專利名稱：與提高或降低哺乳動物排卵率有關(guān)的核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與提高或降低哺乳動物排卵率有關(guān)的核苷酸序列。
具體地，本發(fā)明廣泛涉及在與雜合性雌性哺乳動物排卵率提高有關(guān)的基因中的突變；這些突變導(dǎo)致雜合性雌性哺乳動物不育。對所述突變基因序列的了解可以在用于鑒定攜帶該突變基因的純合性雌性和雄性哺乳動物的雜合子的檢驗中應(yīng)用。對所述基因的生物學(xué)功能及其突變的了解也可以用于提高或降低雌性哺乳動物的排卵率，或用于引起哺乳動物不育或生育能力降低。
背景技術(shù)：
本說明書中引用的所有文獻，包括專利或?qū)＠暾埗际亲鳛閰⒖级?。并非認(rèn)可任何參考文獻組成現(xiàn)有技術(shù)。這些參考文獻中的討論表明了它們的作者的觀點，本申請人保留對所引用的文件的準(zhǔn)確性和針對性進行爭辯的權(quán)利。顯然，盡管本文引用了多篇現(xiàn)有技術(shù)的出版物，但無論是在新西蘭還是任何其它國家，這種引用并不意味著認(rèn)可這些文件就是現(xiàn)有技術(shù)中公知常識的一部分。
Inverdale高生育力基因(FecXI)是綿羊的主要高生育力基因，它最初是在羅姆尼羊群(Inverdale)中發(fā)現(xiàn)的，這種羊群由具有高產(chǎn)仔率的羅姆尼母羊(A281)產(chǎn)生的后代組成。種群隔離研究表明，上述基因位于X染色體上(Davis等，1991)。雜合型I+母羊中該基因的單個拷貝可提高排卵率(多排大約一個卵)，提高產(chǎn)仔率(每只母羊產(chǎn)大約0.6只羊羔)。攜帶該基因的兩個拷貝的純合型II母羊卵巢小且無功能，屬于不育型(Davis等，1992)。對I+和II型綿羊胎兒的研究表明，胎兒直到接近百日齡時卵巢發(fā)育仍然正常生殖細(xì)胞發(fā)育，卵泡發(fā)育，以及卵泡的早期生長階段都正常。但在II型胎兒中，胎兒期達到100天后，初級生長階段以外的卵泡發(fā)育減弱，未見正常的次級卵泡(Smith等，1997)。當(dāng)II型動物體內(nèi)卵母細(xì)胞直徑增大(＞40um)時，沒有跡象表明顆粒細(xì)胞增殖，這與通常觀察到的情況相反(Braw Tal等，1993；McNatty等，1995a；Smith等，1997)。因此，II型動物在胎兒期、新生兒期和成年期存在幼稚的無功能的卵巢，是由于卵泡發(fā)育在初級生長階段被終止。
第二個高產(chǎn)的羅姆尼羊群(Hanna，1995)也攜有與Inverdale羊群表型相似的X-連鎖的突變，但未發(fā)現(xiàn)它與Inverdale羊群有關(guān)聯(lián)。將攜帶Inverdale的公羊與攜帶Hanna的母羊交配，得到無生育能力的純合型雌性動物，由此證實，Hanna動物在Inverdale基因中包含突變(FecXH)(Davis等，1995)。這一Hanna品系在Invermay作為區(qū)別于Inverdale品系的另一個群體而被保留下來。
在尋找導(dǎo)致Inverdale性狀的基因的過程中，本發(fā)明人構(gòu)建了綿羊X-染色體的遺傳連鎖圖譜(Galloway等，1996)，并將Inverdale基因定位在距離微衛(wèi)星標(biāo)志10cM的一個側(cè)翼區(qū)(Galloway等，1999)。所述基因在綿羊X-染色體上的定位，使尋找其它哺乳動物X-染色體上候選基因的范圍縮小，因為，幾乎無一例外地，在一種動物的X染色體上出現(xiàn)的基因也會出現(xiàn)在其它哺乳動物的X染色體上(Ohno，1973)。
Inverdale基因在X染色體上的遺傳，為獲得高產(chǎn)的攜帶單拷貝Inverdale的母羊提供了一種方便的途徑，因為攜帶Inverdale的公羊的所有后代都會通過遺傳獲得該基因。公羊飼養(yǎng)者使用一種遺傳標(biāo)志測試來鑒定能出售的攜帶相應(yīng)性狀的公羊，商人則購買這些公羊用于產(chǎn)出高產(chǎn)的母羊，然后使它們與終端種畜(terminal sire)交配，得到將被屠宰的后代。Inverdale基因的商業(yè)應(yīng)用已經(jīng)在現(xiàn)有的終端種畜交配系統(tǒng)中顯示出極大的優(yōu)勢，每購買一只Inverdale公羊，比通常一只公羊的價值增加$1760(Amer等，1998)。要產(chǎn)出攜帶所述基因的高質(zhì)量公羊，必須能夠區(qū)分非攜帶者(++母羊或+Y公羊)和單拷貝攜帶者(I+母羊或IY公羊)。
有一種遺傳標(biāo)志測試是根據(jù)所述基因周圍微衛(wèi)星標(biāo)志的遺傳而開發(fā)的(即單元型測試)(Galloway等，1999)；參見圖1。但現(xiàn)有的測試僅能鑒定出那些從已知攜帶者遺傳了Inverdale單元型的動物，并非100％精確，因為它不能檢測Inverdale基因本身。在Hanna品系的綿羊中，衍生自X染色體相同區(qū)域但攜帶不同版本的Inverdale的單元型，與A281的后代的單元型不同。
1996年的研究結(jié)果顯示，生長分化因子9(GDF-9)作為轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β超家族的一員，在成年小鼠的卵母細(xì)胞中特異性表達，并且是這種卵母細(xì)胞中卵泡發(fā)生過程(folliculogenesis)所必需的(Dong等，1996)。GDF-9的信使RNA只在卵母細(xì)胞中合成，從原始/初級單層卵泡階段直到排卵后的階段都能合成，雌性GDF-9敲除小鼠由于在此初級單層卵泡階段的卵泡發(fā)育停止而變得不育。Inverdale基因純合型動物都沒有生育能力，它們與GDF-9敲除小鼠具有相似的表型(McNatty等，1995b)。后來有人將GDF-9定位于綿羊的5號染色體上，并因此不導(dǎo)致Inverdale表型(Sadighi等，1998)。
該家族另一個相關(guān)成員GDF-9B，也稱為BMP15，在小鼠和人類的卵巢中被發(fā)現(xiàn)，并且與GDF-9共表達(Laitinen等，1998，Dube等，1998)。BMP15被定位于小鼠的X染色體上，接近Fscl(Dube等，1998)。Fscl(纖維鞘成分)也稱為Akap4(A激酶錨著蛋白4)，它已被定位在小鼠X染色體上距離著絲粒1.6cM之處(Mouse Genome Database(MGD)，October 1999)和人的X染色體的p11.2區(qū)帶上(Dube等，1998)。在Inverdale綿羊(++，I+和II基因型)中，使用不能區(qū)分這些基因型的分子探針進行的初步研究表明，GDF-9B mRNA在初級卵泡而非原始卵泡的卵母細(xì)胞中表達，而且在卵巢中該mRNA僅在卵母細(xì)胞中表達(Galloway等2000。
TGF-ss超家族的成員具有類似的基因結(jié)構(gòu)。GDF-9B編碼區(qū)包含在由4.2kb(人)和3.5kb(小鼠)的內(nèi)含子分隔的兩個外顯子中(Dube等，1998)。在人類中，全長1176bp的編碼序列產(chǎn)生392個氨基酸的前原肽，它的前17個氨基酸對應(yīng)于一個分泌信號。人和小鼠中的前原肽包括蛋白切割位點，通過切割產(chǎn)生一段125個氨基酸的成熟、活性C末端肽和一段N末端原肽產(chǎn)物(Laitinen等，1998，Dube等，1998)。內(nèi)含子序列位于原肽結(jié)構(gòu)域內(nèi)，因此完整的成熟編碼區(qū)位于外顯子2的區(qū)域內(nèi)。
人的BMP15(GDF-9B)野生型的序列公開在US 5,728,679和US5,635,372中。野生型蛋白也已經(jīng)公開，可用于治療骨和軟骨和/或其它結(jié)締組織的缺陷，以及用于傷口復(fù)原和組織修復(fù)。
本發(fā)明人在表達Inverdale或Hanna表型的綿羊中鑒定了綿羊GDF-9B基因的一種突變形式，并首次發(fā)現(xiàn)這種GDF-9B突變型導(dǎo)致這些綿羊的排卵增加，還負(fù)責(zé)純合型綿羊的生育力。
本發(fā)明廣泛涉及上述突變的序列及其相應(yīng)的編碼蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
相應(yīng)地，本發(fā)明一個方面提供了一種分離的突變的GDF-9B核酸分子，其含有選自下組的核苷酸序列a)SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，或SEQ ID NO7；b)能在嚴(yán)格條件下與(a)中分子雜交的序列；c)由(a)定義的分子的功能性變體或片段；d)與(a)，(b)或(c)定義的分子互補的序列；和e)對應(yīng)于(a)-(d)中任一項的分子的反義序列。
所述核酸分子可以是RNA，cRNA，基因組DNA或cDNA分子，也可以是單鏈或雙鏈。所述核酸分子還任選還有一或多個合成的、非天然的、或發(fā)生了改變的核苷酸堿基，或它們的組合。
本發(fā)明還提供了一種鑒定攜有突變的GDF-9B核酸分子的哺乳動物的方法，該方法包括以下步驟(i)獲得該哺乳動物的組織樣品或血液樣品；(ii)從該樣品中分離DNA；(iii)可選地，從步驟(i)獲得的DNA中分離GDF-9B DNA；iv)可選地，用探針檢測所述DNA，該探針與本發(fā)明的突變的GDF-9BDNA互補；v)可選地，擴增突變的GDF-9B DNA的量，并且；vi)確定步驟(ii)中獲得的GDF-9B序列DNA是否攜帶與不育有關(guān)，或與排卵的增加或降低有關(guān)的突變。
優(yōu)選擴增步驟(v)可通過任何便捷方法進行，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
本發(fā)明另一方面提供了一種遺傳標(biāo)記，其通過DNA來篩選排卵增加或不育的哺乳動物，所述遺傳標(biāo)記包含核酸分子，該核酸分子與本發(fā)明第一方面所述的核苷酸序列特異性雜交，或者與包含或相關(guān)于突變的GDF-9B核酸分子的基因組DNA特異性雜交。
哺乳動物可以是雄性或者雌性，還可以是人，或家養(yǎng)動物，寵物，動物園動物或野生哺乳動物。優(yōu)選哺乳動物選自人、綿羊、牛、山羊、鹿、馬、camelid、負(fù)鼠(possum)、豬、小鼠、大鼠、鼬鼠(weasel)、兔(rabbit)、野兔(hare)、雪貂(ferret)、貓和狗。
本發(fā)明另一方面提供了一種分離的多肽，其由具有上述(a)-(d)中任一項所述序列的核酸分子編碼。優(yōu)選所述多肽具有選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，和SEQ ID NO8，或其功能性變體或片段。
本發(fā)明另一方面提供了一種分離的多肽，其具有包含SEQ ID NO10或其功能性變體或片段的氨基酸序列。
本發(fā)明還有一方面提供了一種分離的核酸分子，其具有包含SEQ IDNO9或其功能性片段或變體的核苷酸序列。
本發(fā)明還有一方面提供了一種分離的核酸分子，其編碼基本上如上所述的多肽。
本發(fā)明還有一方面提供了一種調(diào)節(jié)雌性哺乳動物排卵率的方法，該方法包括給予該哺乳動物有效量的突變的GDF-9B多肽，野生型GDF-9B多肽，或其中任一種的功能性片段或變體。
本發(fā)明還提供了一種增加雌性哺乳動物排卵率的方法，所述哺乳動物未攜帶突變的GDF-9B核酸分子，該方法包括給予該哺乳動物有效量的突變的GDF-9B多肽或其功能性變體或片段。
本發(fā)明還提供了一種增加雌性哺乳動物排卵率的方法，所述哺乳動物攜帶兩個拷貝的突變的GDF-9B核酸分子，該方法包括給予該哺乳動物有效量的野生型GDF-9B多肽。
本發(fā)明另一方面提供了一種增加或降低排卵率的方法，或者誘導(dǎo)雌性哺乳動物不育的方法，所述方法包括給予有效量的選自下組的制劑，從而抑制野生型或突變型GDF-9B多肽的生物活性a)免疫有效量的野生型或突變型GDF-9B多肽，或其功能性片段或變體；
b)反義核酸分子，其針對的DNA能編碼野生型或突變型GDF-9B多肽，或它們的功能性片段或變體；c)能與野生型或突變型GDF-9B多肽或其功能性片段或變體結(jié)合的配體，或者野生型或突變型GDF-9B多肽或其功能性片段或變體的抗原。
本發(fā)明進一步的方面提供了一種組合物，其包含有效量的突變的GDF-9B多肽或該多肽的功能性片段或變體，以及藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體或稀釋劑。
本發(fā)明還有一方面提供了一種組合物，其包含有效量的選自下組的制劑以及藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體或稀釋劑a)根據(jù)本發(fā)明的突變的GDF-9B多肽；b)根據(jù)本發(fā)明的野生型GDF-9B多肽；c)針對本發(fā)明的野生型或突變型GDF-9B多肽的反義核酸分子；d)能與本發(fā)明的野生型或突變型GDF-9B多肽結(jié)合的配體，或者本發(fā)明的野生型或突變型GDF-9B多肽的抗原。
本發(fā)明還有一方面提供了一種構(gòu)建體或載體，其包含基本上如上所述的核酸分子。
本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，其被包含本發(fā)明核酸分子的載體或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明還有一方面提供了一種分離的核酸分子，其含有選自SEQ IDNO12或SEQ ID NO14，或其功能性活性片段或變體的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了一種分離的多肽，其包含選自SEQ ID NO13和SEQID NO15的氨基酸序列。
本發(fā)明還有一方面提供了一種分離的功能性活性多肽變體，其如SEQID NO11所示。
本發(fā)明還有一方面提供了一種分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO16所示的核酸序列。
本發(fā)明還提供了一種分離的多肽，其包含SEQ ID NO17所示的氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及一種在負(fù)鼠中降低排卵率或誘導(dǎo)不育的方法，包括給予有效量的多肽，該多肽具有SEQ ID NO17所示的氨基酸序列或其功能性變體或片段。
上文所述的本發(fā)明范圍很廣，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，本發(fā)明并不限于上述，還包括以下部分說明并給出實施例的實施方案。


本發(fā)明的具體優(yōu)選方面將參照附圖加以說明。在附圖中圖1顯示綿羊X染色體的遺傳連鎖圖譜?；蜷g距表示為Kosamabi厘摩(cM)。Inverdale基因定位在陰影條所示的區(qū)域。
圖2a顯示Inverdale綿羊中GDF-9B的外顯子2的核苷酸序列。Inverdale T→A核苷酸取代(加工位點以外的92個核苷酸)的位置用粗體表示。受該取代影響的三聯(lián)密碼用下劃線標(biāo)記。對多肽進行蛋白切割的加工位點以及TGA終止密碼子用框表示。成熟肽編碼序列介于上述兩個框之間。
