)抗炎癥藥物和/或肌肉松弛劑與被該病毒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相接觸的步驟；(2)(1)的方法，其中病毒載體的細(xì)胞毒性被減弱；(3)(1)的方法，其中的非甾類(lèi)抗炎癥藥物是從包括阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、雙氯芬酸和甲芬那酸的組群中選出來(lái)的；(4)(3)的方法，其中的非甾類(lèi)抗炎癥藥物是從包括阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬和吲哚美辛的組群中選出來(lái)的；(5)(4)的方法，其中的非甾類(lèi)藥物是阿司匹林和/或酮洛芬；(6)(1)的方法，其中的肌肉松弛劑是罌粟堿；(7)(1)～(6)的任一個(gè)方法，其中病毒載體是負(fù)鏈RNA病毒載體；(8)(7)的方法，其中的負(fù)鏈RNA病毒是副粘病毒；(9)(8)的方法，其中的副粘病毒是仙臺(tái)病毒；(10)一種抑制病毒載體所攜帶的基因的表達(dá)的制劑，其中該制劑包括非甾體抗炎癥藥物和/或肌肉松弛劑；和(11)(10)的制劑，其中該制劑具有減弱該病毒載體細(xì)胞毒性的能力。本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)病毒載體所攜帶的基因的表達(dá)的方法。特別是，本發(fā)明的方法包括將NSAID和/或肌肉松弛劑與被病毒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相接觸的步驟。NSAID和/或肌肉松弛劑沒(méi)有限制，所需NSAID和/或肌肉松弛劑可以單獨(dú)使用或多重混合。術(shù)語(yǔ)“非甾類(lèi)抗炎癥藥物”(NSAID)是一般性術(shù)語(yǔ)，指除甾類(lèi)外的一類(lèi)具有抗炎癥作用的藥物，也稱(chēng)“阿司匹林類(lèi)藥物”(Goodman&Gilman′sThePharmacologicalBasisofTherapeutics，p.775)。特別是，酸性NSAID已知可以抑制前列腺素生物合成(Vane，J.R.andBotting，R.，F(xiàn)ASEBJ.1，89-96(1987)；Vane，J.R.，Nat.NewBiol.231(25)，232-235(1971))。NSAID包括，例如水楊酸型(阿司匹林鹽諸如水楊酸、阿司匹林以及阿司匹林DL賴(lài)氨酸、二磺酰基)，烯丙基乙酸型(吲哚美辛、雙氯芬酸、舒林酸(sulindac)、萘丁美酮(nabumetone)、丙谷炎痛(progulumethacin)、法呢基吲哚美辛以及依托度酸(etodolac))，丙酸型(布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、氟比洛芬、噻洛芬(tiaprofen)、普拉洛芬(pranoprofen)、洛索洛芬(loxoprofen)、aluminoprofen以及酮洛芬)，滅酸(fenamicacid)型(甲芬那酸、甲苯滅酸(tolufenamicacid))，吡唑啉酮型(苯基保泰松(phenylbutazone)、奧芬保泰松(oxifenbutazone))，昔康(oxicam)-型(吡羅昔康(piroxicam)、替諾昔康(tenoxicam)以及安吡昔康(ampiroxicam))。非酸型NSAID包括，但不限于，依匹唑(epirizole)、噻拉米特(tiaramid)以及依莫法宗(emorfazone)。本發(fā)明中使用的NSAID優(yōu)選酸型NSAID，更優(yōu)選的NSAID包括阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、雙氯芬酸(包括雙氯芬酸鈉)以及甲芬那酸；甚至更優(yōu)選NSAID包括阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬以及吲哚美辛；特別優(yōu)選NSAID包括阿司匹林以及酮洛芬。本發(fā)明使用的肌肉松弛劑包括，但不局限于，例如，骨骼肌松弛劑(筒箭毒堿(tubocurarine)、琥珀膽堿(suxamethonium)、decamethonium以及丹曲林(dantrolene))以及平滑肌松弛劑(罌粟堿、利托君(ritodrne)、特布他林(terbutaline)以及硫酸鎂)。本發(fā)明中優(yōu)選使用的肌肉松弛劑包括平滑肌松弛劑。特別包括，用作平滑肌松弛劑的鴉片堿(opiumalkaloid)，優(yōu)選異喹啉衍生物如罌粟堿。上面提到的NSAID和/或肌肉松弛劑也可以采用鹽的形式(如鈉鹽)、水合物、復(fù)合物等等。另外，它們的異構(gòu)體、類(lèi)似物、衍生物以及其中的酯類(lèi)也包括在內(nèi)。本發(fā)明的制劑可用作在被病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)抑制該病毒載體所攜帶基因的表達(dá)的試劑及藥品，或藥品原料。這些制劑還可用作減弱病毒載體的細(xì)胞毒性的試劑及藥品，或藥品原料。在本發(fā)明的方法中，NSAID和/或肌肉松弛劑與被病毒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相接觸，以便抑制病毒載體所攜帶的基因在細(xì)胞中的表達(dá)。這種接觸可以先于、同時(shí)、或后于病毒載體對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。所有這些實(shí)施方案都包括在本發(fā)明中。病毒載體所攜帶的基因在用該病毒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的表達(dá)，可以通過(guò)使本發(fā)明制劑與這些細(xì)胞接觸來(lái)抑制。在本發(fā)明中，“病毒載體所攜帶的基因”是指通過(guò)該載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞的基因。