專利名稱：人肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2編碼序列、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2的cDNA序列以及該序列編碼的多肽。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生產(chǎn)方法，以及這些多核苷酸和所述多肽的用途。
近年來研究發(fā)現(xiàn)一些口服肽類似物是通過腸多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(IPTS)吸收的，IPTS機(jī)制的發(fā)現(xiàn)拓展了藥物吸收途徑，為許多多肽藥物提供了安全高效的吸收途徑。將藥物設(shè)計(jì)成二肽、三肽類似物形式的前體藥物，經(jīng)IPTS通過腸紋緣膜，前體藥物定位于上皮細(xì)胞膜，在上皮外表面被酶水解釋放出母體藥物，或完全吸收后在排出細(xì)胞前被細(xì)胞內(nèi)的多肽酶或酷酶水解釋放出母體藥物，發(fā)揮藥效。目前，可通過IPTS吸收的藥物有p-內(nèi)酰胺抗生素、頭孢菌素、青霉素、ACE抑制劑、腎素抑制劑、苯丁抑制素、凝血酶抑制劑、促甲狀腺素釋放素及其類似物。其中，苯丁抑制素是含有獨(dú)特氨基酸的二肽，具有抗癌活性，臨床上常以口服劑型的形式用于癌癥治療(《國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊》2000，27(5)301～304)。
肽轉(zhuǎn)運(yùn)過程廣泛存在于細(xì)菌、植物和哺乳動(dòng)物組織中。研究表明，模式真核生物Saccharomyces cerevisiae有兩種截然不同的肽轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，一種是轉(zhuǎn)運(yùn)兩肽/三肽的PTR體系；另一種是轉(zhuǎn)運(yùn)四肽/五肽的OPT體系。PTR體系有三個(gè)基因，PTR1，PTR2和PTR3。由PTR2基因編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)載體PTR2P是一個(gè)含有十二個(gè)跨膜區(qū)域的內(nèi)在蛋白，主要轉(zhuǎn)運(yùn)二肽/三肽，PTR家族成員已在多種生物中被鑒定。(Hauser M，Narita V，DonhardtAM，Naider F，Becker JM.(2001)Mol Membr Biol，18(1)105-12)。然而，本發(fā)明的人肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2尚未被報(bào)道或發(fā)表過。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，該蛋白被命名為人hPTR2。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的人hPTR2的方法。
本發(fā)明還提供了hPTR2基因序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人hPTR2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸30-1760位的核苷酸序列有至少90％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸30-1760位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.1中從30-1760位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的hPTR2蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ IDNO.2序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有hPTR2蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有hPTR2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hPTR2蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸30-1760位的核苷酸序列有至少90％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hPTR2蛋白的重組細(xì)胞；
(c)在適合表達(dá)hPTR2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hPTR2蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為2013個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于30-1760位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“hPTR2蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有hPTR2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中30-1760位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框30-1760位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中30-1760位核苷酸序列同源性低至約90％的簡并序列也能編碼出SEQID NO.2所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸30-1760位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸30-1760位的核苷酸序列的同源性至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人hPTR2相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“hPTR2蛋白多肽”指具有hPTR2蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人hPTR2相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括hPTR2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與hPTR2 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗hPTR2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含hPTR2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括hPTR2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有hPTR2多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供hPTR2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然hPTR2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括hPTR2多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)hPTR2的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有hPTR2多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼hPTR2的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測hPTR2核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于hPTR2多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)hPTR2 