圖2b顯示Hanna綿羊中GDF-9B的外顯子2的核苷酸序列。HannaC→T核苷酸取代(加工位點以外的67個核苷酸)的位置用粗體表示。受該取代影響的三聯(lián)密碼用下劃線標(biāo)記。使原肽經(jīng)蛋白切割產(chǎn)生成熟片段的加工位點以及TGA終止密碼子用框表示。成熟肽編碼序列介于上述兩個框之間。
圖2c顯示圖2a中bp394-599的核苷酸序列。
圖2d顯示圖2b中bp394-599的核苷酸序列。
圖2e顯示圖2a中bp472-486的核苷酸序列。
圖2f顯示圖2b中bp448-462的核苷酸序列。
圖3a顯示GDF-9B Inverdale蛋白的推定的氨基酸序列，所述蛋白由圖2a的核苷酸序列編碼。圖中顯示了成熟GDF-9B的正常形式，原肽部分以斜體表示。由于Inverdale堿基取代而產(chǎn)生的氨基酸(天冬氨酸，D)用粗體表示。
圖3b顯示截短的GDF-9B Hanna蛋白的推定的氨基酸序列，所述蛋白由圖2b的核苷酸序列編碼。圖中顯示了成熟GDF-9B多肽的正常形式，原肽部分以斜體表示。Hanna突變體中，野生型氨基酸(谷氨酰胺，Q)變成了終止密碼子(END)。
圖4顯示了綿羊與人和小鼠的GDF-9B的推定氨基酸序列的比較。序列上方的括號中的數(shù)字表示成熟肽的氨基酸位置?？招娜潜硎綥eu多態(tài)性的位置，實心三角表示單個內(nèi)含子的位置。假定的RRAR加工位點和保守的半胱氨酸用陰影表示。氨基酸23和31位的FecXI和FecXH突變的位置用粗體表示。
圖5顯示Inverdale，Hanna和野生型綿羊GDF-9B序列的層析譜——顯示了發(fā)生突變的區(qū)域。
圖6顯示預(yù)測的FecXI蛋白與來自其它物種的TGF超家族成員的突變區(qū)域的對比排列。
圖7顯示綿羊X染色體上含有GDF9-B基因的區(qū)域的連鎖圖譜。
圖8顯示攜帶Inverdale FecXI突變的綿羊和非攜帶者，利用對強制PCR片段的XbaI消化，而進行SNP變體檢測試驗的結(jié)果非攜帶者，(I+)雜合子攜帶者和(II)純合子攜帶者都顯示在雌性純合子(樣品A1，A2)，雄性攜帶者(樣品A5，A10)和雄性非攜帶者(樣品A3，A4，A6，A7，A8，A11，A12和A13)的側(cè)面。
發(fā)明詳述這是首次發(fā)現(xiàn)，Inverdale和Hanna綿羊的GDF-9B基因中的突變，導(dǎo)致雜合型動物排卵率增加而純合型動物不育。
本文中“包括”是指“包括但不限于”，“包含”也具有相應(yīng)的涵義。
術(shù)語“分離的”是指基本上從天然能產(chǎn)生所述核酸的細(xì)胞或生物所含的各種雜質(zhì)序列中分離或純化出來，包括經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)純化的核酸，通過重組技術(shù)(包括PCR技術(shù))制備的核酸，以及合成的核酸。優(yōu)選從表達Inverdale或Hanna表型的綿羊的基因組DNA中分離所述核酸分子。
術(shù)語“排卵調(diào)節(jié)”是指與在未處理的哺乳動物中的觀察結(jié)果相比，排卵率的增加或降低。
術(shù)語“配體”是指能與另一分子(如多肽或肽)結(jié)合的任何分子，應(yīng)包括，但不限于抗體和噬菌體展示分子。
上述方法中使用的探針和引物也是本發(fā)明的一部分。這些探針和引物可包含能在嚴(yán)格條件下與突變的GDF-9B基因序列雜交的本發(fā)明核酸分子的片段。所述探針和引物也可以用于研究所述突變基因的結(jié)構(gòu)和功能，以及用于從除了表達Inverdale或Hanna表型的綿羊以外的其它哺乳動物中獲得該基因的同系物。
核酸探針和引物可以根據(jù)本發(fā)明的核酸來制備?！疤结槨卑ǜ綆в锌蓹z測的標(biāo)記或報道分子的分離的核酸。常用的標(biāo)記包括放射性同位素、配體、化學(xué)發(fā)光試劑或熒光試劑，以及酶。
核酸的“片段”是核酸的一部分，其比全長短，并至少包含一段在下述嚴(yán)格條件下可與本發(fā)明核酸分子或其互補序列特異性雜交的最短序列。多肽的“片段”是多肽的一部分，其比全長短，但仍然保留了提高或降低哺乳動物排卵率，或?qū)е虏溉閯游锊挥纳飳W(xué)功能。因此，本發(fā)明的片段具有本發(fā)明核酸或多肽的至少一種生物學(xué)活性。
“引物”是短的核酸，優(yōu)選長度為15個核苷酸或更長的寡核苷酸，其可通過核酸雜交而與互補的靶DNA鏈退火，形成所述引物與所述靶DNA鏈的雜交體，然后利用聚合酶(優(yōu)選DNA聚合酶)沿靶DNA鏈延伸。引物對可用于擴增核酸序列，如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或本領(lǐng)域熟知的其它擴增方法。PCR引物對可來自本發(fā)明的核酸序列，例如通過使用為此目的而設(shè)計的計算機程序，如Primer(Version 0.51991，Whitehead Instituteof Biomedical Research，Cambridge，MA)。
制備和使用探針和引物的方法在，例如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2nded，vol.1-3，ed Sambrook等.Cold Spring HarbourLaboratory Press，Cold Spring Harbour，NY，1989中有說明。
探針或引物可以是在溶液中自由存在，也可以經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方法共價或非共價連接于固相支持物上。
使用特異性擴增引物對擴增靶核酸序列(如通過PCR)時的嚴(yán)格條件，是能使該引物對僅與靶核酸序列雜交的條件，在這樣的條件中，具有相應(yīng)野生型序列(或其互補序列)的引物可與所述靶核酸結(jié)合。
除堿基組成、互補鏈長度和雜交核酸之間核苷酸堿基錯配的數(shù)目外，核酸雜交還可被如下條件影響，如鹽濃度、溫度、或有機溶劑，這些是本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解的。
當(dāng)涉及探針或引物時，術(shù)語“特異于(靶序列)”表示，在包含靶序列的指定樣品中，所述探針或引物在嚴(yán)格條件下僅與所述靶序列雜交。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種遺傳標(biāo)記，其用于借助DNA來篩選綿羊、山羊、牛、鹿、小鼠、大鼠或任何其他商業(yè)上重要的哺乳動物的排卵增加或不育。本發(fā)明提供了使用核酸分子鑒定動物個體中序列變體的工具(means)，其中所述核酸分子包含源自突變的GDF-9B DNA序列，或與突變的GDF-9B基因相連的基因組DNA的序列，所述序列變體與該動物的排卵增加或不育有關(guān)。盡管這些變體不一定直接導(dǎo)致排卵增加或不育的性狀，但它們與這些性狀關(guān)系密切，因而足以預(yù)測這種性狀。鑒定這些序列變體的方法是本領(lǐng)域所熟知的，包括但不限于，限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)，AFLP，對突變的GDF-9B基因內(nèi)的DNA或與突變的GDF-9B基因相連的DNA進行直接測序，或者對串聯(lián)重復(fù)單元的可變數(shù)量(VNTR)或微衛(wèi)星多態(tài)性(二元核苷酸重復(fù)或三元核苷酸重復(fù))進行鑒定和定性，對單核苷酸多態(tài)性(SNP)進行檢測和定性。
所述多肽可如下產(chǎn)生在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達適當(dāng)?shù)妮d體，該載體包含本發(fā)明的核酸分子或其功能性變體或片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員對此可以理解。
克隆載體可以根據(jù)所使用的宿主或宿主細(xì)胞來選擇。有效宿主通常具備以下特征(a)自我復(fù)制的能力；(b)針對任何特定的限制性內(nèi)切核酸酶具有唯一的靶點；以及(c)優(yōu)選，攜帶編碼易于篩選的標(biāo)記(如抗生素抗性)的基因。
具有這些特性的兩種主要載體是質(zhì)粒和細(xì)菌病毒(噬菌體)。目前優(yōu)選的載體包括pUC，pBlueScript，pGEM，PGEX，pBK-CMV，λZAP,λGEM和pSP系列。但上述所列并非限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明的DNA分子可通過與適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列可操作地連接在具有復(fù)制能力的表達載體中而被表達。調(diào)控序列可包括如復(fù)制起點，啟動子，增強子和轉(zhuǎn)錄終止序列。對表達載體中包含的調(diào)控序列的選擇取決于被用來表達所述DNA的宿主或宿主細(xì)胞的類型。
一般情況下，原核生物，酵母或哺乳動物細(xì)胞是有用的宿主。術(shù)語“宿主”還包括質(zhì)粒載體。合適的原核宿主包括大腸桿菌(E.coli)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，和假單胞菌屬(Pseudomonas)的許多種。常用的啟動子，如β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)啟動子系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的。與所選宿主相容的任何現(xiàn)有啟動子系統(tǒng)都可使用。酵母中使用的載體也是現(xiàn)有的和熟知的。一個合適的例子是2μ復(fù)制起點質(zhì)粒。
類似的，在哺乳動物細(xì)胞中使用的載體也是眾所周知的。這樣的載體包括SV-40、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的DNA序列、單純皰疹病毒的已知衍生物，以及衍生自質(zhì)粒和噬菌體DNA的組合的載體。
其它真核表達載體是本領(lǐng)域所熟知的(如，P.J.Southern & P.Berg,J.Mol.Appl.Genet.1 327-341(1982)；S.Subramani等，Mol.Cell.Biol.1，854-864(1981)；R.J.Kaufmann & PA.Sharp，“Amplification and Expression ofSequences Cotransfected with a Modular Dihydrefolate ReducaseComplementary DNA Gene,J.Mol.Biol.159，601-621(1982)；R.J.Kaufmann& PA.Sharp，Mol.Cell.Biol.159，601-664(1982)；S.I.Scahill等，“ExpressionAnd Characterization Of The Product Of A Human Immune InterferonDNAgENE In Chinese Hamster Ovary Cells，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80，4654-4659(1983)；G Urlaub & L.A.Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77，4216-4220(1980)。
可用于本發(fā)明的表達載體包含至少一個表達調(diào)控序列，該調(diào)控序列與將要表達的DNA序列或片段可操作地連接。所述調(diào)控序列插入載體以便控制并調(diào)節(jié)所克隆的DNA序列的表達。可用的表達調(diào)控序列的實例如lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，tac系統(tǒng)，trc系統(tǒng)，λ噬菌體的主要操縱子和啟動子區(qū)域，酵母酸性磷酸酶的糖酵解啟動子(如Pho5)，酵母α接合因子的啟動子，以及來源于多形瘤、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、和猿猴病毒的啟動子(如SV40的早期和晚期啟動子)，以及其它已知可以控制原核和真核細(xì)胞和它們的病毒的基因表達的序列，或其組合。
在載體的構(gòu)建中，通過簡便快捷的分析就可區(qū)分包含異源DNA的載體和未經(jīng)修飾的載體，這也是有利的。這些分析中可以使用的報道系統(tǒng)包括報道基因，其他可檢測的標(biāo)記(它們產(chǎn)生可以定量的顏色變化)，抗生素抗性等。一種優(yōu)選的載體中使用了β-半乳糖苷酶報道基因，該基因通過在X-gal平板上有藍(lán)色表型的克隆來檢測。這便于進行選擇。一個實施方案中，β-半乳糖苷酶基因被編碼多角體蛋白的基因所代替，該基因通過用X-gal染色使克隆呈現(xiàn)白色表型而檢測。這種藍(lán)-白顏色選擇可用做檢測重組載體的有用標(biāo)記。
一旦選定，就可按照常規(guī)方法從培養(yǎng)物中分離載體，如凍融抽提，然后純化。
為了進行表達，可將包含本發(fā)明DNA和調(diào)控信號的載體插入或轉(zhuǎn)化至宿主或宿主細(xì)胞中。可用于表達的宿主細(xì)胞包括眾所周知的原核和真核細(xì)胞。合適的原核宿主包括，如大腸桿菌，如大腸桿菌，S G-936，大腸桿菌HB101，大腸桿菌W3110，大腸桿菌X1776，大腸桿菌X2282，大腸桿菌，DHT，和大腸桿菌MR01，假單胞菌屬，芽孢桿菌屬，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，以及鏈霉菌屬(Streptomyces)。合適的真核細(xì)胞包括酵母和其它真菌、昆蟲、動物細(xì)胞，如組織培養(yǎng)中的COS細(xì)胞，CHO細(xì)胞，人的細(xì)胞。
基于所使用的宿主，用適合于所述細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行轉(zhuǎn)化。對于原核細(xì)胞或包含細(xì)胞壁實質(zhì)的其它細(xì)胞，可使用鈣處理方法(Cohen，S NProceedings，National Academy of Science，USA692110(1972))。對于不具有這種細(xì)胞壁的哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選Graeme和Van Der Eb的磷酸鈣沉淀法(Virology 52546(1978))。酵母中的轉(zhuǎn)化可用Van Solingen等(J.Bact.130946(1977))和Hsiao等(Proceedings，National Academy of Science，763829(1979))的方法進行。
