專利名稱：采用循環(huán)脈沖-暫停補(bǔ)料方式的發(fā)酵法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在發(fā)酵過程中降低培養(yǎng)液粘度的方法。
背景技術(shù)：
絲狀微生物是商業(yè)微生物學(xué)中的一種有力工具，因為其可被用于很多不同治療藥物(例如青霉素和頭孢菌素)、商業(yè)化合物(例如檸檬酸)和商品酶(例如蛋白酶和淀粉酶)的商業(yè)生產(chǎn)中。
數(shù)十年來，絲狀微生物的發(fā)酵所呈現(xiàn)出的獨(dú)特的工程學(xué)挑戰(zhàn)是眾所周知的。特別地，絲狀微生物的絲狀形態(tài)通常會導(dǎo)致高粘度，而該高粘度則使對培養(yǎng)液的攪拌、泵送和供氧變的很困難。
盡管已經(jīng)做了大量研究，但關(guān)于在商業(yè)規(guī)模系統(tǒng)內(nèi)轉(zhuǎn)變形態(tài)以降低培養(yǎng)液粘度的研究進(jìn)展相對較少。事實(shí)上，最通常的降低培養(yǎng)液粘度的方法是在培養(yǎng)液中加水將其稀釋或增加攪動以便將絲變成片段。但這些方法都不具有穩(wěn)定的效果。
發(fā)明概述發(fā)明人發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液粘度可以通過在發(fā)酵期間調(diào)整碳補(bǔ)料方式從而以一種有益的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)變，因此我們要求一種生產(chǎn)有價值的化合物的方法，包括如下步驟a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵絲狀細(xì)菌或真菌，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中于發(fā)酵期間用循環(huán)脈沖定量給料/暫停(cyclic pulse dosing/pause)的方式加入糖類，其中所述脈沖定量給料的時間短于暫停時間；和b)從發(fā)酵培養(yǎng)液中回收有價值的化合物。


參考附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，其中圖1顯示了獲自鏈霉菌的3個補(bǔ)料分批發(fā)酵過程(參見實(shí)施例2)的酶活性，干細(xì)胞重和培養(yǎng)液粘度(以標(biāo)準(zhǔn)化形式)。不同發(fā)酵過程間的唯一差別為其中之一延長了暫停時間。
發(fā)明詳述發(fā)明人已經(jīng)揭示了在補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中對細(xì)胞進(jìn)行循環(huán)補(bǔ)料可以作為降低培養(yǎng)液粘度的方法。在發(fā)酵過程中，葡萄糖可持續(xù)地，或以300秒一個循環(huán)的方式補(bǔ)料，在每個循環(huán)中或以30秒或以50秒來使用進(jìn)料泵。在所有發(fā)酵過程中，使用總量相同的葡萄糖對培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料(參見實(shí)施例1)。
數(shù)據(jù)顯示，脈沖補(bǔ)料在時間圖上對全部干細(xì)胞重、氧質(zhì)量傳遞速率、或在每一發(fā)酵過程中全部添加堿(此為細(xì)胞代謝能力的指征變量)都不產(chǎn)生顯著影響。另外，脈沖補(bǔ)料對全部胞外蛋白濃度或胞外蛋白的表觀分布也沒有可測量的影響。
相反的，脈沖補(bǔ)料對形態(tài)學(xué)有顯著的影響。采用脈沖補(bǔ)料方式的細(xì)胞比用持續(xù)補(bǔ)料方式的細(xì)胞小。這導(dǎo)致了脈沖補(bǔ)料的發(fā)酵過程中的粘度低于持續(xù)補(bǔ)料的發(fā)酵過程中的粘度。
有價值的化合物根據(jù)本發(fā)明的有價值的化合物可以是抗生素如青霉素或頭孢霉素或紅霉素或商品化合物如檸檬酸。有價值的化合物還可以是治療性蛋白質(zhì)如胰島素或酶(例如水解酶、轉(zhuǎn)移酶、裂解酶、異構(gòu)酶或連接酶，特別是糖類水解酶(carbohydrolase)、纖維素酶、氧化還原酶、蛋白酶、脂肪酶或糖酶)。
微生物菌株根據(jù)本發(fā)明的微生物菌株可以獲自任何種類的絲狀細(xì)菌或真菌。
例如，在優(yōu)選實(shí)施方式中，有價值的化合物可以獲自鏈霉屬菌株，例如，變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰鏈霉素(Streptomycesmurinus)或獲自放線菌。