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于hPTR2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與hPTR2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制hPTR2蛋白的分子，也包括那些并不影響hPTR2蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的hPTR2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的hPTR2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)hPTR2或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，2013；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，2013；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷hPTR2功能的抗體以及不影響hPTR2功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用hPTR2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與hPTR2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的人hPTR2核苷酸序列全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。當(dāng)然，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明中，hPTR2的cDNA核苷酸序列是如此獲得的以人睪丸λgt10cDNA文庫(Clontech公司)為模板，用兩對(duì)寡核苷酸為引物A15′-CTACCG AGTCCTCAGTGAACC-3′，B15’-GAACGGCCCT CCACGCGAC AT-3‘為正向引物；寡核苷酸A25′-CTG ACGGAGGTGC CTTCACTT-3’，B25’-CATGCTG GCTGGCTGCA TCAG-3‘為反向引物，進(jìn)行PCR。A1/A2的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、68℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘；B1/B2的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、64℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)所得片段長度分別為九百和一千個(gè)堿基左右。然后用限制性酶EcoR I對(duì)兩者進(jìn)行酶切、連接，得到目的cDNA序列及雜帶。雜帶可用電泳等方法去除，從而得到濃度較高的目的cDNA序列。
通過同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的hPTR2蛋白質(zhì)序列中具有肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PTR2)功能域的典型序列。PTR2基因編碼的蛋白是一個(gè)含有十二個(gè)跨膜區(qū)域的內(nèi)在蛋白，主要轉(zhuǎn)運(yùn)二肽/三肽。本發(fā)明具有PTR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員的保守結(jié)構(gòu)域，因此，本發(fā)明的hPTR2蛋白可能是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的新成員，對(duì)肽分子的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收具有調(diào)控作用。這樣本發(fā)明實(shí)際上從基因水平上提供了一種改善營養(yǎng)吸收不良患者癥狀的方法。此外，臨床上常將藥物設(shè)計(jì)成二肽、三肽類似物形式通過口服方式給藥，利用本發(fā)明的hPTR2將為更多的多肽藥物提供安全高效的吸收途徑。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑸鲜龅臄U(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對(duì)插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對(duì)缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiThermEXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對(duì)依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共2722bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于30-1760位核苷酸。根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出hPTR2的氨基酸序列，共576個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.2。
實(shí)施例2結(jié)構(gòu)分析用hPTR2的全長cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)hPTR2的蛋白質(zhì)序列中具有肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PTR2)功能域的典型序列。
本發(fā)明的hPTR2中符合PTR2保守序列的部分為RAILLSLALYLLGLLAFPLLAAPRSRSFLCGDPRPELVRNCSAPFPNGSASCPENAARRCAPATFAGLVLVGLGVATVKANITPFGADQVKDRGPEATRRFFNWFYWSINLGANPVIRRYCYYSAECELFHRLPDSHQSLCGHCFPGSSSVARVSSSPSFLTEVPSLDMFRILTYSCCSQRGGQRRSGEGLGVFQQSSKHSLFDSCKMSRGGPFTEDKVEDVKALVKIVPVFLALIPYWTVYFQMQTTYALQNLHLKIPEISSITTTHHTLPAAWLTMFDAVLILLLIPLKDKLVDPVLRRHGLLPSSLKRIAVGMFFVMCSAFAAGILESKKLDLVKEKTINQTIGGVVFHAADLPIWWQILQYVLIGISEIFASIARQEFAYSAAPKSMQSAIMGLFFFFS(SEQ ID NO 2中從第96-499位)。hPTR2基因編碼的蛋白是一個(gè)含有十二個(gè)跨膜區(qū)域的內(nèi)在蛋白，主要轉(zhuǎn)運(yùn)二肽/三肽。本發(fā)明具有PTR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員的保守結(jié)構(gòu)域，因此，本發(fā)明的hPTR2蛋白可能是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的新成員，對(duì)肽分子的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收具有調(diào)控作用。這樣本發(fā)明實(shí)際上從基因水平上提供了一種改善營養(yǎng)吸收不良患者癥狀的方法。此外，臨床上常將藥物設(shè)計(jì)成二肽、三肽類似物形式通過口服方式給藥，利用本發(fā)明的hPTR2將為更多的多肽藥物提供安全高效的吸收途徑。通過對(duì)本發(fā)明的深入研究，一定能發(fā)現(xiàn)它與許多臨床病例的關(guān)系，并最終為解決這些問題開拓新的思維與方法。
