專利名稱：從芽孢桿菌a7－7(dsm12368)中提取的新型淀粉分解酶以及含有該新型淀粉分解酶的洗 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來自微生物芽孢桿菌(Bacillus sp.)A7-7(DSM12368)的新淀粉分解酶以及具有淀粉分解活性的足夠相似的蛋白，還涉及它們的生產(chǎn)方法以及這些蛋白各種潛在的應(yīng)用。除提及的潛在的應(yīng)用以外，它們可進一步開發(fā)用于其他最重要的工業(yè)目的。更具體而言，本發(fā)明涉及含有這些淀粉分解蛋白的洗滌劑/清洗劑，涉及淀粉分解蛋白或?qū)?yīng)的組合物參與其中的用于清洗織物或硬表面的方法，以及涉及它們清洗織物或硬表面的用途。
α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)水解淀粉和淀粉樣多聚體如直鏈淀粉、支鏈淀粉或糖原的內(nèi)α-1，4-糖苷鍵，以形成糊精以及β-1，6-支鏈寡糖。它們是最重要的工業(yè)用酶之一。對此有兩個理由。第一，象許多底物降解酶一樣，它們從微生物釋放到外圍培養(yǎng)基中，以便通過發(fā)酵和純化在工業(yè)規(guī)模上可相對容易地從培養(yǎng)基中分離出來。第二，大范圍的應(yīng)用需要淀粉酶。
α-淀粉酶的一個重要工業(yè)用途是生產(chǎn)葡萄糖漿。其他應(yīng)用是例如作為活性成分用于洗滌劑/清洗劑、處理織物制造中的原材料、粘合劑的生產(chǎn)以及含糖食品或食品成分的生產(chǎn)中。
數(shù)十年來，酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶或纖維素酶一直作為活性成分用于洗滌劑/清洗劑中。它們對特定組成的洗滌/清洗性能的特殊貢獻如下在蛋白酶的情況下，具有降解含蛋白污漬的能力；在淀粉酶的情況下，是降解含淀粉污漬；以及在脂肪酶的情況下，具有脂解活性。纖維素酶優(yōu)選用于洗滌劑中，首要是依據(jù)它們對洗滌劑的多洗滌循環(huán)性能所起的作用以及它們對織物的纖維效應(yīng)。特定水解產(chǎn)物由洗滌劑的其他成分攻擊、溶解、乳化或懸浮，或依據(jù)它們相對高的溶解度，用洗滌液漂浮，以便在酶和其他組成物之間發(fā)生協(xié)同效應(yīng)。
通常用于洗滌劑/清洗劑中的α-淀粉酶是來自地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的α-淀粉酶。例如，丹麥Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd和美國Genencor Int.，Rochester，New York的對應(yīng)產(chǎn)品分別是商業(yè)上已知的Termamyl和Purastar。從枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)中分離并公開在美國專利申請US1,227,374中的同系物已被Novo Nordisk A/S以BAN的名稱推向市場。
該淀粉酶分子或其密切相關(guān)物已在眾多發(fā)明中被進一步開發(fā)，這些發(fā)明陳述了通過各種分子生物學(xué)修飾使它們的酶特性最佳化用于特定應(yīng)用的問題。這些最佳化可涉及例如底物特異性，涉及各種反應(yīng)條件下酶的穩(wěn)定性或涉及酶活性自身。提及下列專利申請作為最適于特定應(yīng)用的例子EP0 410 498用于織物篩分以及WO96/02633用于淀粉液化。
總之，盡管α-淀粉酶有關(guān)用于洗滌劑/清洗劑中的開發(fā)一直在進行。提及下列專利申請僅作為此的一些例子WO99/02702中的淀粉酶在相對高的溫度下比出發(fā)分子更穩(wěn)定。WO99/23211中的酶在高pH值、有鈣離子存在以及相對高溫度下是穩(wěn)定的。WO97/43424中的α-淀粉酶對鈣離子表現(xiàn)修飾的結(jié)合能力，并因此修飾酶特性。WO99/20768中的誘變方法導(dǎo)致α-淀粉酶變體，這些變體在洗滌劑成分存在下尤其穩(wěn)定。類型修飾尚在爭論中，個別酶特性的變化幾乎總是對特定酶的其他特性和洗滌性能具有效應(yīng)。以此種途徑獲得的現(xiàn)已上市的最佳化產(chǎn)品的一個例子是Duramyl(WO94/02597)，其降低了對氧化的靈敏度(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark；SFW-Journal123，(1997)，pp.723-731)。
由于開發(fā)僅包括若干已知的出發(fā)酶的最佳化，這可能被限制在所獲得結(jié)果中，因此對來自其他天然來源的可比較的酶一直進行平行且深入的研究。該研究已鑒定淀粉一分解的酶，例如來自脂肪桿菌(Pimelobacter)、假單胞菌(Pseudomonas)以及棲熱菌(Thermus)用于食品生產(chǎn)、化妝品和制藥產(chǎn)品(EP0 636 693)中，來自根瘤菌(Rhizobium)、節(jié)桿菌(Arthrobacter)、短桿菌(Brevibacterium)以及微球菌(Micrococcus)(EP0 628 630)，來自火球菌(Pyrococcus)(WO94/19454)以及硫化葉菌(Sulfolobus)用于高溫下或高酸性反應(yīng)條件下的淀粉液化(EP0 727 485和WO96/02633)。來自芽孢桿菌的淀粉酶已被發(fā)現(xiàn)(WO95/26397和WO97/00324)用于堿性pH值下。依據(jù)它們對洗滌劑的靈敏度低，來自各種芽孢桿菌的其他淀粉酶(EP0 670367)適用于洗滌劑/清洗劑中。
依據(jù)它們的起源，來自新公開生物的酶可能比若干確定的酶可能更適用于針對特定應(yīng)用的進一步開發(fā)中。這種酶的一個例子是來自Thermoalcalibacter的淀粉酶(WO98/13481)，其中天然活性很大程度上不受鈣離子的影響，因此從一開始，其就具有用于洗滌劑的正選資格。
從天然資源中分離的酶對特殊用途的進一步最佳化需要采用分子生物學(xué)方法(例如根據(jù)US5,171,673或者WO99/20768)或者化學(xué)修飾(DE4013142)的方法得到。例如，專利申請WO99/43793描述了進一步開發(fā)已知酶Novamylα-淀粉酶。這篇文獻中，通過微生物技術(shù)，Novamyl和已知的環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(CGTases)之間的序列相似性被用來建立一組相關(guān)分子。這些相關(guān)分子是具有其他CGTase特異的共有序列(框)和功能的α-淀粉酶，或與此相反，是具有典型α-淀粉酶的其他區(qū)段或功能的CGTase或者兩分子的嵌合。改進的目的是為了使Novamyl最適于這些應(yīng)用。
專利申請WO99/57250公開了另一種提高洗滌酶的洗滌性能的方法，例如利用脂肪酶、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶或者甚至CGTases。其中所述原理在于通過非氨基酸連接體將特定酶與細菌起源的纖維素結(jié)合區(qū)(CBD)共價結(jié)合在一起。這確保了酶以更大的強度作用于織物的表面。從這種意義上來講，WO99/57252包括其他可能的連接體，因為WO99/57254包括其他酶例如糖基轉(zhuǎn)移酶或者?；D(zhuǎn)移酶，它們與纖維素結(jié)合區(qū)結(jié)合以形成嵌合蛋白，或者通過WO99/57252中提到的連接體結(jié)合。
用于洗滌劑的每一種淀粉酶都有其自己的性能特點，這可以從如下事實反應(yīng)出來有些污垢能夠被一種酶有效清除，而其他一些污垢卻被另一種酶有效清除。這進一步表明用其他淀粉分解酶豐富本領(lǐng)域的必要性，所述其他淀粉分解酶也有著自己的性能范圍。這種必要性也隨消費者需求和習(xí)慣的改變而顯現(xiàn)，據(jù)此例如，對在低溫和中等溫度的環(huán)境下洗滌的洗滌劑就有增長的需求。
除此以外，從生物中獲取的迄今還未為此目的而開發(fā)的新酶可能作為初始產(chǎn)品，以待通過蛋白質(zhì)工程對其進一步進行基因工程的修飾。他們的目的是產(chǎn)生一些目前已知的酶或者從這些酶中衍生的洗滌酶沒有或不具有的特性。
然而，從另一方面講，那些與典型的洗滌成分結(jié)合使用，從一開始就顯示洗滌或清洗性能的天然酶，似乎是特別適合于這些最佳化的候選物。
然而，盡管有這些改進，但是除了工業(yè)規(guī)模上實際使用或以進一步改進形式的天然淀粉分解酶以外，仍需要找到其他的淀粉分解酶，它的初始產(chǎn)品就具有廣泛的應(yīng)用范圍，并且可作為進一步特異改造的起始點。
因此，本發(fā)明所要解決的問題是鑒定迄今還未被記述過的天然α-淀粉酶，它適合于投入工業(yè)應(yīng)用，特別是在洗滌劑/清洗劑方面，或者其能夠被用作特定應(yīng)用進一步改進的基礎(chǔ)。
其次的一個問題是獲得編碼這種淀粉酶的核酸序列，因為這對它的生物技術(shù)生產(chǎn)以及進一步開發(fā)這些酶是必需的。
再其次的問題是找到一種生物，其能夠天然地生產(chǎn)這種特定的淀粉酶。
再其次的問題是使找到的α-淀粉酶能夠采用生物技術(shù)生產(chǎn)。
再其次的問題是提供洗滌劑/清洗劑，它們的洗滌或清洗性能能夠被所發(fā)現(xiàn)的α-淀粉酶提高，也即，其洗滌或清洗性能部分可歸功于根據(jù)本發(fā)明所述的淀粉酶。
再其次的問題是提供對應(yīng)的洗滌/清洗方法并且指出對應(yīng)的潛在用途。
另一其次的問題是確定主要顯現(xiàn)適用于洗滌劑/清洗劑的α-淀粉酶進一步潛在的工業(yè)應(yīng)用。
以上問題的解決方式，也是本發(fā)明的第一個實施方案在于淀粉分解蛋白，其氨基酸序列具有至少96％，優(yōu)選至少98％以及更優(yōu)選100％的同一性于SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列，特別是同一性于SEQID NO.2的第32-516位氨基酸的區(qū)域。
這包括衍生自核苷酸序列的淀粉分解蛋白，所述核苷酸序列是至少85％，優(yōu)選至少90％以及更優(yōu)選100％同一性于SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列，特別是對應(yīng)于SEQ ID NO.2的第32-516位氨基酸的區(qū)域。也包括另一些淀粉分解酶，它們與上述的淀粉分解蛋白足夠的相似，或能夠從已知的方法本身得到。優(yōu)選的代表是能夠從微生物中天然分離，桿菌屬的革蘭氏陽性菌，尤其是芽孢桿菌A7-7(DSM12368)，特別是來自芽孢以及更具體是芽孢桿菌A7-7(DSM12368)。
本發(fā)明的第二個實施方案是編碼淀粉分解蛋白的核酸，其核苷酸序列是至少85％，優(yōu)選至少90％，以及更優(yōu)選100％同一性于SEQ IDNO.1中所示的核苷酸序列，特別是對應(yīng)于SEQ ID NO.2的第32-516位氨基酸的核酸區(qū)域。這些核酸優(yōu)選對應(yīng)地包括編碼本發(fā)明第一個實施方案中的特定蛋白的核酸。
本發(fā)明第三個實施方案是天然生物，它們能夠合成第一個實施方案的衍生物，或包含蛋白或者編碼此蛋白或衍生物的核酸。具體優(yōu)選的實施方案是芽孢桿菌A7-7菌株，它已經(jīng)以DSM(12368)名稱保藏。
本發(fā)明第四個實施方案是含有第二個實施方案的核酸的載體、用這些載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，以及任何生產(chǎn)本發(fā)明第一個實施方案的蛋白或衍生物的生物技術(shù)方法。
本發(fā)明第五個實施方案是洗滌劑/清洗劑，其特征在于它們含有第一個實施方案的蛋白或其衍生物。這些洗滌劑/清洗劑優(yōu)選包括含有淀粉分解蛋白或其衍生物的洗滌劑/清洗劑，所述淀粉分解蛋白或其衍生物的量按重量計為0.000001％到5％，以及特別為0.00001％到3％，洗滌劑/清洗劑包括其他酶，洗滌劑/清洗劑作為本身已知的補充形式存在，或在洗滌劑/清洗劑中淀粉分解活性執(zhí)行釋放洗滌/清洗劑的成分的功能，或是自控的。
本發(fā)明的第六個實施方案是清洗織物或者硬表面的方法，其特征在于第一個實施方案的蛋白或其衍生物在至少一個方法步驟中發(fā)揮作用。第五個實施方案中的洗滌劑/清洗劑優(yōu)選用作此目的，以及淀粉分解蛋白或其衍生物優(yōu)選使用的量是每次應(yīng)用0.01mg到200mg，以及在特殊的方法步驟中使用量是每次應(yīng)用0.02mg到100mg。
本發(fā)明的第七個實施方案是第一個實施方案的蛋白或衍生物或者第五個實施方案的洗滌劑/清洗劑的對應(yīng)的潛在用于清洗清洗織物或硬表面或用于釋放對應(yīng)洗滌劑/清洗劑的成分；優(yōu)選的使用量為在洗碗機或洗衣機中每次應(yīng)用加入0.01mg到200mg淀粉分解蛋白或其衍生物，以及特別加入0.02mg到100mg的淀粉分解蛋白或衍生物。
本發(fā)明的第八個實施方案為所發(fā)現(xiàn)的α-淀粉酶進一步潛在的工業(yè)用途。這些用途包括淀粉的液化方法，特別是乙醇的生產(chǎn)方法，暫時的結(jié)合方法和多種潛在的用途，特別是用于紡織物生產(chǎn)中的原材料或中間產(chǎn)品的處理，特別是用于棉花的退漿，用于線性和/或短鏈寡糖的生產(chǎn)，用于環(huán)糊精的水解，用于從多糖載體或環(huán)糊精中釋放低分子量的化合物，用于食品和/或食品成分的生產(chǎn)，用于動物飼料和/或動物飼料成分的生產(chǎn)，以及用于溶解含淀粉的粘合鍵。
本發(fā)明上下文中的蛋白指基本上是線性的多聚體，由天然氨基酸組成，一般認為發(fā)揮功能的三維結(jié)構(gòu)。在本說明書中，這19種組成蛋白的，自然形成的L-氨基酸由國際上認可的1個字母的和3個字母的代碼所命名。
本發(fā)明上下文中的酶是指一種蛋白質(zhì)，它起著某種生化功能。淀粉分解蛋白或者有淀粉分解功能的酶理解為那些水解多糖的α-1，4-糖苷鍵的蛋白或酶，特別是那些位于多糖中的蛋白或酶。因此，它們也被叫做α-1，4-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)。
很多蛋白質(zhì)形成所謂的蛋白前體，即具有一個信號肽部分。這意味著這種蛋白的N端，其功能通常是保證蛋白在細胞中合成以后被釋放到周質(zhì)或者周圍的介質(zhì)中，以及/或者保證其正確的折疊。然后信號肽在自然狀態(tài)下被一種信號肽酶從蛋白上切下來，與蛋白的其他部分分開，從而使蛋白在沒有N端的情況下發(fā)揮其真正的催化活性。例如，來自芽孢桿菌A7-7(DSM 12368)的天然α-淀粉酶長度為516個氨基酸，如SEQ ID NO.2.中所示。如SEQ ID NO.1中所示，這種酶的信號肽含有31個氨基酸，所以成熟的酶長度為485個氨基酸。
由于它們的酶活性，成熟的肽即合成后經(jīng)處理的酶比起蛋白前體來說更受應(yīng)用的青睞。
前體蛋白就是沒有活性的蛋白前體。它們的前體及其信號頻率被認為是前體蛋白的前體。
在本發(fā)明的上下文中，核酸是那些由核苷酸天然組成的分子，這些核酸的功能是作為信息載體，并且在蛋白質(zhì)或酶中編碼線性氨基酸序列。它們可能是單鏈的，也可能是互補于此單鏈的單鏈，或者是雙鏈。作為天然永久的信息載體，這些核酸DNA更適用于分子生物學(xué)工程。相比之下，為了在自然環(huán)境中例如在正在表達的細胞中實施本發(fā)明，形成RNA，從而對于本發(fā)明有很重要作用的RNA亦代表本發(fā)明的實施方案。
在DNA中，所有三個讀碼框中的兩條互補鏈都必須考慮到。另一點需要注意的是，不同的密碼三聯(lián)體可能編碼同一種氨基酸，因此，某種特定氨基酸序列可以從一些不同的也許僅有最低相似性的核苷酸序列(遺傳密碼子的簡并性)得到。除此以外，不同的生物在應(yīng)用密碼子上也存在差異。由于這些原因，不管是氨基酸序列還是核苷酸序列都必須列入保護范圍，并且公開的核苷酸序列應(yīng)只被看作編碼某氨基酸序列的舉例。
在本說明書中，與蛋白對應(yīng)的信息單位亦稱作基因。
在常用方法的幫助下，如化學(xué)合成或者聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，結(jié)合分子生物學(xué)和/或蛋白質(zhì)化學(xué)的標(biāo)準方法，專家們已經(jīng)能夠在已知DNA和/或氨基酸序列的基礎(chǔ)上生產(chǎn)對應(yīng)的核酸，其長達甚至包括完整的基因。這種方法已經(jīng)掌握了，例如來自“Lexikon der Biochemie”，Spektrum Akademischer Verlag，Berlin，1999，Vol.1，第267-271頁和Vol.2，第227-229頁。
核苷酸序列的變化被稱為突變，其可以通過已知的分子生物學(xué)方法得到。根據(jù)變化的類型，突變分為例如缺失、插入、替代突變，或者不同的基因抑或基因的不同部分被融合在一起(“改組”的突變)；這些就是基因突變。與此相關(guān)的生物就稱為突變體。從這些突變核酸中得到的蛋白被稱為變體。例如，缺失、插入或者替代突變，或者融合導(dǎo)致了基因的缺失、插入、替代突變或融合，以及在蛋白質(zhì)水平上，導(dǎo)致對應(yīng)的缺失、插入或者替代變體或者融合蛋白。
片段是指那些比天然蛋白質(zhì)或那些對應(yīng)于完全翻譯的基因更短并且例如也可通過合成得到的任何蛋白或者肽。在氨基酸序列的基礎(chǔ)上，它們能被設(shè)計成特異的完整蛋白。例如它們可以具有相同的結(jié)構(gòu)，或可發(fā)揮蛋白水解活性或者部分活性，例如底物的絡(luò)合。片段及初始蛋白的缺失變體基本上是一樣的。然而，片段是相對較小的，缺失變體只是缺失小區(qū)域因此僅缺乏個別的部分功能。
在本發(fā)明的上下文中，嵌合或者雜交蛋白由那些由相同或不同生物的不同多肽鏈天然發(fā)生的元件組成。這個過程也就是改組或融合突變。融合的目的在于在融合部分蛋白的幫助下生成或者修飾某種酶的功能。
通過插入突變得到的蛋白被稱為是變體，這種變體能夠通過已知的方法把核酸或蛋白片段插入到起始序列中而得到。因為它們基本是一致的，它們能被置于一個嵌合蛋白中，在這些嵌合蛋白中，區(qū)別僅在于蛋白的不變部分與整個蛋白的大小比例不同。在插入突變蛋白中，外源蛋白的比例低于嵌合蛋白。
倒置突變，即部分序列的倒置，被看作一種缺失與插入的特殊形式。同樣適用于分子不同部分的重組，這與原始的氨基酸序列相異。這也可以被看作是一種缺失變體，作為原始蛋白的插入變體或者改組變體。
在本發(fā)明的上下文中，衍生物是指已經(jīng)化學(xué)修飾的純氨基酸鏈的蛋白。這種衍生化作用可通過宿主生物以生物方法結(jié)合蛋白合成進行。分子生物學(xué)的方法可以用于此目的。這些衍生物也可以化學(xué)方法來實施，例如根據(jù)發(fā)明將氨基酸的側(cè)鏈化學(xué)地轉(zhuǎn)化或者通過共價結(jié)合將另一個化合物結(jié)合到蛋白上。該化合物可以如通過雙功能化合物與根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白結(jié)合的另一蛋白。衍生化作用也被認為包括對大分子載體地共價結(jié)合。
在本發(fā)明上下文，所有的酶、蛋白、片段及衍生物被集體的冠以蛋白的名字除非它們需要清晰的指稱。
在本發(fā)明上下文中，載體被認為是由核酸組成的元件，這些核酸包括一個目的基因作為特征核酸區(qū)。它們能夠在物種或細胞系中經(jīng)若干代或細胞分裂作為穩(wěn)定的遺傳元件建立起來，所述遺傳元件能夠獨立于基因組的其他部分復(fù)制。載體是特殊的質(zhì)粒，即環(huán)形的遺傳元件，尤其是它們被用于細菌的時候。在基因工程中，用于儲存進而進行所謂的基因操作(即所謂的克隆載體)的載體與在宿主細胞中生成目的基因即促進特定蛋白表達的載體是有區(qū)別的。這些載體都被認為是表達載體。
通過與例如在常用數(shù)據(jù)庫中保存的已知酶相比較，被研究酶的特征分子部分，如結(jié)構(gòu)單元或者酶活，能夠從氨基酸及核苷酸序列推導(dǎo)得到。這種比較是通過確定被研究蛋白彼此之間核苷酸或氨基酸序列的相似性來完成的。這就是所謂的同源化。對特定位點的列表稱為比對。在對核苷酸序列的分析中，其互補鏈以及所有可能的三個讀碼框都必須列入考慮范圍，除此以外，還有遺傳密碼子的簡并性和生物特異密碼子的利用率?，F(xiàn)在，比對是由計算機程序產(chǎn)生的，例如通過FASTA或者BLAST算法。這個程序例如由D.J.Lipman和W.R.Pearson(1985)在Science，Vol.227，第1435-1441頁中描述。所有與被比較序列一致的位置的總匯稱為共有序列。
這樣的比較也為被比較序列之間的相似性或同源性提供了信息。此信息通過同一性的百分數(shù)來表示，即相同核苷酸或位置相同的氨基酸殘基的比例。同源性的更廣泛的定義包括保守氨基酸的替換。這樣，同一性百分率就可以變成相似性百分率。這種插入可以針對整個蛋白或者基因，或者單獨的一個區(qū)域。
不同蛋白的同源區(qū)一般有相同的結(jié)構(gòu)單元和/或功能，可以通過與原始氨基酸序列相對照而識別出來。在很小區(qū)域所謂框中是完全同一性的，這些框僅包含一些氨基酸并且一般對于整個活性發(fā)揮至關(guān)重要的作用。同源區(qū)的功能只代表蛋白整體功能的一小部分，例如絡(luò)合底物或過渡復(fù)合體中單個氫鍵橋的形成。
酶活性能夠被那些不參與實際反應(yīng)的其他蛋白區(qū)域定性或者定量的修飾。這關(guān)系到酶的穩(wěn)定性、活性、反應(yīng)條件或底物特異性。
因此，根據(jù)本發(fā)明所述的淀粉分解蛋白的定義不僅適用于實施水解α-1，4-糖苷鍵的單一功能，所述鍵可歸功于可能的催化活性中心的數(shù)個氨基酸殘基。同時它也包括所有支持α-1，4-糖苷鍵水解的功能。這些功能可由單個肽以及蛋白的一個或多個單獨部分作用于實際催化活性區(qū)域來進行。淀粉分解功能定義也涵蓋了修飾功能本身。這是因為，一方面，現(xiàn)在還不確切知道根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白是哪些氨基酸殘基真正催化水解，另一方面，從一開始某種單個功能不能確定性地排出在參與催化之外。輔助功能或者部分活性包括，例如底物的結(jié)合、中間產(chǎn)物或者終產(chǎn)物、激活或抑制或賦予對水解活性的控制效果。這也可以包含結(jié)構(gòu)單元的形成，其遠離活性中心或信號肽，信號肽的功能涉及所形成蛋白從細胞的釋放和/或它的正確的折疊，并且如果沒有信號肽，具有功能的酶一般就不能在體內(nèi)形成?？傊?，無論如何，淀粉或者淀粉樣的聚合體的α-1，4-糖苷鍵必須被水解。
酶的性能被認為是在所屬技術(shù)領(lǐng)域里的效能。這是基于實際的酶活性，但是也依賴于其他與這個過程相關(guān)的因素。這些因素包括穩(wěn)定性、底物結(jié)合、與攜底物的物質(zhì)相互作用或與其他成分相互作用，尤其是協(xié)同作用。例如，考察一種酶是否適用于清洗劑也將包括此酶對與其他成分制成的洗滌劑或清洗劑的洗滌或清洗性能貢獻的判斷。利用已知的分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是前面提到的方法，酶能夠被進一步改進并最適于多種技術(shù)應(yīng)用。
依據(jù)1977年4月28日布達佩斯條約微生物保藏的國際認可，下面的微生物保藏在the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(German Collection of Microorganisms and CellCultures GmbH)in Braunschweig(DSMZ)芽孢桿菌A7-7，其保藏號是DSM12368(DSM98-587)。與這種生物材料的特點相關(guān)的重要數(shù)據(jù)，如DSMZ對保藏數(shù)據(jù)所定，列在了下表1中表1.