在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，有價值的化合物可以獲自絲狀真菌，如頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球菌屬(Crytococcus)、Filibasidium屬、鐮刀菌屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉(Humicola)、Magnaporthe屬、毛霉菌屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Neocallimastix屬、鏈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌屬(Schizophyllum)、Talaromyces屬、Thermoascus屬、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium屬、或木霉屬(Trichoderma)的菌種，特別地，有價值的化合物可以獲自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鐮孢(Fusarium culmorum)、禾本科鐮孢(Fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮孢(Fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢(Fusarium negundi)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)、粉紅鐮孢(Fusariumroseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢(Fusariumsarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色鐮孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicolalanuginosa、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、木霉(Trichoderma harzianum)、康寧木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、或綠色木霉(Trichoderma viride)等菌種。
公眾可從許多培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)獲得上述菌種，比如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德國微生物與細(xì)胞培養(yǎng)物保藏股份有限公司(DeutscheSammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh DSM)、荷蘭真菌菌種保藏中心(CBS)、和農(nóng)業(yè)研究部專利培養(yǎng)物保藏中心，美國北方研究中心(NRRL)。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，此處使用的與給定來源相關(guān)聯(lián)的術(shù)語“獲自”意指有價值的化合物通過上述來源而得以生產(chǎn)或通過用來自上述來源的基因插入的細(xì)胞而得以生產(chǎn)。
發(fā)酵微生物菌株可用現(xiàn)有技術(shù)中任意的公知技術(shù)進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基可以是包含氮源和/或碳源復(fù)合物的復(fù)合培養(yǎng)基，如大豆粉、棉籽粉、谷物浸液、酵母提取物、酪蛋白水解產(chǎn)物、糖漿等等。發(fā)酵培養(yǎng)基也可以是化學(xué)配制的培養(yǎng)基，例如，采用WO98/37179中公開的配制方法。
發(fā)酵可采用補(bǔ)料分批的方式、重復(fù)補(bǔ)料分批的方式或持續(xù)的發(fā)酵步驟。
在補(bǔ)料分批的步驟中，可以于發(fā)酵開始前在培養(yǎng)基中不加入或加入部分包含一個或多個結(jié)構(gòu)和/或催化單元的多種化合物，也可以將包含一個或多個結(jié)構(gòu)和/或催化單元的多種化合物的全部或剩余部分，分別在發(fā)酵過程中補(bǔ)料。在發(fā)酵過程中，用于補(bǔ)料的選用多種化合物可以一起或彼此分離地進(jìn)行補(bǔ)料。