本發(fā)明的人hPTR2除了可作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人hPTR2還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。
針對(duì)本發(fā)明人hPTR2的抗體，用于篩選具有類似結(jié)構(gòu)域的其他蛋白，或者用于親和純化相關(guān)蛋白。
例如，本發(fā)明人hPTR2核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人hPTR2的表達(dá)水平或者抑制人hPTR2的過度表達(dá)。本發(fā)明的人hPTR2蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人hPTR2缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3hPTR2在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，用對(duì)應(yīng)于編碼hPTR2的cDNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得hPTR2的cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-T GAAGGATCCA TGGAGGGCGA GCGGGCGC-3′該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，接之是hPTR2編碼序列氨基端的部分核苷酸序列；3’端引物序列為5’-GGCTGTCGACGGTCCTC GTGCTGGCTG GC-3’該引物含有Sal I限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，一個(gè)翻譯終止子和hPTR2的編碼序列的部分核苷酸序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHI和Sal I消化pQE-9載體以及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，并測序驗(yàn)證hPTR2的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)達(dá)0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的hPTR2。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫hPTR2。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
此外，用常規(guī)方法對(duì)表達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.2的序列一致。
實(shí)施例4hPTR2在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，用對(duì)應(yīng)于編碼hPTR2的cDNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得hPTR2 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為
5′-TGAAGGATCCA TGGAGGGCGA GCGGGCGC-3′該引物含有BamH I限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是hPTR2編碼序列的氨基端部分核苷酸序列；3’端引物序列為5’-GGCTGATATCGGTCCTC GTGCTGGCTG GC-3’該引物含有EcoR V限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和hPTR2的部分核苷酸序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen公司)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(fl ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用BamHI和EcoR V消化pcDNA3載體以及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，并測序驗(yàn)證hPTR2的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對(duì)混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對(duì)表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
此外，用常規(guī)方法對(duì)表達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.2的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組蛋白用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人hPTR2基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。
序列表<210>1<211>2722<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(30)..(1760)<223><400>1tgggctaccg agtcctcagt gaaccggcc atg gag ggc gag cgg gcg ccg ctg53Met Glu Gly Glu Arg Ala Pro Leu1 5ttg ggt tcg cgg cgt ccg gca gtg tcg gcg gcg tec gcg gtg ttc gcg101Leu Gly Ser Arg Arg Pro Ala Val Ser Ala Ala Ser Ala Val Phe Ala10 15 20ggg cgg cgt gcg gcg tgc ggg gcg gtg ctg ttg gcc gag ctg ctg gag149Gly Arg Arg Ala Ala Cys Gly Ala Val Leu Leu Ala Glu Leu Leu Glu25 30 35 40cgc gcg gcc ttc tac ggc gtc acg gcc aac ctg gtg ctg ttc ctg aat197Arg Ala Ala Phe Tyr Gly Val Thr Ala Asn Leu Val Leu Phe Leu Asn45 50 55ggc gcg ccg ttc gac tgg gag ggc gcg cag gcc agc cag gcg ctg ctg245Gly Ala Pro Phe Asp Trp Glu Gly Ala Gln Ala Ser Gln Ala Leu Leu60 65 70ctc ttc atg ggc ctc acc tac ctg ggc tcg ccg ttc ggg ggc tgg ctc293Leu Phe Met Gly Leu Thr