專利名稱：具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽(以下沒有特別強(qiáng)調(diào)時(shí)，都稱之為「本發(fā)明的多肽」)以及通過基因重組技術(shù)制造該多肽的制造方法和其用途。
背景技術(shù)：
以葡萄糖為組成糖的糖，例如用淀粉作為原料制造的淀粉部分分解物，已知有直鏈淀粉、淀粉糊精、麥芽糖糊精、麥芽寡糖、異麥芽寡糖等。已知通常這些糖分子的兩端的任一端為非還原端，而另一端為還原端，表現(xiàn)出還原性。一般來(lái)說，淀粉部分分解物單位固態(tài)物的還原力的大小是以等價(jià)葡萄糖(Dextrose Equivalent＝DE)表示的。該值大的糖通常是低分子、低粘度、有甜味、反應(yīng)性強(qiáng)，容易與氨基酸或蛋白質(zhì)等含有氨基的物質(zhì)發(fā)生羰氨反應(yīng)，褐變之后發(fā)出惡臭，存在著容易使得到的制品的品質(zhì)劣化的缺點(diǎn)。為了改善這樣缺點(diǎn)，很早就期待著不改變淀粉部分分解物的組成糖葡萄糖，而降低或消減其還原力的方法。例如，就象Journal of American Chemical Society、第71卷、353至358頁(yè)(1949)中記載的那樣，已知有通過使macerans淀粉酶作用于淀粉，生成6至8分子的葡萄糖經(jīng)α-1，4-糖苷鍵連接的α-、β-或γ-環(huán)糊精的方法。現(xiàn)在可以由淀粉工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)環(huán)糊精，有效利用這些糖具有的非還原性、無(wú)味、包合能力等特性，用于各種用途。另外就象本申請(qǐng)人于特開平7-143876號(hào)公報(bào)以及特開平7-213283號(hào)公報(bào)等中公布的那樣，通過使非還原性糖生成酶以及海藻糖游離酶作用于麥芽寡糖等淀粉部分分解物，使通過2分子葡萄糖α，α-結(jié)合形成的海藻糖的方法也已知?，F(xiàn)在，該海藻糖可以由淀粉進(jìn)行工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，由于其還原性、溫和，可以在產(chǎn)生高品質(zhì)的甜味特性的用途中利用。象這樣以葡萄糖為組成糖的非還原糖，如葡萄糖聚合度為2的α，α-海藻糖、葡萄糖聚合度為6至8的α-、β-或γ-環(huán)糊精已經(jīng)可以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，雖然利用這些特性可用于各種用途，但這樣的非還原性糖的種類有限，期待著更多種類的非還原性糖乃至低還原性糖的開發(fā)。
而近年來(lái)，以葡萄糖為組成糖的新的環(huán)狀的四糖類已有報(bào)道。即在European Journal of Biochemistry、第226卷、641至648頁(yè)(1994年)中主要報(bào)道了通過使水解酶alternanase作用于葡萄糖殘基α-1，3糖苷鍵與α-1，6糖苷鍵交互連接成的alternan，生成具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖(在本說明書中沒有特別強(qiáng)調(diào)時(shí)，都略稱為「環(huán)狀四糖」，在有甲醇共存下可以使該糖結(jié)晶析出。
具有這樣環(huán)狀結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖是非還原性糖，表現(xiàn)出包合能力，有使揮發(fā)性有機(jī)物穩(wěn)定的作用和不引起羰氨反應(yīng)、不用擔(dān)心褐變、劣化，期待著在各種用途中可以利用、加工。
然而，環(huán)狀四糖的制造必需的原料alternan和酶alternanase的獲得不僅困難，而且生產(chǎn)這樣酶的微生物也不容易獲得。
在這樣狀況下，就象先前國(guó)際專利申請(qǐng)公開第WO 01/90338 A1號(hào)公布的那樣，本發(fā)明人等用作為非還原末端結(jié)合樣式具有α-1，6糖苷鍵、作為該非還原末端以外的結(jié)合樣式具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在3以上的糖(在本說明書中也將該糖略稱為「α-異麥芽糖基葡萄糖」)作為原料，使能特異切斷該糖中的α-異麥芽糖基部分和除此以外的葡萄糖基部分，將該α-異麥芽糖基部分轉(zhuǎn)移，生成環(huán)狀四糖的α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶作用于上述原料，使環(huán)狀四糖生成獲得了成功。該α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶是通過從α-異麥芽糖基葡萄糖轉(zhuǎn)移α-異麥芽糖基生成環(huán)狀四糖的酶，詳細(xì)地說是具有以下理化性質(zhì)的α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶。
(1)作用通過從作為非還原末端結(jié)合樣式具有α-1，6糖苷鍵、該非還原末端以外的結(jié)合樣式為α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在3以上的糖轉(zhuǎn)移α-異麥芽糖基，生成具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖。
(2)分子量通過SDS-凝膠電泳法確定，具有約82,000至約136,000道爾頓范圍內(nèi)的分子量。
(3)等電點(diǎn)通過含有兩性電解質(zhì)的電泳方法確定，具有pl約3.7至8.3范圍內(nèi)的等電點(diǎn)。
(4)最適溫度在pH6.0、反應(yīng)30分鐘的反應(yīng)條件下，最適溫度處于約45℃至約50℃的溫度范圍內(nèi)。
(5)最適pH在35℃、反應(yīng)30的反應(yīng)條件下，最適pH處于pH約5.5至6.5的范圍內(nèi)。
(6)溫度穩(wěn)定性在pH6.0下保持60分鐘的條件下，在約45℃以下具有溫度穩(wěn)定區(qū)。
(7)pH穩(wěn)定性于4℃下保持24小時(shí)的條件下，在pH約3.6至10.0的范圍內(nèi)具有穩(wěn)定pH區(qū)。
但是，就環(huán)狀四糖的原料糖看，雖然有望由豐富又便宜供給的淀粉生產(chǎn)，但實(shí)際上由于α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶不直接作用于淀粉，所以正在采用預(yù)先使淀粉轉(zhuǎn)換成具有上述特定結(jié)構(gòu)的α-異麥芽糖基葡萄糖，例如6-α-葡糖基麥芽糖或異麥芽糖基麥芽糖等比較低的低分子異麥芽寡糖，然后使其被α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶作用使環(huán)狀四糖生成的手法。另外，就從原料生成環(huán)狀四糖的收率看，使用6-α-葡糖基麥芽糖時(shí)，收率約為原料6-α-葡糖基麥芽糖重量的44％。同樣使用異麥芽糖基麥芽糖時(shí)的收率約為31％，而用淀粉時(shí)，不僅需要予先使α-淀粉酶、淀粉去分支酶、β-淀粉酶和α-糖苷酶等作用淀粉生成6-α-葡糖基麥芽糖等比較低的低分子異麥芽寡糖，而且環(huán)狀四糖的收率也極低，約為15％。由淀粉生產(chǎn)環(huán)狀四糖雖然這樣低的收率也可以生產(chǎn)，但擔(dān)心成本高、期待著以淀粉作為原料，提高環(huán)狀四糖的收率的新的制造方法的確立。
在這樣狀況下，本發(fā)明人等期待著以淀粉作為原料，能夠提高由淀粉得到環(huán)狀四糖的收率，生成α-異麥芽糖基葡萄糖的新的酶，所以一直對(duì)微生物進(jìn)行廣泛檢索。結(jié)果意外地發(fā)現(xiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)公開第WO 01/90338 A1號(hào)公布的從土壤中分離出來(lái)的屬于桿菌(Bacillus)屬和節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬的生產(chǎn)α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物C9株、C11株、N75株和A19株都生產(chǎn)新的α-異麥芽糖基葡糖生成酶，通過使新的α-異麥芽糖基葡糖生成酶和α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶作用于以淀粉部分分解物為代表的比較高的高分子寡糖，發(fā)現(xiàn)可以顯著提高目標(biāo)環(huán)狀四糖的收率，在闡明該α-異麥芽糖基葡糖生成酶的諸多性質(zhì)的同時(shí)，確立了該酶的制造方法，以及利用該酶進(jìn)行的α-葡糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)方法、α-異麥芽糖基葡糖的制造方法、以及該酶和α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶合用的環(huán)狀四糖或含有環(huán)狀四糖的糖及其制造方法，同時(shí)確立含有通過這些方法得到的環(huán)狀四糖、或含有環(huán)狀四糖的糖的食物、化妝品、藥品等的組成物。然而，問題是這些微生物生產(chǎn)α-異麥芽糖基葡糖生成酶的能力不充分，在大規(guī)模制造α-異麥芽糖基葡糖和環(huán)狀四糖時(shí)，必須大量培養(yǎng)作為這樣酶的供給源的微生物。
這一點(diǎn)，在今天，由于分子生物學(xué)進(jìn)步，已知酶的本質(zhì)是多肽，構(gòu)成該多肽的氨基酸序列左右著該酶活性的表達(dá)，該氨基酸序列由基因DNA編碼。因此，分離編碼多肽的基因，如果能夠解析其堿基序列，制作含有編碼該多肽的DNA的重組DNA，然后導(dǎo)入適宜的微生物和動(dòng)植物細(xì)胞，通過將得到的轉(zhuǎn)化體于適宜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，已經(jīng)可以比較容易地獲得所需要量的多肽。鑒于這樣的狀況，弄清編碼作為上述酶本質(zhì)的多肽的基因，闡明其堿基序列成了當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是創(chuàng)造具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽，該多肽通過從非還原末端結(jié)合樣式具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在2以上的糖，在實(shí)質(zhì)上不增加還原力情況下進(jìn)行α-葡糖基轉(zhuǎn)移，生成非還原末端的結(jié)合樣式具有α-1，6糖苷鍵，該非還原末端以外的結(jié)合樣式為具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在3以上的糖。
本發(fā)明的第二的目的在于提供編碼上述多肽的DNA。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供含有上述DNA的能夠復(fù)制的重組DNA。
本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供導(dǎo)入了上述重組DNA的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供利用上述轉(zhuǎn)化體制造具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的制造方法。
本發(fā)明的第六個(gè)目的在于提供上述多肽的用途。
本發(fā)明通過具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽解決上述第一個(gè)目的，而該酶具有下述理化性質(zhì)。
(1)通過從非還原末端結(jié)合樣式具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在2以上的糖，在實(shí)質(zhì)上不增加還原力情況下轉(zhuǎn)移α-葡糖基，生成非還原末端的結(jié)合樣式具有α-1，6糖苷鍵，該非還原末端以外的結(jié)合樣式為α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在3以上的糖。
(2)分子量通過SDS-凝膠電泳法確定，具有約74,000至約160,000道爾頓范圍內(nèi)的分子量。
(3)最適溫度在pH6.0、反應(yīng)60分鐘的反應(yīng)條件下，最適溫度處于約40℃至約50℃的溫度范圍內(nèi)。
在pH6.0、反應(yīng)60分鐘的反應(yīng)條件下，有1mM Ca2+存在下，最適溫度處于約45℃至約55℃的溫度范圍內(nèi)。
在pH8.4、反應(yīng)60分鐘的反應(yīng)條件下，最適溫度約為60℃。
在pH8.4、反應(yīng)60分鐘的反應(yīng)條件下，有1mM Ca2+存在下，最適溫度約為65℃。
(4)最適pH在35℃、反應(yīng)60分鐘的反應(yīng)條件下，最適pH處于pH約6.0至8.4的范圍內(nèi)。
(5)溫度穩(wěn)定性在pH6.0下保持60分鐘的條件下，在約45℃以下具有溫度穩(wěn)定區(qū)。
在pH6.0下保持60分鐘的條件下，有1mM Ca2+存在下，在約60℃以下具有溫度穩(wěn)定區(qū)。
在pH8.0下反應(yīng)60分鐘的條件下，在約55℃以下具有溫度穩(wěn)定區(qū)。
在pH8.0下保持60分鐘的條件下，有1mM Ca2+存在下，在約60℃以下具有溫度穩(wěn)定區(qū)。
(6)pH穩(wěn)定性于4℃下保持24小時(shí)的條件下，在pH約為5.0至10.0的范圍內(nèi)具有穩(wěn)定pH區(qū)。
本發(fā)明通過編碼上述多肽的DNA解決上述第二個(gè)目的。
本發(fā)明通過含有編碼上述多肽的DNA和可自我復(fù)制的載體形成的可復(fù)制DNA解決上述第三個(gè)目的。
本發(fā)明通過將含有編碼上述多肽的DNA和可自我復(fù)制的載體形成的可復(fù)制重組DNA導(dǎo)入適宜宿主形成的轉(zhuǎn)化體解決上述第四個(gè)目的。
本發(fā)明通過培養(yǎng)將含有編碼上述多肽的DNA和可自我復(fù)制的載體的可復(fù)制重組DNA導(dǎo)入適宜宿主形成的轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物提取多肽的多肽制造方法解決上述第五個(gè)目的。
本發(fā)明通過確立上述多肽的種種用途解決上述第六個(gè)目的。
附圖的簡(jiǎn)單說明