當(dāng)用合適的載體轉(zhuǎn)化了選定的宿主后，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞，可產(chǎn)生所述被編碼的多肽或肽，通常是融合蛋白的形式。本發(fā)明的多肽或肽可通過上述快速分析來檢測。然后根據(jù)需要回收并純化這些多肽或肽?；厥蘸图兓衫帽绢I(lǐng)域任何已知方法進行，如吸附于陰離子交換樹脂，并隨后洗脫。這種產(chǎn)生本發(fā)明多肽或肽的方法組成了本發(fā)明的另一方面。
用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞也形成本發(fā)明的又一方面此外，與本發(fā)明的核苷酸序列和氨基酸序列基本相同的核苷酸或肽也可以應(yīng)用在優(yōu)選的實施方案中。這里所述的“基本相同”是指兩種序列，當(dāng)它們通過GAP或BESTFIT(核苷酸和肽)用默認(rèn)的缺口權(quán)重進行對比排列時，或者通過計算機算法BLASTP(肽)或BLAST X(核苷酸)計算時，共享至少60％，優(yōu)選75％，最優(yōu)選90-95％的序列同一性。優(yōu)選地，不相同的殘基位置是由保守氨基酸取代產(chǎn)生的不同。例如，具有類似的化學(xué)特性如荷電性或極性的氨基酸的取代不太可能影響蛋白的特性。實例包括用谷氨酰胺取代天冬酰胺，或者用谷氨酸取代天冬氨酸。
本文所用術(shù)語“變體”是指與本發(fā)明的序列“基本相同”的核苷酸、多肽和肽序列。這種變體可能源自對天然核苷酸或氨基酸序列的修飾(如插入、取代或缺失一個或多個核苷酸或氨基酸)，或者也可能是天然產(chǎn)生的變體。術(shù)語“變體”還包括，與本發(fā)明序列在定義為2x SSC 65℃的標(biāo)準(zhǔn)條件下，或優(yōu)選在定義為6x SSC 55℃的嚴(yán)格條件下，能進行雜交的同源序列，只要所述變體能調(diào)節(jié)雌性哺乳動物的排卵率。當(dāng)需要這種變體時，適當(dāng)改變天然DNA的核苷酸序列。這種改變可通過DNA的合成或通過對天然DNA的修飾來實施，如通過位點特異性誘變或盒式誘變。優(yōu)選用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，對cDNA或基因組DNA上需要序列修飾的部分，進行位點特異性引物介導(dǎo)的誘變。
術(shù)語“蛋白或多肽”是指由本發(fā)明核酸分子編碼的蛋白，包括具有相同生物活性(即調(diào)節(jié)排卵的能力)的片段、突變體和同系物。本發(fā)明的蛋白或多肽可從天然來源分離，通過重組核酸分子的表達產(chǎn)生，或者化學(xué)合成。
本發(fā)明另一方面提供了突變的GDF-9B多肽在調(diào)節(jié)哺乳動物排卵率方面的應(yīng)用，所述多肽具有圖3a或3b所示的氨基酸序列，或這些序列的具有與其基本相同的活性的變體或片段。
所述方法包括給予所述哺乳動物有效量的突變型或野生型GDF-9B或其抗體或抗原，或其變體。
優(yōu)選地，對排卵率的調(diào)節(jié)包括給予針對突變的GDF-9B的配體或抗原，以降低內(nèi)源性突變型GDF-9B的水平，從而在雌性哺乳動物中誘導(dǎo)不育。
本發(fā)明另一個方面提供了能與本發(fā)明多肽結(jié)合的配體。更普遍的，所述配體是一種抗體。應(yīng)理解術(shù)語“抗體”包括保留了與本發(fā)明所述多肽結(jié)合的能力的抗體片段或類似物，包括但不限于Fv，F(xiàn)(ab)2片段，scFv分子等等?？贵w可以是多克隆或單克隆的，優(yōu)選單克隆抗體。在部分實施方案中，配體可以是噬菌體展示分子。
本發(fā)明另一方面提供了一種組合物，它至少包含本發(fā)明的多肽以及可藥用或獸用的載體或稀釋劑。當(dāng)然，可在該組合物中包含不止一種的本發(fā)明多肽。
本發(fā)明還有一方面提供了一種試劑盒，它可鑒定攜帶有單拷貝的本發(fā)明突變型GDF-9B核酸分子(雜合型)的雄性和雌性哺乳動物，和/或攜帶有兩個拷貝的本發(fā)明突變型GDF-9B核酸分子(純合型)的雌性哺乳動物，所述試劑盒包含·用于擴增GDF-9B的合適區(qū)域的引物對；并任選一或多種·用于擴增(如PCR擴增)的緩沖鹽溶液；·脫氧核苷酸混合物；·熱穩(wěn)定性DNA聚合酶；·來自被檢測物種的對照DNA；·合適的標(biāo)準(zhǔn)物；·適當(dāng)?shù)臋z測系統(tǒng)，其可以包含每對帶有熒光標(biāo)記或其它標(biāo)記的引物中的一種，或用于檢測產(chǎn)物的帶有標(biāo)記的探針；和·擴增以及對擴增產(chǎn)物后續(xù)檢測的說明和方案以及對結(jié)果的解釋。
本發(fā)明還提供了一種試劑盒，用于檢測哺乳動物中循環(huán)的突變型GDF-9B蛋白。這種試劑盒可包含本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的標(biāo)準(zhǔn)ELISA或酶免疫分析試劑盒；例如，這種試劑盒可包含特異性針對突變的DF-9B蛋白的抗體，以及用于增強該信號的標(biāo)準(zhǔn)第二抗體放大組分。所述抗體可與熒光標(biāo)記或放射性標(biāo)記或發(fā)光標(biāo)記偶聯(lián)，或可對所述第二抗體進行標(biāo)記。也可應(yīng)用合適的溶液，對照，緩沖液，說明及方案。
現(xiàn)在將提供本發(fā)明的實施例，所述實施例并非是作為對本發(fā)明的限制。
動物本項研究所測試的動物，有的來自位于Invermay Agricultural Centre和Woodlands Research Station的AgResearch Inverdale飼養(yǎng)群，還有的來自Mr Arnold Gray，Orawia，Southland(Gray和Davis，1995)可供出售的群體。
所有攜帶Inverdale的動物都是最初的Inverdale母羊(A281)的后代，正是在該母羊中首次發(fā)現(xiàn)了Inverdale基因。
表型測量通過腹腔鏡檢查來確定母羊的攜帶狀態(tài)，從而鑒別不育的II型母羊，或者通過排卵率來區(qū)分I+攜帶者與++非攜帶者。
公羊的攜帶狀態(tài)可以根據(jù)它們的后代的排卵率來確定。自從在II型母羊中發(fā)現(xiàn)不育的卵巢后，一種更快速檢測公羊后代的方法得到應(yīng)用，該方法使每只公羊與7-10只I+母羊交配，然后對6月齡的后代進行腹腔鏡檢。只要發(fā)現(xiàn)不育的II型后代，就可以將該公羊確認(rèn)為攜帶者。這樣做的目的是保證每只公羊產(chǎn)生5只后代，因為在一個只有5只后代的樣本中，產(chǎn)生IY公羊(沒有帶條紋(streak)卵巢的后代)的可能性僅0.031(Davis等1994)。
DNA純化和測序從每只動物的5-10ml全血中的白細(xì)胞中純化DNA(Montgomery和Sise，1990)。對所有亞克隆和PCR產(chǎn)物的測序由Otago大學(xué)基因研究中心(University of Otago Centre for Gene Research)提供的商業(yè)服務(wù)(ABI 373自動測序儀)完成。
DNA標(biāo)記能擴增綿羊DNA的微衛(wèi)星(二核苷酸重復(fù)單元)標(biāo)記由上述AgResearch Molecular Biology Unit開發(fā)(Galloway等，1996)，或來自牛和綿羊的基因作圖庫。如前所述將新的標(biāo)記定位在綿羊的X染色體上(Galloway等，1996)。
對綿羊GDF-9B基因產(chǎn)物的PCR擴增和限制性消化使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的標(biāo)準(zhǔn)條件擴增基因組DNA。引物可根據(jù)人和小鼠的序列來設(shè)計(Galloway等，2000)，經(jīng)證實它們成功地從綿羊DNA中擴增得到基因片段。含有單核苷酸突變的PCR產(chǎn)物用市售限制酶Spel，BsrSI和/或Xbal按照廠商建議的標(biāo)準(zhǔn)條件進行消化。PCR產(chǎn)物和限制性片段化產(chǎn)物通過在2-3％的瓊脂糖凝膠上進行電泳分離來鑒定，同時在凝膠上進行電泳的還有市售DNA分子量標(biāo)志。
測序以及對突變進行檢測的方法我們對PCR片段的所有三種基因型(Inverdale FecX+，Hanna FecXH和野生型FecX)中的綿羊GDF-9B基因進行了測序(Galloway等，2000)，測序在ABI 373測序儀上完成。我們通過對至少6只攜帶每一種等位基因(FecxI，F(xiàn)ecXH和FecX+)的動物的基因組DNA中覆蓋完整編碼區(qū)的序列進行測定，證實了單堿基取代。除了FecXH或FecXI堿基取代(圖2a和2b)，在綿羊GDF-9B基因中僅測出另一種變異，即在某些動物的信號序列中L10或L11的位置上缺失一個Leu密碼子(CTT)(堿圖4和5)。所述Leu缺失與FecXH或FecXI等位基因無關(guān)，與品種(breed)有關(guān)。FecXHC→T取代致使BsrSI限制性位點(actg/gn)丟失，但獲得SpeI位點(a/ctagt)。我們證實在FecXH/FecXH母羊和FecXH/Y公羊中，跨越該區(qū)域的一段541 bp的PCR片段經(jīng)SpeI切割，產(chǎn)生了476和65 bp片段，但在FecXI和野生型動物中并非如此，由此證實了上述堿基取代。在每種等位基因都有一個拷貝的綿羊(FecXI/FeXH)中，鑒定了所有三種片段(541，476和65bp)。類似地，在FecXI和野生型動物出現(xiàn)了BsrSI切割片段，但在FecXH攜帶者中沒有。使用引物#12(GAAGTAACCAGTGTTCCCTCCACCCTTTTCT)；和#13(CATGATTGGGAGAATTGAGACC))從FecXI攜帶者的DNA產(chǎn)生了一段154bp的PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物產(chǎn)生了一個強制性XbaI位點。XbaI(t/ctaga)可以切割攜帶A等位基因(tctaga)的FecXI/FecXI母羊和FecXI/Y公羊的PCR產(chǎn)物，但不能切割攜帶T等位基因(tctagt)的野生型或FecXH的PCR產(chǎn)物。因此，XbaI通過除去僅出現(xiàn)在FeeXI攜帶者中的30個核苷酸的引物#12，而將154bp的PCR產(chǎn)物切割為124bp的片段。所有限制性消化都按照廠家說明在PCR產(chǎn)物的等份試樣上進行，片段在3％FMC Metaphor瓊脂糖凝膠上分離。
連鎖作圖的方法我們?nèi)缜八?Galloway等，1996)，用CRIMAP，通過多點分析，構(gòu)建了綿羊X染色體遺傳連鎖圖譜，并對另外幾個遺傳標(biāo)記MAOA，McM551，OarMP1，和TIMPI進行了定位(Galloway等，2000)。FecXI和GDF-9B被定位在雌性Inverdale連鎖作圖家族中，通過使9只雄性攜帶者(FecXI/Y)與雌性野生型交配，產(chǎn)生62個雜合型FecXI/FecX+雌性第二代，就得到該家族。這62只雌性動物與10只FecXI/Y雄性動物交配，得到96個純合型FecXI/FecXI或雜合型FecXI/FecX+雌性后代。我們通過腹腔鏡檢確定Inverdale動物的攜帶狀態(tài)，以便鑒定不育的FecXI/FecXI母羊，通過對雌性后代進行子孫測試和腹腔鏡檢來鑒定FecXI/Y公羊。出身通過遺傳標(biāo)記來證實，在第三代中選出的所有FecXI/FecX+雌性動物都是FecXI/FecXI不育的雌性動物的同胞(sibling)。未能從第一代收集到野生型雌性動物的DNA。我們根據(jù)基因編碼區(qū)中的T→A突變對GDF-9B進行作圖。
結(jié)果測序結(jié)果對Inverdale和Hanna中編碼完整成熟肽的基因組DNA的PCR片段進行了測序。所測序的區(qū)域還包括位于外顯子2中的原肽的絕大部分(從距離人/小鼠內(nèi)含子/外顯子3’側(cè)70個堿基之處至tga終止密碼子以外30個堿基)。將來自這兩個綿羊品系的GDF-9B序列與野生型綿羊的序列進行比較。測序數(shù)據(jù)表明，在GDF-9B成熟肽中有兩種不同的單堿基取代，其中一種出現(xiàn)在Inverdale品系中，另一種出現(xiàn)在Hanna品系中(圖2)。
在Hanna動物中，位于成熟肽加工位點遠(yuǎn)端的第67位的核苷酸C是T。這使密碼子CAG(編碼谷氨酰胺(G))變成TAG(編碼終止信號)，從而產(chǎn)生截短的成熟蛋白(圖3b)。
在Inverdale動物中，位于成熟肽加工位點遠(yuǎn)端的第92位的核苷酸T變成A，使密碼子GTC(纈氨酸(G))變成(天冬氨酸(D))(圖3a)。
單個堿基取代的驗證通過對至少6個攜有每種基因型(Inverdale，Hanna和野生型非攜帶者)的動物進行測序，驗證了這些單堿基取代。每一動物測序至少一次(表1)。在這組動物中，野生型動物中未發(fā)現(xiàn)Inverdale取代或Hanna取代，Hanna動物中未發(fā)現(xiàn)Inverdale取得，反之亦然。
表1對Inverdale和Hanna動物中單個堿基取代的測序鑒定。
所有動物具有已知品系的已知基因型(+＝野生型等位基因，I＝Inverdale等位基因，H＝Hanna等位基因，Y＝Y(jié)-染色體)。數(shù)字表示來自該動物的單個序列鑒定出相應(yīng)序列變異的次數(shù)。
Hanna Inverdale基因型動物編號Cag(wt)Tag gTc(wt) gAcIY公羊667 2 2IY公羊3432 1 1II母羊2663 1 1HY公羊9513 3 3HY公蘭4864 1 1HH母羊7133 2 2HI母羊7141 2 2 2 2HI母羊4865 1 1 1 1H+母羊7151 1 1 1I+母羊2682 1 1 1+Y羅姆尼羊7610 2 2++羅姆尼羊2884 2 2++羅姆尼羊2958 2 2+Y羅姆尼羊1079 1 1+Y美利奴羊100 2 2++美利奴羊121 1 1限制酶搜索研究表明，Hanna堿基取代在其附近產(chǎn)生SpeI酶切割位點(a/ctagt)并除去BsrSI(actg/gn)位點。這些切割位點如下證實SpeI能將HY和HH動物中跨該區(qū)域的541bpPCR片段切割成476bp和65bp的片段，但在IY和+Y動物中卻不是如此。在攜帶一個拷貝的Inverdale基因和一個拷貝的Hanna基因的綿羊(HI)中，541bp和476bp的片段都可以找到。
類似地，研究顯示BsrS1切割來自IY和+Y動物的片段，但不切割來自HY動物的片段，HI綿羊則顯示這兩種帶。
Inverdale堿基取代未能在該取代位點產(chǎn)生或除去任何酶解位點，因此制備了一種強制性RFLP引物，它在Inverdale等位基因的PCR產(chǎn)物中而不是在野生型中導(dǎo)入XbaI切割位點(t/ctaga)。含有導(dǎo)入的XbaI位點的PCR產(chǎn)物僅在出現(xiàn)Inverdale A突變的情況下產(chǎn)生，在Hanna或野生型動物中不產(chǎn)生。在這種情況下，所述PCR產(chǎn)物被XbaI切割，去除30個堿基，導(dǎo)致最終產(chǎn)物的長度改變。
Inverdale DNA鏈..TTTCAAGACAGCTT..