在重復(fù)補(bǔ)料分批的發(fā)酵或持續(xù)發(fā)酵的過程中，在發(fā)酵期間，全部起始培養(yǎng)基被額外補(bǔ)料。可以將結(jié)構(gòu)單元料(structural element feed(s))一起或分別對起始培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料。在重復(fù)補(bǔ)料分批的發(fā)酵方式中，包含生物質(zhì)的一部分發(fā)酵培養(yǎng)液以規(guī)律的時間間隔取出，而在持續(xù)發(fā)酵過程中，則持續(xù)性取出部分發(fā)酵培養(yǎng)液。因此發(fā)酵過程中要根據(jù)取出發(fā)酵培養(yǎng)液的量而補(bǔ)充部分新鮮培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，發(fā)酵采用補(bǔ)料分批方式或重復(fù)補(bǔ)料分批(repeated fed-batch)方式。
糖類根據(jù)Morrison和BoydOrganic Chemistry，1056頁，第4版“Carbohydrates are polyhydroxy aldehydes，polyhydroxy ketones，orcompounds that can be hydrolysed to them.A carbohydrates that cannotbe hydrolysed to simpler compounds is called a monosaccharide.Acarbohydrates that can be hydrolysed to two monosaccharide moleculesis called a disaccharide.A carbohydrates that can be hydrolysed tomany monosaccharides is called a polysaccharide.”中所定義的任何糖類都可根據(jù)本發(fā)明而被采用。
糖類可優(yōu)選自葡萄糖、蔗糖、葡萄糖糖漿、果糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖、寡糖、限制糊精、糊精、水解谷物糊精、淀粉、環(huán)糊精、maltulose、甘露糖、和半乳糖，特別優(yōu)選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、水解糊精(hydrolyseddextrin)。
根據(jù)本發(fā)明，糖類的加入量一般為0.01g糖/kg培養(yǎng)液/小時-10g糖/kg培養(yǎng)液/小時，特別為0.1g糖類/kg培養(yǎng)液/小時-5g糖類/kg培養(yǎng)液/小時，在最優(yōu)選的實(shí)施方式中為0.5g糖類/kg培養(yǎng)液/小時-2g糖類/kg培養(yǎng)液/小時。
循環(huán)脈沖定量給料/暫停根據(jù)本發(fā)明，發(fā)酵期間糖類的加入方式為循環(huán)脈沖補(bǔ)料/暫停。通過“脈沖”補(bǔ)料糖類和“暫?！毖a(bǔ)料糖類，則出現(xiàn)“可控的”饑餓狀態(tài)，從而降低了粘度。根據(jù)脈沖/暫停次數(shù)(times)的比率而在暫停期間增加糖類的補(bǔ)料量，從而保持整體平均給料速率。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，糖類脈沖定量給料持續(xù)時間為10秒-1000秒，特別的為1秒-500秒，優(yōu)選為5秒-100秒。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，暫停持續(xù)時間為60秒-1800秒(1分鐘-30分鐘)，優(yōu)選為300秒-1800秒(5分鐘-30分鐘)。
根據(jù)本發(fā)明，脈沖定量給料時間短于暫停時間，例如脈沖定量給料時間持續(xù)30秒，而暫停時間持續(xù)，如300秒。
回收有價值的化合物本發(fā)明的另一個方面為發(fā)酵培養(yǎng)液的下游處理步驟。在發(fā)酵過程結(jié)束后，可使用適用于興趣化合物的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從發(fā)酵培養(yǎng)液中回收有價值的化合物。根據(jù)有用產(chǎn)物的性質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)定位而使用相關(guān)的下游處理技術(shù)。首先從發(fā)酵液體中分離有價值的化合物，采用例如，離心或過濾。在有價值的化合物于內(nèi)部累積或于微生物細(xì)胞相連的某些情況下要從生物質(zhì)中回收有價值的化合物。另外，當(dāng)微生物細(xì)胞分泌有價值的化合物時，從發(fā)酵液體中將其回收是眾所周知的。