芽孢桿菌A7-7(DSM12368)的微生物學(xué)特性(如DSMZ 1998年10月9日所確定)
現(xiàn)在，正如我們已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)上述這個特征，由這個菌株產(chǎn)生的淀粉分解酶有使它注定用于很多工業(yè)方法的特性。除此以外，此菌株還有利于影響其培養(yǎng)的特性。
如實施例2中詳細顯示，根據(jù)本發(fā)明的芽孢桿菌A 7-7(DSM12368)菌株的淀粉分解酶具有如下的生化特征作為一種成熟蛋白，它有58kD的表現(xiàn)分子量，由變性SDS聚丙烯凝膠電泳測得，然而一種分子量在59kD左右的蛋白能夠從516個氨基酸的蛋白序列得到(SEQ ID NO.2)，和在除去31個氨基酸的信號肽后，得到55.5kD的蛋白。根據(jù)等電聚焦，成熟蛋白的等電點在6.0。它有淀粉分解的活性。溫育10分鐘pH 10/50℃仍然穩(wěn)定。在60℃下，50％的殘留活性能夠觀察到。這種酶溫育在40℃/pH5-12下10分鐘大部分穩(wěn)定，pH9時，穩(wěn)定性最好。在0.1％SDS存在下，酶溫育在pH 10/50℃下15分鐘顯示98％殘留活性。在外加10HPE/ml蛋白酶并在pH 10/50℃下溫育15分鐘后，酶仍有74％殘留活性。
因此，本發(fā)明提供了一種天然發(fā)生的酶，根據(jù)其與迄今已知酶的序列同源性及其酶活性的強度，它應(yīng)看作α-淀粉酶。原則上，這種酶可被用在需要淀粉分解功能的地方。尤其適于應(yīng)用在堿性pH值和中等溫度下，特別是pH值高于9和/或溫度高于40℃。由于該酶較高的穩(wěn)定性，應(yīng)用范圍被擴大到洗滌劑和蛋白酶。因此，它看上去尤其適合于洗滌劑/清洗劑中。
這種酶的核苷酸序列顯示在序列表中，編號為SEQ ID NO.1。因此，應(yīng)用已知的分子生物學(xué)方法它可以進一步改進。這種酶的氨基酸序列顯示于序列表中，編號為SEQ ID NO.2。
類似的淀粉分解蛋白質(zhì)也是本發(fā)明的實施方案，只有他們的蛋白質(zhì)或DNA序列在SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2中所示序列相似的范疇之內(nèi)，就受到保護。這種相似性范疇包含所有這樣的蛋白質(zhì)它們的氨基酸序列同SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％的同一性。同樣，相似性范疇也包含所有這樣的蛋白質(zhì)它們的核苷酸序列同SEQID NO.1中所示的核苷酸序列具有至少85％、87.5％、90％、92.5％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。這尤其適用于那些涉及第32-516位氨基酸的蛋白質(zhì)的部分范圍。
截至到2000年3月17日，已知最相似的蛋白質(zhì)是從嗜堿芽孢桿菌中提取出來的α-淀粉酶，其在瑞士蛋白數(shù)據(jù)庫保藏號為P 19571(Geneva Bioinformatics(GeneBio)S.A.，Geneva，Switzerland；http//www.genebio.com/sport.html)。在蛋白質(zhì)水平，這個蛋白質(zhì)同本發(fā)明的從芽孢桿菌A7-7(DSM 12368)中提取的淀粉分解酶具有93.4％的序列同源性。通過比較同源性區(qū)域，本發(fā)明的蛋白清楚地表征為α-淀粉酶。圖1中列舉比對了幾種典型相關(guān)的蛋白質(zhì)。
基于這個比對，本發(fā)明的蛋白質(zhì)與用于同源比較的蛋白質(zhì)基本表現(xiàn)出相同的二級和三級結(jié)構(gòu)。他們的結(jié)構(gòu)單元可以從一般容易獲得的數(shù)據(jù)庫中提取出來，比方說從英國劍橋的EMBL歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)數(shù)據(jù)庫，瑞士蛋白庫或GenBank(National Center forBiotechnology Information NCBI，National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA)。比方說在考慮最適反應(yīng)條件或者底物特異性的條件下，如果出現(xiàn)不同的結(jié)構(gòu)，或者如果最終結(jié)果為不同的折疊變體有不同的淀粉分解特性，那么所有這些都包含在本發(fā)明的保護范疇之內(nèi)。這是因為首先，這種折疊結(jié)構(gòu)主要依賴于生產(chǎn)條件，例如說在有或無引導(dǎo)肽的條件下；其次，這些變體最終被證實特別適合用于各種潛在的用途，如淀粉的定量液化，環(huán)式糊精的水解以及用在洗滌劑/清洗劑上。
SEQ ID NO.2所示序列中第32-516位氨基酸所對應(yīng)的部分序列值得特別關(guān)注。這是因為，如同可從氨基酸序列中得出結(jié)論一樣，前31個氨基酸表示信號肽，其在相應(yīng)的微生物生產(chǎn)條件下，這個信號肽可能引發(fā)蛋白質(zhì)從細胞內(nèi)部向周圍介質(zhì)釋放出來。蛋白質(zhì)釋放以后，信號肽就體內(nèi)分解了，以至實際淀粉分解活性是由余下的蛋白質(zhì)部分完成的。
因此，對于實際淀粉分解功能來說，第1-31位的氨基酸可能意義不大，但是對于生產(chǎn)過程特別是對于所需要的折疊很重要。正因為如此，它們不能被排除在本發(fā)明的保護范圍之外。
應(yīng)該指出的是，如果在生產(chǎn)過程中信號肽和/或成熟蛋白質(zhì)的長度上存在菌種之間的差異，有關(guān)SEQ ID NO.2第1-31或者第32-516位置方面的權(quán)利要求同樣適用于對應(yīng)的變體。例如，來自芽孢桿菌A7-7(DSM12368)的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)變要使用位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列前面的多達六個核苷酸。在此可能的開始前存在6個核苷酸ATGACG。這些核苷酸可翻譯為甲硫氨酸-蘇氨酸，這樣信號肽就在N端多了兩個氨基酸，這樣就獲得了與圖1編號2所示的來自芽孢桿菌#707淀粉酶有一定的相似性。信號肽在分裂過程中本身也發(fā)生變化。
在落入上述相似區(qū)域的變體中，尤其優(yōu)先考慮那些對于潛在的應(yīng)用有最優(yōu)化特性的變體。正如開頭所述，這種變體可以通過方法獲得，優(yōu)選是分子生物學(xué)的方法。例如可能缺失本發(fā)明蛋白質(zhì)當(dāng)中的甲硫氨酸、色氨基酸、半胱氨酸和/或酪氨酸殘基，和/或根據(jù)WO94/18314的教導(dǎo)，用不容易氧化的氨基酸殘基替換它們。氧化穩(wěn)定性、pH值活性范圍和/或熱穩(wěn)定性都可以通過這種方法改進。例如，根據(jù)WO99/09183和WO99/23211，通過點突變可進一步進行改進。
根據(jù)本發(fā)明，片段可以理解為任何蛋白質(zhì)或者肽，這些蛋白質(zhì)或者肽小于SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2中對應(yīng)的蛋白質(zhì)，但是同它們在對應(yīng)的部分序列上有足夠的同源。如果這些片段顯示出淀粉分解功能，或者至少有能夠支持水解α-1，4-糖苷鍵的功能，那么它們就會被看成具有淀粉分解活性的片段，并且表示本發(fā)明的實施方案。例如，這適用于那些對底物絡(luò)合或者水解所需的結(jié)構(gòu)單元的形成作出貢獻的片段。這些片段可以是單個結(jié)構(gòu)域或者與結(jié)構(gòu)域不一致的片段。這些片段的獲得相對較為便宜，不再具有出發(fā)分子的一些不好的特性，如可能的活性降低的調(diào)節(jié)機制，或者可發(fā)展成更好的活性范圍。這些蛋白質(zhì)片段也可以通過化學(xué)方法而不是通過生物合成方法取得。例如當(dāng)合成后進行化學(xué)修飾時，化學(xué)合成是有利的。
根據(jù)它們基本的相似性，通過缺失突變所得到的蛋白質(zhì)也可以被轉(zhuǎn)到片段當(dāng)中。這些蛋白質(zhì)主要在生化上對應(yīng)于起始分子或不再具有單個的功能。這一點看起來特別適合于如抑制區(qū)域的缺失中。在最后的分析中，這些缺失被用來產(chǎn)生特異性和擴展蛋白質(zhì)的應(yīng)用范圍。如果淀粉分解功能在廣義上被保持、修飾、特異化或甚至以此途徑首先得到了，那么這些缺失變體和片段也是本發(fā)明的蛋白質(zhì)。這方面唯一的額外要求是上面同源的部分序列依然存在，它們應(yīng)位于上面所提到的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列相似性的范圍之內(nèi)。
例如，按照WO99/57250，有可能提供本發(fā)明蛋白質(zhì)或者其部分，它具有來自其他蛋白質(zhì)的結(jié)合區(qū)，通過肽或非肽連接體與本發(fā)明的蛋白質(zhì)連接，從而使得對底物的水解更為有效。當(dāng)這些構(gòu)建體具有淀粉分解功能，并且構(gòu)建體的那些部分所行使的功能與本發(fā)明的序列足夠的相似時，這些構(gòu)建體就落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。同樣，按照本發(fā)明的淀粉分解蛋白質(zhì)也可跟蛋白酶連接來執(zhí)行雙重功能。
通過從前體蛋白切割N端的氨基酸所得到的蛋白質(zhì)和信號肽也被認為是自然形成的片段或者缺失突變的蛋白質(zhì)。在信號肽酶所識別的某些序列區(qū)域的幫助下，這種分離機制也用來預(yù)先確定重組蛋白質(zhì)的特定切割位點。這樣，本發(fā)明的蛋白質(zhì)就可以在體外激活和/或失活。本發(fā)明的保護范圍也包括所有這些蛋白質(zhì)，只要它落在所要求的保護范圍之內(nèi)并且具有淀粉分解活性。
本發(fā)明的嵌合或雜交蛋白質(zhì)可以這樣理解它們由從各種多肽鏈中自然產(chǎn)生的元件所構(gòu)成。這個過程也稱為改組或融合突變。當(dāng)通過融合所獲得的蛋白質(zhì)具有最廣義上的淀粉分解活性時，那么它們就是本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)。這可以由被源自本發(fā)明蛋白質(zhì)的分子的一部分加以改善或者修飾而得到，也落入所要求的相似性范圍內(nèi)。這種融合的目的可以是例如產(chǎn)生或者修飾淀粉分解功能，或者在本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合部分的幫助下支持水解α-1，4-糖苷鍵的功能。在本發(fā)明的上下文中，我們不關(guān)心這種嵌合蛋白質(zhì)是否是由一個單一的多肽鏈組成，還是由其中可分布各種功能的若干亞單位構(gòu)成。為了實現(xiàn)第二種選擇，例如，有可能將單一的嵌合多肽鏈切割成多個多肽鏈，切割過程或者通過翻譯后的可控制的蛋白水解切割來完成，或者在純化步驟后完成。本發(fā)明也涉及嵌合蛋白，由于它們的結(jié)構(gòu)特征，這些嵌合蛋白質(zhì)在所有氨基酸和/或核苷酸序列上比上文所定義的本發(fā)明相似性范圍具有任選較低的同一性，但是也可將其歸因于至少一個通過融合而引入的區(qū)域中去，并在這個部分如同在整個長度落入上述同源性范圍內(nèi)的淀粉酶具有同樣的功能。
通過插入突變而得到的本發(fā)明蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)的變體，這些變體在整個序列長度上落入SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2指定的保護范圍之內(nèi)，并且通過在各自序列中插入核酸或者蛋白質(zhì)片段而得到。就像采用雜交形成一樣，插入突變的目的是將本發(fā)明的蛋白質(zhì)單個特性同其他蛋白質(zhì)的那些性質(zhì)結(jié)合起來。當(dāng)其區(qū)域在同源性上與SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2具有相應(yīng)的同源性值，并且由于這些區(qū)域蛋白具有最廣義上的淀粉分解功能時，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是通過插入突變得到的蛋白質(zhì)，也可以是嵌合蛋白質(zhì)。
從而，通過倒位突變得到的蛋白質(zhì)以及通過將不同于原始氨基酸序列的分子的不同部分加以重組得到的蛋白質(zhì)都包括在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。這可以被看作是原始蛋白質(zhì)的缺失變體、插入變體或者改組變體。
本發(fā)明的淀粉分解活性的衍生物可以理解為淀粉分解蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)經(jīng)過了修飾，例如，修飾過程可以通過在宿主生物中的加工而與蛋白質(zhì)生物合成相結(jié)合；或者是化學(xué)修飾，例如通過氨基酸側(cè)鏈的轉(zhuǎn)換或者通過共價結(jié)合將另一化合物與蛋白質(zhì)連接。此化合物可以例如由與本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)所組成，例如通過雙功能化合物。這些修飾可以影響，例如，底物的特異性，或者與底物結(jié)合的強度，或者當(dāng)所偶聯(lián)底物是抑制劑時可以暫時阻斷酶活性。這可能適合于例如儲藏。另一實施方案是衍生物，它們通過與大分子載體共價連接而得到，這些載體例如聚乙二醇或多糖。
對于本發(fā)明所述問題的其他解決辦法有淀粉分解蛋白質(zhì)或者衍生物，其與上述蛋白質(zhì)或者衍生物中的一種至少有一個共同的抗原決定簇。
這是因為酶活性的產(chǎn)生不僅由蛋白質(zhì)的純氨基酸序列所決定，也由它的二級結(jié)構(gòu)單元和三維折疊結(jié)構(gòu)所控制。這樣，在一級結(jié)構(gòu)上相互之間明顯不相同的結(jié)構(gòu)域能夠形成空間上基本對應(yīng)的結(jié)構(gòu)，從而具有相同的酶的行為。在二級結(jié)構(gòu)上的共同特征通常被認為是抗血清的相應(yīng)抗原決定簇，或者是純的或單克隆抗體。因而，結(jié)構(gòu)上相似的蛋白質(zhì)或者衍生物能夠通過免疫化學(xué)的交叉反應(yīng)來檢測和分類。
從而，本發(fā)明的保護范圍也包括蛋白質(zhì)或者衍生物，它們具有淀粉分解活性并且能夠通過免疫化學(xué)關(guān)系、而不是通過一級結(jié)構(gòu)的同源性值被歸入上面定義的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或衍生物中。
源于天然物中的本發(fā)明蛋白質(zhì)是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，特別是當(dāng)其來源于如單細胞真菌或者細菌的微生物時。這是因為這些微生物比多細胞微生物或來源于它們的細胞培養(yǎng)物更容易處理。這些代表了特殊實施方案的合適選擇。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或者衍生物首選來源于革蘭氏陽性細菌，因為它們沒有外膜，因此能直接分泌蛋白質(zhì)到周圍介質(zhì)中去。
來源于芽孢桿菌屬的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或者衍生物尤其首選，因為它們公認在工業(yè)過程中具有非常高的生產(chǎn)能力。
在本發(fā)明來自于芽孢桿菌物種的蛋白質(zhì)或者衍生物當(dāng)中，那些來源于嗜堿桿菌(alcaliphilic bacilli)的物種是優(yōu)選的，來源于芽孢桿菌A7-7的尤其優(yōu)選，以及來源于芽孢桿菌A7-7(DSM 12368)的最首選。這是因為本發(fā)明酶的實施方案最初是來源于這一菌株，該酶的相關(guān)序列顯示在序列表中，其酶特性在實施例中有所描述。
出于生產(chǎn)原因，能夠釋放所形成的淀粉分解蛋白質(zhì)進入到周圍介質(zhì)中的菌株是首選的。
有可能的是，盡管自然界的菌株能夠產(chǎn)生本發(fā)明的淀粉分解酶，但是它們在初始確定的條件下僅能很小程度地表達和/或釋放酶到周圍介質(zhì)中。它們?nèi)匀宦淙氡景l(fā)明的保護范圍之內(nèi)，只要可能來用試驗測定合適的環(huán)境條件或者低分子量或者其他因素，在這些因素的影響下，它們能夠被刺激產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)，其生產(chǎn)水平使得經(jīng)濟利用成為可能。象這樣的調(diào)節(jié)機制能目的性地用來進行生物技術(shù)生產(chǎn)，例如用來調(diào)節(jié)其啟動子。
依賴于它的分離、生產(chǎn)或制備，蛋白質(zhì)能夠跟其他物質(zhì)結(jié)合起來，特別是當(dāng)它從蛋白質(zhì)的天然產(chǎn)物中回收之后。然后某些其他物質(zhì)就可以有目的地、甚至獨立地加入到其中，例如來增加它的存儲穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的定義也包含了所有對本發(fā)明必需的實際蛋白質(zhì)的制品。這也與蛋白質(zhì)在某一制品中是否有真正的酶活性無關(guān)，因為有可能需要蛋白質(zhì)在儲藏階段沒有或很少活性，而僅僅在使用時表現(xiàn)它的淀粉分解特性。這取決于，例如，蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)，或可能產(chǎn)生于來源自制品中的一種或多種伴隨物質(zhì)的可逆結(jié)合或另一控制機制。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)能夠用穩(wěn)定劑加以保護，特別是在儲存階段，例如防止其由于物理影響、氧化或者蛋白水解切割而變性、降解或者失活。對于從微生物中獲得的蛋白質(zhì)，抑制蛋白質(zhì)水解更為重要，因為大部分微生物能夠分泌各種蛋白酶作為消化酶進入到周圍介質(zhì)當(dāng)中。這些酶在以后的提純步驟中能夠嚴重破壞所需的蛋白質(zhì)。
一組穩(wěn)定劑是可逆的蛋白酶抑制劑，例如，苯甲脒氫氯化物和亮抑蛋白酶肽、硼砂、硼酸、鹽或其酯、肽醛或者純肽抑制劑，例如卵類粘蛋白或者特異枯草芽孢桿菌蛋白酶抑制劑。其他常見的酶穩(wěn)定劑有氨基醇，如單-、雙-、三-乙醇胺和-丙醇胺，多達C12的脂族羧酸、二羧酸、低級脂肪醇，此外還有多羥基化合物，例如甘油、乙烯二醇、丙二醇或山梨醇。鈣鹽如乙酸鈣、甲酸鈣，鎂鹽，各種聚合體如木質(zhì)素、纖維素醚、聚酰胺或水溶性的乙烯共聚物也可用來對酶制品起穩(wěn)定作用，主要的是防止物理影響或pH值變化。還原劑和抗氧化劑例如亞硫酸鈉或還原糖可提高蛋白的穩(wěn)定性，增加抗氧化分解能力。
本發(fā)明也體現(xiàn)在相應(yīng)的核酸中，假設(shè)該核酸編碼最廣義上的淀粉分解蛋白，并且顯示同SEQ ID NO.1序列足夠的相似性，如上定義，特別體現(xiàn)在一種核酸，該核酸編碼蛋白，所述蛋白對應(yīng)于SEQ ID NO.1中所示氨基酸序列第32-516位氨基酸的部分范圍。
特別優(yōu)選的實施方案是核酸，它們編碼上述本發(fā)明的淀粉分解蛋白質(zhì)之一。這也包括在整體序列長度上并沒有落入SEQ ID NO.1中所定義的相似性范圍之內(nèi)但在個別區(qū)域中確實落入范圍之內(nèi)的變異體。這些包括，例如上面所解釋的通過插入或者缺失突變得到的核苷酸序列、嵌合蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)片段。然而，所謂反義構(gòu)建體，例如通過個別部分區(qū)段，也代表本發(fā)明的實施方案，因為它們可用來調(diào)節(jié)淀粉分解活性。