30b PCR引物末端-tttct在PCR終產(chǎn)物中產(chǎn)生XbaI切割位點tctaga應(yīng)用該方法，來自2HY，1 HH，2+Y和3++動物的PCR片段不被XbaI切割，而來自36II和12IY動物的PCR片段被切割。一例HI動物和47例I+動物顯示，切割的和未切割的片段都有，預(yù)計為雜合型動物。
測序及突變的檢測我們使用針對人、小鼠和綿羊的序列設(shè)計的引物(Galloway等，2000)，對綿羊GDF-9B基因的cDNA和基因組DNA序列進行了測序。綿羊基因與人、小鼠和大鼠的基因類似(Laitinen等，1998；Dube等，1998；Aaltonen等，1999；Jaatinen等，1999)，都具有TGFβ超家族其它成員的典型基因特征。這一全長1179bp的序列編碼393個氨基酸的前原肽(圖4)，它包括被近5.4kb的內(nèi)含子分隔的兩個外顯子。25個氨基酸的預(yù)測的信號肽位于244個氨基酸的原區(qū)之前，125個氨基酸的推定的C末端成熟肽區(qū)域不包括RRAR蛋白酶切割位點。綿羊編碼區(qū)在核苷酸水平上與人的編碼區(qū)有82.9％的同源性，與小鼠的有78.8％的同源性，與大鼠的有78.4％的同源性。
我們還對Inverdale(FecXI)和Hanna(FecXH)攜帶者的基因組DNA進行了測序(圖5)。FecXH攜帶者的成熟肽編碼區(qū)第67位核苷酸上的C→T轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致在第23位氨基酸(未經(jīng)加工的蛋白質(zhì)中第291位殘基)處，由一個提前終止密碼子取代了谷氨酸(Q)。FecXH攜帶者的成熟肽這么早就提前截短，則很可能導(dǎo)致GDF-9B功能的完全喪失。在FecXI攜帶者的成熟肽的第92位核苷酸處，出現(xiàn)與此不同的T→A轉(zhuǎn)換。這一突變使得第31位的殘基(未經(jīng)加工的蛋白質(zhì)上第299位殘基)由纈氨酸(V)變?yōu)樘於彼?D)。這種FecXI突變是所述蛋白質(zhì)的高度保守區(qū)域中的一個非保守轉(zhuǎn)換。來自不同物種的所有其它TGFβ超家族成員在該位置僅包含保守的疏水氨基酸纈氨酸、異亮氨酸或亮氨酸(圖6)。
對綿羊GDF-9B作圖為了定位FecXI，我們制作了綿羊X-染色體的遺傳連鎖圖譜(Galloway等，1996)，并將FecXI定位在綿羊X染色體中心區(qū)上間隔10cM的側(cè)翼標(biāo)志之間(圖7)。在三代共177個動物中發(fā)現(xiàn)了Inverdale表型的連鎖關(guān)系，其中最多有96次指示性(informative)雌性減數(shù)分裂。連鎖作圖表明，F(xiàn)ecXI位于包含TIMPI和MAOA的區(qū)域(與人的Xpl1.2-11.4同線)，而不位于包含PHIA1，XIST和ATP7A的區(qū)域(人Xq13)。通過綿羊中位于OarMP1附近的斷裂點可將這兩組基因歸屬到人和小鼠X染色體上的不同同線(syntenic)組。GDF-9B經(jīng)作圖定位于人Xpl1.2以及小鼠X染色體的同線區(qū)(Dube等，1998；Aaltonen等，1999)。我們在作圖中將綿羊GDF9B定為與在我們的Inverdale圖譜中的FecXI一樣的10cM間隔，在78例共-信息(co-informative)雌性減數(shù)分裂中，未發(fā)現(xiàn)FeXI表型與BMP15的重組體，參見表2。
表2FeXI與綿羊X染色體上的基因和標(biāo)志的連鎖標(biāo)志 重組體數(shù) 共-信息減數(shù)分裂重組分?jǐn)?shù)(θ) Lod評分(雌性)TGLA687 176 0.17 4.20MAOA 2 143 0.15 1.49McM5519 196 0.07 11.61GDF-9B0 213 0 23.18TIMP1 0 177 0 12.34TGLA540 170 0 10.54OarMPI1 206 0.01 18.79ATP7A 1 147 0.08 2.08XIST 2 148 0.13 2.20PHKA1 4 176 0.08 8.47OarAE133 5 211 0.07 14.57對Inverdale圖譜中FecXI表型的CRIMAP兩點連鎖分析在野生型和FeXI綿羊編碼TIMP1的DNA之間未發(fā)現(xiàn)顯著的序列差異，在其它FecXI攜帶者中鑒定并發(fā)(subsequent)重組體的工作，排除了TIMP1作為FecXI候選者的可能。
使用分離的多肽和抗體來控制排卵通過大腸桿菌產(chǎn)生成熟的GDF-9B蛋白，其含有如SEQ ID No10所示的野生型序列，通過化學(xué)方法使其與匙孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)，將這種抗原在弗氏完全佐劑(FCA)中的制劑給10只非發(fā)情期的羅姆尼母羊(0.4mg/只母羊)皮下注射(sc)。另外9只羅姆尼母羊僅注射(sc)KLH在FCA中的制劑作為對照(0.4mg/只母羊)。然后，每隔一個月，對所有動物加強注射抗原(0.2mg/母羊KLH-GDF9B或0.2mg/母羊KLH)在Span，Tween，油佐劑中的制劑。當(dāng)這些母羊進入繁殖季節(jié)時(大概是在初次免疫接種的3-4個月后)，通過切除了輸精管并配了帶有標(biāo)記的挽具的公羊檢查出一些有發(fā)情行為的母羊，對這些母羊進行腹腔鏡檢，以便觀察卵巢表面的黃體(corpora lutea)(即，排卵部位)。10只接受KLH-GDF-9B處理的母羊中的7只，以及所有9只接受KLH處理的母羊都顯示有發(fā)情行為。在顯示發(fā)情行為的KLH-GDF9B免疫組和KLH免疫組綿羊中，平均排卵率見表3。
表3在使用匙孔嘁血藍(lán)(KLH)或偶聯(lián)有KLH的大腸桿菌表達型GDF9B抗原反復(fù)免疫后，表現(xiàn)發(fā)情行為的綿羊中的平均排卵率

KLH-GDF-9B動物相比于KLH對照動物，排卵率顯著增加(p＜0.001)ANOVA，表明發(fā)情的KLH-GDF-9B動物中排卵率的增加與抗體對GDF-9B的應(yīng)答有關(guān)的+證據(jù)見表4表4在使用KLH或偶聯(lián)有KLH的大腸桿菌來源的GDF9B成熟肽對母綿羊反復(fù)免疫之前或之后，綿羊血漿中的平均(范圍)抗體水平。表中所示數(shù)值是在490nm處的吸光值，它代表了針對GDF-9B的抗體的水平。

將綿羊血漿稀釋為1∶5000后，通過ELISA測定抗體水平。ELISA法包括，將96孔板用100ng/孔大腸桿菌表達的全長GDF-9B包被，經(jīng)適當(dāng)?shù)姆忾]處理并連續(xù)洗板后，用100μl稀釋的綿羊血漿和100μl試驗緩沖液溫育。用綿羊血漿溫育后，洗板數(shù)次，加入兔抗綿羊HRP，37℃1小時。然后洗板，用鄰苯二胺加過氧化氫顯色，用硫酸終止顯色。
在另一項證實綿羊GDF-9B的功能性變體能影響卵泡發(fā)育的研究中，10只雌性小鼠腹膜內(nèi)(ip)免疫大腸桿菌來源的綿羊GDF-9B成熟蛋白(0.2mg)在FCA(0.22ml)中的制劑，另外10只雌性小鼠用牛α-乳清蛋白(0.2mg)在FCA(0.22 ml ip)中的制劑免疫，作為對照。然后，用相應(yīng)抗原在Span/Tween/油中的混合物，以2周的間隔，加強免疫3次(第1次0.1mg，第2次和第3次0.05mg)，末次加強免疫的1周后，處死動物。將卵巢固定在Bouin′s含水固定劑中，進行形態(tài)度量學(xué)分析(morphometric analysis)。用系統(tǒng)性隨機取樣方法測定卵巢前囊(preantral)和卵巢囊(antral)中正在發(fā)育的卵泡的總數(shù)。數(shù)據(jù)見表5。
表5小鼠用綿羊GDF9B或牛α-乳清蛋白免疫后，卵巢前囊和卵巢囊中卵泡的平均數(shù)量

The number of preantral follicles in the GDF9B處理組小鼠的前囊狀卵泡數(shù)顯著低于牛α-乳清蛋白處理組小鼠的，p＜0.005(ANOVA)。這兩種處理組的小鼠在囊狀卵泡數(shù)方面沒有顯著性差異。
表明前囊狀卵泡數(shù)的差異與抗體對GDF-9B的應(yīng)答有關(guān)的證據(jù)如下。小鼠經(jīng)反復(fù)免疫后，稀釋至1∶50,000的血清中平均(范圍)抗體水平是2.18(1.28-2.90)，而所有用α-乳清蛋白免疫的小鼠沒有應(yīng)答(即＜0.1)?？贵w水平用ELISA法檢測，以490nm處的吸光值表示。
在另一項研究中，我們通過給予與綿羊GDF-9B肽序列對應(yīng)的抗原，而在受體動物中誘導(dǎo)不育。為獲得不育性，我們合成了一段15個氨基酸的肽序列，它對應(yīng)于突變的野生型綿羊GDF-9B成熟區(qū)的一種變體，它還帶有一個可以與匙孔嘁血藍(lán)(KLH)偶聯(lián)成抗原的C-末端半胱氨酸。我們所用的肽序列是SEVPGPSREHDGPESC。在此項研究中，給10只非發(fā)情期的羅姆尼母羊注射0.4mg/只母羊的KLH-GDF-9B肽抗原在弗氏完全佐劑中的制劑，9只非發(fā)情期的羅姆尼母羊注射0.4mg/母羊KLH抗原作為對照組。然后，每隔一個月，用抗原在Span/Tween/油中的混合物加強免疫(sc)6次(0.2mg/母羊，每次)，每周用切除了輸精管的公羊監(jiān)控發(fā)情行為2-3次。在末次加強免疫之前一周左右，通過腹腔鏡檢評價排卵率。
所有9只KLH處理組母羊表現(xiàn)出有規(guī)律的周期性發(fā)情行為，而10只KLH-GDF-9B肽處理組母羊中，僅有1只表現(xiàn)出發(fā)情行為。KLH對照組母羊的排卵率的幾何平均值(以及95％置信區(qū)間)為1.5(1.1，1.9)，而9只未發(fā)情的KLH-GDF-9B肽處理組母羊的排卵率為0.1例有發(fā)情行為的KLH-GDF-9B肽處理組母羊的排卵率為5。這些數(shù)據(jù)明確表明，通過給予抗體或突變的GDF-9B抗原或其變體，可以誘導(dǎo)不育。
在未顯示發(fā)情的9只KLH-GDF-9B(16體)(即15體+c-末端半胱氨酸)肽(SEQ ID NO11)處理組動物中，對排卵的誘導(dǎo)與抗體對GDF-9B的應(yīng)答有關(guān)，這方面的證據(jù)見表3c。
表6母羊反復(fù)用KLH或與KLH偶聯(lián)的GDF-9B 16體肽免疫之前或之后，血漿中平均(范圍)抗體水平。數(shù)值表示在490nm的吸光值，代表了GDF-9B抗體的水平

抗體水平用表4所述ELISA方法檢測。
總之，上述結(jié)果表明，通過給予GDF-9B抗原，在接受抗原的動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體，可改變卵泡的活力，并因此影響對排卵率的調(diào)節(jié)。
針對突變進行的DNA檢驗GDF-9B基因的序列變體可通過各種方法確定，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，它們被設(shè)計成特別用于鑒定等位基因之間的差異。尤其是，這些方法可用于鑒定Inverdale(FecXI)和Hanna(FecXH)單核苷酸多態(tài)性(SNP)，即FecXH攜帶者中的C→T轉(zhuǎn)換以及FecXI攜帶者中的T→A轉(zhuǎn)換，但是這類方法也可應(yīng)用于其它哺乳動物中可能出現(xiàn)的該基因的其它等位變體。樣品可以來自DNA或直接來自點樣在FTA紙上的全血孔或來自毛發(fā)或卵泡。
其中一種方法包括，用限制酶切割專門來自一種等位基因而不是另一種等位基因的DNA，或切割含有引物以及一種等位基因或另一種等位基因的PCR片段，其中所述引物被設(shè)計成包含一個切割位點。
FecXHC→T取代導(dǎo)致BsrSI限制下位點(actg/gn)丟失，得到SpeI位點(a/ctagt)。我們通過證實SpeI可將FecXH/FecXH母羊和FecXH/Y公羊中橫跨該區(qū)域的541bpPCR產(chǎn)物切割為476和65bp的片段，但不能切割FecXI和野生型綿羊中的片段，從而證實了這一堿基取代。在每種等位基因有一個拷貝的綿羊(FecXI/FecXH)中，鑒定了所有三種片段(541，476和65bp)。類似地，BsrSI可切割FecXI和野生型動物的片段，但不切割FecXH攜帶者的片段。
使用引物#12(GAAGTAACCAGTGTTCCCTCCACCCTTTTCT)；和#13(CATGATTGGGAGAATTGAGACC)從FeXI攜帶者的DNA得到154bp的PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物產(chǎn)生了一個強制性XbaI限制性位點。XbaI(t/ctaga)切割攜帶A等位基因(tctaga)的FecXI/FecXI母羊和FecXI/Y公羊的PCR產(chǎn)物，但不切割攜帶T等位基因(tctagt)的野生型或FecXH的PCR產(chǎn)物。因此，XbaI通過去除僅FecXI攜帶者含有的30個核苷酸的引物#12，而將上述154bp的PCR產(chǎn)物切割為124bp的片段，見圖8。
產(chǎn)物在含有溴化乙錠的3％FMC Metaphor瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外光下觀察。
另一種SNP檢測方法包括使用熒光標(biāo)記的引物以及上述強制性RFLP方法，并在諸如ABI377等測序儀上觀察產(chǎn)物。
另一種SNP檢測方法包括使用Taqman等位基因鑒別方法或SnaPshotTMddNTP引物延伸試劑盒(此處插入說明書)。Taqman等位基因鑒別法應(yīng)用了探針技術(shù)，該項技術(shù)利用AmpliTaq GoldDNA聚合酶的5′-3′核酸酶活性，從而能通過釋放熒光性報道分子直接檢測PCR產(chǎn)物。在等位基因鑒別試驗中用到了兩種探針，它們分別對每種等位基因，并分別含有不同的報道分子染料。Snapshot系統(tǒng)根據(jù)對未標(biāo)記的寡核苷酸引物進行的雙脫氧單核苷酸(熒光標(biāo)記)延伸反應(yīng)來檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)。另一種SNP檢測法應(yīng)用了質(zhì)譜測定數(shù)，其中在有雙脫氧核苷酸存在時，圍繞SNP或突變的區(qū)域通過PCR擴增，寡核苷酸引物通過上述SNP或突變得到延伸。SNP變體根據(jù)質(zhì)量差異進行檢測。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，盡管為了清楚和便于理解的目的對本發(fā)明進行詳細(xì)描述，仍然可以在不脫離本說明書和權(quán)利要求書公開的本發(fā)明的范圍的前提下，可以對本文描述的實施方案和方法進行各種修改。