下面用實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不應(yīng)理解為其對本發(fā)明作出限制。
實(shí)施例1材料和方法菌株和生長條件在所有試驗中均使用Aspergillus oryzae(獲自IFO 4177菌株，發(fā)酵研究所，Osaka，日本)。
凍干孢子用0.1％Tween 80溶液做成懸液且加入甘油至終濃度為30％(w/v)以便保藏。孢子懸液保存于-70℃。接種時，冰凍孢子在新鮮瓊脂糖斜面(酵母提取物4.0g/l，右旋糖單水化物5.0g/l，磷酸二氫鉀1.0g/l，硫酸鎂0.5g/l，瓊脂10g/l)上萌發(fā)孢子，在孢子形成后接種于種子發(fā)酵罐(20L)內(nèi)。
在種子形成培養(yǎng)基中，使用8L復(fù)合生長培養(yǎng)基為下述組合物葡萄糖20.0g/l，(NH4)2SO42.5g/l，酵母提取物10.0g/l，KH2PO41.5g/l，NaCl1.0g/l，MgSO4.7H2O 1.0g/l，CaCl2.2H2O 0.10g/l。滅菌后，加入1.0ml濾過滅菌痕量無機(jī)鹽溶液(ZnSO4.7H2O 5.7g/l，CuSO4.5H2O 1.0g/l，NiCl2.6H2O0.2g/l，F(xiàn)eSO4.7H2O 5.5g/l，MnSO4.H2O 3.4g/l)。然后使用KOH或H3PO4將培養(yǎng)基的pH調(diào)整至3.3。在種子形成發(fā)酵期間，溫度要保持在30℃，空氣流率控制在1.0VVM，漿速控制在750rpm，且通過加入NH3將pH保持在3.3。種子形成培養(yǎng)物長至細(xì)胞的氧利用率達(dá)到0.3mmol/(升×分鐘)的任意值時，5％(v/v)的種子形成培養(yǎng)物被用于接種試驗發(fā)酵。
發(fā)酵條件發(fā)酵罐的額定容積為20升而使用的工作容積為13升。生長培養(yǎng)基包含葡萄糖5.0g/l，(NH4)2SO42.5g/l，KH2PO43.75g/l，NaCl 2.5g/l，MgSO4.7H2O2.5g/l，CaCl2.2H2O 0.25g/l。滅菌后，加入17.5ml濾過滅菌痕量無機(jī)鹽溶液(如上述)。在所有步驟中，均通過使用NH3將pH保持在6.0，溫度保持在30℃，空氣流率控制在1.0VVM，而攪拌速度控制在750rpm。在對照發(fā)酵組中，在初始批次模式期間溶解氧水平升高10％后，將葡萄糖溶液(65％w/v)以10g葡萄糖每小時的速度持續(xù)補(bǔ)料。其它發(fā)酵組用本文所述方式進(jìn)行補(bǔ)料。經(jīng)規(guī)律時間間隔取樣，然后使用干細(xì)胞質(zhì)量的雙份測量法分析生物質(zhì)。形態(tài)學(xué)和流變學(xué)特性的測定如下述。
形態(tài)學(xué)真菌單元影像，包括培養(yǎng)液自由分散菌絲和凝集團(tuán)都被用來分析以便對形態(tài)定量。將1ml培養(yǎng)液與相同體積的定影液(Paul GC和Thomas CR(1998)Characterization of Mycelial Morphology Using Image Analysis.Adv.Biochem.Eng.601-59)混合以配制用于影像分析的樣品，并保存在4℃以備隨后的分析。在影像分析時，混合樣品用20％蔗糖溶液稀釋至終濃度為0.2g/1以便消除由于細(xì)胞重疊而形成的偽象。使用安置在載物臺倒置相差顯微鏡(inverted stage phase contrast microscope，IMT-2，Olympus)上的CCD影像相機(jī)(Sony)捕捉影像，并用安裝在Macintosh計算機(jī)(Quadra950)上的框架抓取卡(G-3，Scion)將其數(shù)字化。使用下載自互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)址http//rsb/info.nih.gov/nih-image/的軟件NIH Image V1.6來分析影像。采用平均投影面積(average projected area)將凝集團(tuán)和自由分散菌絲一同進(jìn)行測定。由于菌絲具有幾乎恒定的菌絲長度，故投影區(qū)域為體積的近似值，故其可被用于定量生物質(zhì)。對每一樣品而言，至少采用100真菌單元的影像進(jìn)行分析以便確定該樣品的平均投射區(qū)域。