核酸形成了分子生物學(xué)研究和進一步發(fā)展的起點。例如在Fritsch，Sambrook和Maniatis編的“分子克隆試驗手冊”，Cold Spring HarbourLaboratory Press，New York，1989中描述了一些這樣的方法。在現(xiàn)有技術(shù)中蛋白質(zhì)工程標(biāo)題下的所有基因工程和蛋白質(zhì)生化方法也基于基因，特別是克隆基因。本發(fā)明的蛋白質(zhì)通過這些方法被進一步優(yōu)化用作各種用途，例如，通過點突變或者與來自其他基因的序列相融合。
通過已知分子生物學(xué)方法得到的本發(fā)明蛋白質(zhì)的變異體本身尤其包括那些個別的特定氨基酸交換或個別氨基酸或部分序列的隨機點突變、缺失，同其他片段或者其他酶的融合、插入或者倒置即部分序列的倒置。這些突變或者修飾可代表特殊用途的優(yōu)選實施方案。這樣的誘變能夠有目的地進行，或者通過隨機方法取得。其能夠例如與隨后以活性為目標(biāo)的篩選和對克隆基因的選擇過程結(jié)合使用。通過突變獲得的基因落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)，假識它們以最廣義編碼的淀粉分解蛋白質(zhì)，并且落入上文所定義的相似性范圍之內(nèi)，至少在同源和功能上相關(guān)區(qū)域之內(nèi)。
本發(fā)明所提問題的另一個解決方案以及本發(fā)明的另一實施方案是有機體，這種有機體能夠自然形成本發(fā)明的蛋白質(zhì)或者衍生物，或者包含編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)或者衍生物的核酸。這是因為它們的發(fā)現(xiàn)使得發(fā)明構(gòu)思付諸實施。這類有機體可以通過一般已知的技術(shù)獲得，例如可以通過從自然環(huán)境中分離菌株，或通過篩選基因庫。SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列可用作，例如一個篩選探針，或者作為構(gòu)建相應(yīng)的PCR引物的模板。相類似，短鏈或者具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的完整的肽可以用來形成相應(yīng)的抗血清，用來鑒定相應(yīng)的生物或者從它們中釋放出的蛋白質(zhì)。
根據(jù)前述的觀察，首選的是微生物，優(yōu)選細菌，尤其是革蘭氏陽性菌包括那些芽孢桿菌屬的細菌，更尤其芽孢桿菌A7-7，以及最尤其芽孢桿菌A7-7(DSM12368)，這是由于它們的可培養(yǎng)性。
本發(fā)明的另一實施方案是載體，它包含第二個實施方案中的一個核酸區(qū)域。
這是因為，為了使用核酸，將DNA合適地克隆到載體中。這些載體包括例如來自細菌質(zhì)粒、來自病毒或細菌噬菌體的那些載體，或帶有不同來源元件的主要合成的載體或質(zhì)粒。在其他基因元件存在下，載體能夠作為穩(wěn)定單元經(jīng)過若干代存在于各自宿主細胞中。在本發(fā)明的上下文中，它們是否作為染色體外的獨立單元，還是整合入染色體，并不重要。現(xiàn)有技術(shù)中已知的許多系統(tǒng)到底選擇哪一種將取決于個案情況。這方面的關(guān)鍵因素包括例如，所能制成的拷貝數(shù)、可得到的選擇系統(tǒng)，最主要包括抗生素抗性，以及能夠容納載體的宿主細胞的可培養(yǎng)性。
載體成為特定基因或者相關(guān)蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)和生化研究的起點，也為依照本發(fā)明所進行的進一步研究以及最終本發(fā)明蛋白質(zhì)的擴增和生產(chǎn)提供了起點。它們代表了本發(fā)明的實施方案，只要根據(jù)本發(fā)明核酸區(qū)域的序列位于前文詳細描述的同源性范圍之內(nèi)。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案是克隆載體。除了儲藏、生物擴增和篩選目的基因以外，克隆載體適于特定基因的特征，例如通過繪制限制性酶切圖或者測序?？寺≥d體也是本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，因為它們代表了要求保護的DNA的可轉(zhuǎn)運和可儲存形式。它們也是分子生物技術(shù)優(yōu)選的起點，這些分子生物技術(shù)不局限于細胞，例如聚合酶鏈式反應(yīng)。
表達載體具有部分序列，其能夠在最適于生產(chǎn)蛋白的宿主生物中復(fù)制以及能夠表達在宿主生物體中存在的基因。優(yōu)選的實施方案是表達載體，它們自己攜帶對表達必須的基因元件。表達例如受到啟動子的影響，所述啟動子調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。這樣，表達可以通過原先位于基因前的天然啟動子來產(chǎn)生，也可以通過與表達載體上提供的宿主細胞的啟動子以及通過修飾啟動子或另一生物的完全不同的啟動子在遺傳工程融合后產(chǎn)生。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案是表達載體，其能夠通過培養(yǎng)條件的改變或者添加一定的化合物，如細胞密度或者特殊因子來調(diào)節(jié)。表達載體使得相關(guān)蛋白質(zhì)能夠被異源產(chǎn)生，也就是說在不是它自然獲得的生物中產(chǎn)生。在通過合適的載體自然表達該基因的宿主生物中產(chǎn)生的同源蛋白產(chǎn)物也處于本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。這種優(yōu)勢在于如它們會自然發(fā)生一樣，對所形成的蛋白質(zhì)也進行與翻譯有關(guān)的自然修飾反應(yīng)。
本發(fā)明的其他實施方案可以是無細胞的表達酶，其中蛋白質(zhì)生物合成體外完成。象這樣的表達系統(tǒng)在現(xiàn)有技術(shù)中也存在。
本發(fā)明的另一個實施方案是細胞，其包含上面所定義的載體的一種，更尤其是克隆或表達載體。這是因為例如在對于誘變、測序或者載體儲存所必需的分子生物學(xué)操作中，這些載體能夠被轉(zhuǎn)染入相應(yīng)的細胞。依據(jù)這種方法，例如革蘭氏陽性細菌，但具體是革蘭氏陰性細菌，能適用于此目的。
另一實施方案是宿主細胞，其表達第一個實施方案的蛋白質(zhì)或衍生物，或者優(yōu)選使用以上定義類型的表達載體，能夠被刺激來表達該蛋白質(zhì)或衍生物。
這是因為，根據(jù)本發(fā)明的淀粉分解酶的體內(nèi)合成需要將相關(guān)的基因轉(zhuǎn)移入宿主細胞。一般來說，合適的宿主細胞包括所有生物，如原核生物、真核細胞或藍藻等。優(yōu)選的宿主細胞是那些容易進行遺傳操作的細胞，例如就其表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及其穩(wěn)定建立而言，如單細胞的真菌或者細菌。此外，優(yōu)選的宿主細胞的區(qū)別在于容易進行微生物和生物技術(shù)操作。這包括例如易培養(yǎng)、高生長率、對發(fā)酵培養(yǎng)基的要求最低、產(chǎn)量高以及對外源蛋白質(zhì)的分泌速率。特定個例的最佳表達系統(tǒng)往往需要從現(xiàn)有技術(shù)所提供的大量不同的系統(tǒng)中通過試驗確定。通過這種方法，本發(fā)明的每個蛋白質(zhì)可以從大量宿主生物中得到。
優(yōu)先的實施方案是宿主細胞，它們的活性可以通過基因調(diào)節(jié)元件進行調(diào)節(jié)，這些元件例如由表達載體提供，但也可一開始就存在于這些細胞中。我們正討論的宿主細胞能夠在受到刺激的情況下表達，例如通過受控添加化學(xué)物質(zhì)作為激活劑，通過改變培養(yǎng)條件或者達到一定的細胞密度。這提供特別經(jīng)濟的目的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的試驗原理的變體是表達系統(tǒng)，其中其他基因，例如那些在其它載體上存在的基因，能夠影響本發(fā)明的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。它們可以修飾基因產(chǎn)物，或者那些與本發(fā)明的蛋白質(zhì)一起有待純化的產(chǎn)物，例如以便影響它的淀粉分解功能。這些可以是例如其它蛋白質(zhì)或酶、抑制劑或影響同各種底物的相互作用的元件。
優(yōu)選的宿主細胞是原核細胞或者細菌細胞。同真核細胞相比，細菌一般具有更短的換代時間和不太嚴格的培養(yǎng)條件。較便宜的生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)的方法就這樣建立起來了。
尤其優(yōu)先這樣的宿主細胞，尤其是細菌，它們能將所形成的蛋白或衍生物分泌到周圍介質(zhì)中，從而本發(fā)明的表達蛋白能夠直接被純化。
本發(fā)明的一個實施方案使用芽孢桿菌A7-7(DSM12368)本身用于同源性表達本發(fā)明的蛋白質(zhì)。做到這一點可以例如通過引入的載體，該載體將已經(jīng)內(nèi)源性存在的本發(fā)明基因或其修飾成分如以多拷貝數(shù)的形式引入到這些細胞中。如果合成以后蛋白質(zhì)受到修飾，這些修飾可由討論中的細胞本身適當(dāng)進行，則尤其有利。
相反，可以優(yōu)選異源表達。革蘭氏陽性細菌如放線菌類或芽孢桿菌沒有外膜，從而它們可以直接將分泌的蛋白質(zhì)釋放到周圍介質(zhì)中。因此，對于異源表達，優(yōu)選的細菌包括芽孢桿菌屬，特別是地衣芽孢桿菌、液化芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或者嗜堿芽孢桿菌。
革蘭氏陰性菌也可以用于異源表達。這種情況下，大量的蛋白質(zhì)被分泌出來進入細胞外間隙，也就是進入細胞周圍兩個細胞膜的間隔區(qū)。這對特殊的應(yīng)用是有利的。革蘭氏陰性菌包括例如克雷伯氏(Klebsiella)屬或埃希氏(Escherichia)屬，優(yōu)選大腸桿菌(E.coli)以及更優(yōu)選E.coli JM109、E.coli DH100B或E.coli DH12S。
真核細胞也適合生產(chǎn)本發(fā)明的淀粉分解蛋白質(zhì)。例子包括酶母如糖酵母(Saccharomyces)或克魯伯氏酵母(Kluyveromyces)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與其合成結(jié)合置于這些系統(tǒng)所允許的修飾時，這一點特別有利。這些修飾包括例如，低分子量化合物的結(jié)合，例如膜錨分子或寡糖。
上述討論的所有元件都能夠結(jié)合到本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法中。對于本發(fā)明的每一個蛋白質(zhì)，有許多可能的方法步驟的組合。它們都是本發(fā)明基于的理論的具體實施方案，即在相關(guān)基因信息的協(xié)助下，定量生產(chǎn)某種蛋白類型的代表，這種類型通過淀粉分解功能所限定，同時也通過同序列表中所示的序列高的同源性得到限定。針對每一個實際個案，最優(yōu)方法還得通過試驗確定。
原則上，采用以下步驟本發(fā)明的核酸也就是那些落入上述限定的與SEQ ID.1的相似性范圍內(nèi)的核酸，可以DNA的形式適當(dāng)?shù)剡B接到表達載體上。這可以轉(zhuǎn)化入宿主細胞，例如轉(zhuǎn)化到容易培養(yǎng)的細菌菌株的細胞中，它釋放出蛋白質(zhì)至周圍的營養(yǎng)介質(zhì)中，這些蛋白質(zhì)的基因受到對應(yīng)基因元件的控制；調(diào)節(jié)元件可以例如通過表達載體而得到。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可通過若干純化步驟例如沉淀或色譜從周圍介質(zhì)中純化出來。專家可把實驗室中已實驗性最優(yōu)化的系統(tǒng)放大到工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。
對于本發(fā)明蛋白質(zhì)，最重要的工業(yè)用途如下。淀粉分解酶的許多成熟工業(yè)用途在手冊中有所描述，例如H.Uhlig的書名為“工業(yè)酶及其應(yīng)用(Industrial enzymes and their applications)”，Wiley，紐約，1998。下面僅列出一些理論上可行的應(yīng)用，絕不完整。如果本發(fā)明的蛋白質(zhì)適用于這里沒有專門要求的其他應(yīng)用方式，那么這些應(yīng)用也應(yīng)當(dāng)包括在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
淀粉分解酶的重要應(yīng)用是作為清洗織物或硬表面的洗滌劑/清洗劑的活性成分。在這些應(yīng)用中，淀粉分解活性用于將含碳水化合物，更特別的是淀粉樣的污漬加以水解，和/或?qū)⑺鼈儚牡孜锷铣?。為此目的，在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)或甚至在洗滌劑/清洗劑中，酶可獨自使用。這些組合物的區(qū)別在于下列事實，淀粉分解酶和其他成分可以協(xié)同方式將污漬清除，例如，淀粉分解蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物被組合物中的其他成分所溶解，例如表面活性劑。本發(fā)明的蛋白質(zhì)既可用于研究或工業(yè)用途的組合物，又可用于家用消費產(chǎn)品。
相應(yīng)地，本發(fā)明的另一個實施方案是任何洗滌劑/清洗劑，其特征在于它們包含本發(fā)明的淀粉分解蛋白質(zhì)或其衍生物。
這意味著，所有可能類型的洗滌組合物，既包括濃縮物也包括不用稀釋的組合物；商業(yè)規(guī)模的使用，用于洗衣機或用于手洗。這些組合物包括例如用于織物、地毯或天然纖維的洗滌劑，對此術(shù)語洗滌劑用于本說明書中。它們也包括例如用于洗碗機或手工洗碗的洗滌劑或用于硬表面，例如金屬、玻璃器皿、陶瓷、瓦片、寶石、涂漆面、塑料、木制品或皮革的清洗劑。對于這些來說，術(shù)語清洗劑用于本說明書中。任何類型的清洗組合物都代表本發(fā)明的一個實施方案，只要其中包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的實施方案包含現(xiàn)有技術(shù)中確定的本發(fā)明組合物的所有提供形式，和/或本發(fā)明組合物的所有適當(dāng)?shù)奶峁┬问?。這些包括例如固體、粉末、液體、膠狀或膏狀組合物，任選由若干相組成，擠壓式或非擠壓式。提供形式還包括包裝在大容器內(nèi)和部分中的壓出膠、顆粒、片劑及小袋。
除了對本發(fā)明必需的酶之外，本發(fā)明的組合物任選包含其他成分，例如表面活性劑，如非離子、負離子和/或兩性表面活性劑和/或漂白劑和/或助洗劑以及任選其他典型成分。
優(yōu)選的非離子表面活性劑為烷氧基化的，有利的是乙氧基化的，特別優(yōu)選含有8-18個碳原子以及平均每mol醇1-12mol環(huán)氧乙烷(EO)的伯醇，其中醇殘基可以是直鏈的，或優(yōu)選2-甲基支鏈的，或通常以羰基合成醇殘基存在的混合物形式可含有直鏈和甲基支鏈的殘基。然而，尤其優(yōu)選的是包含具有12-18碳原子、天然來源的醇的直鏈殘基的脂肪醇乙氧基化物，例如椰子油醇、棕櫚油醇、牛油醇或油醇以及平均每mol醇2-8EO。優(yōu)選的乙氧基化醇包括，例如含有3或4EO的C12-14醇、含有7EO的C9-11醇、含有3EO、5EO、7EO或8EO的C13-15醇、含有3EO、5EO或7EO的C12-18醇及其混合物，例如含有3EO的C12-14醇和含有5EO的C12-18醇的混合物。上述乙氧化的程度是統(tǒng)計平均值，對于特殊產(chǎn)品來說，這個平均值可能是整數(shù)或分數(shù)。優(yōu)選的醇乙氧基化物具有窄的同系物分布(窄范圍乙氧基化物，NRE)。除了這些非離子表面活性劑之外，也可以使用高于12EO的脂肪醇。這類脂肪醇的例子是包含14EO、25EO、30EO或40EO的牛油醇。
另一類或作為非離子表面活性劑單用或與其他非離子表面活性劑合用的優(yōu)選非離子表面活性劑是烷氧基化的、優(yōu)選乙氧基化的、或乙氧基化和丙氧基化的優(yōu)選包含1-4個碳原子的烷基鏈的脂肪酸烷酯，特別是脂肪酸甲酯。
另一類可用的具有優(yōu)勢的非離子表面活性劑是烷基多葡糖苷(APG)。合適的烷基多葡糖苷對應(yīng)于通式RO(G)z，其中R是直鏈或支鏈的，特別是2-甲基支鏈的、飽和或不飽和的、含有8-22個以及優(yōu)選12-18個碳原子的脂族自由基，G是含有5或6個碳原子的糖單元，優(yōu)選是葡萄糖。糖苷化的程度z介于1.0-4.0之間，優(yōu)選在1.0-2.0之間，以及更優(yōu)選在1.1-1.4之間。優(yōu)選使用直鏈烷基多葡糖苷，即烷基多葡糖苷，其中多糖基部分是葡萄糖單元以及烷基部分是正-烷基基團。
氧化胺類的非離子表面活性劑，例如N-椰油烷基-N，N-二甲胺氧化物以及N-牛油烷基-N，N-二羥乙胺氧化物，和脂肪酸鏈烷醇酰胺類也適用。這些非離子表面活性劑的所用量優(yōu)選不多于，尤其不多于所用的乙氧基脂肪醇量的一半。
其它合適的表面活性劑為多羥基脂肪酸酰胺，對應(yīng)于公式(II) 其中RCO是包含6-22個碳原子的脂族?；琑1是氫、含有1-4個碳原子的烷基或羥烷基基團，以及[Z]是直鏈或支鏈的、包含3-10個碳原子和3-10個羥基的多羥烷基。多羥基脂肪酸酰胺為已知物質(zhì)，其通?？赏ㄟ^將還原糖用氨、烷基胺或鏈烷醇胺加以還原性胺化，繼而用脂肪酸、脂肪酸烷酯或脂肪酸氯化物加以酰化而獲得。
這組多羥基脂肪酸酰胺還包括對應(yīng)于式(III)的化合物 其中R是含有7-12個碳原子的直鏈或支鏈烷基或者鏈烯基，R1是含有2-8個碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)化的烷基基團或者芳香基團，以及R2是含有1-8個碳原子的直鏈、支鏈、環(huán)化的烷基基團或芳香基團或者是烷氧基基團，但優(yōu)選C1-4的烷基或者苯基基團，以及[Z]是直鏈的多羥基烷基基團，其中烷基鏈至少被2個羥基取代，或者被該基團的烷氧基化，優(yōu)選乙氧基化或丙氧基化的衍生物取代。優(yōu)選由還原糖例如葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、甘露糖或木糖的還原性胺化而獲得。然后通過例如以醇鹽作為催化劑與脂肪酸甲酯反應(yīng)，可將N-烷氧基或N-芳氧基取代的化合物轉(zhuǎn)化成所需的多羥基脂肪酸酰胺。
合適的陰離子表面活性劑是例如那些磺酸酯和硫酸酯類。合適的磺酸酯類表面活性劑優(yōu)選是C9-13的烷基苯磺酸酯、烯烴磺酸酯，即烯烴和羥烷基磺酸酯的混合物，以及例如通過氣態(tài)三氧化硫的磺酸化接著堿化或酸化磺酸化產(chǎn)物而從帶有中間或末端雙鍵的C12-18單烯烴中獲得的二磺酸酯。其它合適的磺酸酯類表面活性劑是例如通過氯磺化作用或磺化氧化作用接著水解或中和而從C12-18烷烴中獲得的鏈烷磺酸酯。α-磺基脂肪酸的酯(磺酸酯)，例如氫化椰子油、棕櫚核油或牛油脂肪酸的α-磺酸化甲酯也適用。
其它合適的陰離子表面活性劑有磺基化脂肪酸甘油酯。本發(fā)明上下文中的脂肪酸甘油酯指單酯、二酯和三酯及其混合物，其由單甘油與1-3mol的脂肪酸的酯化作用或者在甘油三酯和0.3-2mol的甘油發(fā)生酯交換反應(yīng)進行生產(chǎn)而得來的。優(yōu)選的磺基化脂肪酸甘油酯是含6-22個碳原子的飽和脂肪酸的磺化產(chǎn)物，例如己酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸或山萮酸。