圖1是表示使具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用于麥芽四糖時(shí)生成的產(chǎn)物X的1H-NMR光譜。
圖2是表示使具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用于麥芽五糖時(shí)生成的產(chǎn)物Y的1H-NMR光譜。
圖3是使具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用于麥芽四糖時(shí)生成的產(chǎn)物X的13C-NMR光譜。
圖4是使具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用于麥芽五糖時(shí)生成的產(chǎn)物Y的13C-NMR光譜。
圖5是表示溫度對(duì)來(lái)自圓孢芽孢桿菌C11株的α-異麥芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影響圖。
圖6是表示溫度對(duì)來(lái)自圓孢芽孢桿菌N75株的α-異麥芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影響圖。
圖7是表示溫度對(duì)來(lái)自球形節(jié)桿菌A19株的α-異麥芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影響圖。
圖8是表示pH對(duì)來(lái)自圓孢芽孢桿菌C9株的α-異麥芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影響圖。
圖9是表示pH對(duì)來(lái)自圓孢芽孢桿菌N75株的α-異麥芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影響圖。
圖10是表示pH對(duì)來(lái)自球形節(jié)桿菌A19株的α-異麥芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影響圖。
圖11是表示本發(fā)明的來(lái)自圓孢芽孢桿菌C11株的α-異麥芽糖基葡糖生成酶的溫度穩(wěn)定性圖。
圖12是表示來(lái)自圓孢芽孢桿菌N75株的α-異麥芽糖基葡糖生成酶的溫度穩(wěn)定性圖。
圖13是表示來(lái)自球形節(jié)桿菌A19株的α-異麥芽糖基葡糖生成酶的酶的溫度穩(wěn)定性圖。
圖14是表示來(lái)自圓孢芽孢桿菌C11株的α-異麥芽糖基葡糖生成酶的pH穩(wěn)定性圖。
圖15是表示來(lái)自圓孢芽孢桿菌N75株的α-異麥芽糖基葡糖生成酶的pH穩(wěn)定性圖。
圖16是表示來(lái)自球形節(jié)桿菌A19株的α-異麥芽糖基葡糖生成酶的pH穩(wěn)定性圖。
圖17是表示來(lái)自本發(fā)明的重組DNA『pBGC2』的限制酶圖。圖中，用黑粗線表示的部分是編碼來(lái)自圓孢芽孢桿菌C11的本發(fā)明的具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的DNA。
圖18是表示本發(fā)明的重組DNA『pBGN2』的限制酶圖。圖中，用黑粗線表示的部分是編碼來(lái)自圓孢芽孢桿菌N75的本發(fā)明的具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的DNA。
圖19是表示來(lái)自本發(fā)明的重組DNA『pAGA1』的限制酶圖。圖中，用黑粗線表示的部分是編碼來(lái)自球形節(jié)桿菌A19的本發(fā)明的具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的DNA。
具體實(shí)施例方式
所謂本發(fā)明的多肽指的是具有通過從非還原末端結(jié)合樣式具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在2以上的糖，在實(shí)質(zhì)上不增加還原力情況下轉(zhuǎn)移α-葡糖基，生成非還原末端的結(jié)合樣式具有α-1，6糖苷鍵，該非還原末端以外的結(jié)合樣式為α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在3以上的糖的酶活性的整個(gè)多肽。本發(fā)明的多肽通常具有已解析的氨基酸序列，作為其中一例，如具有序列表中序列號(hào)1所示氨基酸序列、或具有在該氨基酸序列中缺失、或者是被其他氨基酸置換、或者再附加1個(gè)或多個(gè)氨基酸、即1個(gè)或2個(gè)以上、根據(jù)場(chǎng)合不同，1至50個(gè)、或1至30個(gè)、或1至10個(gè)氨基酸的氨基酸序列的多肽。另外即使是相同的DNA，由于導(dǎo)入該DNA的宿主或含有該DNA的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)中使用的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基成分、組成、培養(yǎng)溫度和pH等不同，由于DNA表達(dá)后受到宿主內(nèi)外酶的修飾等，雖然保持著所期望的理化性質(zhì)，但有時(shí)生成在序列表中序列號(hào)1所示氨基酸序列的N末端附近的氨基酸缺失、或被其他氨基酸置換1個(gè)或多個(gè)氨基酸、即1個(gè)或2個(gè)以上、根據(jù)場(chǎng)合不同，缺失、置換1至50個(gè)、或1至30個(gè)、或1至20個(gè)、或1至10個(gè)氨基酸，或者在N末端再新加上1個(gè)或2個(gè)以上、根據(jù)場(chǎng)合不同，加上1至30個(gè)、或1至20個(gè)、或1至10個(gè)氨基酸的變異體。即使是這樣的變異體，只要他具備所期望的理化性質(zhì)，不用說也都包括在本發(fā)明的多肽中。
本發(fā)明的多肽可以通過將本發(fā)明的DNA導(dǎo)入適宜宿主，從得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)液中獲取。作為本發(fā)明中使用的轉(zhuǎn)化體，例如可以是含有序列表中序列號(hào)4、5或6所示從5’，末端開始的堿基序列，或在那些堿基序列中缺失、置換、或附加1或數(shù)個(gè)堿基的堿基序列，或與這些序列互補(bǔ)的堿基序列，或根據(jù)基因的簡(jiǎn)并性，在不改變他編碼的氨基酸序列情況下，用其他堿基置換這些堿基序列中1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基后的堿基序列構(gòu)成的含DNA的轉(zhuǎn)化體。另外，作為上述堿基序列可以例示利用遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，在不改變編碼的氨基酸序列情況下，將1個(gè)或數(shù)個(gè)、即1個(gè)或2個(gè)以上、根據(jù)場(chǎng)合不同，1至150個(gè)、或1至90個(gè)、或1至60個(gè)、或1至30個(gè)氨基酸用其他堿基置換后的堿基序列。
本發(fā)明的DNA只要是編碼本發(fā)明的多肽的堿基序列，不管是來(lái)自天然的，還是人為合成的都可以。作為天然的供給源，例如包括于平成12年4月25日以受托號(hào)FERM BP-7143保藏于日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6所的獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心的圓孢芽孢桿菌C9菌株，以及于平成12年4月25日以受托號(hào)FERM BP-7144保藏于日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6所的獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心的圓孢芽孢桿菌C11菌株、以及于平成13年5月16日以受托號(hào)FERM BP-7591保藏于日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6所的獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心的含圓孢芽孢桿菌N75菌株的桿菌屬，或平成13年5月16日以受托號(hào)FERM BP-7590保藏于日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6所的獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心的含球形節(jié)桿菌A19株在內(nèi)的節(jié)桿菌屬的微生物。從這些微生物的菌體可以得到含有該發(fā)明的DNA的基因。即，將這樣的微生物接種于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，在需氧條件下培養(yǎng)約1至3天后，從培養(yǎng)物中收集菌體，通過用溶菌酶或β-葡聚糖酶等溶解細(xì)胞壁的酶或超聲波進(jìn)行處理，使含有該DNA的基因排到菌體外。此時(shí)，也可以使用蛋白酶等蛋白質(zhì)水解酶，或在SDS等表面活性劑存在下進(jìn)行凍融。對(duì)這樣得到的處理物可以通過使用酚萃取、醇沉淀、離心分離、核酸酶處理等該領(lǐng)域中通常用的方法，可以得到目的DNA。另外，人為合成本發(fā)明的DNA可以根據(jù)序列表中序列號(hào)4、5或6所示堿基序列進(jìn)行化學(xué)合成。另外，也可以以含有該DNA的基因作為模板，使用可作為適當(dāng)引物的化學(xué)合成DNA，進(jìn)行PCR合成。
使用這些DNA工業(yè)上可以大量、便宜而且容易地制造本發(fā)明的多肽。即，將該DNA插入通?？勺晕覐?fù)制的適宜載體之后，做成重組DNA，然后將其導(dǎo)入適宜宿主，將得到的轉(zhuǎn)化體于適宜營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，從該培養(yǎng)物中收集菌體，從該菌體中獲得含有該DNA的重組DNA，將該重組DNA導(dǎo)入通常容易增殖的適宜宿主，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過將得到的轉(zhuǎn)化體于適宜營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，可以制造本發(fā)明的多肽。只要能獲得編碼本發(fā)明的多肽的DNA，利用通常的重組DNA技術(shù)可以比較容易地制備上述重組DNA。另外作為上述載體，如pBR322、pUC18、Bluescript II SK(+)、pUB110、pTZ4、pC194、pHV14、TRp7、YEp7、pBS7等質(zhì)粒載體和λgt·λC、λgt·λB、ρ11、φ1和φ105等噬菌體載體。其中，用大腸桿菌表達(dá)本發(fā)明的DNA時(shí)，pBR322、pUC18、Bluescript II Sk(+)、λgt·λC和λgt·λB合適，用枯草桿菌表達(dá)時(shí)，pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1和φ105合適。pHV14、TRp7、YEp7和pBS7在二種以上的宿主內(nèi)使重組DNA復(fù)制時(shí)有用。
為了將本發(fā)明涉及到的DNA插入到上述載體，可以采用該領(lǐng)域中通常用的方法。具體來(lái)說，首先將含有DNA的基因和可自我復(fù)制的載體用限制酶和/或超聲波切斷，然后對(duì)生成的DNA片段和載體片段進(jìn)行連接。如果利用對(duì)基因和載體切斷處核苷酸具有特異作用的限制酶，特別是II型限制酶，詳細(xì)地講如果使用Sau 3AI、Eco RI、Hind III、Bam HI、Sal I、Xba I、Sac I、Pst I等，容易對(duì)DNA片段和載體片段進(jìn)行連接。根據(jù)需要，可以將兩者進(jìn)行退火后，在生物體內(nèi)或生物體外使DNA連接酶作用。這樣得到的重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌、枯草桿菌、放線菌、酵母等適宜宿主之后，作成轉(zhuǎn)化體，從這些轉(zhuǎn)化體中克隆所期望的轉(zhuǎn)化體，通過培養(yǎng)該克隆可以容易且大量復(fù)制。在上述克隆時(shí)，運(yùn)用菌落雜交法，可以選擇在含有作為非還原末端結(jié)合樣式具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在2以上的糖的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，由該糖生成非還原末端的結(jié)合樣式具有α-1，6糖苷鍵，該非還原末端以外的結(jié)合樣式為具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在3以上的糖的轉(zhuǎn)化體。
通過這些克隆得到的轉(zhuǎn)化體在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，可以在菌體內(nèi)外生產(chǎn)該多肽。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基通常使用碳源、氮源、礦物質(zhì)、以及根據(jù)需要，補(bǔ)充氨基酸或維生素等微量營(yíng)養(yǎng)素的通常用的液體培養(yǎng)基，作為碳源，如淀粉、淀粉水解物、葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖等糖源，而作為氮源，如氨、銨鹽、尿素、硝酸鹽、胨、酵母提取物、脫脂大豆、玉米浸漬液、肉湯等含氮無(wú)機(jī)物和有機(jī)物。將轉(zhuǎn)化體接種于這樣的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基的溫度維持在20至40℃，pH維持在2至10，通過通氣攪拌等在需氧條件下培養(yǎng)約1至6天，可以得到含有該多肽的培養(yǎng)物。該培養(yǎng)物作為含有本發(fā)明多肽的粗多肽可以直接使用，但通常在使用之前，都是通過滲透(壓)休克或表面活性劑將多肽從菌體抽提出來(lái)，或通過超聲波或細(xì)胞溶解酶將菌體破碎之后，通過過濾、離心分離等從菌體或菌體破碎物中分離、純化本發(fā)明的多肽。純化可以采用該領(lǐng)域用于純化多肽的通常方法，例如，對(duì)于除去菌體或菌體破碎物的培養(yǎng)物可以采用將從濃縮、鹽析、透析、分級(jí)沉淀、凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析、親和層析、凝膠電泳、等電點(diǎn)電泳等中選擇出來(lái)的1種或2種以上方法適當(dāng)組合的方法。
本發(fā)明的多肽具有從作為非還原末端結(jié)合樣式具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在2以上的糖，在實(shí)質(zhì)上不增加還原力情況下轉(zhuǎn)移α-葡糖基，生成非還原末端的結(jié)合樣式具有α-1，6糖苷鍵，該非還原末端以外的結(jié)合樣式為α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在3以上的糖的酶活性，詳細(xì)地講，該多肽具有以下理化性質(zhì)。
(1)作用通過從作為非還原末端結(jié)合樣式具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在2以上的糖，在實(shí)質(zhì)上不增加還原力情況下轉(zhuǎn)移α-葡糖基，生成非還原末端的結(jié)合樣式具有α-1，6糖苷鍵，該非還原末端以外的結(jié)合樣式為α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在3以上的糖。
(2)分子量通過SDS-凝膠電泳確定，具有約74,000至約160,000道爾頓范圍內(nèi)的分子量。
(3)最適溫度在pH6.0、反應(yīng)60分鐘的條件下，最適溫度處于約為40℃至約50℃的溫度范圍內(nèi)。
在pH6.0、反應(yīng)60分鐘的反應(yīng)條件下，有1mM Ca2+存在下，最適溫度處于約為45℃至約55℃的溫度范圍內(nèi)。
在pH8.4、反應(yīng)60分鐘的條件下，最適溫度約為60℃?；蛘咴趐H8.4、反應(yīng)60分鐘的條件下，有1mM Ca2+存在下，最適溫度約為65℃。
(4)最適pH在35℃、反應(yīng)60分鐘的條件下，最適pH處于pH約為6.0至8.4的范圍內(nèi)。
(5)溫度穩(wěn)定性在pH6.0下保持60分鐘的條件下，在約45℃以下具有溫度穩(wěn)定區(qū)。
在pH6.0下保持60分鐘的條件下，有1mM Ca2+存在下，在約60℃以下具有溫度穩(wěn)定區(qū)。
在pH8.0下保持60分鐘的條件下，在約55℃以下具有溫度穩(wěn)定區(qū)。
在pH8.0下保持60分鐘的條件下，有1mM Ca2+存在下，在約60℃以下具有溫度穩(wěn)定區(qū)。
(6)pH穩(wěn)定性于4℃下保持24小時(shí)的條件下，在pH約為5.0至10.0的范圍內(nèi)具有穩(wěn)定pH區(qū)。
作為本發(fā)明多肽作用的底物可以使用淀粉、支鏈淀粉、直鏈淀粉、糖原等含有α-1，4糖苷鍵的多糖，以及它們經(jīng)淀粉酶或酸等部分水解得到的淀粉糊精、麥芽糖糊精、麥芽寡糖等部分水解物。也可以隨意使用這些含有α-1，4糖苷鍵的葡糖基糖進(jìn)一步經(jīng)分支酶等加支酶(EC 2.4.1.18)處理的糖。作為經(jīng)淀粉酶分解的部分分解物，例如可以使用經(jīng)Handbook of Amylases and Related Enzymes、パ-ガモン·プレス公司(東京)(1988年)記載的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、麥芽三糖生成淀粉酶(EC 3.2.1.116)、麥芽四糖生成淀粉酶(EC 3.2.1.60)、麥芽五糖生成淀粉酶、麥芽六糖生成淀粉酶(EC 3.2.1.98)等淀粉酶分解的部分分解物。另外，在制備部分分解物時(shí)也可以使支鏈淀粉酶(3.2.1.41)、異淀粉酶(EC 3.2.1.68)等淀粉去分支酶隨意作用。作為底物的淀粉可以使用玉米、小麥、米等來(lái)自谷類的地上淀粉，也可以使用土豆、甘薯、木薯等地下淀粉，優(yōu)選使用使淀粉糊化和/或液化了的溶液。該淀粉部分分解的程度由于分解程度越低，環(huán)狀四糖的產(chǎn)率越高，DE在約20以下、優(yōu)選在約12以下、更理想的是在約5以下合適。底物濃度沒有特別限定。例如，即使使用底物濃度0.1％(w/w)(以下在本說明書中，沒有特別強(qiáng)調(diào)時(shí)，將『％(w/w)』略稱為『％』)的低濃度溶液的時(shí)候，本發(fā)明的酶反應(yīng)也可進(jìn)行，工業(yè)生產(chǎn)上1％以上合適。另外在底物溶液中即使是含有完全不溶的不溶性底物的溶液也可以。希望濃度在40％以下，更優(yōu)選是在20％以下合適。反應(yīng)溫度，反應(yīng)進(jìn)行的溫度，即在直到65℃附近的溫度、優(yōu)選是在30至55℃附近的溫度進(jìn)行反應(yīng)比較好。反應(yīng)pH通?？梢哉{(diào)整到4.5至8的范圍內(nèi)。優(yōu)選是將pH調(diào)整到5.5至7的范圍內(nèi)。反應(yīng)時(shí)間根據(jù)酶反應(yīng)的進(jìn)行狀況適當(dāng)選擇。
通過使α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶作用于本發(fā)明多肽作用于上述底物后生成的α-異麥芽基葡萄糖，可以大量且容易制造本領(lǐng)域中有用的環(huán)狀四糖。使α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶作用的時(shí)期無(wú)論在使本發(fā)明多肽作用時(shí)作用，還是在使該多肽失活后作用都可以。然而，如果用本發(fā)明多肽和α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶同時(shí)作用為宜。具體來(lái)說，通過對(duì)淀粉或其部分分解物在糖原的水溶液中與本發(fā)明的多肽和α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶合用，由淀粉或其部分分解物生成的環(huán)狀四糖的收率大約是固態(tài)物重量的30％以上，而使用糖原時(shí)得到的環(huán)狀四糖的收率大約是固態(tài)物重量的80％以上。本發(fā)明多肽和α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶合用時(shí)的環(huán)狀四糖的生成機(jī)制由兩者的反應(yīng)特性推測(cè)如下。
(1)本發(fā)明多肽作用于作為非還原末端的結(jié)合形式具有α-1，4-糖苷鍵的葡萄糖聚合度在2以上的糖，作用于例如淀粉、糖原或它們的部分分解物等的糖的非還原末端的α-1，4-葡萄糖基，使該葡萄糖基經(jīng)分子間轉(zhuǎn)移到其他的非還原末端葡萄糖基的6位羥基，生成非還原末端具有α-異麥芽糖基的糖。
(2)α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶作用于非還原末端具有異麥芽糖基的糖，該異麥芽糖基經(jīng)分子間轉(zhuǎn)移到位于其他的非還原末端含有異麥芽糖基的糖的非還原末端葡萄糖基的3位羥基上，生成非還原末端具有異麥芽糖基-1，3-異麥芽糖基的糖。
(3)α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶作用于該非還原末端具有異麥芽糖基-1，3-異麥芽糖基的糖，通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)移作用，將異麥芽糖基-1，3-異麥芽糖基與糖斷開，然后進(jìn)行環(huán)化，生成環(huán)狀四糖。
(4)在(3)中異麥芽糖基-1，3-異麥芽糖基斷開后的糖再次通過(1)至(3)的反應(yīng)，生成環(huán)狀四糖，這些反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行，可生成、積蓄大量環(huán)狀四糖。
就象以上說明的那樣，可以推測(cè)，通過合用本發(fā)明的多肽和α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶，象上述那樣兩者反復(fù)作用于各自的底物，環(huán)狀四糖的收率顯著提高。
另外在該環(huán)狀四糖的生成反應(yīng)中，進(jìn)而與其它轉(zhuǎn)移酶合用，四糖的收率提高也可實(shí)現(xiàn)。即，通過合用本發(fā)明的多肽和α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶，使他們作用于濃度約為15％的淀粉部分分解物，得到的環(huán)狀四糖的收率約為底物固態(tài)物重量的55％，在相同條件下，通過合用本發(fā)明多肽和α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶以及環(huán)麥芽糊精葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶(シクロマルトデキストリングルカノトランスフエラ一ゼ)，使他們作用，環(huán)狀四糖收率再提高相當(dāng)于基質(zhì)固態(tài)物重量的約5至10％，即可以提高到約60至65％。
通過上述反應(yīng)得到的溶液作為含有環(huán)狀四糖的溶液或含有環(huán)狀四糖的糖的溶液可以直接使用。然而，一般來(lái)說，這些糖都是通過適宜手法精制后使用。作為精制方法，可以適宜采用眾所周知的方法，例如將用活性炭進(jìn)行脫色、精制，通過H型和OH型離子交換樹脂脫鹽，通過薄層層析、高效液相層析、離子交換柱層析、活性炭柱層析、硅膠柱層析等柱層析分級(jí)，通過醇和丙酮等有機(jī)溶劑進(jìn)行分級(jí)，通過具有適度的分離性能的膜的分離，以及使用淀粉酶，例如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)等或α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)等酶對(duì)殘存的其他糖進(jìn)行分解的方法，利用酵母發(fā)酵處理，通過堿處理等將殘存還原性糖分解除去等各種精制方法1種或2種以上組合后可進(jìn)行精制。特別是作為工業(yè)大量生產(chǎn)方法，離子交換柱層析合適，例如通過使用特開昭58-23799號(hào)公報(bào)、特開昭58-72598號(hào)公報(bào)等中公開的使用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂的柱層析除去夾雜的糖，可以有效制造含有高純度的環(huán)狀四糖或含有環(huán)狀四糖的糖。此時(shí)，可以隨意采用固定床方式、移動(dòng)床方法、類似移動(dòng)床方法中的任一種方法。
這樣得到的環(huán)狀四糖或含有環(huán)狀四糖的糖可以隨意地進(jìn)一步濃縮、做成糖漿狀制品，或干燥后做成非晶形的環(huán)狀四糖或含有非晶形的環(huán)狀四糖的粉末狀糖制品。
為了制造環(huán)狀四糖結(jié)晶，例如可以在有機(jī)溶劑存在或不存在下通過將固態(tài)物純度在約50％以上、固態(tài)物濃度約30％至約90％的環(huán)狀四糖高含有液加入到結(jié)晶罐中，在相當(dāng)于固態(tài)物重量0.1％至20％環(huán)狀四糖種晶存在下，于95℃、優(yōu)選是在10至90℃的范圍內(nèi)在攪拌條件下，由高溫徐徐冷卻到低溫，制造含有環(huán)狀四糖的漿(マスキツト)。作為由漿(マスキツト)制造環(huán)狀四糖結(jié)晶或含有環(huán)狀四糖的糖的方法，可以適宜采用例如塊粉碎法、流動(dòng)造粒法、噴霧干燥法等眾所周知的方法，作為制造含蜜結(jié)晶的方法可以適宜采用分蜜方法等。
這樣得到的環(huán)狀四糖為上品，為帶有淡甜味的非還原性白色粉末或糖漿，而且穩(wěn)定，與其他材料、特別是氨基酸、寡肽、蛋白質(zhì)等含有氨基酸的物質(zhì)混合，即使加工，也幾乎不會(huì)褐變，不發(fā)生惡臭，也不損傷混合的其他材料的物性。另外，由于環(huán)狀四糖具有包合能力，在防止香味成分、有效成分等揮散、防止品質(zhì)劣化、保持香味成分、有效成分穩(wěn)定方面非常好。如果需要，通過合用環(huán)狀糊精類、分枝環(huán)狀糊精類、環(huán)糊精類、環(huán)果聚糖類等其他環(huán)狀糖，通過包合能力進(jìn)一步提高各種成分的穩(wěn)定性也可以有效實(shí)施。除了上述環(huán)狀四糖以外，環(huán)糊精類等環(huán)狀糖不必限定于高純度的糖，低純度的環(huán)狀糖、例如大量麥芽糊精以及含有各種環(huán)糊精的淀粉部分分解物也可以利用。
另外使用本發(fā)明的多肽得到的環(huán)狀四糖由于實(shí)質(zhì)上不會(huì)被淀粉酶或α-葡糖苷酶分解，所以即使口服也不會(huì)被消化吸收，另外也很難被腸道內(nèi)細(xì)菌發(fā)酵，可以作為極低熱量的水溶性食物纖維利用，即使是蟲牙誘發(fā)菌等也很難發(fā)酵，也可以用作很難引起蟲牙的甜味料，以及作為粉末狀物的粘著、固結(jié)防止劑。另外這樣的環(huán)狀四糖本身是無(wú)毒、無(wú)害的天然甜味料，是安全而穩(wěn)定的甜味料。對(duì)于環(huán)狀四糖結(jié)晶制品，與出芽短梗孢糖、羥乙基淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮等粘合劑合用用于片劑、糖衣片劑也可以有效實(shí)施。另外，還具備滲透壓調(diào)節(jié)性、賦形性、賦予光澤性、保濕性、粘性、防止其他糖結(jié)晶性、難發(fā)酵性等有用的性質(zhì)。
因此，使用本發(fā)明的多肽得到的環(huán)狀四糖或含有該糖的糖作為甜味料、調(diào)味劑、品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定劑、防止變色劑、賦形劑等在飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化妝品、醫(yī)藥品等各種組成物中可以有效利用。
另外，使用本發(fā)明的多肽得到的環(huán)狀四糖或含有該糖的糖可以直接用作加甜味的調(diào)味料。如果需要，也可以與例如粉飴、葡萄糖、果糖、乳糖、異構(gòu)化糖、砂糖、麥芽糖、海藻糖(α，α-海藻糖、α，β-海藻糖、β，β-海藻糖)、蜂蜜、楓糖、山梨糖醇、麥芽糖醇、氫查爾酮、蛇菊甙、α-葡糖基蛇菊甙、ラカンカ甜味物、干草甜、ソ-マチン、L-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、乙酰氨基磺酸鉀(acesulfameK)、三氯蔗糖(sucralose)、甘氨酸、丙氨酸等其他的甜味料合用，或者也可以與糊精、淀粉、乳糖等增量劑合用。尤其是與赤蘚糖醇、木糖醇、麥芽糖醇等低熱量甜味料或α-葡糖基蛇菊甙、ソ-マチン、L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯、糖精、乙酰氨基磺酸鉀(acesulfameK)、三氯蔗糖(sucralose)等1種或2種以上高甜度甜味料，作為低能量甜味料或者減肥甜味料等使用很適合。
使用本發(fā)明的多肽得到的環(huán)狀四糖或含有該糖的糖可以直接使用，或根據(jù)需要，與其他增量劑、賦形劑、粘合劑等混合之后，可以隨意做成顆粒、球狀、短棒狀、板狀、立方體、片劑等各種形狀使用。
使用本發(fā)明的多肽得到的環(huán)狀四糖或含有該糖的糖的甜味與具有酸味、咸味、澀味、香味、苦味等其他味道的各種物質(zhì)充分調(diào)和，因?yàn)槟退嵝浴⒛蜔嵝詮?qiáng)，所以在使一般食品帶上甜味、改善味道、改善品質(zhì)等中可以有效利用。例如，用作醬油、粉末醬油、大醬、粉末大醬、未過濾的酒、醬菜、(撒在飯上)粉狀食品、蛋黃醬、飾品、食用醋、三杯醋、粉末飯卷醋、中國(guó)調(diào)料、天汁、面汁、辣醬油、番茄醬、燒肉料汁、カレ-ルウ、燉(燜)食品的調(diào)料、湯料、湯(ダシ)調(diào)料、復(fù)合調(diào)味料、料酒、新料酒、餐用糖、咖啡用糖等各種調(diào)味料的甜味料、以及味道改良劑、品質(zhì)改良劑等也可以有效實(shí)施。另外，用于使煎餅、小方塊糯米點(diǎn)心、米和芝麻等加糖做的點(diǎn)心、皮糖樣點(diǎn)心、餅類、饅頭、米粉糕、餡類、羊羹、水羊羹、錦玉、果凍、蛋糕、麥芽糖球等各種日本點(diǎn)心、面包、餅干、椒鹽餅干、小糖餅、餡餅、プリン、加糖奶油漿、蛋奶羹、奶油填餡點(diǎn)心、華夫餅干、海棉狀點(diǎn)心、炸面圈、巧克力、口香糖、焦糖、牛軋?zhí)?、水果糖等各種洋點(diǎn)心、冰淇淋、雪糕等冰糕、果汁、冰蜜汁類、花醬、花生醬、果泥等醬類、果子醬、橘子果醬、咸果醬、糖果等果實(shí)、蔬菜的加工食品類、什錦醬菜、暴腌的咸甜蘿卜、千枚漬、腌野薤等腌物類、日本羅卜咸菜素、腌白菜素等腌物的素、火腿、香腸等畜肉制品類、魚肉火腿、魚肉香腸、魚糕、筒狀魚卷、炸蝦(魚)等魚肉制品、海膽、咸烏賊、醋海帶、さきするめ、料酒浸的河豚干、鱈、真鯛、蝦等田麩等各種珍味類、用海苔、野菜、麻雀、小魚、貝等制造的用調(diào)料注的制品類、煮豆、土豆沙拉、海帶卷等家常菜食品、乳制品、魚肉、畜肉、果實(shí)、蔬菜罐頭、陶裝類、合成酒、增釀酒、清酒、果酒、發(fā)泡酒、啤酒等酒類、咖啡、可口可樂、果汁、碳酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料等清涼飲料、預(yù)混合料、熱餅混合料、即飲飲料、即飲咖啡、即飲年糕小豆湯、即飲湯等即用食品、另外脫乳食品、治療食品、飲料劑、胨食品、冷凍食品等各種飲食物帶有甜味、味道改良劑、品質(zhì)改良等也可以有效實(shí)施。另外也可以用于提高家畜、家禽、以及蜜蜂、蠶、魚等飼養(yǎng)動(dòng)物的飼料、餌料等嗜好性為目的的用途中。此外，作為香煙、牙膏、口紅、唇膏、內(nèi)服液、片劑、口含片、肝油糖球、口中清涼劑、口中香劑、漱口劑等各種的固態(tài)物、用作膏狀、液體狀等嗜好物、化妝品、醫(yī)藥品等各種組成物的甜味劑、或味道改良劑、矯味劑、以及作為品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定劑等可以有效利用。作為品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定劑在容易失去有效成分、活性等各種生理活性物質(zhì)或含有這些物質(zhì)的健康食品、醫(yī)藥品等中可以有效利用。例如干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β、巨噬細(xì)胞游走抑制因子、神經(jīng)刺激因子、轉(zhuǎn)移因子、白介素II等淋巴因子含有液、胰島素、生長(zhǎng)激素、催乳激素、促紅細(xì)胞生成素、卵細(xì)胞刺激激素等激素含有液、BCG疫苗、日本腦炎疫苗、麻疹疫苗、小兒麻痹疫苗、天花疫苗、破傷風(fēng)類病毒、ハブ抗毒素、人免疫球蛋白等生物制劑含有液、青霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素、硫酸卡那霉素等抗生素含有液、硫胺素、核黃素、L-抗壞血酸、肝油、胡蘿卜素、麥角甾醇、生育酚等維生素含有液、EPA、DHA、花生四烯酸等高不飽和脂肪酸或其酯的衍生物、脂肪酶、酯酶、尿激酶、蛋白激酶、β-淀粉酶、異淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶等酶含有液、藥用人參提取物、甲魚提取物、小球藻提取物、蘆薈提取物、蜂[巢蠟]膠提取物等提取物等或高級(jí)凝膠等各種生理活性物質(zhì)、以及病毒、乳酸菌、酵母等活菌膏等不失去有效成分或活性的、而且穩(wěn)定的高品質(zhì)液體狀、膏狀或固狀健康食品和藥品等容易制造。
使上述那樣的各種組成物中含有用本發(fā)明多肽得到的環(huán)狀四糖或含有環(huán)狀四糖的糖的方法只要是包括在直至完成該制品的工序中都可以，例如可以適宜選擇混合、混揉、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、涂布、被覆、噴霧、注入、結(jié)晶、固化等眾所周知的方法。含有的環(huán)狀四糖的量通常為0.1％以上，優(yōu)選在1％以上。
以下根據(jù)實(shí)驗(yàn)例對(duì)圓孢芽孢桿菌C11株(FERM BP-7144)、圓孢芽孢桿菌N75株(FERM BP-7591)以及球形節(jié)桿菌A19株(FERMBP-7590)產(chǎn)生的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽的理化性質(zhì)的闡明、以及編碼具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽的DNA的闡明、以及利用該DNA的具有重組型α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽的制備方法進(jìn)行說明。
實(shí)驗(yàn)例1來(lái)自圓孢芽孢桿菌C11株的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽的制備實(shí)驗(yàn)例1-1 α-異麥芽糖基葡糖生成酶的制備將淀粉部分分解物(商品名『パインデツクス#4』)4.0％(w/v)、酵母提取物『アサヒミ-スト』1.8％(w/v)、磷酸氫二鉀0.1％(w/v)、磷酸二氫鈉·12水鹽0.06％(w/v)、硫酸鎂·7水鹽0.05％(w/v)以及水構(gòu)成的液體培養(yǎng)基100ml裝入到500ml容量的三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌20分鐘，冷卻之后，接種圓孢芽孢桿菌C11，將于27℃、230rpm下進(jìn)行48小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)的菌液作為種培養(yǎng)。將與種培養(yǎng)時(shí)同樣組成的培養(yǎng)基約20L加入到容量30L的發(fā)酵罐中，加熱滅菌、冷卻溫度達(dá)到27℃后，接種種培養(yǎng)液1％(v/v)，維持在27℃、pH6.0至8.0范圍內(nèi)，進(jìn)行48小時(shí)通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)后，對(duì)培養(yǎng)物中的酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果α-異麥芽糖基葡糖生成酶的活性約為0.55單位/ml，α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性約為1.8單位/ml，對(duì)該培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離(10,000rpm，30分鐘)，對(duì)回收的約18L上清的酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果α-異麥芽糖基葡糖生成酶的活性約為0.51單位/ml(總活性約為9,180單位)，α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性約為1.7單位/ml(總活性約為30,400單位)，兩個(gè)酶活性都主要是在上清中被檢測(cè)的，表明兩個(gè)酶都是被分泌到培養(yǎng)液的分泌型酶。
而上述兩種酶的活性象下述那樣測(cè)定。即，α-異麥芽糖基葡糖生成酶的測(cè)定如下將麥芽三糖溶解于100mM醋酸緩沖液(pH6.0)(終濃度為2％(w/v))，作為底物溶液，然后向0.5ml的底物溶液中加入0.5ml酶液，于35℃下進(jìn)行60分鐘酶反應(yīng)，將該反應(yīng)液煮沸10分鐘，使反應(yīng)停止后，通過高效液相層析(HPLC)法對(duì)該反應(yīng)液中的麥芽糖進(jìn)行定量。α-異麥芽糖基葡糖生成酶的1個(gè)活性單位定義為在上述條件下1分鐘內(nèi)生成1μ摩爾麥芽糖的酶量。而HPLC使用『Shodex KS-80』柱(昭和電工(株式會(huì)社)制造)，在柱溫60℃、洗脫液水的流速0.5ml/min的條件下進(jìn)行，用差示折射計(jì)『RI-8012』(東曹株式會(huì)社制造)進(jìn)行檢測(cè)。
α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定如下將6-α-葡糖基麥芽糖溶解于100mM醋酸緩沖液(pH6.0)(終濃度為2％(w/v))，作為底物溶液，然后向0.5ml的底物溶液中加入0.5ml酶液，于35℃下進(jìn)行30分鐘酶反應(yīng)，將該反應(yīng)液煮沸10分鐘，使反應(yīng)停止后，該反應(yīng)終止液中的葡萄糖量通過用葡萄糖氧化酶法進(jìn)行定量，α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶的1個(gè)活性單位定義為在上述條件下1分鐘內(nèi)生成1μ摩爾葡萄糖的酶量。
實(shí)驗(yàn)例1-2 部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品的制備將實(shí)驗(yàn)例1-1方法得到的培養(yǎng)上清約18L用80％飽和硫銨溶液進(jìn)行鹽析，于4℃下放置24小時(shí)后，該鹽析沉淀物經(jīng)離心分離(10,000rpm、30分鐘)回收，溶解于10mM磷酸緩沖液(pH7.5)后，對(duì)同樣緩沖液進(jìn)行透析，得到大約416ml粗酶液。該粗酶液含有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性約為8,440單位，α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性約為28,000單位。使用三菱化學(xué)株式會(huì)社制造『Sepabeads FP-DA13』凝膠對(duì)該粗酶液進(jìn)行離子交換層析。此時(shí)，無(wú)論α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性成分，還是α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性成分都沒有吸附在『Sepabeads FP-DA13』凝膠上，在非吸附級(jí)分中檢測(cè)到兩個(gè)酶的活性。回收該非吸附級(jí)分，對(duì)含有1M硫銨的10mM磷酸緩沖液(pH7.0)透析，該透析液經(jīng)離心分離除去不溶物，使用『Sephacryl HRS-200』凝膠(Amersham pharmacia biotech株式會(huì)社制造)進(jìn)行親和層析(凝膠量為500ml)。酶活性成分吸附在『Sephacryl HR S-200』凝膠上，用濃度從1M下降至0M硫銨進(jìn)行線性梯度洗脫，再繼續(xù)用濃度從0mM提高至100mM麥芽四糖進(jìn)行線性梯度洗脫，結(jié)果使α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性成分與α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性成分分離之后洗脫，在硫銨線性梯度濃度約為0.3M附近的級(jí)分中檢測(cè)到α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性，在麥芽四糖線性梯度濃度約30mM附近的級(jí)分中檢測(cè)到α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性。將α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性級(jí)分與α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性級(jí)分一個(gè)一個(gè)地回收，分別作為具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品、具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品回收，對(duì)這些酶標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行純化。
實(shí)驗(yàn)例1-3 具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的純化將用實(shí)驗(yàn)例1-2方法得到的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)含有1M硫銨的10mM磷酸緩沖液(pH7.0)透析，該透析液經(jīng)離心分離除去不溶物，使用東曹株式會(huì)社制造的『Butyl-Toyopearl 650M』凝膠進(jìn)行疏水層析(凝膠量為350ml)。該酶活性成分吸附于『Butyl-Toyopearl 650M』凝膠上，用硫銨濃度從1M降至0M進(jìn)行線性梯度洗脫，結(jié)果在硫銨濃度約0.3M附近，吸附的酶活性成分被洗脫出來(lái)，收集回收表現(xiàn)出該酶活性的級(jí)分。再次將該回收液對(duì)含有1M硫銨的10mM磷酸緩沖液(pH7.0)透析，該透析液經(jīng)離心分離除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝膠進(jìn)行親和層析，進(jìn)行純化。該純化各個(gè)階段中的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的酶標(biāo)準(zhǔn)品的酶活性量、比活性、收率如表1所示。
表1