流變學(xué)分析所有流變學(xué)測試均使用采用了“葉片和杯(vane and cup)”幾何學(xué)的回轉(zhuǎn)粘度計(rotational viscometer DVII+，Brookfield)來實(shí)施。所使用的葉片和杯的系統(tǒng)、其校準(zhǔn)方法以及流變學(xué)分析步驟已經(jīng)公開于Marten，MR，Wenger，KS和Khan，SA(1997).Rheology，Mixing Time，andRegime Analysis for a Production-Scale Aspergillus oryzaeFermentation.Bioreactor and Bioprocess Fluid Dynamics.A.W.Nienow.Ednburgh，BHR Group，Cranfield，UK295-313。Herschel-Bulkley方程(τ＝τy+Kγn)用于描述所有批次的流變學(xué)特性，表觀粘度(η)用(τavg/γavg)進(jìn)行計算，其中采用跟據(jù)Marten，MR，Wenger，KS和Khan，SA(1997).Rheology，Mixing Time，and Regime Analysis for aProduction-Scale Aspergillus oryzae Fermentation.Bioreactor andBioprocess Fluid Dynamics.A.W.Nienow.Ednburgh，BHRGroup，Cranfield，UK295-313的所定義的平均切變壓力(ave rage shearstress)和切變率(shear rate)。
統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計比較采用變量分析(AVOVA)。有意義水平(α)定義為0.05。因此，小于0.05的P值或顯著性概率(P)被認(rèn)為是組間顯著性差異的指征(9 5％可信度)。均值的耐受度報道為均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
凝膠電泳采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠(12％均一性，Bio-Rad)來確定胞外培養(yǎng)基中分泌蛋白的分布。
用β-巰基乙醇在Laemmli緩沖液中配制樣品，然后在加入相同體積前加熱。采用低距分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(Bio-Rad)來確定蛋白的分子量。采用掃描(GS-800，Bio-Rad)凝膠然后通過計算軌跡量(比如用其峰下面積定量條帶)來分析(Quantity One software，Bio-Rad)條帶的方法來定量蛋白條帶，。
結(jié)果采用下述方法來計算9個補(bǔ)料批次發(fā)酵的一系列發(fā)酵過程的三個不同的“脈沖片段(pulse ffaction PF)”值脈沖片段(PF)＝(補(bǔ)料-泵“開”時間)/(全部循環(huán)時間)。
在所有發(fā)酵的全部循環(huán)時間為300秒。作為對照組的三個補(bǔ)料批次的發(fā)酵過程以PF＝1.0實(shí)施，且葡萄糖的穩(wěn)定補(bǔ)料速率為10g/小時。第二組的三個發(fā)酵過程以PF＝0.5實(shí)施，且葡萄糖的補(bǔ)料速率為20g/小時，第三組的三個發(fā)酵過程以PF＝0.1實(shí)施，且葡萄糖的補(bǔ)料速率為100g/小時。通過這種安排，不管PF值是多少，在每5分鐘的循環(huán)里，總量相同的葡萄糖被加入到全部的發(fā)酵過程中。全部發(fā)酵的初始葡萄糖濃度均為5g/l，在溶解氧升高10％后開始補(bǔ)料。使用在線檢測來確定氧攝取率(OUR)，二氧化碳釋放率(CER)，加入的全部堿量；取樣后做離線的真菌形態(tài)學(xué)，培養(yǎng)液的流變學(xué)以及生物質(zhì)濃度的分析。
真菌生物質(zhì)(作為干細(xì)胞重測量)在全部發(fā)酵期間幾乎是線性增加至終濃度約17g/l?；貧w分析顯示在三個不同PF值的發(fā)酵過程中的生物質(zhì)圖之間不存在顯著性差異(95％可信度)。
對于全部批次而言，為控制pH而加入的全部堿幾乎為線性升高的，而且對于三個PF值來說，沒有可辨的差別。因此，在補(bǔ)料批次期間的脈沖補(bǔ)料操作對這些能指示細(xì)胞代謝能力的變量沒有明顯的影響。
全部胞外蛋白濃度(作為相同九個發(fā)酵過程期間的時間函數(shù))顯示了初始蛋白濃度為大約1g/l，這歸于來自接種物的殘留蛋白，其在發(fā)酵的補(bǔ)料期間降低了。在初始葡萄糖被消耗掉后，補(bǔ)料開始而且低殘留葡萄糖水平使得分泌蛋白表達(dá)。這引發(fā)了全部蛋白濃度明顯的線性增加，并持續(xù)至每一批次結(jié)束?；貧w分析顯示在三個不同PF值的發(fā)酵的蛋白濃度圖之間不存在顯著性差異(95％可信度)。