這些基因包括所有轉(zhuǎn)入細(xì)胞的基因，如插入載體用來(lái)在細(xì)胞中表達(dá)的基因，來(lái)源于病毒載體的病毒基因，以及可能由該載體攜帶的標(biāo)記基因。而且，術(shù)語(yǔ)“基因”是指遺傳物質(zhì)，包括核酸如RNA和DNA?；蚩梢跃幋a或不編碼蛋白，也可以編碼功能性RNA如核酶或反義RNA?；蚩梢詠?lái)源于天然序列或人工構(gòu)建的序列。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“DNA”包括單鏈和雙鏈DNA。本發(fā)明的方法適用于調(diào)節(jié)具體病毒載體中編碼的外源基因的表達(dá)。例如，本發(fā)明的方法可以用于抑制能表達(dá)外源基因的病毒載體所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中外源基因的表達(dá)。例如，在利用病毒載體進(jìn)行基因治療時(shí)，如果治療基因的高表達(dá)可能造成不希望的副作用，可以使用本發(fā)明的方法抑制治療基因的表達(dá)。外源基因沒(méi)有限制，例如包括編碼生物活性蛋白的基因，它們?cè)谳d體轉(zhuǎn)移后可在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能，尤其是如細(xì)胞因子/趨化因子、激素、酶、可溶性受體以及抗體片斷。本發(fā)明的方法也能抑制病毒載體所擁有的病毒基因的表達(dá)。已知許多由病毒基因表達(dá)的蛋白在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞損害。使用本發(fā)明的方法，通過(guò)抑制這些載體所擁有的基因的表達(dá)來(lái)降低病毒載體的細(xì)胞毒性是可能的。如上所述，基于單純皰疹病毒、腺病毒和呼腸孤病毒的病毒載體都具有細(xì)胞毒性。本發(fā)明可用于抑制由這些病毒載體引起的細(xì)胞損傷。本發(fā)明的方法可用于抑制所希望使用的病毒載體上所攜帶的基因的表達(dá)。在本發(fā)明的應(yīng)用中優(yōu)選可感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體。這些載體包括，例如，逆病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺伴隨病毒載體。優(yōu)選地，它們包括單純皰疹病毒載體、腺病毒載體、逆病毒載體、塞姆利基森林病毒、新培斯病毒載體、痘苗病毒載體和禽痘病毒載體。最優(yōu)選地，它們包括但不限于負(fù)鏈RNA病毒載體例如狂犬病毒載體、麻疹病毒載體和仙臺(tái)病毒載體。此外，如上所述，細(xì)胞毒性病毒載體適合于在本發(fā)明中使用。本發(fā)明提供了減少由病毒載體引起的細(xì)胞損傷的方法，包括將NSAID和/或肌肉松弛劑與通過(guò)病毒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相接觸的步驟。包括NSAID和/或肌肉松弛劑的制劑可用作降低由病毒載體引起的細(xì)胞毒性的制劑。在本發(fā)明中，“負(fù)鏈RNA病毒”是指一種RNA病毒，其基因組由一條負(fù)(負(fù))鏈組成。負(fù)鏈RNA病毒包括，例如，副粘病毒科(Paramyxoviridae)的仙臺(tái)病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒和犬瘟病毒(distempervirus)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)中的流感病毒；以及棒狀病毒科(Rhabdoviridae)中的水泡性口炎病毒和狂犬病毒。上述提及的病毒中，本發(fā)明優(yōu)選的負(fù)鏈RNA病毒載體是非分節(jié)段(即，單鏈)的負(fù)鏈RNA病毒，更優(yōu)選副粘病毒。在這里，“副粘病毒”定義為屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的病毒，或其衍生物。副粘病毒是一組包含非分節(jié)段的負(fù)鏈RNA作為基因組的病毒，包括副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)(包括呼吸道病毒屬(也叫副粘病毒屬)、Rubravirus屬和麻疹病毒屬)以及肺病毒亞科(Pneumovirinae)(包括肺病毒屬和Metapneumovirus)。可用于本發(fā)明的副粘病毒包括，例如，仙臺(tái)病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒、犬瘟病毒、猴副流感病毒(SV5)，以及1、2和3型人副流感病毒。本發(fā)明的副粘病毒優(yōu)選屬于副粘病毒亞科(呼吸道病毒屬、Rubravirus屬和麻疹病毒屬)的病毒，更優(yōu)選屬于呼吸道病毒屬(也叫副粘病毒屬)或其衍生物的病毒。尤其優(yōu)選應(yīng)用于本發(fā)明的呼吸道病毒屬的病毒是，例如，1型人副流感病毒(HPIV-1)、3型人副流感病毒(HPIV-3)、3型牛副流感病毒(BPIV-3)、仙臺(tái)病毒(即已知的1型鼠副流感病毒)、10型猴副流感病毒(SPIV-10)等。最優(yōu)選應(yīng)用于本發(fā)明的副粘病毒是仙臺(tái)病毒。這些病毒可以是天然病毒株、野生型病毒株、突變病毒株、實(shí)驗(yàn)室傳代病毒株、人工構(gòu)建病毒株，以及如前所述。本發(fā)明的方法也可抑制不完整病毒(如DI顆粒)上所攜帶的基因的表達(dá)(J.Virol.68，8413-8417(1994))。在本發(fā)明的“負(fù)鏈RNA病毒載體”是指一種源自負(fù)鏈RNA病毒并將基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的載體。載體是一種用來(lái)將基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的運(yùn)輸體。