通過含有7.5％(w/v)聚丙烯酰胺的凝膠電泳檢定純化的α-異麥芽糖基葡糖生成酶多肽標(biāo)準(zhǔn)品的純度，結(jié)果表明蛋白帶為單一帶，是純度高的多肽。
實(shí)驗(yàn)例1-4 具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的純化將用實(shí)驗(yàn)例1-2方法得到的具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)含有1M硫銨的10mM磷酸緩沖液(pH7.0)透析，該透析液經(jīng)離心分離除去不溶物，使用東曹株式會(huì)社制造的『Butyl-Toyopearl 650M』凝膠進(jìn)行疏水層析(凝膠量為350ml)。該酶活性成分吸附于『Butyl-Toyopearl 650M』凝膠上，用硫銨濃度從1M降至0M進(jìn)行線性梯度洗脫，結(jié)果在硫銨濃度約0.3M附近被洗脫出來(lái)，收集回收表現(xiàn)出該酶活性的級(jí)分。再次將該回收液對(duì)含有1M硫銨的10mM磷酸緩沖液(pH7.0)透析，該透析液經(jīng)離心分離除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝膠進(jìn)行親和層析來(lái)純化。該純化各個(gè)階段中的具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的酶標(biāo)準(zhǔn)品的酶活性量、比活性、收率如表2所示。
表2

通過含有7.5％(w/v)聚丙烯酰胺的凝膠電泳檢定純化的具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的酶標(biāo)準(zhǔn)品的純度，結(jié)果表明蛋白帶為單一帶，是純度高的多肽。
實(shí)驗(yàn)例2 來(lái)自圓孢芽孢桿菌N75的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽的制備實(shí)驗(yàn)例2-1 α-異麥芽糖基葡糖生成酶的制備將淀粉部分分解物(商品名『パインデツクス#4』、)4.0％(w/v)、酵母提取物『アサヒミ-スト』1.8％(w/v)、磷酸氫二鉀0.1％(w/v)、磷酸二氫鈉·12水鹽0.06％(w/v)、硫酸鎂·7水鹽0.05％(w/v)以及水構(gòu)成的液體培養(yǎng)基100ml裝入到500ml容量的三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌20分鐘，冷卻之后，接種圓孢芽孢桿菌N75，將于27℃、230rpm下進(jìn)行48小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)的菌液作為種培養(yǎng)。將與種培養(yǎng)時(shí)同樣組成的培養(yǎng)基約20L加入到容量30L的發(fā)酵罐中，加熱滅菌、冷卻溫度達(dá)到27℃后，接種種培養(yǎng)液1％(v/v)，維持在27℃、pH6.0至8.0范圍內(nèi)進(jìn)行48小時(shí)通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)后，對(duì)培養(yǎng)物中的酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果α-異麥芽糖基葡糖生成酶的活性約為0.34單位/ml，α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性約為1.1單位/ml。對(duì)該培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離(10,000rpm，30分鐘)，對(duì)回收的約18L上清的酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果α-異麥芽糖基葡糖生成酶的活性約為0.33單位/ml(總活性約為5,940單位)，α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性約為1.1單位/ml(總活性約為19,800單位)，兩個(gè)酶活性都主要是在上清中被檢測(cè)到，表明兩個(gè)酶都是被分泌到培養(yǎng)液的分泌型酶。
實(shí)驗(yàn)例2-2 部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品的制備將實(shí)驗(yàn)例2-1得到的培養(yǎng)上清約18L用80％飽和硫銨溶液進(jìn)行鹽析，于4℃下放置24小時(shí)后，該鹽析沉淀物經(jīng)離心分離(10,000rpm、30分鐘)回收，溶解于10mM tris-磷酸緩沖液(pH8.3)后，對(duì)同樣緩沖液進(jìn)行透析，得到約450ml粗酶液。該粗酶液含有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性約4,710單位，α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性約15,700單位。使用三菱化學(xué)株式會(huì)社制造『Sepabeads FP-DA13』凝膠對(duì)該粗酶液進(jìn)行離子交換層析。α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性成分吸附在『Sepabeads FP-DA13』凝膠上，而α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性成分沒有吸附在『Sepabeads FP-DA13』凝膠上，而是在非吸附級(jí)分中檢測(cè)到。然后用NaCl濃度從0M至1M線性梯度進(jìn)行洗脫，結(jié)果α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性成分大約在NaCl線性梯度中的約0.25M附近被洗脫出來(lái)。將α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性級(jí)分與α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性級(jí)分一個(gè)一個(gè)地回收，作為具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品、具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品分別回收，對(duì)這些酶標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行純化。
實(shí)驗(yàn)例2-3 具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的純化將用實(shí)驗(yàn)例2-2方法得到的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)含有1M硫銨的10mM磷酸緩沖液(pH7.0)透析，該透析液經(jīng)離心分離除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝膠(Amersham pharmacia biotech株式會(huì)社制造)進(jìn)行親和層析(凝膠量為500ml)。酶活性成分吸附在『Sephacryl HR S-200』凝膠上，用硫銨濃度從1M降至0M的線性梯度進(jìn)行洗脫，接著用麥芽四糖濃度由0mM上升到100mM的線性梯度進(jìn)行洗脫，結(jié)果在麥芽四糖線性梯度濃度約30mM附近的級(jí)分檢測(cè)到α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性。回收該酶活性級(jí)分。將該回收液對(duì)含有1M硫銨的10mM磷酸緩沖液(pH7.0)透析，該透析液經(jīng)離心分離除去不溶物，使用東曹株式會(huì)社制造的『Butyl-Toyopearl 650M』凝膠進(jìn)行疏水層析(凝膠量為350ml)。該酶吸附于『Butyl-Toyopearl 650M』凝膠上，用硫銨濃度從1M降至0M的線性梯度進(jìn)行洗脫，在硫銨濃度約0.3M附近吸附的酶被洗脫出來(lái)，收集回收表現(xiàn)出該酶活性的級(jí)分。再次將該回收液對(duì)含有1M硫銨的10mM磷酸緩沖液(pH7.0)透析，該透析液經(jīng)離心分離除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝膠進(jìn)行親和層析純化。該純化的各個(gè)階段中的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的酶標(biāo)準(zhǔn)品活性量、比活性、收率如表3所示。
表3