在發(fā)酵的補(bǔ)料批次期間，胞外蛋白濃度(g胞外蛋白每g干細(xì)胞質(zhì)量)所示均值對應(yīng)于PF值1.0，0.5和0.1分別為0.11±0.003，0.11±0.005和0.10±0.005，在這些PF值之間沒有顯著性差異。因此，脈沖補(bǔ)料對全部胞外蛋白濃度圖沒有明顯的影響。
除全部胞外蛋白以外，我們還使用了SDS-PAGE以便了解這些蛋白作為時間函數(shù)的表觀分布。確定了六個這些蛋白的相對濃度，而回歸分析顯示在不同PF值的發(fā)酵過程的蛋白表觀分布之間不存在顯著性差異。因此，脈沖補(bǔ)料并沒有改變該系統(tǒng)中胞外蛋白的表達(dá)方式或表觀分布。
雖然脈沖補(bǔ)料對代謝變量或胞外蛋白表達(dá)沒有明顯的影響，但其對真菌形態(tài)具有顯著影響。特別是真菌單元的平均尺寸。我們使用了平均投射面積(A)來測定真菌單元的尺寸，其能將自由分散的菌絲和凝集團(tuán)(此處所述的任一發(fā)酵中都未發(fā)現(xiàn)片狀物)一起考慮。平均投射面積已經(jīng)分為三個不同的時期。在第一個時期或每個發(fā)酵的補(bǔ)料階段(t＜18小時)，A作為時間的函數(shù)升高。在第二個時期(18＜t＜50小時)，初始葡萄糖衰竭，補(bǔ)料開始，而A開始降低。這會持續(xù)至第三時期(50＜t＜110小時)，這時A保持一個大約穩(wěn)定的值?；貧w分析顯示在開始的兩個時期間A圖之間不存在顯著性差異。相反的，在50小時和每一批次結(jié)束之間，時間平均的A在PF＝1.0和0.5的發(fā)酵之間(P＝2.2×10-4)，以及在PF＝1.0和0.1的發(fā)酵之間(P＝7.4×10-5)具有顯著性差異。
因此，脈沖補(bǔ)料對真菌形態(tài)有可測量的和顯著的影響。在脈沖補(bǔ)料發(fā)酵過程中的真菌單元要小于用持續(xù)葡萄糖流補(bǔ)料的發(fā)酵過程中的真菌單元。
這些發(fā)酵過程中的形態(tài)學(xué)行為顯示了其對培養(yǎng)液粘度具有可測量的影響。我們發(fā)現(xiàn)與形態(tài)學(xué)分析相類似的，培養(yǎng)液粘度情況可被分為三個不同的時期。在第一個時期(t＜18小時)，粘度作為時間的函數(shù)升高，在第二個時期(18＜t＜50小時)，粘度保持相對穩(wěn)定，在第三時期(50＜t＜110小時)，粘度再次升高。
在第一個時期或每個發(fā)酵過程的分批階段，培養(yǎng)液生物質(zhì)和A都升高，結(jié)果粘度同樣升高。在第二個時期，生物質(zhì)繼續(xù)升高，但A降低。顯然這兩個現(xiàn)象相互抵消，結(jié)果粘度保持相對穩(wěn)定。在第三時期，生物質(zhì)升高而A保持穩(wěn)定，這導(dǎo)致了粘度的第二次升高。對開始兩個時期(t＜50小時)的時間平均的粘度的統(tǒng)計學(xué)分析顯示在以三個不同PF值操作的發(fā)酵過程之間不存在顯著性差異。但是，在第三個時期，(t＞50小時)脈沖補(bǔ)料發(fā)酵過程的粘度要顯著低于對照組中的粘度。我們發(fā)現(xiàn)在這一時期，時間平均的粘度值為0.47±0.073，0.23±0.022和0.17±0.019，分別對應(yīng)于以PF值1.0，0.5和0.1所實(shí)施的發(fā)酵過程，在以PF值1.0和0.5之間(P＝1.8×10-5)，以及在PF＝1.0和0.1的發(fā)酵過程之間(P＝2.4×10-6)具有顯著性差異。
簡單的補(bǔ)料策略，特別是其中脈沖定量給料時間短于暫停時間的，可應(yīng)用于生產(chǎn)較小的真菌絲，其可導(dǎo)致發(fā)酵培養(yǎng)液粘度的顯著降低。
實(shí)施例2鏈霉菌發(fā)酵關(guān)于培養(yǎng)液粘度有益降低的第二個試驗來自產(chǎn)生天然胞內(nèi)蛋白的絲狀微生物鼠灰鏈霉素(Streptomyces murinus)。延長暫停時間可輕度增加生產(chǎn)能力，而能顯著降低培養(yǎng)液粘度。
方法三個相同試驗尺寸的發(fā)酵罐從相同種子發(fā)芽罐中獲取種子且同時以250公斤的起始重量運(yùn)行相同的時間。種子形成培養(yǎng)基為普通發(fā)酵成分，包括葡萄糖，谷物浸液，磷酸鉀和硫酸銨。主罐培養(yǎng)基為相同制備的，同樣包括磷酸鈉，硫酸鎂和一些痕量金屬。在主罐內(nèi)生長的起始階段，葡萄糖補(bǔ)料開始，其速率在余下的發(fā)酵過程中保持恒定。即，該發(fā)酵為這種生物的典型發(fā)酵方式。