Tyr Leu Gly Ser Pro Phe Gly Gly Trp Leu75 80 85gcc gac gcc cgc ctc ggc cgg gcc cgc gcc atc ctg ctc agc ttg gcc 341Ala Asp Ala Arg Leu Gly Arg Ala Arg Ala Ile Leu Leu Ser Leu 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Val Arg Asn Cys Ser Ala Pro Phe Pro Asn Gly130 135 140Ser Ala Ser Cys Pro Glu Asn Ala Ala Arg Arg Cys Ala Pro Ala Thr145 150 155 160Phe Ala Gly Leu Val Leu Val Gly Leu Gly Val Ala Thr Val Lys Ala165170 175Asn Ile Thr Pro Phe Gly Ala Asp Gln Val Lys Asp Arg Gly Pro Glu180 185 190Ala Thr Arg Arg Phe Phe Asn Trp Phe Tyr Trp Ser Ile Asn Leu Gly195 200 205Ala Asn Pro Val Ile Arg Arg Tyr Cys Tyr Tyr Ser Ala Glu Cys Glu210 215 220Leu Phe His Arg Leu Pro Asp Ser His Gln Ser Leu Cys Gly His Cys225 230 235 240Phe Pro Gly Ser Ser Ser Val Ala Arg Val Ser Ser Ser Pro Ser Phe245 250 255Leu Thr Glu Val Pro Ser Leu Asp Met Phe Arg Ile Leu Thr Tyr Ser260 265 270Cys Cys Ser Gln Arg Gly Gly Gln Arg Arg Ser Gly Glu Gly Leu Gly275 280 285Val Phe Gln Gln Ser Ser Lys His Ser Leu Phe Asp Ser Cys Lys Met290 295 300Ser Arg Gly Gly Pro Phe Thr Glu Asp Lys Val Glu Asp Val Lys Ala305 310 315 320Leu Val Lys Ile Val Pro Val Phe Leu Ala Leu Ile Pro Tyr Trp Thr325330 335Val Tyr Phe Gln Met Gln Thr Thr Tyr Ala Leu Gln Asn Leu His Leu340 345 350Lys Ile Pro Glu Ile Ser Ser Ile Thr Thr Thr His His Thr Leu Pro355 360 365Ala Ala Trp Leu Thr Met Phe Asp Ala Val Leu Ile Leu Leu Leu Ile370 375 380Pro Leu Lys Asp Lys Leu Val Asp Pro Val Leu Arg Arg His Gly Leu385 390 395 400Leu Pro Ser Ser Leu Lys Arg Ile Ala Va1 Gly Met Phe Phe Val Met405 410 415Cys Ser Ala Phe Ala Ala Gly Ile Leu Glu Ser Lys Lys Leu Asp Leu420 425 430Val Lys Glu Lys Thr Ile Asn Gln Thr Ile Gly Gly Val Val Phe His435 440 445Ala Ala Asp Leu Pro Ile Trp Trp Gln Ile Leu Gln Tyr Val Leu Ile450 455 460Gly Ile Ser Glu Ile Phe Ala Ser Ile Ala Arg Gln Glu Phe Ala Tyr465 470 475 480Ser Ala Ala Pro Lys Ser Met Gln Ser Ala Ile Met Gly Leu Phe Phe485 490 495Phe Phe Ser Cys Ile Gly Ser Phe Val Gly Ser Gly Leu Leu Ala Leu500 505 510Val Ser Leu Lys Ala Ile Gly Trp Met Ser Ser His Thr Asp Phe Gly515 520 525Asn Ile Asn Ser Cys His Leu His Tyr Tyr Phe Phe Leu Leu Ala Ala530 535 540Ile Gln Gly Ala Thr Leu Leu Leu Phe Leu Ile Val Ser Val Lys Tyr545 550 555 560Asp Arg Gln Arg Ala Arg Thr Asp Gly Gly Pro Ala Ser Thr Arg Thr565 570 57權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人hPTR2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸30-1760位的核苷酸序列有至少90％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸30-1760位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.1中核苷酸30-1760位的序列。
4.一種分離的hPTR2蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.一種產(chǎn)生具有hPTR2蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有hPTR2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hPTR2蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸30-1760位的核苷酸序列有至少90％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hPTR2蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)hPTR2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hPTR2蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸30-1760位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的hPTR2蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中約8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域,具體地,本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說,本發(fā)明涉及人肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(hPTR2)的cDNA序列以及該序列編碼的多肽。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生產(chǎn)方法,以及這些多核苷酸和所述多肽的用途。
文檔編號(hào)C12N15/64GK1377965SQ0211141
公開日2002年11月6日 申請日期2002年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月18日
發(fā)明者余龍, 唐麗莎 申請人:復(fù)旦大學(xué)