通過含有7.5％(w/v)聚丙烯酰胺的凝膠電泳檢定純化的α-異麥芽糖基葡糖生成酶多肽標(biāo)準(zhǔn)品的酶標(biāo)準(zhǔn)品純度，結(jié)果表明蛋白帶為單一帶，是純度高的多肽。
實(shí)驗(yàn)例2-4 具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的純化將用實(shí)驗(yàn)例2-2方法得到的具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)含有1M硫銨的10mM磷酸緩沖液(pH7.0)透析，該透析液經(jīng)離心分離除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝膠(Amersham pharmacia biotech株式會(huì)社制造)進(jìn)行親和層析(凝膠量為500ml)。酶活性成分吸附在『Sephacryl HR S-200』凝膠上，用硫銨濃度從1M降至0M的線性梯度進(jìn)行洗脫，結(jié)果大約在硫銨濃度為約0.3M附近檢測(cè)到該酶活性?；厥赵撁富钚约?jí)分。將該回收液對(duì)含有1M硫銨的10mM磷酸緩沖液(pH7.0)透析，該透析液經(jīng)離心分離除去不溶物，使用『Butyl-Toyopearl 650M』凝膠(東曹株式會(huì)社制造)進(jìn)行疏水層析(凝膠量為350ml)。該酶活性成分吸附于『Butyl-Toyopearl 650M』凝膠上，用硫銨濃度從1M降至0M的線性梯度進(jìn)行洗脫，在硫銨濃度約0.3M附近被洗脫出來(lái)，收集回收表現(xiàn)出該酶活性的級(jí)分。將該回收液對(duì)10mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)透析，該透析液經(jīng)離心分離除去不溶物，使用『SuperQ-Toyopearl 650C』凝膠(東曹株式會(huì)社制造)進(jìn)行離子交換柱層析(凝膠量380ml)。該酶不吸附于『SuperQ-Toyopearl 650C』凝膠上，而是在非吸附級(jí)分中洗脫出來(lái)，回收得到的洗脫級(jí)分，作為精制酶標(biāo)準(zhǔn)品。該純化的各個(gè)階段中的具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的酶標(biāo)準(zhǔn)品活性量、比活性、收率如表4所示。
表4

通過含有7.5％(w/v)聚丙烯酰胺的凝膠電泳檢定純化的具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的酶標(biāo)準(zhǔn)品的純度，結(jié)果表明蛋白帶為單一帶，是純度高的多肽。
實(shí)驗(yàn)例3 來(lái)自球形節(jié)桿菌A19的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽的制備實(shí)驗(yàn)例3-1 α-異麥芽糖基葡糖生成酶的制備將淀粉部分分解物(商品名『パインデツクス#4』)4.0％(w/v)、酵母提取物『アサヒミ-スト』1.8％(w/v)、磷酸氫二鉀0.1％(w/v)、磷酸二氫鈉·12水鹽0.06％(w/v)、硫酸鎂·7水鹽0.05％(w/v)以及水構(gòu)成的液體培養(yǎng)基100ml裝入到500ml容量的三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌20分鐘，冷卻之后，接種球形節(jié)桿菌A19，將于27℃、230rpm下進(jìn)行48小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)的菌液作為種培養(yǎng)。將與種培養(yǎng)時(shí)同樣組成的培養(yǎng)基約20L加入到容量30L的發(fā)酵罐中，加熱滅菌、冷卻后溫度達(dá)到27℃后，接種種培養(yǎng)液1％(v/v)，維持在27℃、pH6.0至9.0范圍內(nèi)進(jìn)行48小時(shí)通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)后，對(duì)培養(yǎng)物中的酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果α-異麥芽糖基葡糖生成酶的活性約為1.1單位/ml，α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性約為1.7單位/ml。對(duì)該培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離(10,000rpm，30分鐘)，對(duì)回收的約18L上清的酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果α-異麥芽糖基葡糖生成酶的活性約為1.06單位/ml(總活性約為19,100單位)，α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性約為1.6單位/ml(總活性約為28,800單位)，兩個(gè)酶活性主要都是在培養(yǎng)上清中被檢測(cè)到，表明兩個(gè)酶都是被分泌到培養(yǎng)液的分泌型酶。
另外，來(lái)自球形節(jié)桿菌A19的α-異麥芽糖基葡糖生成酶的活性測(cè)定除了作為底物的緩沖液用100mM甘氨酸-NaOH緩沖液(pH8.4)以外，其他按照實(shí)驗(yàn)例1記載的方法那樣進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)例3-2部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品的制備將實(shí)驗(yàn)例3-1方法得到的培養(yǎng)上清約18L用60％飽和硫銨溶液進(jìn)行鹽析，于4℃下放置24小時(shí)后，該鹽析沉淀物經(jīng)離心分離(10,000rpm、30分鐘)回收，溶解于10mM tris-磷酸緩沖液(pH7.0)后，對(duì)同樣緩沖液進(jìn)行透析，得到大約850ml粗酶液。該粗酶液含有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性約為8,210單位的，α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性約為15,700單位。將該粗酶液使用『DEAE-Toyopearl650S』凝膠(東曹株式會(huì)社制造)進(jìn)行離子交換層析(凝膠量380ml)。兩個(gè)酶活性都吸附于『DEAE-Toyopearl 650S』凝膠，然后用NaCl濃度從0M至1M線性梯度進(jìn)行洗脫，結(jié)果α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性成分大約在NaCl線性梯度中的約0.2M附近被洗脫出來(lái)，α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性成分大約在NaCl線性梯度中的約0.3M附近被洗脫出來(lái)。將α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性級(jí)分與α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性級(jí)分一個(gè)一個(gè)地回收，作為具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品、具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品分別回收，對(duì)這些酶標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行純化。
實(shí)驗(yàn)例3-3 具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的純化將用實(shí)驗(yàn)例3-2方法得到的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)含有1M硫銨的10mM磷酸緩沖液(pH7.0)透析，該透析液經(jīng)離心分離除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝膠(Amersham pharmacia biotech株式會(huì)社制造)進(jìn)行親和層析(凝膠量為500ml)。酶活性成分吸附在『Sephacryl HR S-200』凝膠上，用硫銨濃度從1M降至0M的線性梯度進(jìn)行洗脫，結(jié)果大約在硫銨的線性梯度濃度為約0.2M附近的級(jí)分檢測(cè)到α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性。然后回收該酶活性級(jí)分，作為精制酶標(biāo)準(zhǔn)品。該純化的各個(gè)階段中的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的酶標(biāo)準(zhǔn)品活性量、比活性、收率如表5所示。
表5

通過含有7.5％(w/v)聚丙烯酰胺的凝膠電泳檢定純化的α-異麥芽糖基葡糖生成酶多肽標(biāo)準(zhǔn)品的酶標(biāo)準(zhǔn)品的純度，結(jié)果表明蛋白帶為單一帶，是純度高的多肽。
實(shí)驗(yàn)例3-4 具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的部分純化將用實(shí)驗(yàn)例3-2方法得到的具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)含有1M硫銨的10mM磷酸緩沖液(pH7.0)透析，該透析液經(jīng)離心分離除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝膠(Amersham pharmacia biotech株式會(huì)社制造)進(jìn)行親和層析(凝膠量為500ml)。酶活性成分吸附在『Sephacryl HR S-200』凝膠上，用硫銨濃度從1M降至0M的線性梯度進(jìn)行洗脫，結(jié)果大約在硫銨濃度為0M附近的級(jí)分檢測(cè)到該酶活性。然后回收該酶活性級(jí)分，作為部分純化酶標(biāo)準(zhǔn)品。該純化的各個(gè)階段中的具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的酶標(biāo)準(zhǔn)品的酶活性量、比活性、收率如表6所示。
表6

通過含有7.5％(w/v)聚丙烯酰胺的凝膠電泳檢定純化的具有α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的酶標(biāo)準(zhǔn)品的純度，結(jié)果表明，除了主要的蛋白帶以外，還看到3種小的蛋白帶。
實(shí)驗(yàn)例4-1 對(duì)各種糖的作用使用各種糖進(jìn)行能否作為α-異麥芽糖基葡糖生成酶多肽的底物的試驗(yàn)。制備含有麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、異麥芽糖、異麥芽三糖、6-α-葡糖基麥芽糖、異6-α-葡糖基麥芽糖、海藻糖、曲二糖、黑曲霉二糖、新海藻糖、纖維二糖、龍膽二糖、麥芽糖醇、麥芽三糖醇、乳糖、蔗糖、吡喃葡糖基蔗糖、セラギノ-ス、麥芽糖基葡糖苷、異麥芽糖基葡糖苷的溶液。
向這些溶液中分別按照每1g底物固態(tài)物各2單位加入用實(shí)驗(yàn)例1-3方法得到的來(lái)自圓孢芽孢桿菌C11的純化α-異麥芽糖基葡糖生成酶多肽標(biāo)準(zhǔn)品，或用實(shí)驗(yàn)例2-3方法得到的來(lái)自圓孢芽孢桿菌N75的純化α-異麥芽糖基葡糖生成酶多肽標(biāo)準(zhǔn)品，用實(shí)驗(yàn)例3-3方法得到來(lái)自球形節(jié)桿菌A19的精制α-異麥芽糖基葡糖生成酶多肽標(biāo)準(zhǔn)品，將底物濃度調(diào)整到2％(w/v)，然后于30℃、pH6.0(來(lái)自球形節(jié)桿菌A19的酶調(diào)到pH8.4)條件下使酶作用24小時(shí)。為了研究酶反應(yīng)前后反應(yīng)液中的糖，進(jìn)行硅膠薄層層析(以下略為『TLC』)，作為展開溶劑使用正丁醇、吡啶、水混合液(容量比6∶4∶1)，作為薄層板使用『キ-ゼル膠60』(鋁板，20×20cm，默克公司制造)，進(jìn)行2次展開后，用硫酸-甲醇法對(duì)糖進(jìn)行發(fā)色檢測(cè)，確認(rèn)酶對(duì)各個(gè)糖有無(wú)作用。結(jié)果如7所示。
表7

注)在酶反應(yīng)前后，-表示沒有變化，+表示底物的點(diǎn)稍有減少，確認(rèn)有其他產(chǎn)物，++表示底物的點(diǎn)減少很多，確認(rèn)有其他產(chǎn)物，+++表示底物的點(diǎn)幾乎消失，確認(rèn)有其他產(chǎn)物，就象表7所表明的那樣，具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽在試驗(yàn)的各種糖中，對(duì)葡萄糖聚合度3以上，非還原末端具有麥芽糖結(jié)構(gòu)的糖作用最好。而葡萄糖聚合度為2的糖中，對(duì)麥芽糖、麴二糖、黑曲糖、新海藻糖、麥芽三糖醇、6-α-葡糖基麥芽糖稍有作用。
實(shí)驗(yàn)例4-2來(lái)自麥芽寡糖的產(chǎn)物向最終固態(tài)物濃度為1％的麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖或麥芽五糖的各個(gè)水溶液中分別加入用實(shí)驗(yàn)例1-3方法得到的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽，加入的量分別為每1g固態(tài)物2單位(麥芽糖和麥芽三糖水溶液的情況)、0.2單位(麥芽四糖水溶液的情況)、0.1單位(麥芽五糖水溶液的情況)，然后于35℃、pH6.0條件下作用8小時(shí)，于100℃下保持10分鐘，停止反應(yīng)。用HPLC對(duì)該酶反應(yīng)液的糖組成進(jìn)行測(cè)定。HPLC使用『YMC Pack ODS-AQ303』柱(株式會(huì)社ワイエムシ-制造)，在柱溫40℃、洗脫液水的流速為0.5ml/min的條件下進(jìn)行，用差示折射計(jì)『RI-8012』(東曹株式會(huì)社制造)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如表8所示。
表8

表中葡糖基麥芽糖是α-異麥芽糖基葡萄糖(別名62-O-α-葡糖基麥芽糖、6-α-葡糖基麥芽糖)葡糖基麥芽三糖是α-異麥芽糖基麥芽糖(別名63-O-α-葡糖基麥芽三糖)，X為本實(shí)驗(yàn)例已經(jīng)闡明結(jié)構(gòu)的α-異麥牙糖基麥芽三糖(別名64-O-α-葡糖基麥芽四糖)Y為本實(shí)驗(yàn)例已經(jīng)闡明結(jié)構(gòu)的α-異麥芽糖基麥芽四糖(別名65-O-α-葡糖基麥芽五糖)Z為尚未鑒定的糖。
就象表8的結(jié)果所表明的那樣，使具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用的結(jié)果表明，由底物麥芽糖主要生成葡萄糖和α-異麥芽糖基葡萄糖(別名62-O-α-葡糖基麥芽糖)，由底物麥芽三糖主要生成麥芽糖和α-異麥芽糖基麥芽糖(別名63-O-α-葡糖基麥芽三糖)，此外生成少量的葡萄糖、麥芽四糖、α-異麥芽糖基葡萄糖(別名62-O-α-葡糖基麥芽糖)以及產(chǎn)物X。由底物麥芽四糖主要生成麥芽三糖和產(chǎn)物X，少量的麥芽糖、麥芽五糖、α-異麥芽糖基麥芽糖(別名63-O-α-葡糖基麥芽三糖)以及產(chǎn)物Y。由底物麥芽五糖主要生成麥芽四糖和產(chǎn)物Y，少量的麥芽三糖、麥芽六糖、產(chǎn)物X和產(chǎn)物Z。
對(duì)由底物麥芽四糖生成的主要產(chǎn)物-產(chǎn)物X、以及由底物麥芽五糖生成的主要產(chǎn)物-產(chǎn)物Y進(jìn)行分離純化。通過使用分級(jí)用HPLC柱『YMC Pack ODS-A R355-15S-15 12A』柱(株式會(huì)社ワイエムシイ制造)對(duì)產(chǎn)物X、Y進(jìn)行純化分離，從來(lái)自上述麥芽四糖的反應(yīng)物分離出純度99.9％以上的產(chǎn)物X標(biāo)準(zhǔn)品，固態(tài)物回收率約8.3％，從來(lái)自上述麥芽五糖的反應(yīng)物分離出純度為99.9％以上的產(chǎn)物Y，固態(tài)物回收率約11.5％。
就得到的產(chǎn)物X和產(chǎn)物Y，按照常規(guī)方法進(jìn)行甲基化和NMR分析。甲基化的分析結(jié)果歸納在表9中。而有關(guān)NMR分析的結(jié)果，圖1和圖2分別給出了產(chǎn)物X和產(chǎn)物Y的1H-NMR光譜圖。另外圖3和圖4分別給出了產(chǎn)物X和產(chǎn)物Y的13C-NMR譜，這些結(jié)果歸納在表10中。
表9

從這些結(jié)果判明麥芽四糖經(jīng)具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用生成的產(chǎn)物X是葡萄糖基α結(jié)合在麥芽四糖的非還原末端葡萄糖的6位羥基的5糖，是結(jié)構(gòu)式1表示的α-異麥芽糖基麥芽三糖(別名64-O-α-葡糖基麥芽四糖)。
結(jié)構(gòu)式1α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp而麥芽五糖的產(chǎn)物Y是葡萄糖基α結(jié)合在麥芽五糖的非還原末端葡萄糖的6位羥基的6糖，是結(jié)構(gòu)式2表示的α-異麥芽糖基麥芽四糖(別名65-O-α-葡糖基麥芽五糖)。
結(jié)構(gòu)式2α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp
表10

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以如下面那樣判斷具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽對(duì)麥芽寡糖的作用。
1)具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用于作為底物含有非還原末端的結(jié)合方式為α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在2以上的糖，催化具有將其非還原末端的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到其他分子的非還原末端的葡萄糖殘基的6位上作用的分子間的6-葡萄糖基轉(zhuǎn)移，生成在非還原末端含有6-O-α-葡糖基的葡萄糖聚合度增加1個(gè)的α-異麥芽糖基葡萄糖(別名6-O-α-葡糖基麥芽寡糖)和葡萄糖聚合度減少1個(gè)的麥芽寡糖。
2)具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽也稍微能催化4-葡萄糖基轉(zhuǎn)移，由麥芽寡糖生成很少量葡萄糖聚合度增加1個(gè)的麥芽寡糖和葡萄糖聚合度減少1個(gè)的麥芽寡糖。
實(shí)驗(yàn)例4-3 還原力生成試驗(yàn)為了研究具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽是否具有還原力生成能力，進(jìn)行了以下試驗(yàn)。向最終濃度為1％的麥芽四糖水溶液中按照1g底物固態(tài)物0.25單位的比例加入用實(shí)驗(yàn)例1-3方法得到的來(lái)自圓孢芽孢桿菌C11的純化α-異麥芽糖基葡糖生成酶多肽標(biāo)準(zhǔn)品、或用實(shí)驗(yàn)例2-3方法得到的來(lái)自圓孢芽孢桿菌N75的純化α-異麥芽糖基葡糖生成酶多肽標(biāo)準(zhǔn)品、用實(shí)驗(yàn)例3-3方法得到的來(lái)自球形節(jié)桿菌A19的純化α-異麥芽糖基葡糖生成酶多肽標(biāo)準(zhǔn)品，然后于35℃、pH6.0(來(lái)自球形節(jié)桿菌A19的酶的情況下，pH8.4)條件下使酶作用，隨時(shí)采集一部分反應(yīng)液，于100℃下保持10分鐘之后停止反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)液的還原力進(jìn)行測(cè)定。即，用Somogyi-Nelson法測(cè)定該酶反應(yīng)前后溶液的還原糖量，另外同時(shí)用蒽酮硫酸法測(cè)定該酶反應(yīng)前后溶液的全糖量，還原力產(chǎn)率(％)用以下計(jì)算式算出。
計(jì)算式
結(jié)果如表11所示。
表11