采用本發(fā)明的方法，能夠復(fù)制的和缺乏復(fù)制能力的負(fù)鏈RNA病毒載體上所攜帶的基因的表達(dá)，都可被抑制。本發(fā)明的方法可被用于抑制病毒載體在細(xì)胞(被能夠復(fù)制的具體負(fù)鏈RNA病毒載體轉(zhuǎn)染)中的復(fù)制。因此，病毒載體的過(guò)度增殖和傳播可被抑制。按照本發(fā)明的方法，病毒載體上所攜帶的基因的表達(dá)可被可逆地抑制。因此病毒載體的基因表達(dá)和由病毒載體引起的可能的細(xì)胞損傷，可以在本發(fā)明的制劑與轉(zhuǎn)染細(xì)胞接觸的時(shí)期中得到抑制。當(dāng)停止應(yīng)用該制劑時(shí)，這一抑制作用解除。本發(fā)明的方法在體內(nèi)和體外(包括來(lái)自體內(nèi))都可應(yīng)用。對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用，本發(fā)明的制劑可通過(guò)給藥到體內(nèi)而與病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接觸。給藥途徑?jīng)]有限制，只要制劑能與病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接觸。例如，根據(jù)活性成分的特性，給藥可以是口服的、透皮的、鼻內(nèi)的、支氣管內(nèi)的、肌肉的、腹腔的、靜脈的、關(guān)節(jié)內(nèi)的或皮下的。在體外(包括來(lái)自體內(nèi))應(yīng)用中，是加入本發(fā)明的制劑使其與靶細(xì)胞接觸。例如，可將制劑加到細(xì)胞培養(yǎng)基中。所應(yīng)用的制劑濃度并無(wú)特別限制而且可根據(jù)制劑及其鹽的類(lèi)型、給藥途徑等等適當(dāng)?shù)卮_定。一般而言，希望制劑抑制病毒載體上所攜帶的基因表達(dá)的效果是依賴(lài)于制劑量的。一些制劑的高劑量可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)制劑類(lèi)型和使用目的調(diào)整濃度和給藥量。例如，當(dāng)口服阿司匹林時(shí)，0.5～1.5g/劑以及1.5～4.5g/天是給藥的標(biāo)準(zhǔn)劑量。優(yōu)選不超過(guò)估計(jì)毒性限300mg/Kg(LD501750m/kg的1/6)。本發(fā)明可沒(méi)有任何限制地應(yīng)用于任何目標(biāo)個(gè)體，只要其可以用病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。舉例來(lái)說(shuō)，目標(biāo)可以包括哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)，包括小雞、鵪鶉、小鼠、大鼠、狗、豬、貓、奶牛、兔、綿羊、山羊、猴子和人類(lèi)。當(dāng)本發(fā)明采用體外(包括來(lái)自體內(nèi))的方法時(shí)，應(yīng)用目標(biāo)包括如人、非人哺乳動(dòng)物以及鳥(niǎo)類(lèi)。當(dāng)本發(fā)明采用體內(nèi)方法時(shí)，非人哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)是具體目標(biāo)。本發(fā)明提供可以調(diào)節(jié)病毒載體攜帶基因的表達(dá)的制劑。具體地，本發(fā)明提供制劑(包括NSAID和/或肌肉松弛劑)來(lái)抑制病毒載體所攜帶的基因的表達(dá)。本發(fā)明的制劑可以是單獨(dú)的NSAID和/或肌肉松弛劑，或是它們與無(wú)菌水、生理鹽水、緩沖液、鹽、穩(wěn)定劑、保存劑、表面活性劑等等的組合物。這些組合物可以在用前混合，也可以在使用當(dāng)時(shí)混合。本發(fā)明的制劑可以按照已知的藥學(xué)方法來(lái)配制。例如，本發(fā)明的制劑可以通過(guò)將其與藥物學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合來(lái)配制，所述載體或賦形劑具體有無(wú)菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、混懸劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、緩釋制劑等等。本發(fā)明的制劑可以制備成溶液、粉劑、細(xì)粒劑、顆粒劑、片劑、包衣片、膠囊、錠劑(troche)、口含片(buccaltablet)、酏劑(elixir)、混懸劑、糖漿、滴鼻劑、吸入劑、軟膏、貼劑、栓劑等等。這些配制劑中的NSAID和/或肌肉松弛劑的量可適當(dāng)確定。例如，為配制口服藥，可以根據(jù)需要將賦形劑、粘合劑、分解劑、潤(rùn)滑劑、著色劑、或調(diào)味劑和芳香劑加入一種或多種NSAID和/或肌肉松弛劑中，隨后配制成為粉末、細(xì)粒劑、顆粒劑、片劑、包衣片劑和/或膠囊。賦形劑的實(shí)例包括乳糖、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、結(jié)晶纖維素以及二氧化硅。粘合劑的實(shí)例包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、甲基纖維素、乙基纖維素、阿拉伯樹(shù)膠、黃芪膠、明膠、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素，和聚乙烯吡咯烷酮。分解劑包括，例如玉米淀粉、瓊脂、明膠粉、結(jié)晶纖維素、碳酸鈣、碳酸氫鈉、檸檬酸鈣、糊精以及果膠。潤(rùn)滑劑包括，例如硬脂酸鎂、滑石粉、聚乙二醇、硅石以及植物油等。有很多已知的可加入藥品的著色劑、調(diào)味劑和芳香劑。這些藥品可以為藥片、微膠囊、顆粒、或者例如被糖或其它材料包衣的形式。