本文所引用的參考文獻列舉如下，它們都全文引入作為參考。
參考文獻Aaltonen，J.，Laitinen，M.P.，Vuojolainen，K.，Jaatinen，R.，Horelli-Kuitnen，N.，Seppa，L.，Louhio，H.，Tuuri，T.，Sjoberg，J.，Butzow，R.，Hovata，O.，Dale，L.和Ritvos，O.(1999)人生長分化因子9和其同系物GDF-9b在早期卵泡發(fā)生期間卵母細(xì)胞中的表達(Human growth differentiation factor 9(GDF-9)and its novelhomolog GDF-9b are expressed in oocytes during early folliculogenesis).臨床內(nèi)分泌學(xué)與代謝雜質(zhì)(J.Clin Endocrinol Metab)842744-2750.Amer，P.R.，McEwan，J.C.，Dodds，K.G.和Davis，G.H.1998綿羊中Inverdale生產(chǎn)力基因商業(yè)應(yīng)用的成本受益分析(Cost benefit analysis ofcommercial use of the Inverdale prolificacy gene in sheep).新西蘭社會動物生產(chǎn)學(xué)報(Proceedings of the New Zealand Society of Animal Production)58157-160.Braw-Tal，R.，McNatty，K.P.，Smith，P.，Heath，D.A.Hudson，N.L.，Phillips，D.J.，McLeod，B.J.和David，G.H.1993X-連鎖的Inverdale基因(FecX1)純合的母羊卵巢缺乏次級和第三級卵泡卻包含許多異常結(jié)構(gòu)(The ovaries of eweshomozygouis for the X-linked Inverdale gene(FecX1)are devoid of secondaryand tertiarv follicles but contain many abnormal stmctures).生殖生物學(xué)(生殖生物學(xué)(Biology ofreproduction))49895-907.Davis，G.H.，McEwan，J.C.，F(xiàn)ennessy，P.F.，Dodds，K.G.和Farquhar，P.A.1991綿羊X-染色體存在影響排卵率的主基因的證據(jù)(Evidence for thepresence of a major gene influencing ovulation rate on the X-chromosome ofsheep).生殖生物學(xué)(Biology of reproduction)44620-624.Davis，G.H.McEwan，J.C.，F(xiàn)ennessy.P.F.，Dodds，K.G.，McNatty，K.P.和O，W-S.1992位于X-染色體Inverdale基因純合(Fecx1FecX1)綿羊雙卵巢發(fā)育不全導(dǎo)致的不育(Infertility due to bilateral ovarian hypoplasia in sheephomozygous(Fecx1FecX1)for the Inverdale prolificacy gene located on the X-chromosome).生殖生物學(xué)(Biology of reproduction)46636-640.Davis，G.H.Bruce，G.D.和Reid，P.J.1994純合(Fecx1FecX1)Inverdale綿羊卵巢紋情況繁殖推斷Breeding implications of the streak ovary condition inhomozygous(FecX1FecX1)Inverdale sheep).第五屆家畜生產(chǎn)遺傳應(yīng)用大會會報(Proceedings of the 5thWorld Congress on Genetics Applied to LivestockProduction).19249-252.Davis，G.H.，McEwan，J.C.，F(xiàn)ennessy，P.F.，Dodds，K.G.1995Inverdale基因的發(fā)現(xiàn)(Discovery of the Inverdale gene(FecX)).新西蘭社會動物生產(chǎn)學(xué)報(Proceedings of the New Zealand Society of Animal Production)55289-290.Dong J.，Albertini D.F.，Nishimori K.，Rajendra Kumar T.，LuN.& Matzuk M.M.1996早期卵巢卵泡卵子發(fā)生需要生長分化因子-9(Growth differentiationfctor-9 is required during early ovarian folliculogenesis).自然(Nature)383531-535.Dube，J.L.，Wang，P.，Elvin，J.，Lyons，K.M.，Celeste，A.J.和matznk，M.M.1998骨形態(tài)發(fā)生蛋白15基因在卵母細(xì)胞中的X-連鎖和表達(The bonemorphogenic protein 15 gene is X-linked and expressed in oocytes).分子內(nèi)分泌學(xué)(Molecular Endocrinology)121809-1817.Galloway，S.M.，Hanrahan，V，Dodds，K.G.，Potts，M.D.，Crawford，A.M.和Hill，D.F 1996綿羊X染色體的連鎖圖(A linkage map of the ovine Xchromosome).基因組研究(Genome Research)6667-677.Galloway，S.M.，Cambridge，L.M.，Henry，H.H.，van Stijn，T.C.和Davis，G.H.1999遺傳檢測以鑒定綿羊Inverdale生殖力基因載體(A genetic test toidentify carriers of the ovine Inverdale fecundity gene).新西蘭社會動物生產(chǎn)學(xué)報(Proceedings of the New Zealand Society of Animal Production)59114-116.Galloway，S.M.，McNatty，K.P.，Cambridge，L.M.，Laitinen，M.P.E.，Juengel.J.L.，Jokiranta，T.S.，McLaren，R.J.，Luiro，K.，Dodds，K.G.，Montgomery，G.W.，Beattie，A.E.，Davis，G.H.，和Ritvos，O.(2000)卵母細(xì)胞衍生的生長因子基因(BMP15)突變導(dǎo)致增加排卵率和劑量敏感的不育癥(Mutations in an oocyte-derived growth factor gene(BMP15)cause increased ovulation rate andinfertility in a dosage-sensitive manner).自然遺傳學(xué)(Nature Genetics)25279-283.Gray，A.J.和Davis，G.H.攜帶Inverdale基因(FecX)的綿羊的商業(yè)應(yīng)用(Commercial performance of sheep carrying the Inverdale gene(FecX)).新西蘭社會動物生產(chǎn)學(xué)報(Proceedings of the New Zealand Society of AnimalProduction)55294-295.Hanna，M.M.，1995Romney群中Inverdale基因(FecX)活體(Living with theInverdale gene(FecX)in a Romney flock).新西蘭社會動物生產(chǎn)學(xué)報(Proceedings of the New Zealand Society of Animal Production)55296-297.Jaatinen，R.，Laitinen，M.P.，Vuoiolainen，K.，Aaltonen，J.，Louhio，H.，Heikinheimo，K.，Lehtonen，E.和Ritvos，O.(1999)大鼠卵巢中生長分化因子-9(Gdf-9)mRNA和蛋白質(zhì)的定位以及大鼠GDF-9和其新同系物GDF-9BcDNA克隆(Localisation of growth differentiation factor-9(Gdf-9)mRNA andprotein in rat ovaries and cDNA cloning of rat GDF-9 and its novel homologGDF-9B).分子與細(xì)胞內(nèi)分泌學(xué)(Mol Cell Endocrinol)156189-193.Laitinen，M，Vuojolainen，K.，Jaatinen，R.，Ketola，L，Aaltonen，J.，Lehtonen，E.，Heikinheimo，M.和Ritvos，O.1998與新生長分化因子-9相關(guān)的因子和GDF-9在卵泡發(fā)生期間小鼠卵母細(xì)胞中的共表達(A novel growthdifierentiation factor-9(GDF-9)related factor is co-expressed with GDF-9 inmouse oocytes during folliculogenesis).發(fā)育機制(Mechanisms of Development)78135-140.McNatty，K.P.，Smith，P.，Hudson，N.L.，Heath，D.A.，Tisdall，D.J.，O，W-S.，Braw-Tal，R.1995在羊胎和早期新生綿羊卵巢的發(fā)育和生殖力基因的影響(Development of the sheep ovary during foetal and early neonatal life and theeffect of fecundity genes).繁殖與生育力，增刊(Joumal of Reproduction andFertility，Supplement)49123-135.McNattty，K.P.，Smith，P.，Hudson，N.L.，Lun，S.，Heath，D.，Shackell，G和Corrigan，K.1995對于Inverdale生產(chǎn)力基因(FecX1)雜合(I+)或純合(II)Inverdale 母羊胚胎的卵巢特征(Ovarian characteristics in Inverdale ewesheterozygous(I+)and homozygous(II)for the Inverdale gene(FecX)).新西蘭社會動物生產(chǎn)學(xué)報(Proceedings of the New Zealand Society of AnimalProduction)55301-303.Montgomery，G.W.和Sise，J.A.1990綿羊白細(xì)胞DNA的提取(Extraction ofDNA from sheep white blood cells).新西蘭農(nóng)業(yè)研究(New Zealand Journal ofAgricultural Research)33437-441.小鼠基因組庫(Mouse Genome Database)(MGD)，小鼠基因組信息學(xué)(MouseGenome Informatics)，The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine(October1999).World Wide Web(URLhttp//www.informatics.jax.org/).Ohno，S.1973古連鎖群和冰凍傷害(Ancient linkage groups and frozenaccidents).自然(Nature)244259-262.Sadighi，M.，Montgomery，G.W.，Bodensteiner，K.J.，和Galloway，S.M.1998綿羊染色體5的生長分化因子-9的圖(The growth differentiation factor-9maps to sheep chromosome 5).第26屆動物遺傳學(xué)國際大會會刊(Proceedingsof the 26th International Conference on Animal Genetics)，Auckland，NewZealand，abstract CO20.Smith，P.，O，W-S.，Corrigan，K.A.，Smith，T.，Lundy，T.，David，G.H.和McNattty，K.P. 1997對于Inverdale生產(chǎn)力基因(FecX1)雜合或純合雌綿羊胚胎的卵巢形態(tài)和內(nèi)分泌特征(Ovarian morphology and endocrine characteristicsof female sheep foetuses that are heterozygous or homozygous for the Inverdaleprolificacy gene(FecX1)).生殖生物學(xué)(Biology of reproduction)571183-1192.