就象表11結(jié)果所表明的那樣，若使具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用于底物麥芽四糖，沒有增加反應(yīng)物的還原力，該具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽沒有表現(xiàn)出水解作用，或生成不能檢測(cè)程度的很少量產(chǎn)物。
實(shí)驗(yàn)例4-4 分子量用實(shí)驗(yàn)例1-3方法純化得到的來(lái)自圓孢芽孢桿菌C11的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽、或用實(shí)驗(yàn)例2-3方法純化得到的來(lái)自圓孢芽孢桿菌N75的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽、用實(shí)驗(yàn)例3-3方法純化得到的來(lái)自球形節(jié)桿菌A19的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(凝膠濃度為7.5％(w/v))，與同時(shí)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)(日本バイオ·ラツド·ラボラトリ-ズ(株)制造)進(jìn)行比較，測(cè)定該酶多肽的分子量。來(lái)自C11的該多肽的分子量約為137,000±20,000道爾頓，來(lái)自N75的該多肽的分子量約為136,000±20,000道爾頓，來(lái)自A19的該多肽的分子量約為94,000±20,000道爾頓。
實(shí)驗(yàn)例4-5 等電點(diǎn)用實(shí)驗(yàn)例1-3方法純化得到的來(lái)自圓孢芽孢桿菌C11的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽、或用實(shí)驗(yàn)例2-3方法純化得到的來(lái)自圓孢芽孢桿菌N75的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽、用實(shí)驗(yàn)例3-3方法純化得到的來(lái)自球形節(jié)桿菌A19的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽經(jīng)含有2％(w/v)兩性電解質(zhì)(Amershampharmacia biotech(株)制造)的等電點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，對(duì)電泳后的蛋白帶以及凝膠的pH進(jìn)行測(cè)定，求出該酶多肽的等電點(diǎn)。測(cè)定的結(jié)果為來(lái)自C11的該多肽的等電點(diǎn)pl約為5.2±0.5，來(lái)自N75的該多肽的等電點(diǎn)pl約為7.3±0.5，來(lái)自A19的該多肽的等電點(diǎn)pl約為4.3±0.5。
實(shí)驗(yàn)例4-6 作用溫度和pH在各種溫度、pH條件下，根據(jù)實(shí)驗(yàn)例1-1給出的α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的測(cè)定方法研究溫度和pH對(duì)α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的影響。關(guān)于溫度的影響是在沒有Ca2+存在下和有1mMCa2+存在下測(cè)定的。這些結(jié)果表示在圖5[溫度的影響(來(lái)自C11多肽)]、圖6[溫度的影響(來(lái)自N75多肽)]、圖7[溫度的影響(來(lái)自A19多肽)]、圖8[pH的影響(來(lái)自C11多肽)]、圖9[pH的影響(來(lái)自N75多肽)]、圖10[pH的影響(來(lái)自A19多肽)]中。結(jié)果表明，來(lái)自圓孢芽孢桿菌C11的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的酶標(biāo)準(zhǔn)品的最適溫度在pH6.0、反應(yīng)60分鐘條件下約為45℃(沒有Ca2+存在)或約為50℃(有1mM Ca2+存在)，其最適pH在35℃、反應(yīng)60分鐘條件下約為6.0，來(lái)自圓孢芽孢桿菌N75的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的最適溫度在pH6.0、反應(yīng)60分鐘條件下約為50℃(沒有Ca2+存在)或約為55℃(有1mM Ca2+存在)，其最適pH在35℃、反應(yīng)60分鐘條件下，約為6.0，來(lái)自球形節(jié)桿菌A19的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的最適溫度在pH8.4、反應(yīng)60分鐘條件下約為60℃(沒有Ca2+存在)或約為65℃(有1mM Ca2+存在)，其最適pH在35℃、反應(yīng)60分鐘下約為8.4。
實(shí)驗(yàn)例4-7 穩(wěn)定性具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的溫度穩(wěn)定性是通過將含有該多肽的溶液[20mM醋酸緩沖液、pH6.0(來(lái)自A19的多肽，的情況下，20mM甘氨酸-NaOH緩沖液，pH8.0)]于沒有Ca2+存在或有1mM Ca2+存在下的各個(gè)溫度保持60分鐘，水冷卻后通過測(cè)定殘存α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性求出的。而pH穩(wěn)定性是將具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽于各個(gè)pH的50mM緩沖液中于4℃下保持24小時(shí)后，將pH調(diào)到6.0(來(lái)自A19的多肽的情況下，pH8.0)，測(cè)定殘存的酶活性求出的。這些結(jié)果分別如圖11[溫度穩(wěn)定性(來(lái)自C11多肽)]、圖12[溫度穩(wěn)定性(來(lái)自N75多肽)]、圖13[溫度穩(wěn)定性(來(lái)自A19多肽)]、圖14[pH穩(wěn)定性(來(lái)自C11多肽)]、圖15[pH穩(wěn)定性(來(lái)自N75多肽)]、圖16[pH穩(wěn)定性(來(lái)自A19多肽)]所示。來(lái)自圓孢芽孢桿菌C11的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽的溫度穩(wěn)定性約在低于40℃(沒有Ca2+存在)或約在低于45℃(有1mM Ca2+存在)，該多肽的pH穩(wěn)定性在約5.0至10.0范圍，來(lái)自圓孢芽孢桿菌N75的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽的溫度穩(wěn)定性約在低于45℃(沒有Ca2+存在)，或約在低于50℃(有1mMCa2+存在)，該多肽的pH穩(wěn)定性在約5.0至9.0范圍，來(lái)自球形節(jié)桿菌A19的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性多肽的溫度穩(wěn)定性約在低于55℃(沒有Ca2+存在)，或約在低于60℃(有1mM Ca2+存在)，該多肽的pH穩(wěn)定性在約5.0至9.0范圍。
實(shí)驗(yàn)例5 部分氨基酸序列實(shí)驗(yàn)例5-1 N末端氨基酸序列對(duì)用實(shí)驗(yàn)例1-3方法純化得到的來(lái)自C11株的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽、用實(shí)驗(yàn)例2-3方法純化得到的來(lái)自N75株的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽、用實(shí)驗(yàn)例3-3方法純化得到的來(lái)自A19株的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽用蛋白測(cè)序儀『型號(hào)47.3A』(Applyed biosystems公司生產(chǎn))對(duì)他們的N末端氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果來(lái)自C11株的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽具有序列表中序列號(hào)7所示的氨基酸序列，來(lái)自N75株的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽具有序列表中序列號(hào)19所示的氨基酸序列，來(lái)自A19株的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽具有序列表中序列號(hào)26所示的氨基酸序列。
實(shí)驗(yàn)例5-2 來(lái)自C11株多肽的內(nèi)部氨基酸序列將用實(shí)驗(yàn)例1-3方法純化得到的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的一部分對(duì)10mM Tris-HCl緩沖液(pH9.0)透析后，用同一緩沖液將得到的透析液稀釋到濃度為1mg/ml。通過向該樣品液(1ml)加入10μg的胰蛋白酶(和光純藥株式會(huì)社銷售)，于30℃下反應(yīng)22小時(shí)進(jìn)行肽化。為了分離生成的肽，進(jìn)行反相HPLC。即，使用『microbondpack C18柱』(直徑2.1mm×長(zhǎng)150mm、Waters公司制造)，流速為0.9ml/分，于室溫下，在從0.1％三氟乙酸-8％乙腈溶液至0.1％三氟乙酸-40％乙腈溶液的120分鐘的線性梯度的條件下對(duì)肽進(jìn)行柱層析分級(jí)。從柱子上洗脫下來(lái)的肽通過測(cè)定在波長(zhǎng)210nm的吸光度進(jìn)行檢測(cè)。分別收集與其他肽充分分離的10個(gè)肽[P8(保留時(shí)間約8分鐘)、P20(保留時(shí)間約20分鐘)、P56(保留時(shí)間約56分鐘)、P60(保留時(shí)間約60分鐘)、P62(保留時(shí)間約62分鐘)、P64(保留時(shí)間約64分鐘)、P75(保留時(shí)間約75分鐘)、P82(保留時(shí)間約82分鐘)、P88(保留時(shí)間約88分鐘)、P99(保留時(shí)間約99分鐘)]，將各含多肽級(jí)分分別進(jìn)行真空干燥之后，溶解于200μl的0.1％三氟乙酸-50％乙腈溶液中后，將各個(gè)肽分別上樣到蛋白質(zhì)測(cè)序儀，對(duì)各自氨基酸序列進(jìn)行分析，得到了序列表中序列號(hào)8至17所示的氨基酸序列。
實(shí)驗(yàn)例5-3 來(lái)自N75株多肽的內(nèi)部氨基酸序列將用實(shí)驗(yàn)例2-3方法純化得到的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的一部分對(duì)10mM Tris-HCl緩沖液(pH9.0)進(jìn)行透析后，用同一緩沖液將得到的透析液稀釋到濃度為約1mg/ml。通過向該樣品液(1ml)加入20μg的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶(和光純藥株式會(huì)社銷售)，于30℃下反應(yīng)24小時(shí)進(jìn)行肽化。為了分離生成的肽，進(jìn)行反相HPLC。即使用『microbondpack C18柱』(直徑3.9mm×長(zhǎng)150mm、Warters公司制造)，流速為0.9ml/分，于室溫下，在從0.1％三氟乙酸-8％乙腈溶液至0.1％三氟乙酸-36％乙腈溶液的120分鐘的線性梯度的條件下對(duì)肽進(jìn)行柱層析分級(jí)。從柱子上洗脫下來(lái)的肽通過測(cè)定在波長(zhǎng)210nm的吸光度進(jìn)行檢測(cè)。分別收集與其他肽充分分離的5個(gè)肽[PN 47(保留時(shí)間約47分鐘)、PN 59(保留時(shí)間約59分鐘)、PN 67(保留時(shí)間約67分鐘)、PN 87(保留時(shí)間約87分鐘)、PN 89(保留時(shí)間約89分鐘)]，將各含有肽的級(jí)分分別進(jìn)行真空干燥之后，溶解于200μl的0.1％三氟乙酸-50％乙腈溶液中后將各個(gè)肽分別上樣到蛋白質(zhì)測(cè)序儀，對(duì)各自氨基酸序列進(jìn)行分析，得到了序列表中序列號(hào)20至24所示的氨基酸序列。
實(shí)驗(yàn)例5-4 來(lái)自A19株多肽的內(nèi)部氨基酸序列將用實(shí)驗(yàn)例3-3方法純化得到的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的一部分對(duì)10mM Tris-HCl緩沖液(pH9.0)進(jìn)行透析后，用同一緩沖液將得到的透析液稀釋到濃度為約1mg/ml。通過向該樣品液(1ml)加入20μg的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶(和光純藥株式會(huì)社銷售)，于30℃下反應(yīng)24小時(shí)進(jìn)行肽化。為了分離生成的肽，進(jìn)行反相HPLC。即使用『microbondpack C18柱』(直徑2.1×長(zhǎng)150mm、Waters公司制造)，流速為0.9ml/分，于室溫下，在從0.1％三氟乙酸-16％乙腈溶液至0.1％三氟乙酸-36％乙腈溶液的120分鐘的線性梯度的條件下對(duì)肽進(jìn)行柱層析分級(jí)。從柱子上洗脫下來(lái)的肽通過測(cè)定在波長(zhǎng)210nm的吸光度進(jìn)行檢測(cè)。分別收集與其他肽充分分離的5個(gè)肽[PA39(保留時(shí)間約39分鐘)、PA 81(保留時(shí)間約81分鐘)、PA 86(保留時(shí)間約86分鐘)、PA 92(保留時(shí)間約92分鐘)、PN 104(保留時(shí)間約104分鐘)]，將各含有肽的級(jí)分分別進(jìn)行真空干燥之后，溶解于200μl的0.1％三氟乙酸-50％乙腈溶液后，將各個(gè)肽分別上樣到蛋白質(zhì)測(cè)序儀，分析各自的氨基酸序列，得到了序列表中序列號(hào)27至31所示的氨基酸序列。
實(shí)驗(yàn)例6 含有編碼來(lái)自圓孢芽孢桿菌C11菌株多肽的DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體的制備實(shí)驗(yàn)例6-1 染色體DNA的制備將含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』2.0％(w/v)、酵母提取物1.0％(w/v)、磷酸氫二鉀0.1％(w/v)、磷酸氫二鈉·12水鹽0.06％(w/v)、硫酸鎂·7水鹽0.05％(w/v)以及水構(gòu)成的培養(yǎng)基100ml裝入到500ml容量的三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌20分鐘，冷卻之后，接種圓孢芽孢桿菌C11菌株，于27℃、230rpm下進(jìn)行24小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。然后將經(jīng)離心分離從培養(yǎng)物中收集的菌體懸浮于TES緩沖液(pH8.0)，加入0.05％(w/v)溶菌酶，于37℃溫育30分鐘。于-80℃下對(duì)該處理物冷凍1小時(shí)后，加入TSS緩沖液(pH9.0)后，加溫至60℃，加入TES緩沖液/酚混合液，于冰水中一邊冷卻，一邊激烈振蕩5分鐘，經(jīng)離心分離收集上清。向該上清加入2倍上清容積的冷乙醇，回收沉淀的粗染色體DNA，溶解于SSC緩沖液(pH7.1)后，分別加入核酸酶和蛋白酶7.5μg和125μg，于37℃溫育1小時(shí)使其反應(yīng)。向反應(yīng)物中加入氯仿/異戊醇混合液，對(duì)染色體DNA進(jìn)行萃取，加入冷乙醇，收集含有生成染色體DNA的沉淀。將這樣得到的純化染色體DNA溶解于SSC緩沖液(pH7.1)，終濃度約為1mg/ml，將該溶液于-80℃下冷凍。
實(shí)驗(yàn)例6-2轉(zhuǎn)化體BGC2的制備取1ml實(shí)驗(yàn)例6-1制備的純化染色體DNA溶液，加入約35單位的限制酶Sau 3AI，于37℃反應(yīng)20分鐘，對(duì)染色體DNA進(jìn)行部分分解后，通過蔗糖密度梯度超離心法收集由約2,000至6,000堿基對(duì)構(gòu)成的DNA片段。另一方面，通過常規(guī)方法使限制酶Bam HI作用于質(zhì)粒載體『Bluescript II SK(+)』(Stratagene·cloning system公司制造)，完全切斷后，使用該被切斷的質(zhì)粒載體0.5μg和先前得到的DNA片段約5μg，用『DNA連接試劑盒』(寶酒造(株)制造)按照附帶的說明書操作，進(jìn)行連接，用得到的重組DNA通過通常的感受態(tài)細(xì)胞法對(duì)100μl感受態(tài)細(xì)胞『EpicurianColiXL2-Blue』(Stratagene·cloning system公司制造)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，制作基因文庫(kù)。將得到的作為基因文庫(kù)的轉(zhuǎn)化體接種于按照常規(guī)方法制備的含有胰蛋白酶10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉5g/L、氨芐青霉素鈉鹽100mg/L以及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷50mg/L的瓊脂平板培養(yǎng)基(pH7.0)，于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)后，將培養(yǎng)基上形成的白色菌落約5,000個(gè)固定于尼龍膜『Hybond-N+』上。另一方面，根據(jù)實(shí)驗(yàn)例5-2方法中闡明的序列表中序列號(hào)16所示氨基酸序列第4到第11位的氨基酸序列化學(xué)合成用5’-GGNTTYATGAAYTTYAGRTGGGA-3’表示的堿基序列的寡核苷酸，依據(jù)常規(guī)方法用[γ-32P]ATP和T4聚核苷酸激酶進(jìn)行同位素標(biāo)記，得到作為探針1的合成DNA。從在先前得到的固定于尼龍膜上的菌落中，表現(xiàn)出與探針1顯著會(huì)合的菌落中使用通常的菌落雜交法選擇2種轉(zhuǎn)化體。根據(jù)常規(guī)方法，從這2種轉(zhuǎn)化體提取重組DNA，另一方面，根據(jù)序列表中序列號(hào)17所示氨基酸序列第4到第11位的氨基酸序列化學(xué)合成用5’-GAYGCNTGGATGTTYGGNGAYTGG-3’表示的堿基序列的探針2，同樣進(jìn)行同位素標(biāo)記后，使用通常的Sorthern雜交，選擇表現(xiàn)出顯著會(huì)合的重組DNA，將該轉(zhuǎn)化體命名為『BGC2』。
實(shí)驗(yàn)例6-3 DNA序列的解析將用實(shí)驗(yàn)例6-2方法得到轉(zhuǎn)化體『BGC2』按照常規(guī)方法接種于含有氨芐青霉素鈉鹽100μg/ml的L-肉湯(broth)培養(yǎng)基(pH7.0)，于37℃下進(jìn)行24小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離從培養(yǎng)物中收集菌體，用通常的堿-SDS法提取重組DNA。用通常的雙脫氧法對(duì)該重組DNA的堿基序列進(jìn)行分析，表明該重組DNA是來(lái)自圓孢芽孢桿菌C11菌株，鏈長(zhǎng)5294堿基對(duì)的含有序列表中序列號(hào)18所示堿基序列的DNA。就象圖17所表示的那樣，在該重組DNA中，該DNA連接在限制酶Xba I識(shí)別部位的下游。另外，由該堿基序列推定的氨基酸序列是并記序列號(hào)18中的序列，該氨基酸序列與用實(shí)驗(yàn)例5-1的方法確認(rèn)的本發(fā)明的多肽的N末端氨基酸序列和用實(shí)驗(yàn)例5-2方法闡明的中間部分氨基酸序列、序列表中序列號(hào)7和序列號(hào)8至17所示氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)，表明序列表中序列號(hào)7所示氨基酸序列與并記在序列號(hào)18的氨基酸序列第36至44位的氨基酸序列完全一致。另外序列表中序列號(hào)8、9、10、11、12、13、14、15、16和17所示氨基酸序列分別與并記在序列表中序列號(hào)18中的第823至832、第576至589、第874至904、第1117至1141、第657至670、第367至399、第970至993、第938至953、第279至295以及第632至651位的氨基酸序列完全一致。另外由序列表中序列號(hào)18中第4783至4785位的堿基序列編碼的翻譯終止密碼子(5’-TAA-3’)可以判明本發(fā)明的多肽的C末端是緊靠其前面的谷氨酰胺(序列表中序列18號(hào)中第1284位的氨基酸)。
這些結(jié)果表示本發(fā)明的多肽具有序列表中序列號(hào)1所示氨基酸序列，本發(fā)明的多肽是由來(lái)自圓孢芽孢桿菌C11菌株的序列表中序列號(hào)4所示堿基序列的DNA編碼的。另外并記在序列表中序列號(hào)18中的氨基酸序列的第1至35位的氨基酸序列被推定為該多肽的分泌信號(hào)肽序列。從這些事實(shí)可以判明，該多肽分泌前的前體肽是由并記在序列表中序列號(hào)18中的氨基酸序列構(gòu)成，該氨基酸序列由序列表中序列號(hào)18所示堿基序列編碼。所以將確認(rèn)了該堿基序列的重組DNA命名為『p BGC2』。
實(shí)驗(yàn)例7 含有編碼來(lái)自圓孢芽孢桿菌N75菌株的多肽的DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體的制備實(shí)驗(yàn)例7-1 染色體DNA的制備將含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』2.0％(w/v)、酵母提取物1.0％(w/v)、磷酸氫二鉀0.1％(w/v)、磷酸二氫鈉·12水鹽0.06％(w/v)、硫酸鎂·7水鹽0.05％(w/v)以及水構(gòu)成的培養(yǎng)基100ml裝入到500ml容量的三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌20分鐘，冷卻之后，接種圓孢芽孢桿菌N75菌株，于27℃、230rpm下進(jìn)行24小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。然后將經(jīng)離心分離從培養(yǎng)物中收集的菌體懸浮于TES緩沖液(pH8.0)，加入0.05％(w/v)溶菌酶，于37℃溫育30分鐘。于-80℃下對(duì)該處理物冷凍1小時(shí)后，加入TSS緩沖液(pH9.0)后，加溫至60℃，加入TES緩沖液/酚混合液，于冰水中一邊冷卻，一邊激烈振蕩5分鐘，經(jīng)離心分離收集上清。向該上清加入2倍上清容積的冷乙醇，回收沉淀的粗染色體DNA，溶解于SSC緩沖液(pH7.1)后，分別加入核酸酶和蛋白酶7.5μg和125μg，于37℃溫育1小時(shí)，使其反應(yīng)。向反應(yīng)物中加入氯仿/異戊醇，對(duì)染色體DNA進(jìn)行萃取，加入冷乙醇，收集含有生成的染色體DNA的沉淀。將這樣得到的純化染色體DNA溶解于SSC緩沖液(pH7.1)，終濃度約為1mg/ml，將該溶液于-80℃下冷凍。
實(shí)驗(yàn)例7-2 轉(zhuǎn)化體BGN2的制備取1ml實(shí)驗(yàn)例7-1制備的純化染色體DNA溶液，加入約200單位的限制酶Kpn I，于37℃反應(yīng)16小時(shí)，對(duì)染色體DNA進(jìn)行分解后，通過蔗糖密度梯度超離心法收集由約3,000至7,000堿基對(duì)構(gòu)成的DNA片段。另一方面，通過常規(guī)方法使限制酶Kpn I作用于質(zhì)粒載體『Bluescript II SK(+)』(Stratagene·cloning system公司制造)，完全切斷后，使用該被切斷的質(zhì)粒載體0.5μg和先前得到的DNA片段約5μg，用『DNA連接試劑盒』(寶酒造(株)制造)按照附帶的說明書操作，進(jìn)行連接，用得到的重組DNA通過通常的感受態(tài)細(xì)胞法對(duì)感受態(tài)細(xì)胞100μl『Epicurian Coli XL2-Blue』(Stratagene·cloning system公司制造)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，制作基因文庫(kù)。將得到的作為基因文庫(kù)的轉(zhuǎn)化體接種于按照常規(guī)方法制備的含有胰蛋白酶10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉5g/L、氨芐青霉素鈉鹽100mg/L以及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷50mg/L的瓊脂平板培養(yǎng)基(pH7.0)，于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)后，將培養(yǎng)基上形成的白色菌落約2,500個(gè)固定于尼龍膜『Hybond-N+』(Amersham公司制造)。另一方面，根據(jù)實(shí)驗(yàn)例5-3方法中闡明的序列表中序列號(hào)24所示氨基酸序列第4到第11位的氨基酸序列，化學(xué)合成用5’-GAYGCNTGGATGTTYGGNGAYTGG-3’表示的堿基序列的寡核苷酸，依據(jù)常規(guī)方法用[γ-32P]ATP和T4聚核苷酸激酶進(jìn)行同位素標(biāo)記，得到作為探針1的合成DNA。從在先前得到的固定于尼龍膜上的菌落中，表現(xiàn)出與探針1顯著會(huì)合的菌落中使用通常的菌落雜交法選擇3種轉(zhuǎn)化體。根據(jù)常規(guī)方法，從這3種轉(zhuǎn)化體提取重組DNA，另一方面，根據(jù)序列表中序列號(hào)23所示氨基酸序列第14到第21位的氨基酸序列化學(xué)合成用5’-GTNAAYCARAAYCAYTGGTTYTA-3’表示的堿基序列的探針2，同樣進(jìn)行同位素標(biāo)記后，使用通常的Sorthern雜交，選擇表現(xiàn)出顯著會(huì)合的重組DNA，將該轉(zhuǎn)化體命名為『BGN2』。
實(shí)驗(yàn)例7-3 DNA序列的解析將用實(shí)驗(yàn)例7-2方法得到的轉(zhuǎn)化體『BGN2』按照常規(guī)方法接種于含有氨芐青霉素鈉鹽100μg/ml的L-肉湯培養(yǎng)基(pH7.0)，于37℃下進(jìn)行24小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離從培養(yǎng)物中收集菌體，用通常的堿-SDS法提取重組DNA。用通常的雙脫氧法對(duì)該重組DNA的堿基序列進(jìn)行分析，結(jié)果該重組DNA是來(lái)自圓孢芽孢桿菌N75菌株，鏈長(zhǎng)4991堿基對(duì)的含有序列表中序列號(hào)25所示堿基序列的DNA。就象圖18所表示的那樣，在該重組DNA中，該DNA連接在限制酶Kpn I識(shí)別部位的下游。另外，由該堿基序列推定的氨基酸序列是并記在該序列號(hào)25中的序列，該氨基酸序列與用實(shí)驗(yàn)例5-1的方法確認(rèn)的本發(fā)明的多肽的N末端氨基酸序列和用實(shí)驗(yàn)例5-3方法闡明的作為中間部分氨基酸序列的序列表中序列號(hào)19和序列號(hào)20至24所示氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)，表明序列表中序列號(hào)19所示氨基酸序列與并記在該序列號(hào)25中的氨基酸序列第36至43位的氨基酸序列完全一致。另外序列表中序列號(hào)20、21、22、23和24所示氨基酸序列分別與并記在序列表中序列號(hào)25中的氨基酸序列的第907至925、第367至386、第1034至1058、第996至1020、以及第632至642位的氨基酸序列完全一致。另外由序列表中序列號(hào)25中第4294至4296位的堿基序列編碼翻譯終止密碼子(5’-TAA-3’)可以判明本發(fā)明的多肽的C末端是緊靠其前面的谷氨酰胺(序列表中序列25中第1286位的氨基酸)。
這些結(jié)果表示本發(fā)明的多肽具有序列表中序列號(hào)2所示氨基酸序列，本發(fā)明的多肽是由來(lái)自圓孢芽孢桿菌N75菌株的序列表中序列號(hào)5所示的堿基序列的DNA編碼的。另外序列表中與序列號(hào)25并記的氨基酸序列的第1至35位的氨基酸序列被推定為該多肽的分泌信號(hào)肽序列。從這些事實(shí)可以判明，該多肽分泌前的前體肽是由序列表中與序列號(hào)25并記的氨基酸序列構(gòu)成，該氨基酸序列由序列表中序列號(hào)25所示堿基序列編碼。所以將確認(rèn)了該堿基序列的重組DNA命名為『p BGN2』。
實(shí)驗(yàn)例8 含有編碼來(lái)自球形節(jié)桿菌A19的多肽的DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體的制備實(shí)驗(yàn)例8-1 染色體DNA的制備將含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』 2.0％(w/v)、酵母提取物1.0％(w/v)、磷酸氫二鉀0.1％(w/v)、磷酸二氫鈉·12水鹽0.06％(w/v)、硫酸鎂·7水鹽0.05％(w/v)以及水構(gòu)成的培養(yǎng)基100ml裝入到500ml容量的三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌20分鐘，冷卻之后，接種球形節(jié)桿菌A19，于27℃、230rpm下進(jìn)行24小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。然后將經(jīng)離心分離從培養(yǎng)物中收集的菌體懸浮于TES緩沖液(pH8.0)，加入0.05％(w/v)溶菌酶，于37℃溫育30分鐘。于-80℃下對(duì)該處理物冷凍1小時(shí)后，加入TSS緩沖液(pH9.0)后，加溫至60℃，加入TES緩沖液/酚混合液，于冰水中一邊冷卻，一邊激烈振蕩5分鐘，經(jīng)離心分離收集上清。向該上清加入2倍上清容積的冷乙醇，回收沉淀的粗染色體DNA，溶解于SSC緩沖液(pH7.1)后，分別加入核酸酶和蛋白酶7.5μg和125μg，于37℃溫育1小時(shí)使其反應(yīng)。向反應(yīng)物中加入氯仿/異戊醇混合液，對(duì)染色體DNA進(jìn)行萃取，加入冷乙醇，收集含有生成染色體DNA的沉淀。將這樣得到的純化染色體DNA溶解于SSC緩沖液(pH7.1)，終濃度約為1mg/ml，將該溶液于-80℃下冷凍。
實(shí)驗(yàn)例8-2 轉(zhuǎn)化體AGA1的制備取1ml實(shí)驗(yàn)例8-1制備的純化染色體DNA溶液，加入約10單位的限制酶Kpn I，于37℃反應(yīng)30分鐘，對(duì)染色體DNA進(jìn)行部分分解后，通過蔗糖密度梯度超離心收集由約4,000至8,000堿基對(duì)構(gòu)成的DNA片段。另一方面，通過常規(guī)方法使限制酶Kpn I作用于質(zhì)粒載體『Bluescript II SK(+)』(Stratagene·cloning system公司制造)，完全切斷后，使用該切斷的質(zhì)粒載體0.5μg和先前得到的DNA片段約5μg，用『DNA連接試劑盒』(寶酒造(株)制造)按照附帶的說明書操作，進(jìn)行連接，用得到的重組DNA通過通常的感受態(tài)細(xì)胞法對(duì)感受態(tài)細(xì)胞『Epicurian Coli XL2-Blue』(Stratagene·cloning system公司制造)100μl進(jìn)行轉(zhuǎn)化，制作基因文庫(kù)。將得到的作為基因文庫(kù)的轉(zhuǎn)化體接種于按照常規(guī)方法制備的含有胰蛋白酶10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉5g/L、氨芐青霉素鈉鹽100mg/L以及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷50mg/L的瓊脂平板培養(yǎng)基(pH7.0)，于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)后，將培養(yǎng)基上形成的白色菌落約6,000個(gè)固定于尼龍膜『Hybond-N+』(Amersham公司制造)。另一方面，根據(jù)實(shí)驗(yàn)例5-4方法中闡明的序列表中序列號(hào)27所示氨基酸序列第1到第11位的氨基酸序列化學(xué)合成用5’-CARGARTGGAAYYTNACNGGNGAYCCNTGGAC-3’所示的堿基序列的寡核苷酸，依據(jù)常規(guī)方法用[γ-32P]ATP和T4聚核苷酸激酶進(jìn)行同位素標(biāo)記，得到作為探針1的合成DNA。從在先前得到的固定于尼龍膜上的菌落中表現(xiàn)出與探針1顯著會(huì)合的菌落中使用通常的菌落雜交法選擇3種轉(zhuǎn)化體。根據(jù)常規(guī)方法，從這3種轉(zhuǎn)化體提取重組DNA，另一方面，根據(jù)序列表中序列號(hào)29所示氨基酸序列第6到第16位的氨基酸序列，化學(xué)合成用5’-TGGACNCARCCNGARGCNGGNGCNGTNTTGCA-3’表示的堿基序列的探針2，同樣進(jìn)行同位素標(biāo)記后，使用通常的Sorthern雜交，選擇表現(xiàn)出顯著會(huì)合的重組DNA，將該轉(zhuǎn)化體命名為『AGA1』。
實(shí)驗(yàn)例8-3 DNA序列的解析將用實(shí)驗(yàn)例8-2方法得到轉(zhuǎn)化體『AGA1』按照常規(guī)方法接種于含有氨芐青霉素鈉鹽100μg/ml的L-肉湯培養(yǎng)基(pH7.0)，于37℃下進(jìn)行24小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)離心分離從培養(yǎng)物采集菌體用通常的堿-SDS法提取重組DNA。用通常的雙脫氧法對(duì)該重組DNA的堿基序列進(jìn)行分析，表明該重組DNA是來(lái)自球形節(jié)桿菌A19株，鏈長(zhǎng)5811堿基對(duì)的含有序列表中序列號(hào)32所示堿基序列的DNA。就象圖19所表示的那樣，在該重組DNA中，該DNA連接在限制酶Kpn I識(shí)別部位的下游。另外，由該堿基序列推定的氨基酸序列是并記在該序列號(hào)32中的序列，該氨基酸序列與用實(shí)驗(yàn)例5-1的方法確認(rèn)的本發(fā)明的多肽的N末端氨基酸序列和用實(shí)驗(yàn)例5-4方法闡明的中間部分氨基酸序列的序列表中序列號(hào)26以及序列號(hào)27至31所示氨基酸該序列進(jìn)行比較時(shí)，表明序列表中序列號(hào)26所示氨基酸序列與并記在序列號(hào)32中的氨基酸序列第37至49位的氨基酸序列完全一致。另外序列表中序列號(hào)27、28、29、30和31所示氨基酸序列分別與并記在序列表中的序列號(hào)32中的第227至239、第345至374、第401至430、第89至115、以及第641至667位的氨基酸序列完全一致。另外由序列表中序列號(hào)32中第4550至4552位的堿基序列編碼的翻譯終止密碼子(5’-TGA-3’)可以判明本發(fā)明的多肽的C末端是緊靠其前面的苯丙氨酸(序列表中序列號(hào)32中第965位氨基酸)。
這些結(jié)果表示本發(fā)明的多肽具有序列表中序列號(hào)3所示氨基酸序列，本發(fā)明的多肽是由來(lái)自球形節(jié)桿菌A19株(FERM BP-7590)的序列表中序列號(hào)6所示的堿基序列的DNA編碼的。另外并記在序列表的序列號(hào)32中的氨基酸序列的第1至36位的氨基酸序列被推定為該多肽的分泌信號(hào)肽序列。從這些事實(shí)可以判明，該多肽分泌前的前體肽是由并記在序列表的序列號(hào)32中的氨基酸序列構(gòu)成，該氨基酸序列由序列表中序列號(hào)32所示堿基序列編碼。所以將確認(rèn)了該堿基序列的重組DNA命名為『pAGA1』。
實(shí)驗(yàn)例9 通過本發(fā)明轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)多肽實(shí)驗(yàn)例9-1 轉(zhuǎn)化體BGC2將含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』5g/L、(蛋白)胨20g/L、酵母提取物20g/L以及磷酸氫二鈉1g/L的水溶液100ml裝入到500ml容量的三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌15分鐘，冷卻之后，于無(wú)菌下將pH調(diào)到7.0后，無(wú)菌下添加氨芐青霉素鈉鹽10mg，制備液體培養(yǎng)基。向該液體培養(yǎng)基中接種用實(shí)驗(yàn)例6-2方法得到的轉(zhuǎn)化體『BGC2』，于27℃下進(jìn)行48小時(shí)通氣攪拌培養(yǎng)。為了研究該培養(yǎng)物中有無(wú)該多肽，按照常規(guī)方法，對(duì)該培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離，分離成培養(yǎng)上清和菌體，然后分別回收。對(duì)于菌體通過超聲破碎法從細(xì)胞中制備全提取物、用浸透壓休克法從細(xì)胞外周胞質(zhì)制備提取物。上述超聲破碎法采用使菌體懸浮于10mM磷酸緩沖液(pH7.0)后，將該菌體懸浮液一邊于冰水中冷卻，一邊用超聲波勻漿器(『型號(hào)UH-600』)((株式會(huì)社)エスエムテ-制造)破碎細(xì)胞，該破碎物作為細(xì)胞全提取物的方法。上述滲透(壓)休克法是采用將菌體用含有30mM氯化鈉的10mM Tris-HCl緩沖液(pH7.3)洗凈后，將洗凈菌體懸浮于含有200g/l蔗糖和1mM-EDTA的33mM Tris-HCl緩沖液(pH7.3)，于27℃下振蕩20分鐘，然后進(jìn)行離心分離，回收菌體，將該菌體懸浮于預(yù)先于4℃下冷卻的0.5mM氯化鎂水溶液，于冰水中振蕩20分鐘，從細(xì)胞外周胞質(zhì)提取的方法。然后經(jīng)離心分離回收上清，將該上清作為細(xì)胞外周胞質(zhì)提取物。
對(duì)這樣得到的培養(yǎng)上清、細(xì)胞全提取物和細(xì)胞外周胞質(zhì)提取物分別測(cè)定α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性，將各個(gè)活性值換算成每1ml培養(yǎng)物的值。結(jié)果如表12所示。
表12