優(yōu)選的烷(鏈烯)基硫酸鹽是堿金屬鹽，以及具體是C12-18的脂肪醇的硫酸半酯的鈉鹽，例如椰油脂肪醇、牛油脂肪醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鯨蠟醇或硬脂醇或C10-20的羰基合成醇以及具有同樣鏈長仲醇的對應(yīng)的半酯。其它優(yōu)選的烷(鏈烯)基硫酸鹽是那些具有上述鏈長、含有基于石化產(chǎn)品的合成的、直鏈烷基鏈，并且它們的降解行為類似于基于油化品原料的對應(yīng)的化合物。C12-16烷基硫酸酯、C12-15烷基硫酸酯以及C14-15烷基硫酸酯從洗滌技術(shù)的觀點出發(fā)而優(yōu)選。其它合適的陰離子表面活性劑是2，3-烷基硫酸酯。
用1-6mol的環(huán)氧乙烷乙氧基化的直鏈或者支鏈C7-21醇例如含有平均3.5mol環(huán)氧乙烷(EO)的2-甲基支鏈的C9-11醇或者是含有1-4EO的C12-18脂肪醇的硫酸單酯也同樣適用。鑒于他們高的發(fā)泡能力，他們僅以相對小的量使用，例如按重量計在清洗劑中的量為1％-5％。
其它合適的陰離子表面活性劑是烷磺基琥珀酸的鹽，其也已知是磺基琥珀酸鹽或磺基琥珀酸酯，以及表示磺基琥珀酸與醇，優(yōu)選脂肪醇，以及特別是乙氧基化的脂肪醇而形成的單酯或/或二酯。優(yōu)選的磺基琥珀酸酯含有C8-18脂肪醇殘基或其混合物。特別優(yōu)選的磺基琥珀酸酯含有衍生自乙氧基化的脂肪醇的脂肪醇部分，其在分離中考慮時，代表非離子的表面活性劑(描述參見下文)。在這些磺基琥珀酸鹽中，那些衍生自窄范圍乙氧基化的脂肪醇的脂肪醇部分尤其優(yōu)選。在烷(鏈烯)基鏈中優(yōu)選含有8-18個碳原子的烷(鏈烯)基琥珀酸或其鹽也同樣適用。
其它合適的陰離子表面活性劑尤其是肥皂。合適的肥皂是飽和脂肪酸肥皂，如月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、氫化芥子酸和山萮酸的鹽，以及尤其衍生自天然脂肪酸如椰油、棕櫚核油或牛油脂肪酸的肥皂混合物。
陰離子表面活性劑包括肥皂可以鈉、鉀或銨鹽及作為有機堿如單-、二-或三乙醇胺的可溶性鹽的形式存在。陰離子表面活性劑優(yōu)選以鈉或鉀鹽的形式存在，更優(yōu)選的是鈉鹽形式。
表面活性劑在本發(fā)明的洗滌劑中存在的總量按重量計優(yōu)選5％-50％，特別是8％-30％，含量依據(jù)最終洗滌劑。
依據(jù)本發(fā)明，可存在漂白劑。在那些能在水中產(chǎn)生H2O2而充當(dāng)漂白劑的化合物中，過碳酸鈉，過硼酸鈉鹽四水合物和過硼酸鈉一水合物是特別的重要。其它有用的漂白劑有例如過氧焦磷酸鹽、檸檬酸的過水合物和產(chǎn)生H2O2的過酸鹽或過酸，如過硫酸鹽或過硫酸。也可使用脲過氧水合物過尿素，其化學(xué)式為H2N-CO-NH2·H2O2。如果需要，組合物中也可含有有機類的漂白劑，特別是用于清洗硬表面，例如在洗碗機中，雖然原則上有機漂白劑也可用于洗衣劑。典型的有機漂白劑是二酰基過氧化物，例如二苯甲?；^氧化物。其它典型的有機漂白劑是過氧酸，其中烷基過氧酸和芳基過氧酸作為例子特別提及。優(yōu)選的代表是過氧苯甲酸及其環(huán)取代的衍生物，例如烷基過氧苯甲酸，還有過氧-α-萘甲酸和單過鄰苯二甲酸鎂鹽，脂族或取代的脂族過氧酸，例如過氧月桂酸、過氧硬脂酸、ε-苯二(甲)酰亞氨基過氧己酸(PAP)、o-羧基苯甲酰氨基過氧己酸、正壬烯氨基過酸性脂肪酸和正壬烯氨基過琥珀酸鹽，以及脂族和芳脂族的過氧二羧酸，例如1，12-二過氧羧酸、1，9-二過氧壬二酸、二過氧癸二酸、二過氧巴西基酸、二過氧苯二甲酸、2-癸基二過氧丁烷-1，4-二酸、N，N-對苯二甲酰-二(6-氨基過氧己酸)。
漂白劑的含量按重量計可以從1-40％，以及在具體的實施方案中，從10-20％，過硼酸一水合物或者過碳酸鹽有利使用。淀粉酶與過碳酸鹽或者淀粉酶與過羧酸的協(xié)同作用公開在WO99/63036和WO99/63037中。
如果洗滌溫度等于或者低于60℃，以及特別是對衣物進行預(yù)處理，為了提高漂白效果，組合物中可含有漂白活化劑。合適的漂白活化劑是形成脂族過氧羧酸的化合物，所述脂族過氧羧酸優(yōu)選含有1-10個碳原子，以及更優(yōu)選含有2-4個碳原子和/或在過水解條件下任選取代的過苯甲酸。攜帶具有上述碳原子數(shù)的O-和/或N-?；?或任選取代的苯甲?；奈镔|(zhì)是適用的。優(yōu)選的漂白活化劑是聚?；耐閾味罚貏e是四乙?；蚁┒?TAED)、?；娜貉苌?，特別是1，5-二乙酰基-2，4-二氧代六氫-1，3，5-三嗪(DADHT)、?；母孰?，特別是1，3，4，6-四乙酰基甘脲(TAGU)、N-酰基亞胺，特別是正壬?；牾啺?NOSI)、酰化的苯酚磺酸鹽，特別是正壬?；蛘呤钱惾甚；u苯磺酸鹽(正-或異-NOBS)、?；u羧酸，例如三乙基-O-乙?；鶛幟仕猁}(TEOC)、羧酸酐，特別是鄰苯二甲酸酐、靛紅酸酐和/或琥珀酸酐、羧酸酰胺，例如N-甲基二乙酰胺、乙交酯、?；嘣?，特別是三醋精、乙二醇二乙酸酯、異丙烯基乙酸酯、2，5-雙乙酸基-2，5-二氫呋喃和烯醇酯，它們從德國專利申請DE196 16 693和DE196 16 767中得知，乙酰化的山梨醇和甘露醇及其混合物(SORMAN)，它們在歐洲專利申請EP0 525 239中描述，?；茄苌铮貏e是五乙?；咸烟?PAG)、五乙?；?、四乙酰基木糖和八乙?；樘?，以及乙?；娜芜xN-烷基化葡糖胺和葡糖酸內(nèi)酯、三唑和三唑衍生物和/或粒狀的己內(nèi)酰胺和/或己內(nèi)酰胺衍生物，優(yōu)選的是N-乙酰化內(nèi)酰胺，例如N-苯甲酰己內(nèi)酰胺和N-乙酰己內(nèi)酰胺，這些是從國際專利申請WO-A-94/27970、WO-A-94/28102、WO-A-94/28103、WO-A-95/00626、WO-A-95/14759和WO-A-95/17498中得來。從德國專利申請DE-A-196 16 769中得知的取代的親水性?；铱s醛和在德國專利申請DE-A-196 16 770以及國際專利申請WO-A-95/14075中描述的酰基內(nèi)酰胺也優(yōu)選采用。與從德國專利申請DE-A-44 43 177中得知的常規(guī)漂白活化劑組合也可采用。腈衍生物，例如氰基吡啶、四腈(nitrile quats)，例如N-烷基銨乙腈，和/或氨腈衍生物也可使用。優(yōu)選的漂白活化劑為4-(辛酰氧基)-苯磺酸鈉、正壬?；虍惾甚Ｑ趸交撬狨?正或異-NOBS)、十一酰氧基苯磺酸酯(UDOBS)、十二酰氧基苯磺酸鈉(DOBS)、十一酰氧基苯甲酸(DOBA，OBC10)和/或十二酰氧基苯磺酸酯(OBS12)以及N-甲基嗎啉鎓乙腈(MMA)。這類漂白活化劑常用量基于組合物整體按重量計為0.01-20％，優(yōu)選0.1％-15％，以及更優(yōu)選1％-10％。
除了或代替上述的常規(guī)漂白活化劑以外，所謂的漂白催化劑也可摻入。漂白催化劑是促進漂白的過渡金屬鹽或者是過渡金屬復(fù)合體如錳、鐵、鈷、釕或者鉬-salen的復(fù)合體或者羰基復(fù)合體。具有含氮的三角配體的錳、鐵、鈷、釕、鉬、鈦、釩和銅的復(fù)合體，以及鈷、鐵、銅、釕-氨合物的復(fù)合體也可以用做漂白催化劑，優(yōu)選使用在DE197 09284A1中描述的化合物。依照WO99/63038，乙腈的衍生物以及依照WO99/63041，漂白活化的過渡金屬化合物與淀粉酶組合后也能發(fā)生漂白活化的效果。
本發(fā)明的組合物通常含有一種或多種助洗劑(builder)，特別是沸石、硅酸鹽、碳酸鹽、有機共助洗劑以及磷酸鹽，假使根據(jù)生態(tài)環(huán)境對使用這些磷酸鹽沒有反對意見的話。磷在洗碗機洗滌劑中是尤其優(yōu)選的助洗劑。
合適的晶體層狀硅酸鈉對應(yīng)于通式NaMSixO2x+1·yH2O，其中M是鈉或者氫，x是1.6-4之間的數(shù)，以及y是0-20之間的數(shù)，x值優(yōu)選為2、3或4。如這些的晶體層狀硅酸鹽記載在如歐洲專利申請EP-A-0 164 514中。對應(yīng)于上述通式的優(yōu)選的晶體層硅酸鹽是其中M為鈉、x為2或3的那些。β-和δ-二硅酸鈉Na2Si2O5·yH2O均特別優(yōu)選。這些化合物可從市場上購得，如SKS(Clariant)。因此SKS-6主要是δ-二硅酸鈉，其化學(xué)式為Na2Si2O5·y H2O，而SKS-7主要是β-二硅酸鈉。通過與酸(例如檸檬酸或碳酸)反應(yīng)，δ-二硅酸鈉生成kanemite NaHSi2O5·H2O，其以SKS-9和SKS-10(Clariant)在市場上銷售。對這些層狀硅酸鹽進行化學(xué)修飾也有優(yōu)勢。例如，層狀硅酸鹽的堿度可受到適度的影響。與δ-二硅酸鈉相比，摻雜磷酸或者碳酸的層狀硅酸鹽已經(jīng)修飾了晶體形態(tài)，他們?nèi)芙飧於绎@示出與δ-二硅酸鈉相關(guān)的鈣結(jié)合能力增加。層狀硅酸鹽具有一般的經(jīng)驗式xNa2O·yH2O·zP2O5，其中x與y的比例對應(yīng)于0.35-0.6，x和z的比例對應(yīng)于1.75-1200，以及y和z的比例對應(yīng)于4-2,800，它們在專利申請DE19601063中有記載。層狀硅酸鹽的溶解度還可通過利用特別精細顆粒的層狀硅酸鹽來提高。晶體層狀硅酸鹽和其他成分的化合物也可采用。尤其引人關(guān)注的是與纖維素衍生物組成的化合物，其在崩解效果上具有優(yōu)勢，并尤其用于洗滌劑片劑中，以及與聚羧酸如檸檬酸或聚體聚羧酸組成的化合物，例如丙烯酸的共聚體。
其他有用的助洗劑是無定形硅酸鈉鹽，具有模量(Na2O∶SiO2比率)為1∶2-1∶3.3，優(yōu)選為1∶2-1∶2.8，以及更優(yōu)選是1∶2-1∶2.6，其可以延遲解并表現(xiàn)多重洗滌循環(huán)特性。與常規(guī)的無定形硅酸鈉相關(guān)的溶解推遲可由多種方法獲得，例如表面處理、混合/壓實或通過過干燥法。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“無定形”同樣可理解為包括“X-射線無定形”。換一種說法，硅酸鹽并不產(chǎn)生任何強烈的X-射線反射，這在X-射線衍射實驗中是晶體物質(zhì)的特征，但最多有一個或多個具有幾度衍射角寬的散射X-輻射的最大值。然而，在電子衍射實驗中，當(dāng)硅酸鹽粒子產(chǎn)生彎曲或者甚至尖銳的衍射最大值時，甚至可獲得特別好助洗劑特性。這個可解釋表示這些產(chǎn)品具有微晶區(qū)域，大小介于10至數(shù)百nm，優(yōu)選上限為50nm以及更優(yōu)選上限達20nm。尤其優(yōu)選壓實的無定型硅酸鹽、混合的無定型硅酸鹽以及干燥的X-射線-無定形硅酸鹽。
根據(jù)本發(fā)明所用的精細晶體、含有結(jié)合水的合成沸石優(yōu)選是沸石A和/或沸石P。沸石MAP(Crosfield)是尤其優(yōu)選的P-型沸石。然而，沸石X和A、X和/或P的混合物也可適用。依照本發(fā)明，優(yōu)選的是使用例如，商業(yè)上可得到的沸石X和沸石A的共晶體化物(按重量計約80％的沸石X)，其由CONDEA Augusta S.p.A.以VEGOBOND AX名稱上市，并可由下列公式描述nNa2O·(1-n)K2O·Al2O3·(2-2.5)SiO2·(3.5-5.5)H2O。
適當(dāng)?shù)姆惺骄Ｗ映叽缧∮?0μm(體積分布，正如由CoulterCounter方法測量)，并按重量計優(yōu)選含有18-22％，以及更優(yōu)選的20-22％的結(jié)合水。
眾所周知的磷酸鹽當(dāng)然也可用作助洗劑，倘若它們的應(yīng)用對生態(tài)環(huán)境不應(yīng)避免。在大量市場上可得到的磷酸鹽中，堿金屬磷酸鹽在洗滌劑工業(yè)中最為重要，五鈉三磷酸和五鉀三磷酸(鈉和鉀的三磷酸鹽)尤其優(yōu)選。
“堿金屬磷酸鹽”是各種磷酸的堿金屬(特別是鈉和鉀)鹽的集合術(shù)語，包括偏磷酸(HPO3)n和正磷酸(H3PO4)以及更高分子量的代表。磷酸鹽組合各種好處他們充當(dāng)堿度來源，阻止石灰沉積在機器零件上以及在織物上石灰結(jié)殼，此外，有助于清潔效果。
磷酸二氫鈉(NaH2PO4)以二水化合物(密度1.91gcm-3，熔點60°)和一水化合物(密度2.04gcm-3)形式存在。這兩種鹽都是白色易溶于水的粉末，加熱后喪失結(jié)晶水，并在200℃下轉(zhuǎn)化為弱的酸性二磷酸鹽(二磷酸氫二鈉，Na2H2P2O7)，以及在更高溫度時轉(zhuǎn)化為三偏磷酸鈉(Na3P3O9)和長鏈高分子量偏磷酸鈉(Maddrell鹽)(參見下文)。NaH2PO4顯示酸性反應(yīng)。用氫氧化鈉調(diào)整磷酸到pH值4.5，然后噴霧干燥所得“漿”就可形成NaH2PO4。磷酸二氫鉀(初級或者一元磷酸鉀、磷酸氫鉀、KDP)KH2PO4是白色鹽，其密度為2.33gcm-3，熔點253°(分解形成多磷酸鉀(KPO3)x)，并且易溶于水。
硫酸氫二鈉(次磷酸鈉)Na2HPO4是無色、易溶于水的晶體鹽。以無水、帶2mol水(密度2.066gcm-3，95°時失水)、帶7mol水(密度1.68gcm-3，熔點48°時失去5mol水)以及12mol水(密度1.52gcm-3，熔點35°失去5mol水)的形式存在，在100°時變成無水，以次強度加熱，就會轉(zhuǎn)變成二磷酸鹽Na4P2O7。以酚酞作指示劑，用蘇打水中和磷酸就能制備磷酸氫二鈉。磷酸氫二鉀(次級或者二元磷酸鉀)K2HPO4是無定型的白色鹽、易溶于水。
磷酸三鈉，叔磷酸鈉，Na3PO4，由無色晶體組成，密度1.62gcm-3，十二水合物的熔點73-76℃(分解)，十水合物的熔點為100℃(對應(yīng)于19-20％P2O5)，無水形式的密度為2.536gcm-3(對應(yīng)于39-40％P2O5)。通過堿性反應(yīng)磷酸三鈉易溶于水，其制備方法是通過蒸發(fā)濃縮恰好1mol磷酸氫二鈉和1mol氫氧化鈉的溶液。磷酸三鉀(三級或者三元磷酸鉀)K3PO4是白色易潮解的顆粒粉末，密度2.56gcm-3，熔點1340°，通過堿性反應(yīng)易溶于水。例如如果托馬斯(Thomas)礦渣與煤和硫酸鉀一起加熱，就形成磷酸三鉀。盡管價格更高，但由于它們更易溶，所以在洗滌劑工業(yè)中，高效磷酸鉀通常比相應(yīng)的鈉化合物更受歡迎。
二磷酸四鈉(焦磷酸鈉)Na4P2O7以無水形式(密度2.534gcm-3，熔點988°，也有人認為是880°)和十水合物的形式存在(密度1.815-1.836gcm-3，熔點94°時失水)。這兩個物質(zhì)都是無色晶體，通過堿性反應(yīng)溶于水中。當(dāng)磷酸氫二鈉加熱到200°以上，或通過磷酸與蘇打以化學(xué)計量比反應(yīng)并噴霧干燥該溶液就形成焦磷酸鈉。十水合物絡(luò)合重金屬鹽和硬鹽，由此減少了水的硬度。二磷酸鉀(焦磷酸鉀)K4P2O7以三水合物的形式存在，是一種無色吸濕性粉末，密度2.33gcm-3，溶于水，在25°時，1％溶液pH值為10.4。
相對高分子量的磷酸鈉和磷酸鉀是通過濃縮NaH2PO4或KH2PO4形成的。它們可劃分成環(huán)型，即鈉和鉀的偏磷酸鹽，以及鏈型，即鈉和鉀的多磷酸鹽。特別是鏈型有很多不同的名稱熔合或煅燒的磷酸鹽、格雷姆鹽(Graham鹽)、四聚偏磷酸鉀(Kurrol鹽)以及Maddrell鹽。所有更高的鈉和鉀的磷酸鹽都統(tǒng)稱為濃縮的磷酸鹽。
在工業(yè)上有重要用途的三磷酸五鈉Na5P3O10(三聚磷酸鈉)是非吸濕性白色水溶性鹽，其不帶水或帶6個水分子結(jié)晶，具有通式NaO-[P(O)(ONa)-O]n-Na，其中n＝3。在室溫條件下，大約17克無結(jié)晶水的鹽溶于100克的水中，在60°時是約20克，而在100°時大約是32克。將這種溶液加熱2小時到100°，大約8％的正磷酸鹽和15％的二磷酸通過水解形成。在制備三磷酸五鈉時，將磷酸與蘇打水溶液或者氫氧化鈉以化學(xué)計量比反應(yīng)，并將溶液噴霧干燥。同格雷姆鹽和磷酸氫鈉相似，三磷酸五鈉溶解許多不溶性的金屬化合物(包括石灰肥皂等)。市場上的三磷酸五鈉K5P3O10例如按重量計都是50％溶液(＞23％P2O5，25％K2O)的形式。多磷酸鉀廣泛應(yīng)用于洗滌劑工業(yè)中。還存在三磷酸鉀鈉，根據(jù)本發(fā)明，也可使用。例如當(dāng)三偏磷酸鈉用氫氧化鉀水解時形成三磷酸鉀鈉
根據(jù)本發(fā)明，它們可以完全相同的方式用作三聚磷酸鈉、三聚磷酸鉀或者它們的混合物。根據(jù)本發(fā)明，三聚磷酸鈉和三聚磷酸鈉鉀兩者的混合物或者三聚磷酸鉀和三聚磷酸鉀鈉兩者的混合物或者三聚磷酸鈉和三聚磷酸鉀和三聚磷酸鈉鉀三者的混合物也可使用。
根據(jù)本發(fā)明，能夠應(yīng)用到洗滌劑/清洗劑中的有機共助洗劑尤其包括多羧酸鹽或多羧酸、聚體多羧酸鹽、多天冬氨酸、聚乙縮醛、任選氧化糊精、其他有機共助洗劑(參見下文)和膦酸酯。下面描述這些類物質(zhì)。
有用的有機助洗劑例如為以鈉鹽形式可用的多羧酸，在本發(fā)明上下文中理解為攜帶一個以上酸官能團的羧酸的多羧酸。只要對生態(tài)是安全的，這些羧酸包括例如檸檬酸、脂肪酸、琥珀酸、戊二酸、蘋果酸、酒石酸、馬來酸、反丁烯二酸、糖酸、氨基羧酸、次氮基三乙酸(NTA)及其混合物。優(yōu)選的鹽是多羧酸的鹽，如檸檬酸、脂肪酸、琥珀酸、戊二酸、酒石酸、糖酸及其混合物。
這些酸本身就可利用。除了它們助洗效應(yīng)以外，這些酸也通常具有使成分酸化的性質(zhì)，因此在洗滌劑或清洗劑中用來建立相對較低和適中的pH值，除非pH值要求通過混合其他成分而得到。在這方面特別提及系統(tǒng)相容性和對環(huán)境安全的酸，如檸檬酸、乙酸、酒石酸、馬來酸、乳酸、乙醇酸、琥珀酸、戊二酸、脂肪酸、葡萄酸以及它們的混合物。然而，無機酸尤其是硫酸，或堿尤其是銨或堿金屬的氫氧化物也可用作pH調(diào)節(jié)劑。這些調(diào)節(jié)劑存在于本發(fā)明的組合物中，其量按重量計不高于20％，以及特別為1.2％-17％。
其他合適的助洗劑有聚體多羧酸鹽，也就是例如具有相對分子量為500-700,000g/mol的聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的堿金屬鹽。
本說明書中提及的聚體多羧酸鹽的分子量是特定酸形式的平均分子量Mw，其主要利用紫外檢測儀通過凝膠滲透層析(GPC)測定。測定根據(jù)聚丙烯酸的外標(biāo)進行，所述外標(biāo)依靠其與所研究聚合物的結(jié)構(gòu)相似性而提供實際的分子量值。這些值完全不同于以聚苯乙烯磺酸為標(biāo)準測定的分子量值。以聚苯乙烯磺酸為標(biāo)準測定的分子量一般高于本說明書中提到的分子量。
尤其合適的聚合物是聚丙烯酸酯，其優(yōu)選具有2,000-20,000g/mol的分子量。由于具有優(yōu)良的溶解性，該組優(yōu)選的代表是短鏈聚丙烯酸酯，其分子量為2,000-10,000g/mol，以及特別為3,000-5,000g/mol。
合適的還有共聚體聚羧酸酯，特別是丙烯酸與甲基丙烯酸的那些共聚體聚羧酸酯，以及丙烯酸或甲基丙稀酸與馬來酸的那些共聚體聚羧酸酯。按重量計含有50-90％丙烯酸以及50-10％馬來酸的丙烯酸/馬來酸共聚體尤其合適?；谟坞x酸，它們的相對分子量一般在2,000to 70,000g/mol，優(yōu)選在20,000-50,000g/mol，更優(yōu)選在30,000-40,000g/mol的范圍內(nèi)。(共)聚體聚羧酸酯可以粉末形式或者水溶液的形式利用。(共)聚體聚羧酸酯在清洗劑中所占的含量按重量計為0.5-20％，特別為1-10％。
為了增加水中的溶解度，這些聚合體也可包含烯丙基磺酸，如烯丙基羥苯磺酸以及甲代烯丙基磺酸作為單體。
其他特別優(yōu)選的聚合物是由2種以上不同單體單元構(gòu)成的可生物降解的聚體，如那些含有以丙烯酸和馬來酸以及乙烯醇或乙烯醇衍生物作為單體的鹽的聚體，或者那些含有以丙烯酸和2-烷基烯丙基磺酸和糖衍生物作為單體的鹽的聚體。
其他優(yōu)選的共聚物是那些優(yōu)選含有丙烯醛和丙烯酸/丙烯酸鹽或丙烯醛和乙烯基醋酸酯作為單體的共聚物。