測定每單位重量培養(yǎng)液的酶活性，通過使用遵守ISO-9001的校驗方法測定每單位體積的培養(yǎng)培養(yǎng)液的干細(xì)胞重。使用采用了6cm錐體和平板幾何學(xué)的Carrimed壓力控制的流變儀測定粘度。所述流變儀在指導(dǎo)下可施用10s-1&100s-1切變率，穩(wěn)定的壓力狀態(tài)用于計算表觀粘度。
結(jié)果圖1顯示了來自三個補(bǔ)料批次發(fā)酵過程的結(jié)果(以標(biāo)準(zhǔn)化的形式)。在這些發(fā)酵過程之間的唯一差別為三個過程的最后一個具有延長的暫停時間脈沖定量給料時間盡可能的快(＜10秒)而暫停時間為7分鐘。
每單位質(zhì)量的活性數(shù)據(jù)顯示了對來自脈沖-暫停補(bǔ)料方式的酶活性的影響為較小而正向的，對每單位體積細(xì)胞干重沒影響。粘度數(shù)據(jù)顯示了根據(jù)脈沖-暫停補(bǔ)料方式的培養(yǎng)液粘度具有顯著而高有益的降低。
結(jié)論脈沖-暫停定量給料方式導(dǎo)致生產(chǎn)能力小幅度增加以及粘度顯著性降低。這對大規(guī)?；旌闲阅苄纬芍饕绊?，其將導(dǎo)致能生成高生物質(zhì)濃度而因此具有高產(chǎn)出率的大規(guī)模發(fā)酵成為可能。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)有價值的化合物的方法，包括如下步驟a)在發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)發(fā)酵絲狀細(xì)菌或真菌，在發(fā)酵期間采用循環(huán)式脈沖定量給料/暫停的方式在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中加入糖類，其中所述脈沖定量給料時間短于暫停時間；和b)從發(fā)酵液中回收有價值的化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述有價值的化合物為抗生素或蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)為酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述酶為水解酶、蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、氧化還原酶、或糖酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述絲狀細(xì)菌為鏈霉屬菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述絲狀真菌為曲霉屬菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述糖類選自，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和水解糊精。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述糖類的加入量為從0.01g糖類/kg培養(yǎng)液/小時-10g糖類/kg培養(yǎng)液/小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脈沖補(bǔ)料持續(xù)時間為從1秒-500秒。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述暫停持續(xù)時間為從60秒-1800秒。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)有價值的化合物的方法，包括如下步驟a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵絲狀細(xì)菌或真菌(例如鏈霉屬菌株或曲霉屬菌株)，在發(fā)酵期間采用循環(huán)脈沖定量給料/暫停的方式在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中加入糖類，其中所述脈沖定量給料的時間短于暫停時間；和b)從發(fā)酵培養(yǎng)液中回收有價值的化合物。
文檔編號C12N1/14GK1558945SQ02818761
公開日2004年12月29日 申請日期2002年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月1日
發(fā)明者凱文·S·溫格, 瑪麗亞·A·凱塞多, 斯圖爾特·M·斯托克斯, 斯沃普尼爾·巴加瓦, 馬克·R·馬滕, A 凱塞多, R 馬滕, 凱文 S 溫格, 尼爾 巴加瓦, 特 M 斯托克斯 申請人:諾維信公司, 諾維信北美公司, 巴爾的摩的馬里蘭大學(xué)