就象表12所表明的那樣，轉(zhuǎn)化體『BGC2』在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，其中大部分都分泌到細(xì)胞外周胞質(zhì)。另外作為第一對(duì)照，將大腸桿菌『XL2-Blue』株在除了培養(yǎng)基中不加氨芐青霉素外，其他都與上述轉(zhuǎn)化體的情況同一條件下進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中制備培養(yǎng)上清和菌體破碎物。作為第二對(duì)照，將圓孢芽孢桿菌C11株在除了不含氨芐青霉素外，其他都與上述轉(zhuǎn)化體的情況同一條件下進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中制備培養(yǎng)上清和菌體破碎物。第一對(duì)照的培養(yǎng)上清以及菌體破碎物中都沒有檢測(cè)到α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性。在第二對(duì)照的培養(yǎng)上清和菌體破碎物中雖然檢測(cè)到α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性，但每一培養(yǎng)物分別約為0.37單位和0.02單位，與轉(zhuǎn)化體『BGC2』相比該值明顯地低。
將上述得到的細(xì)胞外周胞質(zhì)提取物再按照實(shí)驗(yàn)例1的方法，進(jìn)行鹽析、透析，使用『Sepabeads FP-DA13』凝膠、『Sephacryl HR S-200』凝膠、『Butyl-Toyopearl 650M』凝膠進(jìn)行柱層析，純化，按照實(shí)驗(yàn)例1給出的方法對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行分析。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，分子量約137,000±20,000道爾頓，經(jīng)等電點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析，等電點(diǎn)約為5.2±0.5，α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的最適溫度約為45℃(沒有Ca2+存在下)，約50℃(Ca2+存在下)。最適pH約6.0。溫度穩(wěn)定性約到40℃(沒有Ca2+存在下)，約50℃(Ca2+存在下)。pH穩(wěn)定性約為5.0至10.0。這些結(jié)果表明，該重組型多肽與用實(shí)驗(yàn)例1方法得到的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的理化性質(zhì)實(shí)質(zhì)上是相同的。
實(shí)驗(yàn)例9-2 轉(zhuǎn)化體BGN2將含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』5g/L、(蛋白)胨20g/L、酵母提取物20g/L以及磷酸氫二鈉1g/L的水溶液100ml裝入到500ml容量的三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌15分鐘，冷卻之后，于無(wú)菌下將pH調(diào)到7.0后，無(wú)菌下添加氨芐青霉素鈉鹽10mg，制備液體培養(yǎng)基。向該液體培養(yǎng)基中接種用實(shí)驗(yàn)例7-2方法得到的轉(zhuǎn)化體『BGN2』，于27℃下進(jìn)行48小時(shí)通氣攪拌培養(yǎng)。為了研究該培養(yǎng)物中有無(wú)該多肽，與實(shí)驗(yàn)例9-1的方法同樣分別制備培養(yǎng)上清、細(xì)胞全提取物和細(xì)胞外周胞質(zhì)提取物。對(duì)于培養(yǎng)上清、細(xì)胞全提取物和細(xì)胞外周胞質(zhì)提取物分別測(cè)定α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性，將各個(gè)活性值換算成每1ml培養(yǎng)物的值。結(jié)果如表13所示。
表13