其他優(yōu)選的助洗劑是聚體的氨基雙羧酸、鹽或其前體。聚天冬氨酸或者鹽及其衍生物除了有它們共助洗特性以外，還有穩(wěn)定漂白的效應(yīng)，是特別優(yōu)選的。
其他合適的助洗劑是聚縮醛，它們可通過二醛與含有5-7個碳原子和至少3個羥基的多羥基羧酸反應(yīng)得到。優(yōu)選的聚縮醛可從二醛如乙二醛、戊二醛、對苯二醛及其混合物得到，以及從多羥基羧酸如葡糖酸和/或葡庚糖酸獲得。
其他合適的有機助洗劑是糊精，如碳水化合物的寡聚體或多聚體，它們可由部分水解淀粉獲得。通過標(biāo)準方法如酸或者酶催化的方法進行水解反應(yīng)。終產(chǎn)物優(yōu)選平均分子量為400-500,000g/mol的水解產(chǎn)物。優(yōu)選具有右旋糖當(dāng)量(DE)0.5-40，特別為2-30的多糖，與DE100的右旋糖比較，該DE是可接受的衡量多糖的還原效果。DE為3-20的麥芽糊精和DE為20-37的干葡萄糖糖漿以及具有相對高的分子量為2,000-30,000g/mol的所謂黃、白糊精都可采用。
這些糊精的氧化衍生物是它們與氧化劑的反應(yīng)產(chǎn)物，所述氧化劑能將糖環(huán)的至少一個醇官能團氧化成羧酸官能團。本發(fā)明組合物中尤其優(yōu)選的有機助洗劑是根據(jù)EP472 042、WO97/25399和EP755 944的氧化淀粉或其衍生物。
其他合適的共助洗劑是羥二琥珀酸鹽以及其他二琥珀酸的衍生物，優(yōu)選乙二胺二琥珀酸鹽。乙二胺-N，N’-二琥珀酸鹽(EDDS)優(yōu)選以鈉鹽或者鎂鹽形式使用。就此而論，丙三醇二琥珀酸酯和丙三醇三琥珀酸酯也是優(yōu)選對象。在含沸石和/或含硅酸鹽的制劑中所用的量按重量計為3-15％。
其它有用的有機助洗劑是例如乙?；牧u基羧酸及其鹽，其可任選以內(nèi)酯形式出現(xiàn)并含有至少4個碳原子、至少一個羥基和最多2個酸性官能團。
具有共助洗劑特性的另一類物質(zhì)有膦酸鹽，特別是羥基鏈烷和氨基鏈烷膦酸鹽。在羥基鏈烷膦酸鹽中，1-羥基乙烷-1，1-二膦酸鹽(HEDP)作為共助洗劑尤為重要。優(yōu)選使用鈉鹽、顯示中性反應(yīng)的二鈉鹽以及顯示堿性反應(yīng)(pH9)的四鈉鹽。優(yōu)選的氨基鏈烷膦酸鹽有乙二胺四亞甲基膦酸鹽(EDTMP)、二乙基三胺五亞甲基膦酸鹽(DTPMP)及其更高的同系物。優(yōu)選使用中性反應(yīng)的鈉鹽形式，如EDTMP的六鈉鹽或者DTPMP的七-和十鈉鹽。在膦酸鹽中，HEDP優(yōu)選用作助洗劑。另外，氨基鏈烷膦酸鹽具有顯著的重金屬結(jié)合能力。因此，尤其如果泡沫里亦含有漂白劑，有益的是可利用氨基鏈烷膦酸鹽，特別為DTPMP，或者上述膦酸鹽的混合物。
另外，任何能與堿土金屬離子形成復(fù)合物的化合物都可用作共助洗劑。
本發(fā)明的組合物可任選包含助洗劑，其量按重量計高達90％，以及優(yōu)選高達75％。本發(fā)明的洗滌劑具有助洗劑，其含量按重量計尤其為5-50％。根據(jù)本發(fā)明，在硬表面上的清洗劑尤其是洗碗機洗滌劑中，助洗劑的含量按重量計尤其為5-88％。在優(yōu)選的實施方案中，這類組合物不含水溶性的助洗劑。在另一實施方案中，本發(fā)明的組合物特別是洗碗洗滌劑按重量計包含20-40％的水溶性有機助洗劑，特別是堿金屬檸檬酸鹽，按重量計含有5-15％的堿金屬碳酸鹽以及20-40％的堿金屬二硅酸鹽。
在液體或凝膠形式的洗滌劑/清洗劑的組合物中可用的溶劑屬于例如一元醇或者多元醇、烷醇胺或乙二醇醚的基團，條件是在指定的濃度范圍內(nèi)它們能與水混合。這些溶劑優(yōu)選選自乙醇，正或異丙醇，丁醇，乙二醇甲醚，乙二醇乙醚，乙二醇丙醚，乙二醇moo-正丁醚，二乙二醇甲醚，二乙二醇二乙醚，丙二醇甲基、乙基或丙基醚，二丙二醇單甲基或單乙基醚，二異二丙醇單甲基或單乙基醚，甲氧基、乙氧基或丁氧基三甘醇，1-丁氧基乙氧基-2-丙醇，3-甲基-3-甲氧基丁醇，丙二醇叔-丁醚以及這些溶劑的混合物。
根據(jù)本發(fā)明，溶劑可以液體或凝膠形式存在于洗滌劑/清洗劑中，其量按重量計為0.1-20％，優(yōu)選低于15％，以及特別低于10％。
為了調(diào)節(jié)粘稠度，可向本發(fā)明組合物中加入一種或者多種增稠劑，例如增稠系統(tǒng)。這些高分子量物質(zhì)也稱為膨脹劑，在最終變成粘滯的、純的或膠狀溶液之前，通?？梢晕找后w并且在此過程中發(fā)生膨脹。
合適的增稠劑是無機或者聚合體的有機化合物。無機增稠劑包括例如聚硅酸、粘土礦物如蒙脫石、沸石、硅石和斑脫土。有機增稠劑屬于天然聚合體、修飾的天然聚合體和完全合成的聚合體的組別。天然存在的聚合體例子有瓊脂、角叉菜、黃蓍膠、阿拉伯膠、藻酸鹽、果膠、聚糖、瓜耳膠、刺槐豆膠、淀粉、糊精、明膠以及干酪素?？捎米髟龀韯┑男揎椀奶烊痪酆象w首先屬于改良淀粉和纖維素的組別，并包括例如羧甲基纖維素及其他纖維素醚、羥基乙基和羥基丙基纖維素以及樹膠醚。完全合成的增稠劑包括聚合體，如聚丙烯和聚甲基丙烯化合物、乙烯基聚合體、聚羧酸、聚醚、聚亞胺、聚酰胺和聚氨基甲酸酯。
基于最終組合物，增稠劑可使用的量按重量計多達5％，優(yōu)選在0.05-2％之間，以及特別在0.1-1.5％的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的洗滌劑/清洗劑可任選含有螯合劑、電解液和其他輔助劑，如熒光增白劑、再沉淀抑制劑、銀腐蝕抑制劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、泡沫抑制劑、研磨劑、染料和/或香精，以及微生物試劑和/或紫外吸收劑作為它的補充成分。
本發(fā)明的衣物洗滌劑可包含二氨基1，2-二苯乙烯二磺酸的衍生物或其堿金屬鹽作為熒光增白劑。合適的熒光增白劑有例如4，4’-雙-(2-苯胺基-4-嗎啉基-1，3，5-三嗪基-6-氨基)-1，2-二苯乙烯-2，2’-二磺酸或者相似組成的化合物，所述化合物包含二乙醇氨基、甲氨基、苯胺基或者2-甲氧基乙氨基而不是嗎啉基。增白劑也可使用取代的二苯基苯乙烯基類型，如4，4’-雙-(2-磺苯乙烯基)-二苯基、4，4’-雙-(4-氯-3-磺苯乙烯基)-二苯基或者4-(4-氯苯乙烯基)-4’-(2-磺苯乙烯基)-二苯基的堿金屬鹽。上述增白劑的混合物也可以使用。
再沉淀抑制劑的作用是使污漬從懸浮于洗滌液中的纖維剝離。合適的再沉淀抑制劑一般是水溶性有機膠體，如淀粉、膠粘物、明膠、淀粉或纖維素的羧酸乙醚或者磺酸乙醚的鹽，也可以是酸性纖維素或淀粉的硫酸酯的鹽。包含酸性基團的水溶性聚酰胺也適用此目的。淀粉衍生物除了上面提及的以外，例如還有乙醛淀粉等也都可使用。纖維素乙醚如羧甲基纖維素(鈉鹽)、甲基纖維素、羥烷基纖維素以及混合醚，如甲基羥乙基纖維素、甲基羥丙基纖維素、甲基羧甲基纖維素及其混合物優(yōu)選使用，例如基于組合物，其使用量按重量計為0.1-5％。
為了保護銀器免遭腐蝕，可以在本發(fā)明的洗碗洗滌劑中使用銀腐蝕抑制劑?，F(xiàn)有技術(shù)中，銀腐蝕抑制劑是已知的，并包括例如，苯并三唑、三價鐵氯化物以及硫酸鈷。例如，從歐洲專利EP0 736 084B1中可了解到，特別適合與酶一起使用的銀腐蝕抑制劑有錳、鈦、鋯、鉿、釩、鈷或鈰鹽和/或絡(luò)合物，在這些絡(luò)合物中上述金屬元素以氧化數(shù)II、II、IV、V或VI的一種形式存在。這些化合物的例子有MnSO4、V2O5、V2O4、VO2、TiOSO4、K2TiF6、K2ZrF6、Co(NO3)2、Co(NO3)3及其混合物。
污漬釋放劑或污漬驅(qū)除劑通常是聚合體，當(dāng)這些聚合體用于衣物洗滌劑中時，它們就給洗衣纖維提供污漬排斥特性和/或支持洗滌劑的其他成分懸浮污漬的能力。如果這些聚合體用于硬物表面的清洗劑中時，也能觀測到可比較的效果。
特別有效并長期確立的污漬釋放劑是含有二羧酸、亞烷基乙二醇(alklene glycol)以及聚鏈烯乙二醇(polyalylene glycol)單元的共聚多脂。例子為共聚物或者聚乙烯對苯二酸和聚氧乙烯乙二醇(DT 16 17141或DT 22 00 911)的共聚物。DE-OS 2253063中提到酸性組合物，其中含有由二堿性羧酸和亞烷基或環(huán)亞烷基聚乙二醇組成的共聚體。在DE-PS 28 57 292、DE-PS 33 24 258以及EP 0 253 567中描述了乙烯對苯二酸鹽和聚環(huán)氧乙烷對苯二酸鹽的共聚體和它們在洗滌劑中的應(yīng)用。歐洲專利EP 066 944涉及組合物，其含有乙二醇、聚乙二醇、芳族二羧酸與磺化芳族二羧酸以一定摩爾比率構(gòu)成的共聚脂。歐洲專利EP 0 185 427描述了甲基-或乙基-末端的聚酯，其含有乙烯和/或丙稀對苯二酸鹽單元和聚環(huán)氧乙烷對苯二酸鹽單元，以及描述了含有此種污漬釋放聚合體的洗滌劑。歐洲專利EP 0 241 984涉及聚酯，這種聚酯除了含有氧乙烯基團和對苯二鹽單元以外，還包含取代的乙烯單元和甘油單元。歐洲專利EP 0 241 985描述了聚酯，其除了含有氧乙烯基團和對苯二酸鹽以外，還含有1，2-丙烯、1，2-丁烯和/或3-甲氧基-1，2-丙烯基團和甘油單元，并且其以C1-4烷基為末端。歐洲專利申請EP0 272 033描述了包含聚丙烯對苯二酸鹽和聚氧乙烯對苯二酸鹽單元的至少部分以C1-4烷基或?；鶠槟┒说木埘?。歐洲專利EP 0 274 907描述了包含以磺乙基為末端的對苯二酸鹽的污漬釋放聚酯。根據(jù)歐洲專利申請EP 0357 280，包含對苯二酸鹽、亞烷基乙二醇和聚-C2-4-乙二醇單元的污漬釋放聚酯可通過不飽和末端基的磺化來產(chǎn)生。國際專利申請WO95/32232涉及酸性芳族污漬釋放聚酯。國際專利申請WO97/31085描述用于棉織物的污漬驅(qū)除劑，其含有若干官能團單元第一單元例如可能是陽離子的，能通過靜電相互作用吸附到棉表面，以及第二單元是疏水的，負責(zé)遺留在水/棉界面上的活性物質(zhì)。
適用于本發(fā)明的洗衣洗滌劑中的染料轉(zhuǎn)移抑制劑尤其包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯咪唑、多聚N-氧化物，如聚-(乙烯基吡啶-N-氧化物)和乙烯基吡咯烷酮與乙烯基咪唑(viyl imidazole)的共聚物。
如果組合物用在機器清洗過程中，把典型的泡沫抑制劑加入到它們里面會大有好處。合適的泡沫抑制劑有例如具有較高百分含量的C18-24脂肪酸的天然或合成來源的肥皂。合適的非表面活性的泡沫抑制劑有例如有機多分子硅醚及其與微細任選硅烷化的硅石還有石臘、臘、微晶臘的混合物，以及它們與硅烷化的硅石或者二-硬脂酰亞乙基二酰胺的混合物。不同泡沫抑制劑的混合物，如硅氧烷、石蠟和蠟的混合物也可以被有效的利用。泡沫抑制劑，特別是含硅氧烷-和/或含石蠟-的泡沫抑制劑優(yōu)選固定到粒狀水溶性的或水分散的支持物上。尤其優(yōu)選石蠟和二-硬脂酰亞乙基二酰胺的混合物。
另外，本發(fā)明的硬表面清洗劑可含有研磨劑組分，特別是選自硅石粉、木料粉、塑料粉、粉筆和玻璃狀微珠以及它們的混合物。存在于本發(fā)明清洗劑中的研磨劑，其量按重量計優(yōu)選不超過20％，特別為5-15％。
將染料和香精加入到本發(fā)明的洗滌劑/清洗劑中以改善產(chǎn)品帶來的美學(xué)印象，并給消費者不僅提供所需要的洗滌和清潔性能而且還提供了視覺和感觀上“典型和不會誤解”的產(chǎn)品。合適的芳香油或香料包括個別的芳香化合物，如酯、醚、醛、酮、醇和烴類的合成產(chǎn)品。酯類的芳香化合物有例如苯甲基醋酸酯、苯氧乙基異丁酸酯、乙酸p-叔丁基環(huán)己酯、乙酸芳樟酯、乙酸二甲基苯甲基原酯、乙酸苯基乙酯、安息香酸芳樟酯、甲酸苯甲酯、甘氨酸乙基甲基苯酯、丙酸烯丙基環(huán)己酯、丙酸蘇合香酯(styrallyl propionate)和水楊酸苯甲酯。醚包括例如苯甲基乙醚；醛包括例如含有8-18個碳原子的直鏈鏈烷醛(alkanals)、檸檬醛、香茅醛、香茅基氧乙醛、仙客來醛、羥基香茅醛、鈴蘭醛(lilial)和bourgeonal；酮包括例如紫羅酮、α-異甲基紫羅酮以及甲基柏木酮；醇包括茴香腦醇(anethol)、香茅醇、丁子香酚、香葉醇、沉香醇、苯乙基醇和松油醇；以及烴最主要包括萜，如苧烯和蒎烯。然而，優(yōu)選使用各種香精的混合物一起產(chǎn)生誘人香氣。象這樣的芳香油也可包含天然香精混合物，這些混合物可得自植物源如松樹、柑橘屬植物、茉莉、綠葉刺蕊草、玫瑰或衣蘭衣蘭油。還可適用的有鼠尾草油、春黃菊油、丁香油、蜜蜂花油、薄荷油、肉桂葉油、酸橙花油、杜松子油、巖蘭油、乳香油、楓子香油和巖薔薇油，以及橙花油、苦橙油(neroli oil)、桔皮油和檀香油。洗滌劑/清洗劑的染料含量按重量計通常低于0.01％，而香料卻可占到總制劑的2％。
雖然把香味應(yīng)用到載體上會更好，所述載體能夠增強香氣與正被洗滌/清洗的物質(zhì)之間的粘著，并通過較慢釋放香氣給處理過的織物特別提供持久的芳香，但香料可直接摻入到洗滌劑/清洗劑中。合適的載體物質(zhì)有例如環(huán)糊精、環(huán)糊精/香料復(fù)合物，其任選用其它輔助劑包被。另一優(yōu)選的芳香載體是已描述過的沸石X，它也能夠吸收香氣而不是表面活性劑或在與表面活性劑的混合物中。因此，含有所述的沸石X的洗滌劑/清洗劑和優(yōu)選在沸石上至少部分吸收的香料是優(yōu)選的。
專家易于篩選的優(yōu)選的染料具有高的儲藏穩(wěn)定性，不受組合物中的其他成分和受光的影響，并且對織物纖維不顯示顯著的直接性染色從而不給它們上色。
為了控制微生物，洗滌劑/清洗劑可以含有抗菌劑。依賴抗菌譜和作用機制，抗菌劑分為細菌抑制劑和殺菌劑、真菌抑制劑和殺真菌劑等。這些組的重要代表是例如芐烷銨氯化物、烷芳基磺酸鹽、鹵代苯酚和苯酚汞醋酸鹽。在本發(fā)明教導(dǎo)的情況下，術(shù)語“抗微生物活性”和“抗菌劑”具有通常的意思，如K.H.Wallhuβer在“Praxis derSterilisation，Desinfektion-KonservierungKeimidentifizierung-Betriebshygiene”(第5版，Stuttgart/New YorkThieme，1995)中所定義，其中所述的任何具有抗微生物活性的物質(zhì)是可用的。合適的殺菌劑優(yōu)選選自醇、胺、醛、殺菌劑酸及其鹽、羧酸酯、酸酰胺、苯酚、苯酚衍生物、聯(lián)苯、聯(lián)苯基烷、尿素衍生物、氧和氮縮醛和縮甲醛、芐脒、異噻唑啉(isothiazolines)、鄰苯二甲酰亞胺衍生物、吡啶衍生物、抗菌劑表面活性化合物、胍、殺菌劑兩性化合物、喹啉、1，2-二溴代-2，4-二氰基丁烷、碘代-2-丙基丁基氨基甲酸酯、碘、碘遞體、過氧化合物、鹵化合物以及上述的混合物。
殺菌劑可選自乙醇、正丙醇、異丙醇、丁烷-1，3-二醇、苯氧基乙醇、1，2-丙二醇、甘油、十一烯酸、安息香酸、水楊酸、二水乙酸(dihydracetic acid)、鄰-苯基酚、N-甲基嗎啉乙腈(MMA)、2-苯甲基-4-氯酚、2，2’-亞甲基-雙-(6-溴代-4-氯酚)、4，4’-二氯-2’-羥基聯(lián)苯乙醚(Dichlosan)、2，4，4’-三氯-2’-羥基二苯基醚(Trichlosan)、chlorohexidine、N-(4-氯代苯基)-N-3，4-二氯苯基)-尿素、N，N′-(1，10-癸烷二基二-1-嘧啶基-4-亞基)-雙-(1-辛胺)-二氫氯化物、N，N′-雙-(4-氯苯基)-3，12-二亞氨基-2，4，11，13-四氮雜四癸烷二亞氨基酰胺、葡糖魚精蛋白、抗菌表面活性四元化合物、胍包括二胍和聚胍，如1，6-雙-(2-乙基己基二胍基己烷)-二氫氯化物、1，6-雙-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-苯基-N1，N1-甲基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-鄰-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，6-二氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-[N1N1′-β-(對-甲氧基苯基)-二胍基-N5，N5′]-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1N1′-α-甲基-β-苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-對-硝基苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、ωω-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-二-正丙基醚二氫氯化物、ωω′-二-(N1，N1′-對-氯苯基二胍基-N5，N5′)-二-正丙基醚四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，4-二氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-對-甲基苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，4，5-三氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、1，6-二-[N1，N1′-α-(對-氯苯基)-乙基二胍基-N5，N5′]-己烷二氫氯化物、ωω-二-(N1，N1′-對-氯苯基二胍基-N5，N5′)-間-二甲苯二氫氯化物、1，12-二-(N1，N1′-對-氯苯基二胍基-N5，N5′)-十二烷二氫氯化物、1，10-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-癸烷四氫氯化物、1，12-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-十二烷四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-鄰-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-鄰-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、乙烯-雙-(1-甲苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(對-甲苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(3，5-二甲基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(對-叔戊基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(壬基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(正丁基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(2，5-二乙氧基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(2，4-二甲基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(鄰-聯(lián)苯雙縮胍)、乙烯-雙-(混合-戊基萘基雙縮胍)、正丁基乙烯-雙-(苯基雙縮胍)、三亞甲基-雙-(鄰-甲苯基雙縮胍)、正丁基三亞甲基-雙-(苯基雙縮胍)以及相應(yīng)的鹽，如醋酸鹽、葡糖酸鹽、氫氯化物、氫溴化物、檸檬酸鹽、亞硫酸氫鹽、氟化物、聚馬來酸鹽、正椰油烷基肌氨酸鹽、亞磷酸鹽、次亞磷酸鹽、過氟辛酸鹽、硅酸鹽、山梨酸鹽、水楊酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、亞氨基醋酸鹽、肉桂酸鹽、硫氰酸鹽、精氨酸鹽、苯四酸鹽、四羧基丁酸鹽、安息香酸鹽、戊二酸鹽、單氟磷酸鹽、過氟丙酸鹽和它們的混合物。鹵化二甲苯和甲酚衍生物，如對-氯-間-甲酚或?qū)?氯-間-二甲苯，并且植物起源的天然殺菌劑(如香料和香草)以及動物和微生物起源的天然抗菌劑也是合適的。優(yōu)選的抗菌劑有抗菌性表而活性的四元化合物、植物起源和/或動物起源的天然抗菌劑，以及最優(yōu)選的是至少一個植物起源的抗菌劑，其來自咖啡因、可可堿和茶堿以及香精油如丁子香酚、麝香草酚和香葉醇，和/或至少一個動物起源的抗菌劑，其來自酶如牛奶蛋白、溶菌酶以及乳過氧化物酶和/或至少一個抗菌性表面活性的四元化合物，其包含銨、锍、鏻、碘鎓或砷鎓基、過氧化合物和氯化合物。微生物起源的物質(zhì)也稱為bacteriozines也可以使用。