用于注射的組合物可按常規(guī)方法，通過(guò)將主藥與pH調(diào)節(jié)劑、溶劑或等滲劑相混合來(lái)配制，可以根據(jù)需要與助劑、或穩(wěn)定劑等混合。用于配制的原料可以包含通常用于藥品、加藥化妝品、化妝品等的原料。具體地，使用的原料包括，例如動(dòng)物油、植物油、礦物油、酯油、蠟、高級(jí)乙醇、脂肪酸、硅油、表面活性劑、磷脂、醇、多元醇、可溶性高分子、粘土礦，以及純水。此外，可按需加入添加劑，其包括但不限于pH緩沖液、抗氧化劑、螯合劑、抗菌劑、殺真菌劑、著色劑以及調(diào)味劑。本發(fā)明的制劑可以采用所需給藥途徑來(lái)給藥，例如口服、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、支氣管、肌肉、腹腔、靜脈、關(guān)節(jié)內(nèi)、或皮下，如上所述。所述制劑還可以全身給藥或局部給藥。制劑的劑量和給藥方法可以變化，取決于藥物組合物中活性成分造成組織轉(zhuǎn)變的能力、處理的目的、以及受試者(例如病人)的體重和年齡。合適的劑量和給藥方法可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。給藥可以進(jìn)行一次或多次?？梢詫⒈景l(fā)明制劑應(yīng)用于所需培養(yǎng)細(xì)胞和個(gè)體。目標(biāo)個(gè)體和細(xì)胞可以來(lái)源于任何哺乳動(dòng)物(包括人、猴、小鼠、大鼠、兔、綿羊、奶牛和狗)，以及其它脊椎動(dòng)物。特別是，本發(fā)明的制劑可用于在采用病毒載體的人類(lèi)基因治療中，調(diào)節(jié)病毒所攜帶的基因的表達(dá)。本發(fā)明的制劑還可用于可逆地抑制病毒載體所攜帶的基因的表達(dá)。在一種特別適宜的給藥中，可以將本發(fā)明制劑給藥于皮下，或直接給藥于角質(zhì)以下或鄰近部位?？梢詫⒅苿┡渲瞥赡芸刂戚d體的局部、經(jīng)皮表達(dá)水平的經(jīng)皮吸收藥。經(jīng)皮吸收藥可以是軟膏、泥敷劑(catalpasm)和粘帶(tape)等。通常與藥物和化妝品混合的成分，優(yōu)選作為基材、助劑或賦形劑，通過(guò)混合來(lái)制備經(jīng)皮吸收的藥物。例如，這些藥物也可以采用泥敷劑的形式，其主成分是一種可以在水中膨脹的聚合物，如粘性樹(shù)脂(多萜類(lèi)樹(shù)脂、烴類(lèi)樹(shù)脂等等)、天然或合成的橡膠(聚異丁烯、苯乙烯-丁烯、苯乙烯-異戊二烯、苯乙烯-乙烯-丁烯、1，4-聚異戊二烯等)或半乳甘露聚糖。聚乙二醇和脂肪酸酯也可以混合。脂肪酸酯包括，如乙基油酸酯、異丙基肉豆蔻酸酯、異丙基棕櫚酸酯、丁基硬脂酸酯、肉豆蔻基豆蔻酸酯、辛基十二烷基肉豆蔻酸酯、膽甾醇硬脂酸酯和二異丙基己二酸酯。聚乙二醇包括，如聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇1540和聚乙二醇4000。如有必要，這些復(fù)合物可包含吸收聚合物。例如，吸收聚合物優(yōu)選在水中能吸收自重的十倍或更多重量，可膨脹并成為凝膠。吸收聚合物優(yōu)選微粉末，包括羧甲基纖維素及其金屬鹽類(lèi)、羧甲基聚合物等等(其中引入少量交聯(lián))，聚丙烯酸及其金屬鹽類(lèi)，鈉鹽，羧甲基化聚乙烯醇，或皂化淀粉接枝的丙烯腈的金屬鹽類(lèi)。圖1顯示了用于評(píng)價(jià)制劑的SeV基因的結(jié)構(gòu)。圖2顯示了SeV基因轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的阿司匹林濃度依賴(lài)性抑制。LLC-MK2細(xì)胞以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染，感染兩天后按記錄的濃度加入阿司匹林，每?jī)商煸诨厥盏呐囵B(yǎng)基中測(cè)量SeV基因轉(zhuǎn)錄的阿司匹林濃度依賴(lài)性抑制。圖2(A)顯示了HA活性，這反映了病毒顆粒數(shù)。圖2(B)顯示了LDH釋放的量，這反映了細(xì)胞毒性。圖2(C)顯示了SEAP活性變化的時(shí)間進(jìn)程，這反映了病毒所攜帶的基因的表達(dá)水平。圖3顯示了熒光顯微照片，這反映了加入阿司匹林四天和六天后的GFP表達(dá)量和細(xì)胞損傷度。LLC-MK2細(xì)胞以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染，感染兩天后按記錄的濃度加入阿司匹林。圖4顯示了Western印跡分析的照片。分析是這樣進(jìn)行的，以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染LLC-MK2細(xì)胞，在感染兩天后加入阿司匹林，然后在加入阿司匹林的兩天、四天和六天后離心回收的培養(yǎng)基。Western印跡分析采用(A)抗M的抗體和(B)主要識(shí)別NP的DN-1抗體在回收的病毒顆粒上進(jìn)行操作。圖4(C)顯示了采用抗M的抗體、DN-1抗體和抗G3PDH的抗體進(jìn)行細(xì)胞的Western印跡分析，該細(xì)胞是加入阿司匹林六天后獲得的。圖5顯示了回收的病毒顆粒采用抗M抗體進(jìn)行Western印跡的定量結(jié)果，所述病毒顆粒是在SeV18+SEAP/F-GFP以MOI＝3感染LLC-MK2細(xì)胞，感染兩天后加入阿司匹林，然后在加入阿司匹林兩天、四天和六天后回收培養(yǎng)基并離心而獲得的。圖6顯示了在回收的培養(yǎng)基中HA活性的變化，培養(yǎng)基是在以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染LLC-MK2細(xì)胞、感染兩天后加入5mM阿司匹林、然后每?jī)商旒尤胄迈r培養(yǎng)基而回收的，該新鮮培養(yǎng)基或者含有5mM阿司匹林，或者無(wú)阿司匹林(阿司匹林處理時(shí)間長(zhǎng)度0、2、4、6和8天)。