就象表13所表明的那樣，轉(zhuǎn)化體『BGN2』在培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，其中大部分都分泌到細(xì)胞外周胞質(zhì)。另外作為第一對(duì)照，將大腸桿菌『XL2-Blue』株在除了培養(yǎng)基中不加氨芐青霉素外，其他都與上述轉(zhuǎn)化體情況相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中制備培養(yǎng)上清和菌體破碎物。作為第二對(duì)照，將圓孢芽孢桿菌N75株在除了不含氨芐青霉素外，其他都與上述轉(zhuǎn)化體情況相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中制備培養(yǎng)上清和菌體破碎物。第一對(duì)照的培養(yǎng)上清以及菌體破碎物都沒有檢測(cè)到α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性。在第二對(duì)照的培養(yǎng)上清和菌體破碎物中雖然檢測(cè)到α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性，但每一培養(yǎng)物分別約為0.21單位和0.01單位，與轉(zhuǎn)化體『BGN2』相比該值明顯地低。
將上述得到的培養(yǎng)上清和細(xì)胞外周胞質(zhì)提取物的混合物再按照實(shí)驗(yàn)例2的方法，進(jìn)行鹽析、透析，使用『Sepabeads FP-DA13』凝膠、『Sephacryl HR S-200』凝膠、『Butyl-Toyopearl 650M』凝膠進(jìn)行柱層析，純化，按照實(shí)驗(yàn)例2給出的方法對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行分析。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，分子量約136,000±20,000道爾頓，經(jīng)等電點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析，等電點(diǎn)約為7.3±0.5，α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的最適溫度約為50℃(沒有Ca2+存在下)，約55℃(Ca2+存在下)。最適pH約6.0。溫度穩(wěn)定性約到45℃(沒有Ca2+存在下)，約50℃(Ca2+存在下)。pH穩(wěn)定性約為5.0至9.0。這些結(jié)果表明，該重組型多肽與用實(shí)驗(yàn)例2方法得到的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的理化性質(zhì)實(shí)質(zhì)上是相同的。
實(shí)驗(yàn)例9-3 轉(zhuǎn)化體AGA1將含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』5g/L、(蛋白)胨20g/L、酵母提取物20g/L以及磷酸氫二鈉1g/L的水溶液100ml裝入到500ml容量的三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌15分鐘，冷卻之后，于無(wú)菌下將pH調(diào)到7.0后，加入氨芐青霉素鈉鹽10mg制備液體培養(yǎng)基。向該液體培養(yǎng)基中接種用實(shí)驗(yàn)例8-2方法得到的轉(zhuǎn)化體『AGA1』，于27℃、進(jìn)行約48小時(shí)通氣攪拌培養(yǎng)。為了研究該培養(yǎng)物中有無(wú)該多肽，與實(shí)驗(yàn)例9-1的方法同樣分別制備培養(yǎng)上清、細(xì)胞全提取物和細(xì)胞外周胞質(zhì)提取物。對(duì)于培養(yǎng)上清、細(xì)胞全提取物和細(xì)胞外周胞質(zhì)提取物分別測(cè)定α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性，將各個(gè)活性值換算成每1ml培養(yǎng)物的值。結(jié)果如表14所示。
表14