適合用作抗菌劑的季銨化合物(QUATS)具有通式(R1)(R2)(R3)(R4)N+X-，其中R1-R4可以相同或不同，并代表C1-22烷基、C7-28芳烷基或雜環(huán)基、兩個或在芳香化合物如吡啶存在的情況下甚至是三個同氮原子一起形成雜環(huán)的基團，如吡啶鎓或咪唑鎓化合物，以及X-代表鹵化物離子、硫酸根離子、氫氧根離子或類似的陰離子。為了達到最佳抗菌活性的目的，這些取代基中至少一個優(yōu)選具有8-18，更優(yōu)選12-16個碳原子的鏈長。
QUATS可以通過叔胺與烷基化試劑反應(yīng)得到，所述烷基化試劑如氯甲烷、苯甲基氯化物、硫酸二甲酯、十二烷基溴化物，以及還有環(huán)氧乙烷。帶有一個長烷基鏈和兩個甲基的叔胺的烷基化作用尤其簡單。使用氯甲烷在溫和條件下，含兩個長鏈和一個甲基的叔胺的季銨化作用也可進行。含三個長烷基鏈或者羥基取代的烷基鏈的胺缺乏活性，并優(yōu)選采用二甲基硫酸鹽季銨化。
合適的QUATS有例如芐烷銨氯化物(N-烷基-N，N-二甲基苯甲基銨氯化物，CAS No.8001-54-5)、benzalkon B(m，p-二氯苯甲基二甲基-C12-烷基銨氯化物，CAS No.58390-78-6)、benzoxonium氯化物(苯甲基十二基-雙-(2-羥乙基)-銨氯化物)、溴化十六烷基三甲銨(N-十六碳烷基-N，N-三甲基銨溴化物，CAS No.57-09-0)、benzetonium氯化物(N，N-二-甲基-N-[2-[2-[對-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯氧基]-乙氧基]-乙基]-苯甲基銨氯化物，CAS No.121-54-0)、二烷基二甲基銨氯化物，如二-正癸基二甲基銨氯化物(CAS No.7173-51-5-5)、二癸基二甲基銨溴化物(CASNo.2390-68-3)、二辛基二甲基銨氯化物、1-十六烷基吡啶鎓氯化物(CASNo.123-03-5)和噻唑啉碘化物(CAS No.15764-48-1)以及它們的混合物。尤其優(yōu)選的QUATS是含有C8-18烷基的芐烷銨氯化物，特別是C12-14烷基苯甲基二甲基銨氯化物。
芐烷銨鹵化物和/或取代的芐烷銨鹵化物可商業(yè)上獲得，如來自Lonza的Barquat、來自Mason的Marquat、來自Witco/Sherex的Variquat以及來自Lonza的Hyamine和來自Lonza的Bardac。其他商業(yè)上可獲得的抗菌劑有N-(3-氯烯丙基)-hexaminium氯化物，如來自Dow的Dowicide和Dowicil，芐乙銨氯化物(benzethoniumchloride)，如來自Rohm & Haas的Hyamine1622，甲基芐乙銨氯化物，如來自Rohm & Haas的Hyamine 10X，十六烷基吡啶鎓氯化物，如來自Merrell Labs的cepacolchloride。
抗菌劑的用量按重量計在0.0001-1％的范圍內(nèi)，優(yōu)選在0.001-0.8％的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在0.005-0.3％的范圍內(nèi)，以及最優(yōu)選在0.01-0.2％的范圍內(nèi)。
另外，這些組合物可任選含有紫外吸收劑，所述吸收劑可吸附到經(jīng)處理的織物上，并增強纖維和/或其他制劑成分的光穩(wěn)定性。紫外吸收劑是有機物質(zhì)(濾光劑)，它們能吸收紫外線并以長波輻射如熱的形式釋放吸收的能量。
具有這些所需特性的化合物是例如通過無輻射鈍化而發(fā)揮作用的化合物以及具有2位和/或4位取代基的二苯甲酮的衍生物。其他合適的紫外吸收劑是取代的苯并三唑、3-苯基-取代的丙烯酸鹽(2位上任選用氰基取代的肉桂酸衍生物)、水楊酸鹽、有機Ni復(fù)合物和天然物質(zhì)，如7-羥基香豆素和其本身的咪唑丙烯酸。聯(lián)苯基具有特殊的重要性，以及首要的是例如在EP0728749A中所述的商業(yè)上以TinosorbFD和TinosorbFR ex Ciba可得到的1，2-二苯乙烯衍生物。合適的UV-B吸收劑包括3-苯亞甲基樟腦或3-苯亞甲基非樟腦和它的衍生物，如在EP-B1 0693471中所述的3-(4-甲基苯亞甲基)-樟腦；4-氨基安息香酸衍生物，優(yōu)選4-(二甲基氨基)-安息香酸-2-乙基己基酯、4-(二甲基氨基)-安息香酸-2-辛基酯和4-(二甲基氨基)-安息香酸戊基酯；肉桂酸的酯，優(yōu)選4-甲氧基肉桂酸-2-乙基己基酯、4-甲氧基肉桂酸丙基酯、4-甲氧基肉桂酸異戊基酯、2-氰基-3，3-苯基肉桂酸-2-乙基己基酯(氰雙苯丙烯酸辛酯)；水楊酸的酯，優(yōu)選水楊酸-2-乙基己基酯、水楊酸-4-異丙基苯甲基酯、水楊酸高薄荷基酯；二苯甲酮的衍生物，優(yōu)選2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基-4′-甲基二苯甲酮、2，2′-二羥基-4-甲氧基二苯甲酮；苯亞甲基丙二酸的酯，優(yōu)選4-甲氧基苯亞甲基丙二酸二-2-乙基己基酯；三嗪衍生物，如2，4，6-三苯胺-(對-羰基-2′-乙基-1′-己氧基)-1，3，5-三嗪和EP 0818450 A1中所述的辛基三嗪酮或者二辛基丁氨基三嗪酮(Uvasorb HEB)；丙烷-1，3-二酮如1-(4-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-丙烷-1，3-二酮；如E P0694521 B1中所述的酮三環(huán)(5.2.1.0)癸烷衍生物。其他合適的UV-B吸收劑有2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和堿金屬、堿土金屬、銨、烷基銨、烷醇銨及其葡糖銨鹽；二苯甲酮的磺酸衍生物，優(yōu)選2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸及其鹽；3-苯亞甲基樟腦的磺酸衍生物，如4-(2-氧代-3-亞龍腦基甲基)-苯磺酸和2-甲基-5-(2-氧代-3-亞龍腦基)-磺酸及其鹽。
典型的UV-A過濾劑具體有苯甲酰甲烷的衍生物，如1-(4′-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-丙烷-1，3-二酮、4-叔丁基-4′-甲氧基聯(lián)苯甲酰甲烷(Parsol 1789)、1-苯基-3-(4′-異丙基苯基)-丙烷-1，3-二酮和DE19712033A1(BASF)中所述的烯胺化合物。UV-A和UV-B過濾劑當(dāng)然可以混合物的形式利用。除了上面提到的可溶性物質(zhì)外，不溶的光封閉色素，也就是精細分散的優(yōu)選“毫微化的”金屬氧化物或鹽也可以用于這種目的。適合的金屬氧化物的例子具體有氧化鋅、二氧化鈦以及鐵、鋯、硅、鎂、鋁和鈰的氧化物以及它們的混合物。硅酸鹽(滑石)、硫酸鋇和硬脂酸鋅也可作為鹽使用。氧化物和鹽以色素的形式應(yīng)用在護膚的乳劑和裝飾性化妝品上。顆粒直徑平均小于100nm，優(yōu)選在5-50nm之間，以及更優(yōu)選在15-30nm之間。它們一般為球形，盡管橢圓或其他非球形顆粒也能用。這些色素也可經(jīng)表面處理，也就是說親水性的或疏水性的。典型的例子是包被二氧化鈦，如Titandioxid T805(Degussa)和Eusolex T2000(Merck)。合適的疏水型包被材料首要是硅氧烷，以及其中尤其是三烷氧基辛硅烷或者simethicones。微粉化的氧化鋅優(yōu)選使用。其他合適的UV過濾劑可以在P.Finkel，SFW-Journal 122，543(1996)的綜述中找到。
UV吸收劑的常用量按重量計在0.01-5％的范圍內(nèi)，以及優(yōu)選在0.03-1％的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或其他蛋白質(zhì)在洗滌劑和清洗劑中也需要特別的保護。本發(fā)明的組合物可含有用于此目的的穩(wěn)定劑。
一組穩(wěn)定劑是可逆的蛋白酶抑制劑，它能在組合物于洗滌液中稀釋之后解離。芐脒氫氯化物和亮抑酶肽就為此目的而確立。硼砂、硼酸或它們的鹽或酯，首先包括例如在WO95/12655中由芳香基臨位取代的苯基硼酸、在WO92/19707中由芳香基間位取代的苯基硼酸和在US5,972,873中由芳香基對位取代的苯基硼酸或它們的鹽或酯，也經(jīng)常用于這種目的。WO98/13460和EP583 534公開肽醛，也就是具有還原C末端的寡肽，特別是那些含有2-50個單體、用于可逆性抑制洗滌劑蛋白酶的寡肽。肽的可逆性蛋白酶抑制劑尤其包括卵類粘蛋白(WO93/00418)。例如，WO 00/01826公開了針對蛋白酶枯草桿菌素的特異性可逆的肽抑制劑，用于含蛋白酶的組合物中，而WO00/01831公開了相應(yīng)的蛋白酶和抑制劑的融合蛋白質(zhì)。
其他酶的穩(wěn)定劑有氨基醇，如單-、二-、三-乙醇-和-丙醇胺和它們的混合物、例如從EP0 378 261和WO97/05227中得知的多達C12的脂族羧酸，如琥珀酸，其他羧酸或上述酸的鹽。德國專利申請DE19650537中為此目的公開了封端的脂肪酸酰胺烷氧酸鹽。如WO97/18287中所公開，某些用作助洗劑的有機酸額外能夠穩(wěn)定存在的酶。
除了上面所有多羥基化合物如甘油、乙二醇、丙二醇或山梨醇以外，低級脂族醇也是其他常用酶的穩(wěn)定劑。根據(jù)更近的申請(EP0 965268)，二甘油磷酸鹽也能防止酶受到物理影響而發(fā)生變性。在EP0 028865中為此目的公開了鈣鹽，例如醋酸鈣或甲酸鈣，例如根據(jù)歐洲專利申請EP0 378 262，鎂鹽也可作此用途。
聚酰胺寡聚體(WO99/43780)或者聚合體的化合物，例如木質(zhì)素(WO97/00932)，水溶性乙烯基共聚物(EP828 762)或者如EP702712中所公開的纖維素乙醚、丙烯酸聚合體和/或聚酰胺可對酶制劑產(chǎn)生穩(wěn)定作用，以克服物理影響或者pH值的變化。包含了聚胺-N-氧化物的聚合體(EP587 550和EP581 751)同時擔(dān)當(dāng)酶穩(wěn)定劑和染料轉(zhuǎn)移抑制劑。其它聚合體穩(wěn)定劑是除了在WO97/05227所公開的其他成分以外的直鏈C8-18聚氧化烯。如WO97/43377和WO98/45396所公開，烷基聚糖苷可穩(wěn)定本發(fā)明組合物中的酶成分，甚至提高它們的性能。如WO98/17764所公開，包含交聯(lián)氮的化合物擔(dān)當(dāng)著污漬釋放劑和酶穩(wěn)定劑的雙重作用。根據(jù)WO97/32958，疏水性非離子聚合物與其它穩(wěn)定劑的混合物對纖維素酶有穩(wěn)定的作用，因此這些或者相似的組成也同樣適合本發(fā)明中所必需的酶。
如EP780 466所公開，還原劑和抗氧化劑將增加酶對氧化分解的穩(wěn)定性。含硫的還原劑例如從EP0 080 748和EP0 080 223中得知。其它的例子是亞硫酸鈉(EP533 239)和還原糖類(EP656 058)。
在很多情況下，還采用穩(wěn)定劑的組合，例如在WO96/31589中多羥基化合物、硼酸和/或硼砂的組合，在EP126 505中硼酸或硼酸鹽、還原鹽與丁二酸或其它二羧酸的組合，或者硼酸或硼酸鹽與多羥基或多氨基化合物的組合以及與如EP080 223中所披露的還原鹽的組合。根據(jù)WO98/13462，肽/乙醛穩(wěn)定劑的效果可通過與硼酸和/或硼酸衍生物和多羥基化合物的組合來增強，根據(jù)WO98/13459，其還可通過添加鈣離子而進一步增強。
具有穩(wěn)定的酶活性的組合物代表著本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。特別優(yōu)選的是含有以上面提到的幾種方法而加以穩(wěn)定的酶的組合物。
本發(fā)明組合物含有對本發(fā)明必需的蛋白質(zhì)或衍生物，其量按重量計優(yōu)選為0.000001-5％，以及優(yōu)選遞增的是0.00005-4％、0.00001-3％、0.0001-2％，在最特別優(yōu)選的實施方案中，其量按重量計為0.001-1％。蛋白質(zhì)濃度可用已知方法來測定，例如BAC法(bicinchonic acid(二辛可酸)；2，2’-biquinolyl(二喹啉基)-4，4’-dicarboxylic acid(二羧酸))或者縮二脲法(A.G.Gornall，C.S.Bardawill和M.M.David，J.Biol.Chem.177，(1948)，第751-766頁)。
除了對本發(fā)明必需的蛋白質(zhì)外，本發(fā)明的組合物可以包含其它的淀粉分解酶，更特別是α-淀粉酶。這些也可包括從開始提到的用于洗滌劑/清洗劑中而確立的酶。商業(yè)上可得到的淀粉酶的例子是BAN、Termamyl、Purastar、Amylase-LT、Maxamyl、Duramyl和/或PurafectOx-Am。多種酶彼此能互補是明智的。這種補充作用可以發(fā)生例如在調(diào)整意義上，例如通過彼此的活化作用或者失活作用。這可出現(xiàn)例如，通過至少對本發(fā)明必需的、不與已知α-淀粉酶同源的這部分酶對本發(fā)明不必需的淀粉分解活性產(chǎn)生影響。
然而，針對不同的底物特異性，聯(lián)合使用也是合適的。二者都是本發(fā)明的實施方案。
特別對于化學(xué)成分復(fù)雜的污漬，將洗滌劑/清洗劑中的淀粉分解酶和其它清洗酶和/或有清潔活性的酶一起使用是很有優(yōu)勢的。因而，以除本發(fā)明蛋白質(zhì)之外的其它酶為特征的洗滌劑/清洗劑代表本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。
除其它淀粉酶如蛋白酶之外，這些其它的酶包括例如脂肪酶、角質(zhì)酶、酯酶、普魯蘭酶、纖維素酶、半纖維素酶和/或木聚糖酶和它們的混合物。蛋白酶、脂肪酶、β-葡聚糖酶和/或纖維素酶是特別優(yōu)選的。其它酶通過它們特殊的酶活性增加相應(yīng)組合物的清洗性能。這些包括例如，作為酶漂白系統(tǒng)的成分的氧化還原酶或過氧物酶、蟲漆酶(WO00/39306)、β-葡聚糖酶(WO99/06515和WO99/06516)或者果膠溶解酶(WO 00/42145)，這些具體用于專門的清洗劑中。
商業(yè)上可得到的用在本發(fā)明組合物中酶的例子有蛋白酶、如枯草桿菌蛋白酶BPN’、Properase、BLAP、Optimase、Opticlean、Maxatase、Maxacal、Maxapem、Alcalase、Esperase、Savinase、Durazym、Everlase和/或PurafectG或PurafectOxP和脂肪酶，如Lipolase、Lipomax、Lumafast和/或Lipozym。
這些組合物中蛋白酶的活性可用Tenside Vol.7(1970)，第125-132頁中所述的方法來測定。它因此以PU(蛋白酶單位)來表示。優(yōu)選的組合物的蛋白酶活性能夠高達每克1,500,000蛋白酶單位(PU，用TensideVol.7(1970)，第125-132頁中所述的方法測定)。
就分離而言，首先，合適的酶是從微生物中獲得的那些，例如細菌或真菌，例如來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)、絨毛狀腐殖菌(Humicola lanuginosa)、鞭毛腐殖菌(Humicolainsolens)、類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)或洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)，更為特別的是通過這些菌株自然形成的酶的混合物或者與其它菌株的混合物。他們用已知方法從合適的微生物中通過發(fā)酵方法而分離，這些微生物在德國專利DE1940488和DE2121397，在美國專利US3,623,957和US4,264,738，在歐洲專利申請EP006 638和在國際專利申請WO91/02792中有所描述。
這些任選附加的酶也可被吸附到載體和/或裝入膠囊密封在膜材料中以防止它們過早失活，例如在歐洲專利EP0 564 476或者國際專利申請WO94/23005中所描述的那樣。它們在洗滌劑中存在的量按重量計優(yōu)選多達10％，以及更優(yōu)選0.2％-2％，具有抗氧化降解的穩(wěn)定性酶，如從國際專利申請WO94/18314中得知，是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的組合物可由幾種相組成，例如為了釋放在時間或空間上彼此獨立存在的活性成分。這些相可以是各種各樣的聚集狀態(tài)，但是，在特定的實施方案中，在同一個聚集聚合狀態(tài)下有兩種相。
由幾種固態(tài)成分構(gòu)成的本發(fā)明化合物可以容易地通過各種粉末和顆粒的混合來生產(chǎn)，這些粉末和顆粒具有各種各樣的成分和/或以整體的松散形式具有彼此不同的釋放行為。本發(fā)明固態(tài)、單相或多相組合物的生產(chǎn)能夠用已有的方法來生產(chǎn)，例如通過噴霧干燥或造粒，酶和其它任選的熱敏感成分如漂白劑可在后階段單獨添加。本發(fā)明的組合物具有大的容積密度，特別在650-950g/升的范圍內(nèi)，優(yōu)選通過包含從EP0 0486 592中得知的擠壓步驟的方法來生產(chǎn)。基于造粒的另一優(yōu)選的生產(chǎn)方法描述在歐洲專利EP0 0642 576中。
蛋白質(zhì)能夠以干燥、顆粒狀或膠囊化的形式或者膠囊化另加干燥的形式用于固態(tài)洗滌劑/清洗劑。它們可以單獨即作為單相添加，或者與其它有或沒有壓實的同相中的成分一起添加。如果微膠囊化的酶一定要以固態(tài)形式生產(chǎn)，則水可經(jīng)過加工例如通過噴霧干燥、離心或者再溶解從水溶液中除去。以這種方式獲得的顆粒大小通常為50-200μm。
膠囊化形式適合用來保護酶不受其它成分的影響，例如漂白劑或者用于促進緩釋的成分。按照它們的大小，膠囊是毫膠囊、微膠囊或者納膠囊，微膠囊特別優(yōu)選于酶。例如，微膠囊在專利申請WO97/24177和DE19918267中公開。在另一可能的膠囊化方法中，其從有淀粉或淀粉衍生物的溶液或懸浮液與酶溶液的混合物開始，適用于洗滌劑或清洗劑的酶在淀粉或淀粉衍生物中膠囊化。一個如此膠囊化的方法在德國申請DE19956382“微膠囊酶的生產(chǎn)方法(A process for theproduction of microencapsulated enzymes)”中公開。
另一種生產(chǎn)本發(fā)明固態(tài)組合物的方法是壓片或者壓實。所產(chǎn)片劑可以為單相或者多相片劑。因而這種提供形式也使得本發(fā)明的固態(tài)組合物以兩相生產(chǎn)。為了生產(chǎn)單相或者多相形式的本發(fā)明組合物，單色或者多色片劑由若干層組成，任選各層的所有成分可在混合器里一起混合，在50-100kN.cm2和以及優(yōu)選的60-70kN.cm2的應(yīng)用壓力下以常規(guī)壓片機，例如離心壓片機或者旋轉(zhuǎn)壓片機將所得混合物壓片。尤其如果是多層片劑，至少預(yù)壓一層是有好處的。以5-20kN.cm2和更特別10-15kN.cm2的應(yīng)用壓力是優(yōu)選的。以這種方式生產(chǎn)的片劑優(yōu)選具有10-50g且更特別15-40g的重量。片劑可以是任何的形狀，包括圓形、橢圓形或角形以及它的變化形式。