圖7顯示了在回收的培養(yǎng)基中LDH釋放量的變化，培養(yǎng)基是在以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染LLC-MK2細(xì)胞、感染兩天后加入5mM阿司匹林、然后每?jī)商旒尤胄迈r培養(yǎng)基而回收的，該新鮮培養(yǎng)基或者含有5mM阿司匹林，或者無(wú)阿司匹林(阿司匹林處理時(shí)間長(zhǎng)度0、2、4、6和8天)。圖8顯示了在回收的培養(yǎng)基中SEAP活性變化的時(shí)間進(jìn)程，培養(yǎng)基是在以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染LLC-MK2細(xì)胞、感染兩天后加入5mM阿司匹林、然后每?jī)商旒尤胄迈r培養(yǎng)基而回收的，該新鮮培養(yǎng)基或者含有5mM阿司匹林，或者無(wú)阿司匹林(阿司匹林處理時(shí)間長(zhǎng)度0、2、4、6和8天)。圖9顯示了反映GFP表達(dá)和細(xì)胞損傷的熒光顯微照片，這是經(jīng)過(guò)周期性觀察獲得的。以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染LLC-MK2細(xì)胞，感染兩天后加入5mM阿司匹林，然后每?jī)商旒尤牒?mM阿司匹林或者無(wú)阿司匹林的新鮮培養(yǎng)基(阿司匹林處理時(shí)間長(zhǎng)度0、2、4、6和8天)。GFP表達(dá)量和細(xì)胞損傷度通過(guò)熒光顯微鏡檢周期性地進(jìn)行觀察。圖10顯示了在回收的培養(yǎng)基中HA的活性和LDH的釋放量。以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+/ΔF-GFP感染LLC-MK2細(xì)胞，感染兩天后按照記錄的濃度加入阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、雙氯芬酸鈉、甲芬那酸或者罌粟堿。每?jī)商鞙y(cè)量回收的培養(yǎng)基中HA的活性及LDH的釋放量。圖10在圖11處繼續(xù)。圖11顯示了在回收的培養(yǎng)基中HA的活性和LDH的釋放量。以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+/ΔF-GFP感染LLC-MK2細(xì)胞，感染兩天后按照記錄的濃度加入阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、雙氯芬酸鈉、甲芬那酸或者罌粟堿。每?jī)商鞙y(cè)量回收的培養(yǎng)基中HA的活性及LDH的釋放量。圖11從圖10處繼續(xù)。圖12顯示了在回收的培養(yǎng)基中HA的活性和LDH的釋放量。以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染LLC-MK2細(xì)胞，感染兩天后按照記錄的濃度加入異山梨醇二硝酸酯(ISDN)或者尼可地爾(nicorandil)。每?jī)商鞙y(cè)量回收的培養(yǎng)基中HA的活性及LDH的釋放量。圖13顯示了在回收的培養(yǎng)基中HA的活性和LDH的釋放量。以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染LLC-MK2細(xì)胞，感染兩天后加入5mM阿司匹林或1mM酮洛芬，然后立即加入L-NAME。每?jī)商鞙y(cè)量回收的培養(yǎng)基中HA的活性及LDH的釋放量。實(shí)行本發(fā)明的最佳模式本發(fā)明參考以下實(shí)施例進(jìn)行具體舉例說(shuō)明，但不應(yīng)理解為僅限于這些。另外，說(shuō)明書(shū)各處提到的參考文獻(xiàn)都引入作參考。通過(guò)添加阿司匹林抑制SeV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制阿司匹林(乙酰水楊酸)首先被選作最典型的NSAID。對(duì)阿司匹林是否影響仙臺(tái)病毒(SeV)的增殖(轉(zhuǎn)錄和復(fù)制)進(jìn)行了檢測(cè)。評(píng)估是從表達(dá)調(diào)節(jié)而不是抗病毒效果的角度進(jìn)行。因此，阿司匹林(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.，Osaka，Japan)在SeV感染兩天后加入，此時(shí)病毒已經(jīng)增殖到一定程度。LLC-MK2(猴腎細(xì)胞)以5×105細(xì)胞/孔的濃度接種至6孔板中，接著培養(yǎng)在包含10％胎牛血清(FBSBioWhittaker，Walkersville，MD)的MEM(Gibco-BRL，Rockville，MD)培養(yǎng)基上，在5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞用PBS洗，然后用MOI＝3分F-缺失型SeV感染，該SeV編碼分泌型堿性磷酸酶(SEAP)和綠色熒光蛋白(GFP)基因(SeV18+SEAP/ΔF-GFP圖1)。F-缺失型SeV通過(guò)Li.等(Li，H.-O.等.，J.Virology74，6564-6569(2000)，WO00/70070)描述的方法來(lái)制備。感染以后，細(xì)胞培養(yǎng)繼續(xù)在無(wú)血清的MEM培養(yǎng)基上進(jìn)行。感染兩天以后，該培養(yǎng)基用含有0.625、1.25、2.5和5mM阿司匹林或無(wú)阿司匹林的MEM培養(yǎng)基(無(wú)血清)替換。每?jī)商焓占恳慌囵B(yǎng)物的培養(yǎng)基，用含有同樣內(nèi)容的新鮮培養(yǎng)基替換。測(cè)定血紅素凝集活性(HA活性)作為病毒粒子形成的指示；測(cè)定乳糖脫氫酶(LDH)的量作為細(xì)胞損傷的指示；測(cè)定SEAP活性作為該載體所攜基因的表達(dá)水平的指示。GFP表達(dá)水平和細(xì)胞損傷也可采用熒光顯微鏡檢定時(shí)地觀察。HA活性采用Kato等.，(Kato，A.等.，GenesCells1，569-579(1996))描述的方法來(lái)測(cè)定。