序列表<110> 農(nóng)業(yè)研究有限公司(Agresearch Limited)蘇珊，加洛韋(Galloway，Susan)肯尼思，麥克納蒂(McNatty，Kenneth)喬治，戴維斯(Davis，George)奧利，里特沃斯(Ritvos，Olli)<120> 與提高或降低哺乳動物排卵率有關(guān)的核苷酸序列<130> 30929X144<150> NZ 500844<151> 2000-05-05<160> 17<170> PatentIn version 3.0<210> 1<211> 778<212> DNA<213> 土耳其盤羊(Ovis aries)<220><221> CDS<222> (1)..(762)<220><221> mat_peptide<222> (388)..()<220><221> mutation<222> (479)..(479)<223> Inverdale中為核苷酸a而野生型中為核苷酸t(yī)，Inverdale中為密碼子gac而野生型中為密碼子gt<220><221> misc feature<222> (376)..(387)<223> 弗林蛋白酶序列<220><221> misc_feature<222> (763)..(765)<223> 終止密碼子<400> 1ctt cac cta act cat tcc cac ctc tcc tgc cat gtg gag ccc tgg 45Leu His Leu Thr His Ser His Leu Ser Cys His Val Glu Pro Trp-125-120 -115gtc cag aaa agc cca acc aat cac ttt cct tct tca gga aga ggc 90Val Gln Lys Ser Pro Thr Asn His Phe Pro Ser Ser Gly Arg Gly-110 -105 -100tcc tca aag cct tcc ctg ttg ccc aaa act tgg aca gag atg gat atc138Ser Ser Lys Pro Ser Leu Leu Pro Lys Thr Trp Thr Glu Met Asp Ile-95 -90 -85atg gaa cat gtt ggg caa aag ctc tgg aat cac aag ggg cgc agg gtt 186Met Glu His Val Gly Gln Lys Leu Trp Asn His Lys Gly Arg Arg Val-80 -75 -70cta cga ctc cgc ttc gtg tgt cag cag cca aga ggt agt gag gtt ctt 234Leu Arg Leu Arg Phe Val Cys Gln Gln Pro Arg Gly Ser Glu Val Leu-65 -60 -55gag ttc tgg tgg cat ggc act tca tca ttg gac act gtc ttc ttg tta 282Glu Phe Trp Trp His Gly Thr Ser Ser Leu Asp Thr Val Phe Leu Leu-50 -45 -40ctg tat ttc aat gac act cag agt gtt cag aag acc aaa cct ctc cct 330Leu Tyr Phe Asn Asp Thr Gln Ser Val Gln Lys Thr Lys Pro Leu Pro-35 -30 -25 -20aaa ggc ctg aaa gag ttt aca gaa aaa gac cct tct ctt ctc ttg agg 378Lys Gly Leu Lys Glu Phe Thr Glu Lys Asp Pro Ser Leu Leu Leu Arg-15 -10 -5agg gct cgt caa gca ggc agt att gca tcg gaa gtt cct ggc ccc tcc 426Arg Ala Arg Gln Ala Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser-1 1 510agg gag cat gat ggg cct gaa agt aac cag tgt tcc ctc cac cct ttt 474Arg Glu His Asp Gly Pro Glu Ser Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe15 20 25caa gac agc ttc cag cag ctg ggc tgg gat cac tgg atc att gct ccc 522Gln Asp Ser Phe Gln Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro30 35 40 45cat ctc tat acc cca aac tac tgt aag gga gta tgt cct cgg gta cta 570His Leu Tyr Thr Pro Asn Tyr Cys Lys Gly Val Cys Pro Arg Val Leu50 55 60cac tat ggt ctc aat tct ccc aat cat gcc atc atc cag aac ctt gtc 618His Tyr Gly Leu Asn Ser Pro Asn His Ala Ile Ile Gln Asn Leu Val65 70 75agt gag ctg gtg gat cag aat gtc cct cag cct tcc tgt gtc cct tat 666Ser Glu Leu Val Asp Gln Asn Val Pro Gln Pro Ser Cys Val Pro Tyr80 85 90aag tat gtt ccc att agc atc ctt ctg att gag gca aat ggg agt atc 714Lys Tyr Val Pro Ile Ser Ile Leu Leu Ile Glu Ala Asn Gly Ser Ile95 100 105ttg tac aag gag tat gag ggt atg att gcc cag tcc tgc aca tgc agg 762Leu Tyr Lys Glu Tyr Glu Gly Met Ile Ala Gln Ser Cys Thr Cys Arg110 115 120 125tgacggcaaa ggtgca778<210> 2<211> 254<212> PRT<213> 土耳其盤羊(Ovis aries)<220><221> misc_feature<222> (376)..(387)<223> 弗林蛋白酶序列<220><221> misc_feature<222> (763)..(765)<223> 終止密碼子<400> 2Leu His Leu Thr His Ser His Leu Ser Cys His Val Glu Pro Trp-125 -120 -115Val Gln Lys Ser Pro Thr Asn His Phe Pro Ser Ser Gly Arg Gly-110 -105 -100Ser Ser Lys Pro Ser Leu Leu Pro Lys Thr Trp Thr Glu Met Asp Ile-95 -90 -85Met Glu His Val Gly Gln Lys Leu Trp Asn His Lys Gly Arg Arg Val-80 -75 -70Leu Arg Leu Arg Phe Val Cys Gln Gln Pro Arg Gly Ser Glu Val Leu-65 -60 -55Glu Phe Trp Trp His Gly Thr Ser Ser Leu Asp Thr Val Phe Leu Leu-50 -45 -40Leu Tyr Phe Asn Asp Thr Gln Ser Val Gln Lys Thr Lys Pro Leu Pro-35 -30 -25 -20Lys Gly Leu Lys Glu Phe Thr Glu Lys Asp Pro Ser Leu Leu Leu Arg-15 -10 -5Arg Ala Arg Gln Ala Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser-1 1 5 10Arg Glu His Asp Gly Pro Glu Ser Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe15 20 25Gln Asp Ser Phe Gln Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro30 35 40 45His Leu Tyr Thr Pro Asn Tyr Cys Lys Gly Val Cys Pro Arg Val Leu50 55 60His Tyr Gly Leu Asn Ser Pro Asn His Ala Ile Ile Gln Asn Leu Val65 70 75Ser Glu Leu Val Asp Gln Asn Val Pro Gln Pro Ser Cys Val Pro Tyr80 85 90Lys Tyr Val Pro Ile Ser Ile Leu Leu Ile Glu Ala Asn Gly Ser Ile
95 100 105Leu Tyr Lys Glu Tyr Glu Gly Met Ile Ala Gln Ser Cys Thr Cys Arg110 115 120 125<210> 3<211> 778<212> DNA<213> 土耳其盤羊(Ovis aries)<220><221> CDS<222> (1)..(453)<220><221> mat_peptide<222> (388)..()<220><221> mutation<222> (454)..(454)<223> Hanna中為核苷酸t(yī)而野生型中為核苷酸c，Hanna中為密碼子tag而野生型中為密碼子ca<220><221> misc_feature<222> (376)..(387)<223> 弗林蛋白酶序列<220><221> misc_feature<222> (454)..(456)<223> 提前終止密碼子<400> 3ctt cac cta act cat tcc cac ctc tcc tgc cat gtg gag ccc tgg45Leu His Leu Thr His Ser His Leu Ser Cys His Val Glu Pro Trp-125-120 -115gtc cag aaa agc cca acc aat cac ttt cct tct tca gga aga ggc90Val Gln Lys Ser Pro Thr Asn His Phe Pro Ser Ser Gly Arg Gly-110-105-100tcc tca aag cct tcc ctg ttg ccc aaa act tgg aca gag atg gat atc138Ser Ser Lys Pro Ser Leu Leu Pro Lys Thr Trp Thr Glu Met Asp Ile-95 -90 -85atg gaa cat gtt ggg caa aag ctc tgg aat cac aag ggg cgc agg gtt186Met Glu His Val Gly Gln Lys Leu Trp Asn His Lys Gly Arg Arg Val-80 -75 -70cta cga ctc cgc ttc gtg tgt cag cag cca aga ggt agt gag gtt ctt234Leu Arg Leu Arg Phe Val Cys Gln Gln Pro Arg Gly Ser Glu Val Leu-65 -60 -55gag ttc tgg tgg cat ggc act tca tca ttg gac act gtc ttc ttg tta282Glu Phe Trp Trp His Gly Thr Ser Ser Leu Asp Thr Val Phe Leu Leu-50 -45 -40ctg tat ttc aat gac act cag agt gtt cag aag acc aaa cct ctc cct 330Leu Tyr Phe Asn Asp Thr Gln Ser Val Gln Lys Thr Lys Pro Leu Pro-35 -30 -25 -20aaa ggc ctg aaa gag ttt aca gaa aaa gac cct tct ctt ctc ttg agg 378Lys Gly Leu Lys Glu Phe Thr Glu Lys Asp Pro Ser Leu Leu Leu Arg-15 -10 -5agg gct cgt caa gca ggc agt att gca tcg gaa gtt cct ggc ccc tcc 426Arg Ala Arg Gln Ala Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser-1 1 5 10agg gag cat gat ggg cct gaa agt aac tagtgttccc tccacccttt473Arg Glu His Asp Gly Pro Glu Ser Asn15 20tcaagtcagc ttccagcagc tgggctggga tcactggatc attgctcccc atctctatac533cccaaactac tgtaagggag tatgtcctcg ggtactacac tatggtctca attctcccaa593tcatgccatc atccagaacc ttgtcagtga gctggtggat cagaatgtcc ctcagccttc653ctgtgtccct tataagtatg ttcccattag catccttctg attgaggcaa atgggagtat713cttgtacaag gagtatgagg gtatgattgc ccagtcctgc acatgcaggt gacggcaaag773gtgca778<210> 4<211> 151<212> PRT<213> 土耳其盤羊(Ovis aries)<220><221> misc_feature<222> (376)..(387)<223> 弗林蛋白酶序列<220><221> misc_feature<222> (454)..(456)<223> 提前終止密碼子<400> 4Leu His Leu Thr His Ser His Leu Ser Cys His Val Glu Pro Trp-125-120-115Val Gln Lys Ser Pro Thr Asn His Phe Pro Ser Ser Gly Arg Gly-110-105-100Ser Ser Lys Pro Ser Leu Leu Pro Lys Thr Trp Thr Glu Met Asp Ile-95 -90 -85Met Glu His Val Gly Gln Lys Leu Trp Asn His Lys Gly Arg Arg Val-80 -75 -70Leu Arg Leu Arg Phe Val Cys Gln Gln Pro Arg Gly Ser Glu Val Leu-65 -60 -55Glu Phe Trp Trp His Gly Thr Ser Ser Leu Asp Thr Val Phe Leu Leu-50 -45 -40Leu Tyr Phe Asn Asp Thr Gln Ser Val Gln Lys Thr Lys Pro Leu Pro-35 -30 -25 -20Lys Gly Leu Lys Glu Phe Thr Glu Lys Asp Pro Ser Leu Leu Leu Arg-15 -10 -5Arg Ala Arg Gln Ala Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser-1 1 5 10Arg Glu His Asp Gly Pro Glu Ser Asn15 20<210> 5<211> 391<212> DNA<213> 土耳其盤羊(Ovis aries)<220><221> CDS<222> (1)..(375)<220><221> mutation<222> (92)..(92)<220><221> misc_feature<222> (376)..(378)<223> 終止密碼子<400> 5caa gca ggc agt att gca tcg gaa gtt cct ggc ccc tcc agg gag cat 48Gln Ala Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser Arg Glu His1 5 10 15gat ggg cct gaa agt aac cag tgt tcc ctc cac cct ttt caa gac agc 96Asp Gly Pro Glu Ser Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe Gln Asp Ser20 25 30ttc cag cag ctg ggc tgg gat cac tgg atc att gct ccc cat ctc tat 144Phe Gln Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro His Leu Tyr