起始于常規(guī)操作的蛋白質(zhì)分離和制備在濃縮的水或者非水溶液中的酶和甚至對本發(fā)明所需的蛋白質(zhì)可以添加到液體、凝膠體或糊狀體的本發(fā)明組合物中，例如以液體形式，即作為溶液、懸浮液或者乳液，也可以凝膠形式或膠囊形式或干粉。這種在典型溶劑里以溶液形式存在的本發(fā)明洗滌劑或者清洗劑一般通過簡單混合成分來制備，所述成分以原樣或溶液的形式引入到自動攪拌器中。
本發(fā)明的實施方案是液態(tài)、凝膠體或者糊狀體組合物，已向其中以膠囊形式加入了對本發(fā)明必需的蛋白質(zhì)和/或一種其它現(xiàn)有蛋白質(zhì)和/或一種其它現(xiàn)有的成分。含有淀粉酶敏感物質(zhì)的對應(yīng)組合物是特別優(yōu)先的。淀粉酶敏感物質(zhì)和對本發(fā)明必需的淀粉分解酶一起使用在洗滌劑或清洗劑中可具有協(xié)同效應(yīng)，例如淀粉分解酶支持微膠囊的分解然后釋放膠囊化的成分，以至它們只能在一定時間而不在存儲期間和/或不能在清洗程開始的時候釋放。這種機理可形成含有代表本發(fā)明優(yōu)選實施方案的各種成分和各種類型膠囊的復(fù)雜洗滌劑或清洗系統(tǒng)的基礎(chǔ)。
類似的作用也可觀察到，當(dāng)洗滌劑或清洗劑分布在至少兩個不同的相中時，例如兩個或者多個片劑形式的洗滌劑或清洗劑的固體結(jié)合在一起的相，或者在相同粉狀的洗滌劑/清洗劑中各種顆粒。用在洗碗機和洗滌劑中的兩相或多相清洗劑是已知的。在前一激活相中的淀粉分解酶活性對于被淀粉酶敏感的膜或者包衣所圍繞的后一相的活化來說是必需的，或者淀粉酶敏感材料是固相的完整部分，在其部分或完整水解過程中，正被討論中的相分解。因而為此目的，本發(fā)明所必需的酶的利用是本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。
洗滌劑/清洗劑的成分在它們的性能上能夠適當(dāng)?shù)南嗷ブС?。為了提高清洗性能，淀粉酶和染料轉(zhuǎn)移抑制劑協(xié)同應(yīng)用公開在例如專利申請WO99/63035中。還已知的是聚合體能夠同時用作共助洗劑，例如烷基聚糖苷，可穩(wěn)定和增加存在酶的活性和穩(wěn)定性，參照專利申請WO98/45396。對本發(fā)明必需的淀粉分解活性也能夠通過上面提到的其它成分的一種得到修飾，更尤其得到穩(wěn)定和/或提高。因而，用于本發(fā)明組合物對應(yīng)適合制劑尤其代表著本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。特別在組合物的洗滌或清洗性能以這種方式得到增強時應(yīng)用。
該發(fā)明的基本概念也體現(xiàn)在清洗織物或硬表面的方法中，其特征在于本發(fā)明的淀粉分解蛋白質(zhì)或衍生物在至少其中一個方法步驟中變成活性的。
機械清洗方法通過多級清洗程序來區(qū)分，即通過各種具有清洗活性的成分在相互不同的時間段應(yīng)用于待清洗物品的實際情況而定。將這些方法應(yīng)用于例如清洗規(guī)定的食物制備單元中。另一方面，由于它們的酶活性，對本發(fā)明必需的蛋白質(zhì)本身能夠進攻含碳水化合物的污漬，甚至以部分或全部不需要洗滌劑或其它以洗滌劑或者清洗劑為特性的成分。因而，在本發(fā)明的一種實施方案中，用于織物或者硬表面的機械清洗方法也可以選擇，其中對本發(fā)明必需的蛋白質(zhì)在一定時期內(nèi)作用于污漬上而不用其它的清洗活性成分。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案是任何清洗方法，包括人工，但尤其是機械清洗方法，其特征在于對本發(fā)明必需的淀粉分解蛋白質(zhì)或衍生物在至少一個方法步驟中變成活性的。這些方法可以是清洗織物或類似材料的方法以及清洗硬表面的方法。
如實施例所示，對本發(fā)明必需的來自芽孢桿菌A7-7(DSM12368)的α-淀粉酶是合適的，當(dāng)其摻入在合適的洗滌劑或清洗劑中時，既用于提高織物的機械洗滌劑的清洗性能，也用于增加洗碗機洗滌劑的清洗性能。
因而，本發(fā)明其它優(yōu)選的實施方案是任何清洗方法，包括人工，但尤其是機械清洗方法，其特征在于本發(fā)明組合物用于至少一個方法步驟中。這些方法既可以是清洗織物或類似材料的方法也可以為清洗硬表面的方法。
特別適用于清洗方法例如常規(guī)家用洗碗機或者家用洗衣機中的本發(fā)明蛋白或片段，其每次應(yīng)用的量為0.02mg-400mg的淀粉分解蛋白或片段，優(yōu)選0.01mg-200mg，以及更優(yōu)選0.02mg-100mg的淀粉分解酶或片段。
在機械清洗織物或硬表面方法的一個可能的實施方案中，每升洗滌液活性濃度為0.0005mg-10mg，以及優(yōu)選為0.0005mg-8mg已經(jīng)證明對本發(fā)明必需的蛋白質(zhì)來說特別合適。因而，它們代表著本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。在其它合適的實施方案中，相應(yīng)值可以和上述數(shù)值有顯著地區(qū)別，特別是當(dāng)考慮機械消耗5-50升的洗滌液時，實際上機械清洗方法需要同樣數(shù)量的洗滌劑。
本發(fā)明蛋白質(zhì)或者組合物的應(yīng)用代表本發(fā)明的另一種實施方案。這種應(yīng)用可通過機器或任何其它尤其是人工的方式進行。這種方法涉及到各種各樣的材料，特別是織物或者硬表面的清洗。對本發(fā)明必需的蛋白質(zhì)可包埋到其它清潔物質(zhì)的制劑中，或者依賴于其性質(zhì)，甚至可以在很大程度上不與這些化合物伴隨存在。
另一種相應(yīng)的實施方案是利用本發(fā)明蛋白質(zhì)自身來清洗織物和硬表面，特別是在多級步驟的清洗方法中。
優(yōu)選的實施方案是任何潛在的應(yīng)用，其中本發(fā)明組合物用來清洗織物或硬表面。
重要應(yīng)用的特征在于淀粉分解蛋白質(zhì)或片段在洗碗機或洗衣機中每次使用量為0.02mg-400mg，優(yōu)選0.01mg-200mg，以及更優(yōu)選0.02mg-100mg。
本發(fā)明蛋白質(zhì)或衍生物用于完全或部分地溶解固態(tài)洗滌劑或清洗劑成分周圍的保護層或者采用存在于它們之中或周圍的淀粉酶敏感材料分解固態(tài)相，是本發(fā)明的另一種實施方案。這同樣適用于實施方案，其中淀粉分解蛋白質(zhì)以它們自己或與至少一種其它清潔物質(zhì)或支持清洗效果的活性物質(zhì)一起的這些相中的一種而存在。要達到這種程度，淀粉分解蛋白質(zhì)意在激活由一種以上相組成的洗滌劑或者清洗劑中的相關(guān)相或者其它相。為了在硬表面或者織物類材料上產(chǎn)生清洗效果，這些成分的釋放從此觀點上也是尤其優(yōu)選的。
利用本發(fā)明的酶來部分或者全部分解液體、凝膠形式或者糊狀組合物中的含碳水化合物的膠囊，特別是納膠囊、微膠囊或者毫囊體，是本發(fā)明的實施方案，其中組合物的膠囊化成分緩釋的重要性在前面已經(jīng)討論過了。當(dāng)成分緩釋用于在硬表面或織物樣材料上產(chǎn)生清洗效果的時候，這種實施方案是尤其優(yōu)選的本發(fā)明的實施方案。
另一種實施方案是利用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其衍生物來處理織物加工中的原材料或中間產(chǎn)品，特別是用于退漿棉。
用于織物生產(chǎn)的原材料就中間產(chǎn)品，例如基于棉花的那些織品，為了便于更好加工，在他們生產(chǎn)以及進一步加工過程中以上漿來完成。這個過程既用在紗線和中間產(chǎn)品也用在織物上，已知為上漿。本發(fā)明淀粉分解蛋白質(zhì)適合于除漿，即含淀粉的保護層(退漿)。
本發(fā)明的另一種實施方案是液化淀粉的方法，更特別用來生產(chǎn)乙醇，其特征在于它們使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或者其衍生物。
對于液化淀粉來說，將溶脹在水或緩沖液中的淀粉與淀粉分解酶溫育，這樣多糖分解成更小的成分，最終主要轉(zhuǎn)換成麥芽糖。本發(fā)明的酶優(yōu)選用于此方法或用于其中包含的一個步驟，其中它們的生化特性使得它們?nèi)菀椎卣系较鄳?yīng)的生產(chǎn)方法中。可以是這種情形，例如，當(dāng)它們要引入到除了需要同樣反應(yīng)條件的其它酶的方法步驟中的時候。本發(fā)明淀粉分解蛋白質(zhì)尤其優(yōu)選于它們自身所形成的產(chǎn)品是目的焦點的地方。淀粉液化也可代表用于生產(chǎn)乙醇或者其衍生物例如乙酸的多級方法中的一步。
本發(fā)明的另一種實施方案是利用本發(fā)明蛋白質(zhì)或者衍生物來生產(chǎn)直鏈和/或短鏈寡糖。
由于酶的活性，本發(fā)明淀粉分解蛋白質(zhì)主要形成相對高分子量的寡糖，如經(jīng)過相對短的溫育期后來自淀粉樣聚合體的麥芽六糖、麥芽七糖或者麥芽八糖。經(jīng)過相對長的培育期后，在反應(yīng)產(chǎn)物中低級寡糖如麥芽糖和麥芽三糖的比例增加。如果對某些反應(yīng)產(chǎn)物特別感興趣，本發(fā)明蛋白質(zhì)的相應(yīng)的變體和/或反應(yīng)條件可相應(yīng)得到修飾。當(dāng)純化合物不是主要事情而是如在僅具有某些物理特性的溶液、懸浮液或者凝膠的形成中的相似化合物的混合物，這尤其是誘人的。
本發(fā)明另一實施方案是將本發(fā)明蛋白質(zhì)或衍生物用于水解環(huán)糊精。
環(huán)糊精是α-1，4-糖苷的環(huán)寡糖，其中那些6、7或8個葡萄糖單體，α-、β-和γ-環(huán)糊精(或者環(huán)-六-、-七-或-八-淀粉酶)具有最大的經(jīng)濟價值。采用疏水性外來分子，如芳香劑、香精或者藥物活性素，它們能夠形成外來分子從中按需要釋放的內(nèi)含化合物。依賴于這些成分的應(yīng)用領(lǐng)域，如此內(nèi)含化合物是重要的，例如用在食品、藥物或化妝品的生產(chǎn)，例如在終端消費者的相應(yīng)產(chǎn)品中。因此，從環(huán)糊精中釋放成分是對本發(fā)明蛋白質(zhì)的一種實際應(yīng)用。
另一種實施方案是將本發(fā)明蛋白質(zhì)或衍生物用于從多聚糖載體或環(huán)糊精中釋放低分子量的化合物。
由于它們的酶活性，本發(fā)明淀粉分解蛋白質(zhì)也能從其它α-1，4-糖苷的多糖中釋放低分子量的化合物。如采用環(huán)糊精，這可在分子水平以及甚至更大系統(tǒng)上發(fā)生，例如在微膠囊形式中膠囊化的成分。例如淀粉是在存貯過程中用于使如酶的化合物膠囊化的確定的原料，它們能以規(guī)定量介入到反應(yīng)混合物中去。來自這些膠囊的緩釋方法可由本發(fā)明的淀粉分解酶來支持。
另一實施方案將本發(fā)明蛋白質(zhì)或衍生物用來生產(chǎn)食物和/或食物成分。
用蛋白質(zhì)或衍生物來生產(chǎn)動物飼料和/或動物飼料成分是本發(fā)明的另一實施方案。
無論何地，淀粉或者淀粉衍生的碳水化合物都扮演著食物成分或者動物飼料的角色，淀粉分解的活性可用于生產(chǎn)這些物品。它能增加和多聚糖相關(guān)的單體或寡聚體的比例，所述多聚糖能有益于食物的味道、消化性和稠度。對于一些動物飼料的生產(chǎn)這可能是必需的，并且例如在果汁、酒類或其它食物的生產(chǎn)中，如果多聚糖的水平減少，則甜度和/或更容易溶解的糖水平增加。上面提到的液化淀粉和/或生產(chǎn)乙醇的應(yīng)用可看作是這個原理的工業(yè)變體。
此外，淀粉酶也可以通過腐敗阻止面包或者糖果失去味道(抗腐效應(yīng))。為達到此目的，它們在烘焙前適當(dāng)?shù)丶釉谏鎴F里。因而，本發(fā)明優(yōu)選的實施方案是本發(fā)明蛋白質(zhì)用在面包和糖果的生產(chǎn)中。
另一實施方案是將本發(fā)明蛋白質(zhì)或者衍生物用于溶解含淀粉的粘合鍵。
暫時性的鍵合方法其特征在于它們用本發(fā)明蛋白質(zhì)或衍生物來代表本發(fā)明的另一實施方案。
除了其它天然材料以外，淀粉作為一種粘結(jié)劑在紙品生產(chǎn)和在不同紙和紙板的粘結(jié)中已經(jīng)使用了數(shù)個世紀。例如，這適用于制圖和書籍中。在很長的一段時期里，這些紙能變卷曲或在不利影響下能斷裂，例如潮濕導(dǎo)致它們完全的破壞。為了存貯這些紙和板，有必要溶解粘合層，通過利用本發(fā)明的淀粉溶解蛋白質(zhì)會使這很容易實現(xiàn)。植物聚合體，例如淀粉或纖維素及其水溶性衍生物，用作粘合劑或者漿糊。為達此目的，它們首先必須膨脹在水中，接著在應(yīng)用到待粘合表面之后干燥，這樣它就可以固定到底物上。為了影響所形成漿糊的粘合特性，本發(fā)明的酶可添加至這種水懸浮液里。然而，代替這項功能或者除了這項功能之外，為了干燥后在表面上停留長時間如數(shù)年不動，它也可添加在漿糊里?？刂浦車h(huán)境條件的變化，例如通過潤濕，能夠用來在后一段時期內(nèi)激活酶并因此誘導(dǎo)溶解漿糊。以此方式，粘合的表面更易與底物分離。在這個過程中，本發(fā)明的酶通過它的淀粉分解活性作為臨時粘合過程的分離劑或者分離粘合物品所謂“開關(guān)”。
所用的培養(yǎng)基是YPSS培養(yǎng)基，包括15g/l可溶性淀粉、4g/l酵母提取物、1g/l K2HPO4和0.5g/l MgSO4x7H2O。高溫滅菌后，用20％的碳酸鈉溶液將pH值調(diào)整到10.3。把25ml的培養(yǎng)基加入到消過毒的100ml的厄倫美厄燒瓶中，并用已在YPSS瓊脂平板上生長的芽孢桿菌A7-7(DSM12368)培養(yǎng)物接種。在30℃/200r.p.m搖動48小時進行培養(yǎng)。
用這種方法可以從250ml的培養(yǎng)基中獲得2.6mg的蛋白質(zhì)，正如通過BCA方法(雙辛可酸；2，2′-二喹啉基-4，4′-二羧酸)所測定。通過SDS凝膠電泳和銀染顯示純的蛋白質(zhì)。
利用PHAST系統(tǒng)(Pharmacia-Amersham)，在8-25％的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，并與相關(guān)大小的標(biāo)記物進行比較，來自芽孢桿菌A7-7(DSM12368)的淀粉分解酶的分子量為58kD。
根據(jù)PHAST系統(tǒng)(Pharmacia-Amersham)中pH3～9的等電聚焦，其等電點位于pH6.0。
純酶的淀粉分解活性通過所謂的DNS方法測定，即采用二硝基水楊酸。為此目的，在淀粉分解過程中由酶釋放的寡糖、二糖和葡萄糖單元可用二硝基水楊酸(DNS)氧化還原端來進行檢測。顯色的強度與所形成的水解產(chǎn)物的數(shù)量成正比。該測試如下進行將50μl酶溶液與100μl 1％可溶性淀粉的tris/馬來酸鹽緩沖液、pH6.5(將12.11gtris+11.61g馬來酸溶解于1升水中，用0.2N NaOH調(diào)節(jié)pH值)50℃下溫育15分鐘，用300μl DNS溶液(8.8g二硝基水楊酸、915ml蒸餾水、250g酒石酸鉀-鈉、334ml 4.5％NaOH、6.3g亞硫酸氫鈉)100℃下氧化還原糖20分鐘。冰浴中冷卻后，對照空白值，在540nm處檢測光吸收。通過麥芽糖濃度系列進行分析校準?；钚砸赃€原糖(基于麥芽糖)μmol/分鐘/毫升來表示。
根據(jù)測試結(jié)果，實施例中的蛋白質(zhì)明顯具有淀粉分解活性。在下文中，以這種方式測定的活性充當(dāng)各種條件下的酶穩(wěn)定性的參數(shù)。
在pH10下溫育10分鐘，測量酶的溫度穩(wěn)定性。在室溫、30℃、40℃和50℃條件下，活性至少為85％。40℃時，淀粉酶的殘留活性為最大值的90％。60℃時，酶有50％的活性。當(dāng)溫度大于60℃時，活性隨著溫度升高而嚴重喪失，但在80-90℃時仍有10％的殘留活性。
當(dāng)40℃下溫育10分鐘后，來自芽孢桿菌A7-7(DSM12368)的淀粉分解酶在pH值為5-12時是相當(dāng)穩(wěn)定的。在pH值為8-9時，淀粉分解酶的穩(wěn)定性高達100％。當(dāng)pH更高或更低時，其活性緩慢降低，盡管在pH5或pH12時仍然有65％以上的殘留活性。
為了進一步表征，對不利影響酶活性的可能的干擾因素如蛋白酶或洗滌劑進行了研究。在pH10/50℃下接觸10HPE/ml的蛋白酶Savinase(丹麥，Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd；HPE單位的測定方法在Tenside 7(1970)，第125-132中有報道)和0.1％ SDS 15分鐘之后，該酶顯示74％的殘留活性。在同樣條件下(pH10、50℃、15分鐘)僅接觸0.1％ SDS，該酶顯示98％的殘留活性。仍在同樣實驗條件下，在3mM EDTA存在下，酶的殘留活性為10％，而在1mM EDTA存在下，酶的殘留活性則為65％。
為了測定內(nèi)在的氨基酸序列，將依據(jù)實施例1獲得并且依據(jù)實施例2純化的蛋白質(zhì)首先用乙醇沉淀，然后通過變性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。在對應(yīng)條帶從SDS聚丙烯酰胺凝膠中切下后，在原位以胰蛋白酶進行消化，所得的肽用HPLC分離，并用Edman降解和MELDI-TOF分析法進行分析。下列兩個片段(D1和D6)選自眾多以這種方式獲得的胰蛋白酶的片段D1GITAVWIPPAWK 5’-GTN TGG ATH CCN CCNCGN TGG-3’D6QGYPSVFYGDYYGIPTH 5’-CGD ATN CCN TAN TARTCN CC-3’相應(yīng)退化的PCR引物的構(gòu)建來自它們的氨基酸序列(左邊所示)。它們的核苷酸序列顯示于右邊(N代表任何堿基；H代表A或C或T；R代表A或G；D代表A、G或T)。
以常規(guī)準備的芽孢桿菌A7-7(DSM12368)染色體DNA作為模板，采用標(biāo)準PCR和此引物對，將大約1000bp的大片段進行擴增。為了儲存，把該PCR片段克隆到載體pGEM-Teasy(Promega，Madison，Wisconsin，USA)中。
于2000年3月17日采用BLAST方法(S.F.Altschul等，Nucl.AcidsRes.，25(1997)，第3389-3402頁)進行的序列比較表征該酶為α-淀粉酶。在蛋白質(zhì)水平，該蛋白質(zhì)與已知蛋白的同源性介于71-95％的同一性之間，如下列表2所示。
表2本發(fā)明來自芽孢桿菌A7-7(DSM12368)的酶與最相似的其它代表性蛋白質(zhì)的同源性；在蛋白水平以同一性％表示。ID代表瑞士蛋白數(shù)據(jù)庫的入口(日內(nèi)瓦，瑞士)。
圖1顯示與代表性蛋白質(zhì)的比對。所有蛋白質(zhì)都是α-淀粉酶，所以，基于實質(zhì)性一致，必須認為本發(fā)明的酶也是α-酶。這與從淀粉降解的微生物中原始分離的基因(實施例1)以及在用攜帶插入物的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株中發(fā)現(xiàn)淀粉分解活性(實施例4)是一致的。從此生產(chǎn)株中可獲得的淀粉分解蛋白的特性與野生型株的那些相對應(yīng)(實施例2)。依據(jù)實施例4可生成這種生產(chǎn)株。
A、B和C的對照洗滌劑基本組成如下(用重量百分比表示)4％直鏈烷基苯磺酸鹽(鈉鹽)、4％C12-18脂肪醇硫酸鹽(鈉鹽)、5.5％C12-18脂肪醇x7EO、1％皂鈉、11％碳酸鈉、2.5％無定型二硅酸鈉、20％過硼酸鈉四水化物、5.5％TAED、25％沸石A、4.5％聚羧酸酯、0.5％膦酸鹽、2.5％粒狀泡沫抑制劑、5％硫酸鈉、1％蛋白酶顆粒，其余為水、熒光增白劑、香精和鹽。對于各種測試系列，將各種淀粉酶加入到對照洗滌劑中，以使其終濃度為每升清洗液中淀粉分解活性為44TAU。
淀粉分解活性TAU的測定是利用修飾的對-硝基苯麥芽庚糖苷(maltoheptaoside)，其末端葡萄糖單元由苯亞甲基封閉，苯亞甲基被淀粉酶裂解成游離的對-硝基苯寡糖，這種寡糖反過來與輔酶葡糖淀粉酶和α-葡萄糖苷酶反應(yīng)形成葡萄糖和對-硝基苯酚。對-硝基苯酚的釋放量與淀粉酶活性成正比。例如可用Abott Quick-Start Testkit(Abott Park，Illinois，USA)來進行測量。利用光度計37℃下對照空白，將測試混合物中吸光度(405nm)的增加檢測3分鐘。已知活性的標(biāo)準酶用作校準(例如Genencor的Maxamyl/Purastar的活性為2900TAU/g)。以每分鐘吸光度差異dE(405nm)對標(biāo)準酶濃度繪圖來進行評估。