也就是說(shuō)，含有病毒的培養(yǎng)基在96圓底孔板中進(jìn)行兩倍系列稀釋?zhuān)@樣使得每孔中包含50μl樣品。50μl貯存的雞血(COSMOBIOCo.，Ltd.，Tokyo，Japan)，用PBS稀釋至1％后加入每孔中，混合。混合物在4℃孵育1小時(shí)。觀察紅細(xì)胞凝集，通過(guò)挑選仍可觀察到凝集的最高病毒稀釋度來(lái)計(jì)算HA活性。因認(rèn)為1HAU相當(dāng)于1×106病毒，故用病毒數(shù)表示實(shí)驗(yàn)值。通過(guò)病毒粒子形成的減少(圖2(A))顯示，添加5mM阿司匹林抑制了HA活性的增長(zhǎng)，。LDH定量通過(guò)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(Roche，Basel，Switzerland)按照試劑盒中的方法進(jìn)行。觀察到了LDH釋放的阿司匹林濃度依賴(lài)性降低。在細(xì)胞培養(yǎng)中幾乎沒(méi)有觀察到細(xì)胞損傷，尤其是那些含有5mM阿司匹林者(圖2(B))。SEAP活性用ReporterAssayKit-SEAP(TOYOBO，Osaka，Japan)按照試劑盒方法測(cè)量。也觀察到SEAP活性的阿司匹林濃度依賴(lài)性降低。最顯著的活性降低可見(jiàn)于含5mM阿司匹林的培養(yǎng)物(圖2(C))。在添加阿司匹林的四和六天后(分別在SeV感染的六和八天后)獲取熒光顯微照片，見(jiàn)圖3。GFP表達(dá)和細(xì)胞損傷的阿司匹林濃度依賴(lài)性降低得以確定。加入5mM阿司匹林的效果是顯著的。病毒蛋白用Western印跡進(jìn)行半定量分析，以便從另一個(gè)視角評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制水平。分析了與上述相同的樣品。也就是說(shuō)，LLC-MK2細(xì)胞用SeV18+SEAP/ΔF-GFP以MOI＝3感染，阿司匹林在感染兩天后加入，在阿司匹林加入后每隔兩天收集培養(yǎng)基，在加入阿司匹林六天后(感染八天后)收集細(xì)胞。培養(yǎng)基在48,000g離心45分鐘以回收病毒蛋白，細(xì)胞直接用細(xì)胞刮來(lái)回收。病毒蛋白通過(guò)SDS-PAGE及接著的Western印跡來(lái)檢測(cè)，使用主要識(shí)別NP蛋白的抗-M抗體和DN-1抗體(都是兔多克隆抗體)。Western印跡如下進(jìn)行從6孔板的一個(gè)孔中收集細(xì)胞(貯存于-80℃)，從培養(yǎng)基中得到病毒蛋白，將它們?nèi)苡?×稀釋的100ulSDS-PAGE樣品緩沖液中(RedLoadingBufferPack；NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)。樣品在98℃熱處理十分鐘。離心后，10ul上清液加在SDS-PAGE凝膠(Multigel10/20；DaiichiPureChemicalsCo.，Ltd，Tokyo，Japan)上，電泳在15mA進(jìn)行2.5小時(shí)。病毒蛋白通過(guò)半干法在轉(zhuǎn)移至PVDF膜(ImmobilonPVDFtransfermembrane；Millipore，Bedford，MA)，條件是100mA轉(zhuǎn)移1小時(shí)。轉(zhuǎn)移后的膜接著用封閉液(BlockAce；SnowBrandMilkProductsCo.，Ltd，Sapporo，Japan)于4℃封閉1小時(shí)。雜交是與第一抗體溶液4℃保溫過(guò)夜，所述第一抗體含10％BlockAce和1∶4,000稀釋的抗-M抗體或1∶1,000稀釋的DN-1抗體。膜用含0.05％Tween20的TBS(TBST)洗3次，用TBS洗3次，然后用第二抗體溶液室溫雜交1小時(shí)，所述第二抗體溶液中含10％BlockAce和1∶5,000稀釋的HRP結(jié)合抗兔IgG抗體(Anti-rabbitIgG(Goat)H+Lconi.；ICNP，Aurora，OH)。膜用TBST洗3次，然后用TBS洗3次，然后用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白(ECLWestern印跡detectionreagents；AmershamPharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)。結(jié)果表明，在培養(yǎng)基和感染細(xì)胞中的病毒蛋白都減少了(圖4)。另外，用抗-M抗體進(jìn)行半定量分析(圖5)與HA活性分析(圖2(A))結(jié)果較一致。因此，可以得出結(jié)論，加入阿司匹林確實(shí)可以抑制SeV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。阿司匹林處理時(shí)間對(duì)抑制SeV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的活性的影響對(duì)阿司匹林處理不同時(shí)間長(zhǎng)度時(shí)，病毒增殖的差異進(jìn)行了檢測(cè)，從而分析其對(duì)SeV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的抑制是否受阿司匹林處理時(shí)間長(zhǎng)短的影響，也就是分析加入阿司匹林的作用是永久的還是瞬時(shí)的。該實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例1所述進(jìn)行。也就是，LLC-MK2(猴腎細(xì)胞)以5×105細(xì)胞/孔的濃度接種至6孔板中，接著在含10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，于5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞用PBS洗，然后用SeV18+SEAP/ΔF-GFP以MOI＝3感染。