35 40 45acc cca aac tac tgt aag gga gta tgt cct cgg gta cta cac tat ggt192Thr Pro Asn Tyr Cys Lys Gly Val Cys Pro Arg Val Leu His Tyr Gly50 55 60ctc aat tct ccc aat cat gcc atc atc cag aac ctt gtc agt gag ctg240Leu Asn Ser Pro Asn His Ala Ile Ile Gln Asn Leu Val Ser Glu Leu65 70 75 80gtg gat cag aat gtc cct cag cct tcc tgt gtc cct tat aag tat gtt288Val Asp Gln Asn Val Pro Gln Pro Ser Cys Val Pro Tyr Lys Tyr Val85 90 95ccc att agc atc ctt ctg att gag gca aat ggg agt atc ttg tac aag336Pro Ile Ser Ile Leu Leu Ile Glu Ala Asn Gly Ser Ile Leu Tyr Lys100 105 110gag tat gag ggt atg att gcc cag tcc tgc aca tgc agg tgacggcaaa 385Glu Tyr Glu Gly Met Ile Ala Gln Ser Cys Thr Cys Arg115 120 125ggtgca 391<210> 6<211> 125<212> PRT<213> 土耳其盤羊(Ovis aries)<220><221> misc_feature<222> (376)..(378)<223> 終止密碼子<400> 6Gln Ala Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser Arg Glu His1 5 10 15Asp Gly Pro Glu Ser Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe Gln Asp Ser20 25 30Phe Gln Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro His Leu Tyr35 40 45Thr Pro Asn Tyr Cys Lys Gly Val Cys Pro Arg Val Leu His Tyr Gly50 55 60Leu Asn Ser Pro Asn His Ala Ile Ile Gln Asn Leu Val Ser Glu Leu65 70 75 80Val Asp Gln Asn Val Pro Gln Pro Ser Cys Val Pro Tyr Lys Tyr Val
85 90 95Pro Ile Ser Ile Leu Leu Ile Glu Ala Asn Gly Ser Ile Leu Tyr Lys100 105 110Glu Tyr Glu Gly Met Ile Ala Gln Ser Cys Thr Cys Arg115 120 125<210> 7<211> 391<212> DNA<213> 土耳其盤羊(Ovis aries)<220><221> CDS<222> (1)..(66)<220><22l> mutation<222> (67)..(67)<220><221> misc_feature<222> (67)..(69)<223> 提前終止密碼子<400> 7caa gca ggc agt att gca tcg gaa gtt cct ggc ccc tcc agg gag cat 48Gln Ala Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser Arg Glu His1 5 10 15gat ggg cct gaa agt aac tagtgttccc tccacccttt tcaagtcagc 96Asp Gly Pro Glu Ser Asn20ttccagcagc tgggctggga tcactggatc attgctcccc atctctatac cccaaactac156tgtaagggag tatgtcctcg ggtactacac tatggtctca attctcccaa tcatgccatc216atccagaacc ttgtcagtga gctggtggat cagaatgtcc ctcagccttc ctgtgtccct276tataagtatg ttcccattag catccttctg attgaggcaa atgggagtat cttgtacaag336gagtatgagg gtatgattgc ccagtcctgc acatgcaggt gacggcaaag gtgca 391<210> 8<211> 22<212> PRT<213> 土耳其盤羊(Ovis aries)<220><221> misc_feature<222> (67)..(69)<223> 提前終止密碼子<400> 8Gln Ala Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser Arg Glu His1 5 10 15Asp Gly Pro Glu Ser Asn20<210> 9<211> 778<212> DNA<213> 土耳其盤羊(Ovis aries)<220><221> CDS<222> (1)..(762)<220><221> misc_feature<222> (376)..(387)<223> 弗林蛋白酶序列<220><221> mat_peptide<222> (388)..()<220><221> misc_feature<222> (479)..(479)<223> Inverdale突變的位置<220><221> misc_feature<222> (454)..(454)<223> Hanna突變的位置<220><221> misc_feature<222> (763)..(765)<223> 終止密碼子<400> 9ctt cac cta act cat tcc cac ctc tcc tgc cat gtg gag ccc tgg45Leu His Leu Thr His Ser His Leu Ser Cys His Val Glu Pro Trp-125-120-115gtc cag aaa agc cca acc aat cac ttt cct tct tca gga aga ggc90Val Gln Lys Ser Pro Thr Asn His Phe Pro Ser Ser Gly Arg Gly-110-105-100tcc tca aag cct tcc ctg ttg ccc aaa act tgg aca gag atg gat atc138Ser Ser Lys Pro Ser Leu Leu Pro Lys Thr Trp Thr Glu Met Asp Ile-95 -90 -85atg gaa cat gtt ggg caa aag ctc tgg aat cac aag ggg cgc agg gtt186Met Glu His Val Gly Gln Lys Leu Trp Asn His Lys Gly Arg Arg Val
-80 -75 -70cta cga ctc cgc ttc gtg tgt cag cag cca aga ggt agt gag gtt ctt234Leu Arg Leu Arg Phe Val Cys Gln Gln Pro Arg Gly Ser Glu Val Leu-65 -60 -55gag ttc tgg tgg cat ggc act tca tca ttg gac act gtc ttc ttg tta282Glu Phe Trp Trp His Gly Thr Ser Ser Leu Asp Thr Val Phe Leu Leu-50 -45 -40ctg tat ttc aat gac act cag agt gtt cag aag acc aaa cct ctc cct330Leu Tyr Phe Asn Asp Thr Gln Ser Val Gln Lys Thr Lys Pro Leu Pro-35 -30 -25 -20aaa ggc ctg aaa gag ttt aca gaa aaa gac cct tct ctt ctc ttg agg378Lys Gly Leu Lys Glu Phe Thr Glu Lys Asp Pro Ser Leu Leu Leu Arg-15 -10 -5agg gct cgt caa gca ggc agt att gca tcg gaa gtt cct ggc ccc tcc426Arg Ala Arg Gln Ala Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser-1 1 5 10agg gag cat gat ggg cct gaa agt aac cag tgt tcc ctc cac cct ttt474Arg Glu His Asp Gly Pro Glu Ser Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe15 20 25caa gtc agc ttc cag cag ctg ggc tgg gat cac tgg atc att gct ccc522Gln Val Ser Phe Gln Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro30 35 40 45cat ctc tat acc cca aac tac tgt aag gga gta tgt cct cgg gta cta570His Leu Tyr Thr Pro Asn Tyr Cys Lys Gly Val Cys Pro Arg Val Leu50 55 60cac tat ggt ctc aat tct ccc aat cat gcc atc atc cag aac ctt gtc618His Tyr Gly Leu Asn Ser Pro Asn His Ala Ile Ile Gln Asn Leu Val65 70 75agt gag ctg gtg gat cag aat gtc cct cag cct tcc tgt gtc cct tat666Ser Glu Leu Val Asp Gln Asn Val Pro Gln Pro Ser Cys Val Pro Tyr80 85 90aag tat gtt ccc att agc atc ctt ctg att gag gca aat ggg agt atc714Lys Tyr Val Pro Ile Ser Ile Leu Leu Ile Glu Ala Asn Gly Ser Ile95 100 105ttg tac aag gag tat gag ggt atg att gcc cag tcc tgc aca tgc agg762Leu Tyr Lys Glu Tyr Glu Gly Met Ile Ala Gln Ser Cys Thr Cys Arg110 115 120 125tgacggcaaa ggtgca 778<210> 10<211> 254<212> PRT<213> 土耳其盤羊(Ovis aries)<220><221> misc_feature<222> (376)..(387)<223> 弗林蛋白酶序列<220><221> misc_feature<222> (479)..(479)<223> Inverdale突變的位置<220><221> misc_feature<222> (454)..(454)<223> Hanna突變的位置<220><221> misc_feature<222> (763)..(765)<223> 終止密碼子<400> 10Leu His Leu Thr His Ser His Leu Ser Cys His Val Glu Pro Trp-125-120-115Val Gln Lys Ser Pro Thr Asn His Phe Pro Ser Ser Gly Arg Gly-110-105-100Ser Ser Lys Pro Ser Leu Leu Pro Lys Thr Trp Thr Glu Met Asp Ile-95 -90 -85Met Glu His Val Gly Gln Lys Leu Trp Asn His Lys Gly Arg Arg Val-80 -75 -70Leu Arg Leu Arg Phe Val Cys Gln Gln Pro Arg Gly Ser Glu Val Leu-65 -60 -55Glu Phe Trp Trp His Gly Thr Ser Ser Leu Asp Thr Val Phe Leu Leu-50 -45 -40Leu Tyr Phe Asn Asp Thr Gln Ser Val Gln Lys Thr Lys Pro Leu Pro-35 -30 -25 -20Lys Gly Leu Lys Glu Phe Thr Glu Lys Asp Pro Ser Leu Leu Leu Arg-15 -10 -5Arg Ala Arg Gln Ala Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser-1 1 5 10Arg Glu His Asp Gly Pro Glu Ser Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe15 20 25Gln Val Ser Phe Gln Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro30 35 40 45His Leu Tyr Thr Pro Asn Tyr Cys Lys Gly Val Cys Pro Arg Val Leu50 55 60His Tyr Gly Leu Asn Ser Pro Asn His Ala Ile Ile Gln Asn Leu Val65 70 75Ser Glu Leu Val Asp Gln Asn Val Pro Gln Pro Ser Cys Val Pro Tyr80 85 90Lys Tyr Val Pro Ile Ser Ile Leu Leu Ile Glu Ala Asn Gly Ser Ile95 100 105Leu Tyr Lys Glu Tyr Glu Gly Met Ile Ala Gln Ser Cys Thr Cys Arg110 115 120 125<210> 11<211> 16<212> PRT<213> 土耳其盤羊(Ovis aries)<400> 11Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser Arg Glu His Asp Gly Pro Glu Ser Cys1 5 10 15<210> 12<211> 206<212> DNA<213> 土耳其盤羊(Ovis aries)<220><221> CDS<222> (1)..(204)<223> 突變周圍Inverdale GDF9B核苷酸序列的亞型<220><221> mutation<222> (86)..(86)<223> Inverdale突變的位置<400> 12ggc agt att gca tcg gaa gtt cct ggc ccc tcc agg gag cat gat ggg48Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser Arg Glu His Asp Gly1 5 10 15cct gaa agt aac cag tgt tcc ctc cac cct ttt caa gac agc ttc cag96Pro Glu Ser Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe Gln Asp Ser Phe Gln20 25 30cag ctg ggc tgg gat cac tgg atc att gct ccc cat ctc tat acc cca144Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro His Leu Tyr Thr Pro35 40 45aac tac tgt aag gga gta tgt cct cgg gta cta cac tat ggt ctc aat192Asn Tyr Cys Lys Gly Val Cys Pro Arg Val Leu His Tyr Gly Leu Asn50 55 60tct ccc aat cat gc 206Ser Pro Asn His65<210> 13<211> 68<212> PRT<213> 土耳其盤羊(Ovis aries)<400> 13Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser Arg Glu His Asp Gly1 5 10 15Pro Glu Ser Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe Gln Asp Ser Phe Gln20 25 30Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro His Leu Tyr Thr Pro35 40 45Asn Tyr Cys Lys Gly Val Cys Pro Arg Val Leu His Tyr Gly Leu Asn50 55 60Ser Pro Asn His65<210> 14<211> 206<212> DNA<213> 土耳其盤羊(Ovis aries)<220><221> CDS<222> (1)..(60)<223> 突變周圍Hanna GDF9B核苷酸序列的亞型<220><221> mutation<222> (61)..(61)<223> Hanna突變的位置<400> 14ggc agt att gca tcg gaa gtt cct ggc ccc tcc agg gag cat gat ggg 48Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser Arg Glu His Asp Gly1 5 10 15cct gaa agt aac tagtgttccc tccacccttt tcaagtcagc ttccagcagc 100Pro Glu Ser Asn20tgggctggga tcactggatc attgctcccc atctctatac cccaaactac tgtaagggag160tatgtcctcg ggtactacac tatggtctca attctcccaa tcatgc 206<210> 15<211> 20<212> PRT<213> 土耳其盤羊(Ovis aries)<400> 15Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser Arg Glu His Asp Gly1 5 10 15Pro Glu Ser Asn20<210> 16<211> 1519<212> DNA<213> 帚尾袋貂(Trichosurus vulpecula)<220><221> Intron<222> (1)..(712)<220><221> CDS<222> (713)..(1519)<220><221> mat_peptide<222> (1178)..()<220><221> exon<222> (713)..(1519)<220><221> misc_feature<222> (1166)..