將本發(fā)明的芽孢桿菌A7-7(DSM 12368)的淀粉分解酶與Termamyl、Duramyl和BAN(生產(chǎn)商Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)相比較。用于污漬D的洗滌劑基本配方相同，只是沒有蛋白酶，其用作A-C或添加淀粉酶的對照。
在本實施例中，CIELAB系統(tǒng)中織物的白度在用Minolta CR310清洗前后進行測量，并與設(shè)定為100％的標(biāo)準比較而來。對各自測試所得結(jié)果的差異顯示于下列表3中。顯示的是5次測量的平均值。它們是本發(fā)明酶對所用洗滌劑的清洗效果起作用的直接指標(biāo)。
表3
從表中可以看出，與任何三種參照酶相比，來自芽孢桿菌A7-7(DSM 12368)的α-淀粉酶對污漬B具有明顯強的清洗性能。對于其他污漬，盡管仍然好于沒有淀粉分解酶的對照值，但其顯示清洗性能稍有提高(在誤差范圍內(nèi))。由于所測試的所有洗滌劑制劑均含有野生型酶對此通常非常敏感的漂白劑，所以這個結(jié)果更有說服力。
清洗后，經(jīng)洗滌的織物纖維白度如前述實施例的同樣方法測定。所得的差異在表4中顯示，并代表5次測量的平均值，這些平均值還是特定酶對洗滌劑的清洗效果起作用的直接指標(biāo)。
表4
從表中可以看出，與任何參照酶比較，無漂白劑的洗滌劑制劑中的芽孢桿菌A7-7(DSM 12368)的α-淀粉酶對污漬B和C具有更好的清洗性能。
清洗后，以硫酸鋇的白度作為標(biāo)準100％，與之對比可測出洗過織物的白度。測量用的是Datacolor SF500-2分光光度計，測試條件為460nm(紫外阻擋濾光片)、孔徑30mm、無光澤面、光源類型D65、10°、d/8°。下表4中顯示測試結(jié)果，以反射率％表示，即和硫酸鋇比較的百分數(shù)，表4還列出具體的起始值。所示值是5次測量的平均值，并且是本發(fā)明的淀粉酶對所用洗滌劑的清洗效果起作用的直接指標(biāo)。
表5
從表中可以看出，與任何所測試的參照系統(tǒng)比較，該制劑中的芽孢桿菌A7-7(DSM 12368)的α-淀粉酶對E的清洗性能明顯更好，而對F的清洗性能則是可比較的。
下列基本配方用于洗滌劑(所有量按重量百分比)55％三磷酸鈉(以無水表示)、4％無定型二硅酸鈉(以無水表示)、22％碳酸鈉、9％過硼酸鈉、2％ TAED、2％非離子表面活性劑、1.4％蛋白酶顆粒，其余為水、染料和香精。對于各種測試，將各種淀粉酶，即Termamyl、Duramyl、BAN(生產(chǎn)商Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)或來自芽孢桿菌A7-7(DSM12368)的淀粉酶以每清洗循環(huán)淀粉酶活性150TAU的有效量加入到基本制劑中，活性測定如實施例1中所述方法進行。
清洗后，用碘酒染色通過碘/淀粉反應(yīng)后，對污漬A的除去進行評估，評估以肉眼進行，等級賦值為0(＝不變，即十分顯著的污漬)到10(＝無可辨別的污漬)。污漬B和C的除去按重量測定，以％表示。為此目的，受污然后清洗的容器的重量與容器的初始重量之間的差異和未清洗的容器與其初始重量之間的差異有關(guān)。這種關(guān)系可看成是去除百分率。
下表6列出了所得結(jié)果，其中A和B是9次測量的平均值，C是18次測量的平均值。它們是本發(fā)明酶對所用洗滌劑的清洗效果起作用的直接指標(biāo)。
表6
這些結(jié)果表明，45℃下，在洗碗機洗滌劑中，芽孢桿菌A7-7(DSM12368)α-淀粉酶在對全部三種污漬的清洗性能中好于所有其它檢測的淀粉酶。
清洗后，利用碘與淀粉的反應(yīng)，對污漬A的去除如實施例4進行評價，等級賦值為0到10。同樣如實施例4，對污漬B和C去除的測定按重量法進行，以百分比表示。所得結(jié)果顯示于下表6中，其中A是9次測試的平均值，B是10次測試的平均值，而C是18次測試的平均值。它們是本發(fā)明酶對所用洗滌劑的清洗效果起作用的直接指標(biāo)。
表7
這些結(jié)果表明，甚至在洗碗溫度55℃時，在洗碗機洗滌劑中，芽孢桿菌A7-7(DSM12368)的α-淀粉酶在清洗性能方面優(yōu)于所有測試的其它酶。


圖1本發(fā)明芽孢桿菌A7-7(DSM 12368)的淀粉分解酶與三種最相似的淀粉酶的比對。
在圖1中，1＝芽孢桿菌A7-7(DSM12368)的淀粉酶2＝芽孢桿菌#707的成熟的淀粉酶，其根據(jù)Tsukamoto、Kimura、Ishii、Takano和Yamane，Biochem.Biophys.Res.Common.151(1988)，第25-31頁3＝來自WO96/23873的SEQ ID NO.1中的淀粉酶4＝來自WO96/23873的SEQ ID NO.2中的淀粉酶序列表<110>漢高兩合股份公司(Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien)<120>從芽孢桿菌A7-7(DSM 12368)中提取的新型淀粉分解酶以及含有該新型淀粉分解酶的洗滌劑和清洗劑(Neues amylolytisches Enzym aus Bacillus sp.A7-7(DSM12368)sowie Wasch-und Reinigungsmittel mitdiesem neuen amylolytischen Enzym)<130>SCT022689-09<140><141><150>DE10036752<151>2000-07-28<150>DE10036753<151>2000-07-28<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1551<212>DNA<213>芽孢桿菌A 7-7(Bacillus sp.A7-7)(DSM12368)<220><221>CDS<222>(1)..(1551)<220><221>mat肽<222>(94)<400>1atg aga aaa cgt aaa aat gga tta atc agt att cta ttg gca ttt ttg 48Met Arg Lys Arg Lys Asn Gly Leu Ile Ser Ile Leu Leu Ala Phe Leu-30 -25 -20ttg gta ctt aca tca ata cct ttt act tca gca aac gta gaa gca cac 96Leu Val Leu Thr Ser Ile Pro Phe Thr Ser Ala Asn Val Glu Ala His-15 -10 -5-1 1cat aat ggc aca aat gga aca atg atg caa 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500 505 510Trp Val Asn Asn51權(quán)利要求
1.一種淀粉分解蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少96％的同一性。
2.一種淀粉分解蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少98％的同一性。
3.一種淀粉分解蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與SEQ ID NO.2中所示第32-516位的氨基酸序列具有至少96％的同一性。
4.一種淀粉分解蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與SEQ ID NO.2中所示第32-516位的氨基酸序列具有至少98％的同一性。
5.一種源自核苷酸序列的淀粉分解蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列與SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性，特別是在對應(yīng)于SEQ ID NO.2中所示第32-516位氨基酸的核苷酸區(qū)域上。
6.一種源自核苷酸序列的淀粉分解蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列與SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性，特別是在對應(yīng)于SEQ ID NO.2中所示第32-516位氨基酸的核苷酸區(qū)域上。
7.一種淀粉分解蛋白質(zhì)，其與SEQ ID NO.2中所示氨基酸序列在整體上和/或在第32-516位置上具有同一性，和/或與源自SEQ IDNO.1中所示核苷酸序列的氨基酸序列在整體上和/或在第32-516位置上具有同一性。
8.一種通過缺失突變得到的如權(quán)利要求1-7中任一項所述的淀粉分解蛋白質(zhì)片段或淀粉分解蛋白質(zhì)。
9.一種通過插入突變得到的淀粉分解蛋白質(zhì)，或一種至少部分由與權(quán)利要求1-8中任一項所述蛋白質(zhì)或片段具有同一性的蛋白質(zhì)的淀粉分解活性部分組成的淀粉分解嵌合蛋白。
10.一種權(quán)利要求1-9中任一項所述的蛋白質(zhì)的淀粉分解活性衍生物。
11.一種淀粉分解蛋白質(zhì)或衍生物，其與權(quán)利要求1-10中所述蛋白質(zhì)或衍生物的一種具有至少一個共同的抗原決定簇。
12.一種如權(quán)利要求1-11中任一項所述的淀粉分解蛋白質(zhì)或衍生物，其特征在于它是從微生物中天然獲得的。
13.一種如權(quán)利要求12中所述的淀粉分解蛋白質(zhì)或衍生物，其特征在于所述微生物是革蘭氏陽性細菌。
14.一種如權(quán)利要求13中所述的淀粉分解蛋白質(zhì)或衍生物，其特征在于所述革蘭氏陽性細菌是芽孢桿菌屬的一種。
15.一種如權(quán)利要求14中所述的淀粉分解蛋白質(zhì)或衍生物，其特征在于所述芽孢桿菌是芽孢桿菌A7-7，以及特別是芽孢桿菌A7-7(DSM12368)。
16.一種編碼淀粉分解蛋白質(zhì)的核酸，其核苷酸序列與SEQ IDNO.1中所示核苷酸序列具有至少85％的同一性，特別是在對應(yīng)于SEQID NO.2中所示第32-516位氨基酸的核苷酸區(qū)域上。
17.一種編碼淀粉分解蛋白質(zhì)的核酸，其核苷酸序列與SEQ IDNO.1中所示核苷酸序列具有至少90％的同一性，特別是在對應(yīng)于SEQID NO.2中所示第32-516位氨基酸的核苷酸區(qū)域上。
18.一種編碼淀粉分解蛋白質(zhì)的核酸，其核苷酸序列與SEQ IDNO.1中所示核苷酸序列具有100％的同一性，特別是在對應(yīng)于SEQ IDNO.2中所示第32-516位氨基酸的核苷酸區(qū)域上。
19.一種核酸，其編碼權(quán)利要求1-15中所述蛋白質(zhì)或衍生物的一種。
20.一種天然生物，其形成權(quán)利要求1-15中所述蛋白質(zhì)或衍生物的一種或包含編碼這些蛋白質(zhì)或衍生物的核酸。
21.一種如權(quán)利要求20所述的生物，其特征在于它是微生物，優(yōu)選是細菌。
22.一種如權(quán)利要求21所述的生物，其特征在于所述細菌是革蘭氏陽性細菌。
23.一種如權(quán)利要求22所述的生物，其特征在于所述革蘭氏陽性細菌是芽孢桿菌屬的一種，特別是芽孢桿菌A7-7，以及最特別是芽孢桿菌A7-7(DSM12368)。
24.一種載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求16-19所述的核酸區(qū)域或編碼權(quán)利要求1-15中所述蛋白質(zhì)或衍生物的一種的核酸區(qū)域。
25.一種根據(jù)權(quán)利要求24所述的克隆載體。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求24所述的表達載體。
27.一種細胞，其包含權(quán)利要求24-26中任一項所述的載體。
28.一種宿主細胞，其表達權(quán)利要求1-15中所述蛋白質(zhì)或衍生物的一種或能受激后表達該蛋白質(zhì)或衍生物，優(yōu)選使用權(quán)利要求26中所述的表達載體。
29.一種如權(quán)利要求28所述的宿主細胞，其特征在于它是細菌，特別是它將形成的蛋白質(zhì)或衍生物分泌到周圍介質(zhì)中。
30.一種如權(quán)利要求28或29所述的宿主細胞，其特征在于它是芽孢桿菌屬的細菌，特別是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或嗜堿桿菌(Bacillus alcalophilus)。
31.一種如權(quán)利要求28或29所述的宿主細胞，其特征在于它是革蘭氏陰性細菌。
32.一種如權(quán)利要求31所述的宿主細胞，其特征在于它屬于埃希氏屬(genus Escherichia)，優(yōu)選是大腸桿菌(Escherichia coli)種，以及更優(yōu)選是菌株大腸桿菌(E.coli)JM109、E.coli DH 100B或E.coliDH 12S中的一株。
33.一種如權(quán)利要求28中所述的宿主細胞，其特征在于它是真核細胞，特別是對所形成的蛋白質(zhì)進行翻譯后修飾的真核細胞。
34.一種用來生產(chǎn)權(quán)利要求1-15中任一項所述蛋白質(zhì)或衍生物的方法，其使用權(quán)利要求16-19中任一項所述的核酸和/或使用權(quán)利要求24-26中任一項所述的載體和/或使用權(quán)利要求28-33中任一項所述的宿主細胞或使用天然形成蛋白質(zhì)或衍生物的細胞，特別是權(quán)利要求20-23中任一項所述的細胞。
35.一種洗滌劑或清洗劑，其特征在于它包含權(quán)利要求1-15中任一項所述的蛋白質(zhì)或衍生物。
36.一種如權(quán)利要求35中所述的洗滌劑或清洗劑，其特征在于它包含按重量計為0.000001-5％，以及特別是0.00001-3％的淀粉分解蛋白質(zhì)或衍生物。
37.一種如權(quán)利要求35或36中所述的洗滌劑或清洗劑，其特征在于它另包含一種或多種其它淀粉分解蛋白質(zhì)，特別是α-淀粉酶。
38.一種如權(quán)利要求35-37中任一項所述的洗滌劑或清洗劑，其特征在于它另包含其它酶，特別是蛋白酶、脂酶、β-葡聚糖酶和/或纖維素酶中的一種或多種。
39.一種如權(quán)利要求35-38中任一項所述的洗滌劑或清洗劑，其特征在于它由一種以上的相組成。
40.一種如權(quán)利要求35-39中任一項所述的洗滌劑或清洗劑，其特征在于它是固態(tài)的，以及在于至少兩種不同的粉末或顆粒以整體松散的形式相互混合存在。
41.一種如權(quán)利要求39中所述的洗滌劑或清洗劑，其特征在于至少兩種固相相互連接，特別是在共同的壓實步驟之后。
42.一種如權(quán)利要求39-41中任一項所述的洗滌劑或清洗劑，其特征在于相的至少一種包含淀粉酶敏感的物質(zhì)，特別是淀粉，或至少部分被該物質(zhì)所包圍或包被。
43.一種如權(quán)利要求35-42中任一項所述的洗滌劑或清洗劑，其特征在于它是液體、膠狀或漿狀，而且存在的蛋白和/或存在的酶的至少一種和/或存在的其它成分的至少一種獨自或與其它成分一起被封裝，優(yōu)選是在微膠囊中，以及特別是在由淀粉酶敏感的物質(zhì)組成的微膠囊中。
44.一種如權(quán)利要求35-43中任一項所述的洗滌劑或清洗劑，其特征在于淀粉分解活性由洗滌劑/清洗劑其他成分中的一種進行修飾，特別是獲得穩(wěn)定和/或其對洗滌劑/清洗劑的洗滌/清洗效果的貢獻得到提高。
45.一種清洗織物或硬表面的方法，其特征在于權(quán)利要求1-15中任一項所述的淀粉分解蛋白質(zhì)或衍生物在至少一個方法步驟中變成活性的。
46.一種清洗織物或硬表面的方法，其特征在于將權(quán)利要求35-44中任一項所述的洗滌劑/清洗劑用于至少一個方法步驟中。
47.一種如權(quán)利要求45或46中所述的方法，其特征在于淀粉分解蛋白質(zhì)或衍生物在所述方法步驟中的用量每次為0.01-200mg，以及優(yōu)選每次為0.02-100mg。
48.一種權(quán)利要求1-15中任一項所述的淀粉分解蛋白質(zhì)或衍生物的用途，其獨自或與至少一種其它清洗劑或?qū)η逑纯椢锘蛴脖砻娴那逑葱Ч鹬С肿饔玫幕钚晕镔|(zhì)一起使用。
49.一種權(quán)利要求35-44中任一項所述的洗滌劑的用途，其用于清洗織物或硬表面。
50.一種權(quán)利要求48或49所述的用途，其特征在于淀粉分解蛋白質(zhì)或衍生物的用量每次為0.01-200mg，優(yōu)選每次為0.02-100mg，優(yōu)選每次使用洗碗機或洗衣機。
51.一種權(quán)利要求1-15中任一項所述的淀粉分解蛋白質(zhì)或衍生物的用途，其獨自或與至少一種其它清洗劑或在洗滌劑或清洗劑中對清洗效果起支持作用的活性物質(zhì)一起使用，所述洗滌劑或清洗劑由一種以上的相組成，用于激活這些或其它相。
52.一種權(quán)利要求1-15中任一項所述的淀粉分解蛋白質(zhì)或衍生物的用途，其獨自或與至少一種其它清洗劑或在洗滌劑或清洗劑中對清洗效果起支持作用的活性物質(zhì)一起使用，所述洗滌劑或清洗劑含有封裝在膠囊內(nèi)的成分，用于將成分從膠囊中釋放出來。
53.一種權(quán)利要求1-15中任一項所述蛋白質(zhì)或衍生物的用途，其用于在織物生產(chǎn)過程中對原料或中間產(chǎn)物進行處理，特別是用來使棉退漿。
54.一種液化淀粉的方法，特別用來生產(chǎn)乙醇，其特征在于其中使用權(quán)利要求1-15中任一項所述的蛋白質(zhì)或衍生物。
55.一種權(quán)利要求1-15中任一項所述蛋白質(zhì)或衍生物的用途，其用來生產(chǎn)直鏈和/或短鏈寡糖。
56.一種權(quán)利要求1-15中任一項所述蛋白質(zhì)或衍生物的用途，其用來水解環(huán)糊精。
57.一種權(quán)利要求1-15中任一項所述蛋白質(zhì)或衍生物的用途，其用于從多糖載體或環(huán)糊精中釋放低分子量化合物。
58.一種權(quán)利要求1-15中任一項所述蛋白質(zhì)或衍生物的用途，其用來生產(chǎn)食品和/或食品成分。
59.一種權(quán)利要求1-15中任一項所述蛋白質(zhì)或衍生物的用途，其用來生產(chǎn)動物飼料和/或動物飼料成分。
60.一種權(quán)利要求1-15中任一項所述蛋白質(zhì)或衍生物的用途，其用來溶解含淀粉的粘合鍵。
61.一種短暫的鍵合方法，其特征在于其中使用權(quán)利要求1-15中任一項所述的蛋白質(zhì)或衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及從微生物芽孢桿菌A 7－7(DSM12368)中提取的新型淀粉分解酶、具有淀粉分解功能的足夠相似的蛋白、生產(chǎn)它們的方法以及這些蛋白的各種應(yīng)用領(lǐng)域。此外，它們可進一步開發(fā)在實施的應(yīng)用領(lǐng)域以外的其他首要技術(shù)目的。本發(fā)明具體涉及含有前述類型淀粉分解蛋白的洗滌劑和清洗劑，涉及清洗織物或硬表面的方法，所述方法包括這些淀粉分解蛋白或類似物試劑的用途，以及涉及它們用于清洗織物或硬表面。
文檔編號C12N15/09GK1443236SQ01813012
公開日2003年9月17日 申請日期2001年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月28日
發(fā)明者貝婭特麗克絲·科特維茨, 羅蘭·布雷韋斯, 卡爾-海因茨·毛雷爾, 勞拉·波拉尼, 安格拉·黑勒布蘭特, 伊姆加德·施密特, 雷吉娜·施特爾, 安格里特·韋伯 申請人:漢高兩合股份公司