感染以后，細(xì)胞培養(yǎng)繼續(xù)在無(wú)血清的MEM培養(yǎng)基上進(jìn)行。感染兩天以后，加入含5mM阿司匹林的MEM培養(yǎng)基(無(wú)血清)。培養(yǎng)基每?jī)商旎厥找淮?，并且同時(shí)加入含或不含5mM阿司匹林的新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)物用阿司匹林處理0、2、4、6或8天，然后檢測(cè)?；厥盏呐囵B(yǎng)基進(jìn)行HA活性分析、LDH定量和SEAP活性分析。GFP表達(dá)和細(xì)胞損傷也用熒光顯微鏡進(jìn)行周期性檢查。HA活性的變化(圖6)說(shuō)明在阿司匹林處理時(shí)期，HA活性的增加是比較低的，也就是說(shuō)，病毒粒子的形成被抑制。然而，在阿司匹林處理完兩天后，觀察到了HA活性的增加和病毒粒子的形成。這一重要發(fā)現(xiàn)在于，觀察到的該現(xiàn)象與阿司匹林處理時(shí)間的長(zhǎng)短無(wú)關(guān)，說(shuō)明加入阿司匹林引起的作用是瞬時(shí)的。LDH的反應(yīng)比HA晚兩天，在阿司匹林處理完成四天后開(kāi)始增加。因此，LDH釋放水平證實(shí)了與HA活性同樣的現(xiàn)象，說(shuō)明觀察到的這種增加與阿司匹林處理時(shí)間長(zhǎng)短無(wú)關(guān)(圖7)。LDH與HA反應(yīng)相比延遲兩天，認(rèn)為是反映了病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的增加(HA活性增加)，與由于細(xì)胞損傷導(dǎo)致LDH釋放至培養(yǎng)基中，這兩個(gè)事件之間有時(shí)間滯后。HA活性和LDH水平中觀察到的敏感變化，在應(yīng)答阿司匹林處理開(kāi)始時(shí)和結(jié)束時(shí)的SEAP活性中卻沒(méi)有觀察到。然而，在阿司匹林處理后SEAP活性開(kāi)始降低之后，恢復(fù)看起來(lái)要花大約六天時(shí)間(從處理結(jié)束開(kāi)始)(圖8)。熒光顯微鏡圖像展示于圖9。這些結(jié)果支持了上述在HA活性、LDH水平和SEAP活性中的改變?cè)诎⑺酒チ痔幚砥陂g，GFP表達(dá)較低且觀察不到細(xì)胞損傷，然而，在阿司匹林處理完成之后，GFP表達(dá)增加并且可觀察到細(xì)胞損傷。觀察到的這些改變與阿司匹林處理時(shí)間長(zhǎng)短無(wú)關(guān)。因此可確定，阿司匹林抑制SeV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的活性是瞬時(shí)的。除阿司匹林外的NSAID的作用檢測(cè)除阿司匹林外的其它制劑抑制SeV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的活性。所測(cè)制劑有，酮洛芬(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.，Osaka，Japan)、氟比洛酚(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.，Osaka，Japan)、吲哚美辛(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.，Osaka，Japan)、雙氯芬酸鈉(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.，Osaka，Japan)、甲芬那酸(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.，Osaka，Japan)以及作為平滑肌松弛劑的罌粟堿(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.，Osaka，Japan)。罌粟堿不包括在NSAID中，但據(jù)報(bào)道能抑制巨細(xì)胞病毒增殖(Albrecht，T.等.，ProcSocExpBiolMed186，41-46(1987))。該實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例1所述進(jìn)行LLC-MK2(猴腎細(xì)胞)以5×105細(xì)胞/孔的濃度接種至6孔板中，接著在含10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，于5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞用PBS洗，然后用SeV18+SEAP/ΔF-GFP或不編碼SEAP的F缺失型SeV(SeV18+/ΔF-GFP)，以MOI＝3感染。感染以后，細(xì)胞在無(wú)血清的MEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天，然后在含已記錄濃度制劑的MEM培養(yǎng)基(無(wú)血清)上培養(yǎng)。培養(yǎng)基每?jī)商焓占淮危⒂猛w積的新鮮培養(yǎng)基替換。對(duì)回收的培養(yǎng)基進(jìn)行HA活性和LDH定量分析。GFP表達(dá)和細(xì)胞損傷也用熒光顯微鏡進(jìn)行周期性檢查。這些結(jié)果說(shuō)明所有測(cè)試的制劑都可抑制SeV所攜基因的表達(dá)。所測(cè)制劑總體上可分成三組(1)酮洛芬，其按照與阿司匹林同樣的方式，抑制SeV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，并減少細(xì)胞損傷；(2)氟比洛酚和吲哚美辛，在測(cè)試濃度下，其抑制SeV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，但僅適度減少細(xì)胞損傷；(3)雙氯芬酸鈉、甲芬那酸和罌粟堿，其抑制SeV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，并增加細(xì)胞損傷(圖10～11)。