(1177)<223> 弗林蛋白酶序列<400> 16tttgtttatc tatgtcccaa atattttttt ctccttttgg agcaaatgca aaggaaaggg60acttagctgg tgaagaatca gggtaggttg gaacacccac taaggaaagt gaaactatag120aaagagcact aggtctggac ctgggttaga atcctgtctt tgccacatct tagccgtgta180accttaggca agtggcttaa cttctctggg ccttcatttt atcttctgta aaatgagaca240tttccaactg tggtctccat gcatttgcat tagctgttcc ctgtgcctgg aatgccctcc300ctcctttgtg tctcagaatc cttaatcttt cttctatctt cttttcttct cttcccctac360ttcccagtta ctactgctct ctccctcctc aaatcacatt atgctgttct tacccattcg420cacattatcg gattccaatc ctgctctctg cacggccccc cacccccggt agaacatgag480cttcttgaag gccaggcttg tttttcctct ctatggtgcc tgacatatac aggagcttaa540taaacacttg ttgaccagat agtgtggagc tggctttgag ggggaagtga acctccccct600aattggtcat ttatgatgcc aagggagaag gcctaacaga actcttctct tggtcaggtg660ggttgggaag ctgacattct gttcttctta ccaccttcat tttctctgtg ca ggt715Gly-155ccc tgg tat gtg caa acc cta gac ttc cca ctt cgg cca aac cgt760Pro Trp Tyr Val Gln Thr Leu Asp Phe Pro Leu Arg Pro Asn Arg-150 -145 -140gac atg gac cat ctg gtg agg gcc gct gtt gct tac cgc cct cgc805Asp Met Asp His Leu Val Arg Ala Ala Val Ala Tyr Arg Pro Arg-135 -130 -125ctc cgc cta tct cac tcc cat ctt tcc tgc cat gtg gaa ccc tgg850Leu Arg Leu Ser His Ser His Leu Ser Cys His Val Glu Pro Trp-120 -115 -110gcc cac aag agc acc atc ctc ctg gga gga ggc tcc cca ggc ttt gct898Ala His Lys Ser Thr Ile Leu Leu Gly Gly Gly Ser Pro Gly Phe Ala-105 -100 -95ttg ccg gag gcc tgg gca gaa atg gat ctc acc aat tac att cag cag 946Leu Pro Glu Ala Trp Ala Glu Met Asp Leu Thr Asn Tyr Ile Gln Gln-90 -85 -80caa gtt cag cct caa aag ggg agg aga gtc ctt cac atc caa gtc agg 994Gln Val Gln Pro Gln Lys Gly Arg Arg Val Leu His Ile Gln Val Arg-75 -70 -65tgt cag cag caa gaa agg aca gag att ggc ctt ggg tgg agg cag gcc 1042Cys Gln Gln Gln Glu Arg Thr Glu Ile Gly Leu Gly Trp Arg Gln Ala-60 -55 -50ttg gct act gac act gct ttc ctg gtt ctg tat ttc aac aat acc ttt 1090Leu Ala Thr Asp Thr Ala Phe Leu Val Leu Tyr Phe Asn Asn Thr Phe-45 -40 -35 -30aaa agt gtg cca cga atg gag ctg cca gaa ctt ctg gtg ggg gac cct 1138Lys Ser Val Pro Arg Met Glu Leu Pro Glu Leu Leu Val Gly Asp Pro
-25 -20 -l5gag gga gcc gat ctc ctt tcc ctg gcc cgg cga gtc cgt cag gtg ggc1186Glu Gly Ala Asp Leu Leu Ser Leu Ala Arg Arg Val Arg Gln Val Gly-10 -5 -1 1cct gta agg tct gaa gca cct ggc cag tca ctg gag cag aca cag tgt1234Pro Val Arg Ser Glu Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Gln Thr Gln Cys5 10 15tct ctc cat cct ttc cag gtt agc ttc cac cag ctg ggc tgg gag aac1282Ser Leu His Pro Phe Gln Val Ser Phe His Gln Leu Gly Trp Glu Asn20 25 30 35tgg atc att gcc ccc cat ctg tac agc cca aac tac tgc aag ggg gcc1330Trp Ile Ile Ala Pro His Leu Tyr Ser Pro Asn Tyr Cys Lys Gly Ala40 45 50tgt cca cgg gtg cta cac tct ggc ctc cga tca ccc aac cat gcc atc1378Cys Pro Arg Val Leu His Ser Gly Leu Arg Ser Pro Asn His Ala Ile55 60 65att cag aac ctt atc aac gag ctg gtg gat aga agc atc ccc cga ccc1426Ile Gln Asn Leu Ile Asn Glu Leu Val Asp Arg Ser Ile Pro Arg Pro70 75 80tca tgc gtc cct tac aag tac atg ccc att agt gtc ctg ctg att gag1474Ser Cys Val Pro Tyr Lys Tyr Met Pro Ile Ser Val Leu Leu Ile Glu85 90 95gcc agt ggc agc atc ctg tac aaa gaa tat gag gac atg att gcc1519Ala Ser Gly Ser Ile Leu Tyr Lys Glu Tyr Glu Asp Met Ile Ala100 105 110<210> 17<211> 269<212> PRT<213> 帚尾袋貂(Trichosurus vulpecula)<220><221> misc_feature<222> (1166)..(1177)<223> 弗林蛋白酶序列<400> 17Gly Pro Trp Tyr Val Gln Thr Leu Asp Phe Pro Leu Arg Pro Asn-155-150-145Arg Asp Met Asp His Leu Val Arg Ala Ala Val Ala Tyr Arg Pro-140-135-130Arg Leu Arg Leu Ser His Ser His Leu Ser Cys His Val Glu Pro-125-120-115Trp Ala His Lys Ser Thr Ile Leu Leu Gly Gly Gly Ser Pro Gly-110 -105 -100Phe Ala Leu Pro Glu Ala Trp Ala Glu Met Asp Leu Thr Ash Tyr Ile-95 -90 -85 -80Gln Gln Gln Val Gln Pro Gln Lys Gly Arg Arg Val Leu His Ile Gln-75 -70 -65Val Arg Cys Gln Gln Gln Glu Arg Thr Glu Ile Gly Leu Gly Trp Arg-60 -55 -50Gln Ala Leu Ala Thr Asp Thr Ala Phe Leu Val Leu Tyr Phe Asn Asn-45 -40 -35Thr Phe Lys Ser Val Pro Arg Met Glu Leu Pro Glu Leu Leu Val Gly-30 -25 -20Asp Pro Glu Gly Ala Asp Leu Leu Ser Leu Ala Arg Arg Val Arg Gln-15 -10 -5 -1 1Val Gly Pro Val Arg Ser Glu Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Gln Thr5 10 15Gln Cys Ser Leu His Pro Phe Gln Val Ser Phe His Gln Leu Gly Trp20 25 30Glu Asn Trp Ile Ile Ala Pro His Leu Tyr Ser Pro Asn Tyr Cys Lys35 40 45Gly Ala Cys Pro Arg Val Leu His Ser Gly Leu Arg Ser Pro Asn His50 55 60 65Ala Ile Ile Gln Asn Leu Ile Asn Glu Leu Val Asp Arg Ser Ile Pro70 75 80Arg Pro Ser Cys Val Pro Tyr Lys Tyr Met Pro Ile Ser Val Leu Leu85 90 95Ile Glu Ala Ser Gly Ser Ile Leu Tyr Lys Glu Tyr Glu Asp Met Ile100 105 110Ala
權(quán)利要求
1.一種分離的突變的GDF-9B核酸分子，包含選自下組的核苷酸序列a)SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，或SEQ ID NO7；b)能在嚴(yán)格條件下與a)所述分子雜交的序列；c)一種序列，其為a)所定義的分子的功能性變體或片段；d)與a)，b)或c)所定義的分子互補的序列；以及e)對應(yīng)于a)-d)中任一項所述分子的反義序列。
2.用于在哺乳動物中借助DNA來篩選增加的排卵或不育特性的遺傳標(biāo)記，它包括下述核酸分子，該核酸分子與權(quán)利要求1所述核苷酸序列特異性雜交，或與編碼GDF-9B突變基因的基因組DNA特異性雜交，或與相關(guān)于GDF-9B突變基因的基因組DNA特異性雜交。
3.權(quán)利要求2的遺傳標(biāo)記，其中所述哺乳動物選自人、綿羊、牛、山羊、鹿、馬、camelids、負(fù)鼠、豬、小鼠、大鼠、兔、野兔、鼬鼠、雪貂、貓和狗。
4.能與權(quán)利要求1所述核苷酸序列特異性雜交的探針。
5.能與權(quán)利要求1所述核苷酸序列特異性雜交的引物。
6.包含權(quán)利要求1所述核酸分子的載體。
7.包含權(quán)利要求1所述核酸分子的構(gòu)建體。
8.被權(quán)利要求6或7所述載體或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
9.一種分離的多肽，包含選自下組的氨基酸序列a)SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8；或b)如a)所述的序列的功能性變體或片段。
10.一種分離的多肽，其包含SEQ ID NO10的氨基酸序列或其功能性片段或變體。
11.一種分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求9的多肽。
12.一種鑒別攜帶有編碼GDF-9B的突變核酸分子的哺乳動物的方法，該方法包括如下步驟(i)從所述哺乳動物獲得組織或血液樣品；(ii)從該樣品中分離DNA；并任選(iii)從步驟(i)獲得的DNA中分離GDF-9B DNA；(iv)用與權(quán)利要求1或11所述突變的GDF-9B DNA互補的探針探測上述DNA；(v)擴增所述突變的GDF-9B DNA的量；和/或(vi)確定從步驟(ii)獲得的GDF-9B DNA序列是否攜帶與不育、或排卵的增加或減少有關(guān)的突變。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述哺乳動物為雄性或雌性，并攜帶所述突變的GDF-9B核酸分子的單個拷貝。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述哺乳動物是雌性，并攜帶所述突變的GDF-9B核酸分子的兩個拷貝。
15.權(quán)利要求12-14中任一項的方法，其中所述哺乳動物選自人、綿羊、牛、山羊、鹿、馬、camelids、負(fù)鼠、豬、小鼠、大鼠、兔、野兔、鼬鼠、雪貂、貓和狗。
16.一種調(diào)節(jié)雌性哺乳動物排卵率的方法，該方法包括給予該哺乳動物有效量的選自下組的制劑a)權(quán)利要求9的多肽，或b)權(quán)利要求10的多肽。
17.一種增加雌性哺乳動物排卵率的方法，所述哺乳動物不攜帶突變的GDF-9B核酸分子，所述方法包括給予該哺乳動物有效量的權(quán)利要求9的多肽。
18.一種增加不育的雌性哺乳動物的排卵率的方法，所述哺乳動物攜帶突變的GDF-9B核酸分子的兩個拷貝，所述方法包括給予該哺乳動物有效量的權(quán)利要求10的多肽。
19.一種在雌性哺乳動物中增加或減少排卵率或誘導(dǎo)不育的方法，包括給予有效量的選自下組的制劑，從而抑制該突變型或野生型GDF-9B多肽的生物學(xué)活性a)免疫有效量的野生型或突變型GDF-9B多肽，其含有權(quán)利要求9或10的氨基酸序列；b)一種反義核酸分子，它針對編碼野生型或突變型GDF-9B多肽的核酸，所述多肽包括權(quán)利要求9或10的氨基酸序列；c)一種配體，它與含有權(quán)利要求9或10所述氨基酸序列的野生型或突變型GDF-9B多肽結(jié)合，或者是所述多肽的抗原。
20.權(quán)利要求18或19的方法，其中所述雌性哺乳動物選自人、綿羊、牛、山羊、鹿、馬、camelids、負(fù)鼠、豬、小鼠、大鼠、兔、野兔、鼬鼠、雪貂、貓和狗。
21.一種組合物，它含有有效量的權(quán)利要求9的多肽，以及一種可藥用或獸用的載體或稀釋劑。
22.一種組合物，它含有有效量的選自下組的制劑，以及一種可藥用或獸用的載體或稀釋劑a)一種野生型或突變型GDF-9B多肽，它含有權(quán)利要求9或10所述氨基酸序列；b)一種反義核酸分子，它針對(a)所述的多肽；c)一種配體，它與(a)所述多肽結(jié)合，或者是該多肽的抗原。
23.一種配體，其與權(quán)利要求9所述多肽結(jié)合。
24.權(quán)利要求23的配體，其中所述配體是抗體或含有抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段。
25.權(quán)利要求24的配體，其中所述配體為單克隆抗體。
26.權(quán)利要求24的配體，其中所述配體是噬菌體展示分子。
27.權(quán)利要求1的核酸分子的用途，用于鑒定哺乳動物個體中與排卵增加、排卵減少或不育有關(guān)的序列變體。
28.一種用于鑒定攜帶突變型GDF-9B核酸分子的哺乳動物的試劑盒，該試劑盒包含a)用于擴增GDF-9B合適區(qū)域的引物對；和任選地，下述一項或多項b)用于DNA擴增的緩沖液；c)脫氧核苷酸混合物；d)用于DNA擴增的工具；e)來自待測物種的對照DNA；f)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)；以及g)檢測系統(tǒng)。
29.一種分離的核酸分子，它含有SEQ ID NO9所示核苷酸序列，或其功能活性片段或變體。
30.一種分離的功能性變體多肽，它如SEQ ID NO11所示。
31.一種分離的核酸分子，它含有SEQ ID NO12或SEQ ID NO14所示核酸序列，或上述任一種序列的功能性片段或變體。
32.一種分離的多肽，它如SEQ ID NO13或SEQ ID NO15所示，或者是上述任一種序列的功能性片段或變體。
33.一種分離的核酸分子，它含有SEQ ID NO16所示核苷酸序列，或其功能性片段或變體。
34.一種分離的多肽，它具有SEQ ID NO17所示氨基酸序列，或其功能性片段或變體。
35一種在負(fù)鼠中降低排卵率或誘導(dǎo)不育的方法，包括給予有效量的權(quán)利要求34的多肽。
36.一種分離的核酸分子，基本上參照本文中任何實施例和/或附圖而如本文所述。
37.一種分離的多肽，基本上參照本文中任何實施例和/或附圖而如本文所述。
38.一種載體，它插入了本發(fā)明分離的核酸分子，基本上參照本文中任何實施例和/或附圖而如本文所述。
39.一種與本發(fā)明多肽結(jié)合的配體，基本上參照本文中任何實施例和/或附圖而如本文所述。
40一種鑒定攜帶突變型核酸分子的哺乳動物的方法，基本上參照本文中任何實施例和/或附圖而如本文所述。
41.一種調(diào)節(jié)雌性哺乳動物排卵率的方法，基本上參照本文中任何實施例和/或附圖而如本文所述。
42.一種組合物，基本上參照本文中任何實施例和/或附圖而如本文所述。
43.本發(fā)明的核酸分子在鑒定變體序列方面的應(yīng)用，基本上參照本文中任何實施例和/或附圖而如本文所述。
44.一種鑒定攜帶突變型GDF-9B核酸分子的哺乳動物的試劑盒，基本上參照本文中任何實施例和/或附圖而如本文所述。
全文摘要
本發(fā)明涉及與提高或降低哺乳動物排卵率有關(guān)的核苷酸序列。具體地，本發(fā)明涉及在與雜合性雌性哺乳動物排卵率提高有關(guān)的基因中的突變；這些突變導(dǎo)致雜合性雌性哺乳動物不育。對所述突變基因序列的了解可以在用于鑒定攜帶該突變基因的純合性雌性和雄性哺乳動物的雜合子的檢驗中應(yīng)用，從而提高或降低雌性哺乳動物的排卵率，或引起雌性哺乳動物不育或生育能力降低。
文檔編號C12N1/21GK1436237SQ01811320
公開日2003年8月13日 申請日期2001年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月5日
發(fā)明者奧利·V·P·里特沃斯, 喬治·H·戴維斯, 蘇珊·M·加洛韋, 肯尼恩·P·麥克納蒂 申請人:農(nóng)業(yè)研究有限公司, 奧利·V·P·里特沃斯