就象表14所表明的那樣，轉(zhuǎn)化體『AGA1』在培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，其細(xì)胞中大部分都分泌到細(xì)胞外周胞質(zhì)。另外作為第一對(duì)照，將大腸桿菌『XL2-Blue』株在除了培養(yǎng)基中不加氨芐青霉素外，其他都與上述轉(zhuǎn)化體的情況相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中制備培養(yǎng)上清和菌體破碎物。作為第二對(duì)照，將球形節(jié)桿菌A19株在除了不含氨芐青霉素外，其他都與上述轉(zhuǎn)化體的情況相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中制備培養(yǎng)上清和菌體破碎物。第一對(duì)照的培養(yǎng)上清以及菌體破碎物中都沒有檢測(cè)到α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性。在第二對(duì)照的培養(yǎng)上清和菌體破碎物中雖然檢測(cè)到α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性，但每一培養(yǎng)物分別約為0.33單位和0.01單位，與轉(zhuǎn)化體『AGA2』相比該值明顯地低。
將上述得到的培養(yǎng)上清和細(xì)胞外周胞質(zhì)提取物的混合物再按照實(shí)驗(yàn)例3的方法，進(jìn)行鹽析、透析，使用『DEAE-Toyopearl 650M』凝膠、『Sephacryl HRS-200』凝膠進(jìn)行柱層析，進(jìn)行純化，按照實(shí)驗(yàn)例3給出的方法對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行分析。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，分子量約94,000±20,000道爾頓，經(jīng)等電點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析，等電點(diǎn)約為4.3±0.5，α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶活性的最適溫度約為60℃(沒有Ca2+存在下)，約65℃(Ca2+存在下)。最適pH約8.4。溫度穩(wěn)定性約到55℃(沒有Ca2+存在下)，約60℃(Ca2+存在下)。pH穩(wěn)定性約為5.0至9.0。這些結(jié)果表明，該重組型多肽與用實(shí)驗(yàn)例3方法得到的具有α-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的理化性質(zhì)實(shí)質(zhì)上是同一的。
這些結(jié)果表明，本發(fā)明的多肽通過重組DNA技術(shù)可以制造，同時(shí)多肽的產(chǎn)率也顯著提高。
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的多肽的制造方法和使用本發(fā)明多肽制備環(huán)狀四糖和含有環(huán)狀四糖的糖的制造方法。
實(shí)施例1 本發(fā)明多肽的制造將含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』5g/L、(蛋白)胨20g/L、酵母提取物20g/L以及磷酸氫二鈉1g/L的水溶液100ml裝入到500ml容量的三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌15分鐘，冷卻，無(wú)菌下將pH調(diào)到7.0后，加入氨芐青霉素鈉鹽100μg/ml。向該液體培養(yǎng)基中接種用實(shí)驗(yàn)例5-2方法得到的轉(zhuǎn)化體『BGC2』，于27℃、230rpm下進(jìn)行24小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)，得到種培養(yǎng)液。然后將上述同樣組成的液體培養(yǎng)基約18L加入到容量30L的發(fā)酵罐中，同樣進(jìn)行滅菌、冷卻后到27℃后，加入氨芐青霉素鈉鹽50μg/ml，接種1v/v％種培養(yǎng)液，維持在27℃進(jìn)行48小時(shí)通氣攪拌培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離，回收菌體，懸浮于10mM磷酸緩沖液(pH7.0)后，經(jīng)超聲波處理破碎菌體，通過離心分離除去不溶物，得到上清。對(duì)該培養(yǎng)上清中的酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果每1L培養(yǎng)物檢測(cè)出約1,100單位的酶活性。使用該上清，通過實(shí)驗(yàn)例1的方法進(jìn)行純化，得到含有每ml約61單位的比活性約13.5單位/mg蛋白質(zhì)的本發(fā)明多肽水溶液約70ml。
實(shí)施例2 本發(fā)明多肽的制備將含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』5g/L、(蛋白)胨20g/L、酵母提取物20g/L以及磷酸氫二鈉1g/L的水溶液100ml裝入到500ml容量的三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌15分鐘，冷卻，無(wú)菌下將pH調(diào)到7.0后，加入氨芐青霉素鈉鹽100μg/ml。向該液體培養(yǎng)基中接種用實(shí)驗(yàn)例6-2方法得到的轉(zhuǎn)化體『BGN2』，于37℃、230rpm下進(jìn)行24小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)，得到種培養(yǎng)液。然后將上述同樣組成的液體培養(yǎng)基約18L加入到容量30L的發(fā)酵罐中，進(jìn)行同樣滅菌、冷卻到27℃后，加入氨芐青霉素鈉鹽50μg/ml，接種1v/v％種培養(yǎng)液，維持在27℃進(jìn)行48小時(shí)通氣攪拌培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離，得到上清。對(duì)該培養(yǎng)上清中的酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果每1L培養(yǎng)物檢測(cè)出約750單位的酶活性。使用該上清，通過實(shí)驗(yàn)例2的方法進(jìn)行純化，得到含有每ml約72單位的比活性約12.6單位/mg蛋白質(zhì)的本發(fā)明多肽水溶液75ml。
實(shí)施例3 含有環(huán)狀四糖的糖漿狀物的制備將木薯淀粉做成濃度約為25％的淀粉乳，加入α-淀粉酶(商品名『木薯酶』、ナガセ生物化學(xué)工業(yè)(株式會(huì)社)制造)(每100g淀粉固態(tài)物加0.2g)，于85℃至90℃下反應(yīng)約20分鐘，然后于120℃高壓滅菌20分鐘，再急劇冷卻到約35℃，得到DE約4的液化溶液，按照最終平均每g淀粉固態(tài)物對(duì)應(yīng)2.2單位和6.6單位的比例，向液化溶液中分別加入用實(shí)施例1方法得到的多肽和用實(shí)驗(yàn)例1-4方法得到的α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶，再加入環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶(株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所制造)使每1g淀粉固態(tài)物為10單位，于pH6.0、35℃下反應(yīng)48小時(shí)。將該反應(yīng)液于95℃下保存30分鐘后，調(diào)整到pH5.0、50℃后，按照每1g固態(tài)物300單位比例加入α-葡糖苷酶(商品名『轉(zhuǎn)葡糖苷酶L「アマノ」』、天野株式制藥會(huì)社制造)，反應(yīng)24小時(shí)，再按照每1g固態(tài)物30單位加入葡糖淀粉酶(商品名『グルコチ-ム』ナガセ生物化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)，反應(yīng)17小時(shí)，將該反應(yīng)液加熱到95℃，保持30分鐘后，利用常規(guī)方法將冷卻、過濾后得到的濾液用活性炭進(jìn)行脫色，通過H型和OH型離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽純化，進(jìn)一步濃縮之后得到含有濃度為60％環(huán)狀四糖的糖漿，收率約為原料淀粉固態(tài)物的90％。
該糖漿每份固態(tài)物含有葡萄糖38.4％、環(huán)狀四糖58.1％以及含有3.5％其他糖，有溫和甜味、適度的粘度、保濕性、包合性，作為甜味料、味道改良劑、脫水防止劑、穩(wěn)定劑、防止變色劑、賦形劑、包合劑等可以在各種飲食、化妝品、藥品等各種組成物中有效利用。
實(shí)施例4 環(huán)狀四糖結(jié)晶性粉末的制造將玉米淀粉做成濃度約為20％的淀粉乳，然后加入0.1％碳酸鈣，將pH調(diào)整到6.5，每100g淀粉固態(tài)物加入α-淀粉酶0.3g(商品名『ダ-マミ-ル60L』、ノボ公司制造)，于95℃反應(yīng)約15分鐘，然后于120℃高壓滅菌20分鐘，再急劇冷卻到約35℃，得到DE約4的液化溶液，按照最終平均每g淀粉固態(tài)物分別對(duì)應(yīng)2.5單位和7.0單位的比例向液化溶液中加入用實(shí)施例1方法得到多肽和用實(shí)驗(yàn)例1-4方法得到α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶，再加入環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶(株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所制造)，使每1g淀粉固態(tài)物為10單位，于pH6.0、35℃下反應(yīng)48小時(shí)。將該反應(yīng)液于95℃下保存30分鐘后，調(diào)整到pH5.0、50℃后，按照每1g固態(tài)物300單位比例加入α-葡糖苷酶(商品名L『轉(zhuǎn)葡糖苷酶L「アマノ」』、天野制藥株式會(huì)社制造)，反應(yīng)24小時(shí)，再按照每1g固態(tài)物30單位比例加入葡糖淀粉酶(商品名『グルコチ-ム』ナガセ生物化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)，反應(yīng)17小時(shí)，將該反應(yīng)液加熱到95℃，保持30分鐘后，利用常規(guī)方法將冷卻、過濾后得到的濾液用活性炭進(jìn)行脫色、通過H型和OH型離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽純化，進(jìn)一步濃縮之后，得到每份固態(tài)物含有葡萄糖34.2％、環(huán)狀四糖62.7％、其他糖3.1％的濃度為60％的環(huán)狀四糖的糖漿。
使用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂(商品名『アンバ-ライトCR-1310(Na型)』、オルガノ株式會(huì)社制造)對(duì)該含有環(huán)狀四糖的糖漿進(jìn)行柱層析。將樹脂充填到4根內(nèi)徑5.4cm的帶有外套的不銹鋼柱，直列串接，樹脂層全長(zhǎng)20m。將柱溫維持在60℃，加入相當(dāng)于樹脂為5％(v/v)的糖液，用SV0.13使60℃的溫水流過，進(jìn)行分級(jí)，用HPLC法對(duì)洗脫液的糖組成進(jìn)行檢測(cè)，收集含環(huán)狀四糖量高的級(jí)分，進(jìn)行純化，得到單位固態(tài)物約含98％環(huán)狀四糖的環(huán)狀四糖含量高的溶液。
將該溶液濃縮到濃度約為70％后，加入到結(jié)晶罐中，作為種晶加入約2％的含5至6個(gè)水結(jié)晶環(huán)狀四糖，慢慢冷卻，得到結(jié)晶率約45％的漿(マスキツト)。從干燥塔上的噴嘴以150kg/cm2的高壓對(duì)該漿(マスキツト)進(jìn)行噴霧。同時(shí)從干燥塔的上部送85℃的熱風(fēng)，吸收設(shè)計(jì)在底部傳送用金屬網(wǎng)傳送帶上的結(jié)晶粉末，一邊從傳送帶的下面送45℃的溫風(fēng)，一邊使該粉末緩慢地移到干燥塔外，取出。將該結(jié)晶粉末填充到熟化塔后，邊送溫風(fēng)，邊使其熟化10小時(shí)，完成結(jié)晶和干燥，得到收率約為原料淀粉固態(tài)物20％的含5至6個(gè)水結(jié)晶環(huán)狀四糖粉末。
本品還原性非常低、很難發(fā)生羰氨反應(yīng)、也沒有吸濕性、操作容易、有溫和甜味、適度的粘度、保濕性、包合性和難消化性，作為甜味料、低熱量食品原材料、味道改良劑、風(fēng)味改良劑、品質(zhì)改良劑、脫水防止劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、包合劑、粉末化基體材料等可以在各種飲食、化妝品、藥品等各種組成物中有效利用。
實(shí)施例5 環(huán)狀四糖結(jié)晶性粉末的制備將玉米淀粉做成濃度約為30％的淀粉乳，然后加入0.1％碳酸鈣，將pH調(diào)整到6.5，每100g淀粉固態(tài)物加入α-淀粉酶0.3g(商品名『ダ-マミ-ル60L』、ノボ公司制造)，于95℃反應(yīng)約15分鐘，然后于120℃高壓滅菌20分鐘，再急劇冷卻到約51℃，得到DE約4的液化溶液，按照每克淀粉固態(tài)物分別對(duì)應(yīng)2.4單位和8.0單位的比例向液化溶液中加入用實(shí)施例2方法得到多肽和用實(shí)驗(yàn)例2-4方法得到α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶，再加入環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶(株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所制造)，使每1g淀粉固態(tài)物為3單位，于pH5.5、51℃下反應(yīng)48小時(shí)。將該反應(yīng)液于95℃下保存30分鐘后，調(diào)整到pH5.0、50℃后，按照每1g固態(tài)物300單位比例加入α-葡糖苷酶(商品名『轉(zhuǎn)葡糖苷酶「アマノ」』、天野制藥株式會(huì)社制造)，反應(yīng)24小時(shí)，再按照每1g固態(tài)物30單位比例加入葡糖淀粉酶(商品名『グルコチ-ム』ナガセ生物化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)，反應(yīng)17小時(shí)，將該反應(yīng)液加熱到95℃，保持30分鐘后，利用常規(guī)方法將冷卻、過濾后得到的濾液用活性炭進(jìn)行脫色、通過H型和OH型離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽純化，進(jìn)一步濃縮之后得到每克固態(tài)物含有葡萄糖46.8％、環(huán)狀四糖44.0％、其他糖9.8％的濃度為60％的含環(huán)狀四糖的糖漿。將得到的含有環(huán)狀四糖的糖漿作為原糖液，為了提高環(huán)狀四糖的含量，按照實(shí)施例5的方法進(jìn)行使用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂的柱層析，收集含有環(huán)狀四糖量高的級(jí)分，進(jìn)行純化、濃縮、噴霧干燥后得到收率約為原料淀粉固態(tài)物45％的環(huán)狀四糖粉末。
得到的本品每份固態(tài)物含有葡萄糖3.7％、環(huán)狀四糖80.5％以及15.8％其他糖，有溫和甜味、適度的粘度、保濕性、包合性，作為甜味料、味道改良劑、品質(zhì)改良劑、脫水防止劑、穩(wěn)定劑、防止變色劑、賦形劑、包合劑、粉末化基體材料等可以在各種飲食、化妝品、藥品等各種組成物中有效利用。
本發(fā)明是起到如此顯著作用效果的發(fā)明，可以說是對(duì)該領(lǐng)域有重大意義的發(fā)明。
序列表<110>Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsukagaku Kenkyujo<120>具有a-異麥芽糖基葡糖生成酶活性的多肽<130>WO879<160>32<210>1<211>1249<212>PRT<213>微生物<220><400>1Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile Ser Ser Ser Val Thr Gly Asp1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Val Asp Asn Gly Ala Glu Pro Ser Asp Asp Leu20 25 30Leu Ile Val Gln Ala Val Gln Asn Gly Ile Leu Lys Val Asp Tyr Arg35 40 45Pro Asn Ser Ile Thr Pro Ser Ala Lys Thr Pro Met Leu Asp Pro Asn50 55 60Lys Thr Trp Ser Ala Val Gly Ala Thr Ile Asn Thr Thr Ala Asn Pro65 70 75 80Met Thr Ile Thr Thr Ser Asn Met Lys Ile Glu Ile Thr Lys Asn Pro85 90 95Val Arg Met Thr Val Lys Lys Ala Asp Gly Thr Thr Leu Phe Trp Glu100 105 110Pro Ser Gly Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe Leu His Ala115 120 125Thr Gly Asp Asn Met Tyr Gly Ile Arg Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ser130 135 140Gly Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Asn His Ala Ala His Ala Gly145 150 155 160Glu Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Trp Ser Thr Ala Gly Tyr165 170 175Gly Leu Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Tyr Thr Asp Ser Thr180 185 190Thr Gly Gln Met Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro Glu Gly Arg195 200 205Arg Tyr Ala Lys Gln Asn Val Glu Tyr Tyr Ile Met Leu Gly Thr Pro210 215 220Lys Glu Ile Met Thr Asp Val Gly Glu Ile Thr Gly Lys Pro Pro Met225 230 235 240Leu Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp Asp Thr Asn245 250 255Gln Thr Glu Phe Thr Asn Asn Val Asp Thr Tyr Arg Ala Lys Asn Ile260 265 270Pro Ile Asp Ala Tyr Ala Phe Asp Tyr Asp Trp Lys Lys Tyr Gly Glu275 280 285Thr Asn Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Thr Asn Phe Pro Ser Ala
290 295 300Ser Thr Thr Ser Leu Lys Ser Thr Met Asp Ala Lys Gly Ile Lys Met305 310 315 320Ile Gly Ile Thr Lys Pro Arg Ile Val Thr Lys Asp Ala Ser Ala Asn325 330 335Val Thr Thr Gln Gly Thr Asp Ala Thr Asn Gly Gly Tyr Phe Tyr Pro340 345 350Gly His Asn Glu Tyr Gln Asp Tyr Phe Ile Pro Val Thr Val Arg Ser355 360 365Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Asn Glu Arg Ala Trp Phe Trp Asn His Ser370 375 380Thr Asp Ala Leu Asn Lys Gly Ile Val Gly Trp Trp Asn Asp Glu Thr385 390 395 400Asp Lys Val Ser Ser Gly Gly Ala Leu Tyr Trp Phe Gly Asn Phe Thr405 410 415Thr Gly His Met Ser Gln Thr Met Tyr Glu Gly Gly Arg Ala Tyr Thr420 425 430Ser Gly Ala Gln Arg Val Trp Gln Thr Ala Arg Thr Phe Tyr Pro Gly435 440 445Ala Gln Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp Ile Gly Ile Gln450 455 460Tyr Asn Lys Gly Glu Arg Ile Asn Trp Ala Ala Gly Met Gln Glu Gln465 470 475 480Arg Ala Val Met Leu Ser Ser Val Asn Asn Gly Gln Val Lys Trp Gly485 490 495Met Asp Thr Gly Gly Phe Asn Gln Gln Asp Gly Thr Thr Asn Asn Pro500 505 510Asn Pro Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gln Phe Ser Ala Leu Thr Pro515 520 525Val Phe Arg Val His Gly Asn Asn His Gln Gln Arg Gln Pro Trp Tyr530 535 540Phe Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala Ile Gln Leu Arg545 550 555 560Tyr Ser Leu Ile Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser Ala Tyr Glu565 570 575Asn Gly Asn Gly Leu Val Arg Pro Leu Met Gln Ala Tyr Pro Thr Asp580 585 590Ala Ala Val Lys Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp Leu595 600 605Leu Ala Ala Pro Val Val Asp Lys Gln Gln Thr Ser Lys Asp Ile Tyr610 615 620Leu Pro Ser Gly Ser Trp Ile Asp Tyr Ala Arg Gly Asn Ala Ile Thr625 630 635 640Gly Gly Gln Thr Ile Arg Tyr Ser Val Asn Pro Asp Thr Leu Thr Asp645 650 655Met Pro Leu Phe Ile Lys Lys Gly Ala Ile Ile Pro Thr Gln Lys Val660 665 670Gln Asp Tyr Val Gly Gln Ala Ser Val Thr Ser Val Asp Val Asp Val675 680 685Phe Pro Asp Thr Thr Gln Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly690 695 700Ala Ser Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Thr Tyr Phe Lys Gln Asn Met Thr705 710 715 720Ala Gln Asp Asn Gly Ser Gly Ser Leu Ser Phe Thr Leu Gly Ala Lys725 730 735Ser Gly Ser Tyr Thr Pro Ala Leu Gln Ser Tyr Ile Val Lys Leu His740 745 750Gly Ser Ala Gly Thr Ser Val Thr Asn Asn Ser Ala Ala Met Thr Ser755 760 765Tyr Ala Ser Leu Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ala Gly Glu Gly Trp Ala770 775 780Thr Gly Lys Asp Ile Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys Val Thr Ala785 790 795 800Gly Thr Ala Ser Ser Lys Ser Ile Ala Val Thr Gly Val Ala Ala Val805 810 815Ser Ala Thr Thr Ser Gln Tyr Glu Ala Glu Asp Ala Ser Leu Ser Gly820 825 830Asn Ser Val Ala Ala Lys Ala Ser Ile Asn Thr Asn His Thr Gly Tyr835 840 845Thr Gly Thr Gly Phe Val Asp Gly Leu Gly Asn Asp Gly Ala Gly Val850 855 860Thr Phe Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn Val Ser Leu865870 875 880Arg Tyr Ala Asn Ala Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Ser Ile Phe Val885 890 895Asn Gly Lys Arg Val Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu Ala Asn Trp900 905 910Asp Thr Trp Ser Thr Gln Ser Glu Thr Leu Pro Leu Thr Ala Gly Val915 920 925Asn Val Val Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ser Asp Ala Gly Asp Thr Gly Asn930935940Val Asn Ile Asp Asn Ile Thr Val Pro Phe Ala Pro Ile Ile Gly Lys945 950 955 960Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Ser Leu Asn Thr965 970 975Asn His Trp Tyr Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Val Asp Gly Leu Ser Ala980 985 990Val Gly Ala Gln Val Lys Tyr Asn Val Asn Val Pro Ser Ala Gly Ser99510001005Tyr Gln Val Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Ser Ala Ala Thr Lys Thr1010 10151020Leu Ser Thr Tyr Ile Asn Gly Ala Lys Leu Gly Gln Thr Ser Phe Thr1025 103010351040Ser Pro Gly Thr Asn Trp Asn Val Trp Gln Asp Asn Val Gln Thr Val104510501055Thr Leu Asn Ala Gly Ala Asn Thr Ile Ala Phe Lys Tyr Asp Ala Ala106010651070Asp Ser Gly Asn Ile Asn Val Asp Arg Leu Leu Leu Ser Thr Ser Ala
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Leu Lys Val Asp Tyr Arg35 40 45Pro Asn Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Thr Pro Met Leu Asp Pro Asn50 55 60Lys Thr Trp Pro Ser Ile Gly Ala Val Ile Asn Thr Ala Ser Asn Pro65 70 75 80Met Thr Ile Thr Thr Pro Ala Met Lys Ile Glu Ile Ala Lys Asn Pro85 90 95Val Arg Leu Thr Val Lys Lys Pro Asp Gly Thr Ala Leu Leu Trp Glu100 105 110Pro Pro Thr Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe Leu His Gly115 120 125Thr Gly Asp Asn Met Tyr Gly Ile Arg Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ser130135 140Gly Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Thr Gln Ala Ala Arg Ala Gly145 150 155 160Asp Gln Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Ile Trp Ser Thr Ala Gly Tyr165 170 175Gly Val Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Glu Ala180 185 190Thr Gly Lys Leu Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro Glu Gly Arg195 200 205Arg Tyr Thr Lys Gln Asp Val Glu Tyr Tyr Ile Met Leu Gly Thr Pro210 215 220Lys Glu Ile Met Ser Gly Val Gly Glu Ile Thr Gly Lys Pro Pro Met225 230 235 240Leu Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp Asp Leu Asn245 250 255Glu 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catcgcgacg aaggattttt cgaacaatcc taccgtgcag 1020ggaacggacg cggcgagcgg cggttatttt tatccgggac atagcgaata caaggactac 1080ttcatcccgg tctttgtgcg cagcatcgac ccttataacc ctgctgcacg ctcctggttc 1140tggaaccact ccaaggatgc gttcgataaa ggcatcgtag gctggtggaa cgacgagacg 1200gatgcggtat cgtcgggagg ggcctcctac tggttcggca attttacgac cggccatatg 1260tcccaggcgc tttacgaggg acagcgggca tatacgtcga acgcccagcg cgtctggcag 1320acagcgcgca cgttctatcc cggggcgcag cgttatgcga cgacgctctg gtcgggagac 1380atcgggattc agtataccaa gggggaaaga atcaactggg ctgccggcat gcaggagcag 1440cgggcggtga tgctttcttc gatcaacaac ggccaggtca aatggggaat ggacacaggc 1500ggcttcaacc agcaggacgg cacgacgaac aatccgaatc cggacctgta cgccagatgg 1560atgcagttca gcgcgctgac tccggtgttc cgcgtgcatg gcaacaatca ccagcagcgc 1620cagccttggt attatggctc gacagccgag gaggcatcca aggaagcgct ccagctccgt 1680tactccctga ttccttatat gtatgcttac gaaagaagcg cctacgagaa cggtaacgga 1740cttgtccggc cgctgatgca ggaataccct gccgatgcca acgccaaaaa ctatctcgat 1800gcctggatgt tcggcgattg gctgctggcg 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1.一種多肽，具有通過從非還原末端結(jié)合樣式具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在2以上的糖，通過在實(shí)質(zhì)上不增加還原力情況下進(jìn)行α-葡糖基轉(zhuǎn)移，生成非還原末端的結(jié)合樣式具有α-1，6糖苷鍵，該非還原末端以外的結(jié)合樣式為具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在3以上的糖的酶活性，而且具有序列表中序列號(hào)1、2或3所示氨基酸序列、或在這些氨基酸序列中缺失、置換或附加了1或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1記載的多肽，其是具有以下理化性質(zhì)的多肽，(1)分子量通過SDS-凝膠電泳法確定，具有處于約74,000至約160,000道爾頓范圍內(nèi)的分子量，(2)最適溫度在pH6.0、反應(yīng)60分鐘的條件下，最適溫度處于約40℃至約50℃的溫度范圍內(nèi)，在pH6.0、反應(yīng)60分鐘的條件下，有1mM Ca2+存在下，最適溫度處于約45℃至約55℃的溫度范圍內(nèi)，在pH8.4、反應(yīng)60分鐘的條件下，最適溫度為60℃，在pH8.4、反應(yīng)60分鐘的條件下，有1mM Ca2+存在下，最適溫度約為65℃，(3)最適pH在35℃、反應(yīng)60分鐘的條件下，最適pH處于約6.0至8.4的pH范圍內(nèi)，(4)溫度穩(wěn)定性在pH6.0下保持60分鐘的條件下，在約45℃以下具有溫度穩(wěn)定區(qū)域，在pH6.0下保持60分鐘的條件下，有1mM Ca2+存在下，在約60℃以下具有溫度穩(wěn)定區(qū)域，在pH8.0下反應(yīng)60分鐘的條件下，在約55℃以下具有溫度穩(wěn)定區(qū)域，在pH8.0下保持60分鐘的條件下，有1mM Ca2+存在下，在約60℃以下具有溫度穩(wěn)定區(qū)域，(5)pH穩(wěn)定性于4℃下保持24小時(shí)的條件下，在pH約為5.0至10.0的pH范圍內(nèi)具有穩(wěn)定pH區(qū)域。
3.DNA，其編碼權(quán)利要求1或2記載的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3記載的DNA，其中，含有序列表中序列號(hào)4、5或6所示堿基序列或在那些堿基序列中缺失、置換或附加1或數(shù)個(gè)堿基的堿基序列，或者與這些序列互補(bǔ)的堿基序列，或在這些堿基序列中根據(jù)基因的簡(jiǎn)并性，在不改變他編碼的氨基酸序列情況下用其他堿基置換了其中的1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基的堿基序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4記載的DNA，其中，含有根據(jù)基因的簡(jiǎn)并性，不改變序列表中序列號(hào)1、2或3所示氨基酸序列，序列表中序列號(hào)4、5或6所示堿基序列中1或數(shù)個(gè)堿基被其他堿基置換了的堿基序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5記載的DNA，其來(lái)自于桿菌屬微生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5記載的DNA，其來(lái)自于節(jié)桿菌屬微生物。
8.可復(fù)制重組DNA，其中，含有權(quán)利要求3至7中任一項(xiàng)記載的DNA和可自我復(fù)制載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8記載的可復(fù)制重組DNA，其中可自我復(fù)制的載體是質(zhì)粒載體Bluescript II SK(+)。
10.轉(zhuǎn)化體，是將權(quán)利要求8或9記載的可復(fù)制重組DNA導(dǎo)入適宜宿主形成的。
11.根據(jù)權(quán)利要求10記載的轉(zhuǎn)化體，其中宿主是大腸菌。
12.多肽的制備方法，其特征是將權(quán)利要求10或11記載的轉(zhuǎn)化體于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從其培養(yǎng)物中采集權(quán)利要求1或2記載的多肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12記載的多肽制備方法，其特征是通過采用將從離心分離、過濾、濃縮、鹽析、透析、分級(jí)沉淀、凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析、親和層析、凝膠電泳和等電點(diǎn)電泳中選擇出來(lái)的1種或2種以上的方法提取培養(yǎng)物中的權(quán)利要求1或2記載的多肽。
14.一種生成糖的方法，是使權(quán)利要求1或2記載的多肽作用于非還原末端結(jié)合樣式具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在2以上的糖，通過實(shí)質(zhì)上不增加上述糖的還原力進(jìn)行α-葡糖基轉(zhuǎn)移，使非還原末端的結(jié)合樣式具有α-1，6糖苷鍵，該非還原末端以外的結(jié)合樣式為具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在3以上的糖生成的方法。
15.一種糖的制備方法，是使權(quán)利要求1或2記載的多肽作用于非還原末端結(jié)合樣式具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在2以上的糖，通過實(shí)質(zhì)上不增加上述糖的還原力進(jìn)行α-葡糖基轉(zhuǎn)移，生成作為非還原末端的結(jié)合樣式具有α-1，6糖苷鍵，作為該非還原末端以外的結(jié)合樣式具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在3以上的糖的制造方法。
16.環(huán)狀四糖的制造方法，其特征是使權(quán)利要求1或2記載的多肽作用于非還原末端結(jié)合樣式具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在2以上的糖，通過實(shí)質(zhì)上不增加上述糖的還原力進(jìn)行α-葡糖基轉(zhuǎn)移，使非還原末端的結(jié)合樣式具有α-1，6糖苷鍵，該非還原末端以外的結(jié)合樣式為具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在3以上的糖生成，然后通過從非還原末端結(jié)合樣式具有α-1，6糖苷鍵、該非還原末端以外的結(jié)合樣式為α-1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在3以上的糖轉(zhuǎn)移α-異麥芽糖基，使具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖與生成的酶作用，使具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖生成，進(jìn)行提取。
17.根據(jù)權(quán)利要求16記載的環(huán)狀四糖的制備方法，其特征是包括使環(huán)狀四糖結(jié)晶的工序。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17記載的環(huán)狀四糖的制備方法，其特征是環(huán)狀四糖為糖漿或結(jié)晶。
全文摘要
本發(fā)明以提供可以用于制造具有環(huán){→6)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→3)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→6)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→3)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖的多肽、以及編碼該多肽的DNA和其用途作為課題，通過確立作用于作為非還原末端結(jié)合樣式具有α－1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在2以上的糖，實(shí)質(zhì)上不增加上述糖的還原力進(jìn)行α－葡糖基轉(zhuǎn)移，使作為非還原末端的結(jié)合樣式具有α－1，6糖苷鍵，作為該非還原末端以外的結(jié)合樣式具有α－1，4糖苷鍵的葡萄糖聚合度在3以上的糖生成的多肽、編碼該多肽的DNA、包含編碼該多肽的DNA和可自我復(fù)制載體的可復(fù)制重組DNA、將該重組DNA導(dǎo)入適宜宿主形成的轉(zhuǎn)化體、該多肽的制造方法和其用途，解決上述課題。
文檔編號(hào)C12P19/18GK1484701SQ02803657
公開日2004年3月24日 申請(qǐng)日期2002年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月12日
發(fā)明者久保田倫夫, 丸田和彥, 彥, 山本拓生, 生, 溫, 福田惠溫 申請(qǐng)人:株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所