這些結(jié)果說(shuō)明，抑制SeV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制可由很多NSAID完成，但作用機(jī)制可能不同。既抑制SeV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制又降低細(xì)胞毒性的阿司匹林和酮洛芬，被認(rèn)為在調(diào)節(jié)SeV攜帶基因的表達(dá)方面具有最有效的特性。其它制劑最終可降低表達(dá)，因此它們與阿司匹林和酮洛芬相似，也可用于調(diào)節(jié)載體所攜基因的表達(dá)。對(duì)這種作用的機(jī)制研究有一種觀點(diǎn)是，NO的抗病毒作用是阿司匹林抑制VSV增殖的作用機(jī)制(Chen，N.等.，Virology276，44-51(2000))。也就是，它認(rèn)為抑制前列腺素E2的產(chǎn)生是由于抑制環(huán)氧合酶(Cox)活性(該酶是NSAID的一個(gè)作用位點(diǎn))，結(jié)果導(dǎo)致NO合成酶(NOS)的激活，這又接著導(dǎo)致NO的產(chǎn)生增強(qiáng)，并抑制了VSV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。還有一種觀點(diǎn)認(rèn)為，在白細(xì)胞介素-12對(duì)VSV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的抑制中有NOS的參與(Komatsu，T.等.，Viarology259，334-341(1999))。因此，檢測(cè)NSAID對(duì)SeV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的抑制中NO的參與。檢測(cè)NO的直接作用，以確定加入NO-相關(guān)制劑是否會(huì)抑制SeV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。然而，加入異山梨醇二硝酸酯(ISDNSigma，St.Louis，MO)或尼可地爾(ChugaiPharmaceuticalCo.，Ltd.，Tokyo，Japan)并沒(méi)有顯著抑制轉(zhuǎn)錄和復(fù)制(圖12)。因此，沒(méi)有觀察到NO直接影響抑制。而且，在Sev轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的實(shí)際抑制條件中，即已加入了5mM阿司匹林或1mM酮洛芬(圖13)的條件中，加入NOS抑制劑L-NAME(DOJINDOLABORATORIES，Kumamoto，Japan)沒(méi)有觀察到抑制的恢復(fù)。因此，上述轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的抑制中NO的參與，在本發(fā)明的實(shí)施例中沒(méi)有觀察到，說(shuō)明這里包含著不同的機(jī)制。工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明提供一種非甾類(lèi)抗炎癥藥物和肌肉松弛劑的新用途。這些制劑可調(diào)節(jié)病毒載體所攜帶的基因的表達(dá)，或抑制病毒載體的細(xì)胞毒性。本發(fā)明在調(diào)節(jié)基因治療過(guò)程中，由病毒載體導(dǎo)入的治療性及病毒基因表達(dá)中尤其有用。權(quán)利要求1.一種用于抑制病毒載體所攜帶的基因的表達(dá)的方法，包括將非甾類(lèi)抗炎癥藥物和/或肌肉松弛劑與被該病毒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相接觸的步驟。2.權(quán)利要求1的方法，其中病毒載體的細(xì)胞毒性被減弱。3.權(quán)利要求1的方法，其中的非甾類(lèi)抗炎癥藥物選自阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、雙氯芬酸或甲芬那酸。4.權(quán)利要求3的方法，其中的非甾類(lèi)抗炎癥藥物選自阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬或吲哚美辛。5.權(quán)利要求4的方法，其中的非甾類(lèi)藥物是阿司匹林和/或酮洛芬。6.權(quán)利要求1的方法，其中的肌肉松弛劑是罌粟堿。7.權(quán)利要求1～6任一個(gè)的方法，其中病毒載體是負(fù)鏈RNA病毒載體。8.權(quán)利要求7的方法，其中的負(fù)鏈RNA病毒是副粘病毒。9.權(quán)利要求8的方法，其中的副粘病毒是仙臺(tái)病毒。10.一種抑制病毒載體所攜帶的基因的表達(dá)的制劑，其中該制劑包括非甾類(lèi)抗炎癥藥物和/或肌肉松弛劑。11.權(quán)利要求10的制劑，其中該制劑具有減弱該病毒載體的細(xì)胞毒性的能力。全文摘要本發(fā)明的發(fā)明者揭示了非甾體類(lèi)抗炎藥物和肌肉松弛劑可抑制病毒載體上所攜帶的基因的表達(dá)。這些制劑也抑制病毒載體的細(xì)胞毒性。本發(fā)明提供了一種方法，該方法通過(guò)使用非甾體類(lèi)抗炎藥物和/或肌肉松弛劑調(diào)節(jié)病毒所攜帶的基因的表達(dá)。這些制劑的效果是可逆的，并且在停止給藥后病毒載體的基因表達(dá)和細(xì)胞毒性都會(huì)增強(qiáng)。本發(fā)明的制劑對(duì)于調(diào)節(jié)病毒基因和治療性基因的表達(dá)，以及在采用病毒載體的基因治療中抑制病毒載體的細(xì)胞毒性是有用的。文檔編號(hào)C12N15/86GK1561396SQ02819250公開(kāi)日2005年1月5日申請(qǐng)日期2002年9月27日優(yōu)先權(quán)日2001年9月27日發(fā)明者井上誠(chéng),飯?zhí)镎虏?長(zhǎng)谷川護(hù)申請(qǐng)人:株式會(huì)社載體研究所