專利名稱：治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以多元酚類、其衍生物和/或它們的鹽作為有效成分的藥物、食品、飲料或飼料。
作為多元酚類的生理活性，已知主要是抗氧化活性，對于生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)活性尚不知道。
神經(jīng)細(xì)胞對于維持人的智能、記憶、感情、行動(dòng)等精神活動(dòng)承擔(dān)著主要的作用。認(rèn)為在作為這些精神活動(dòng)基礎(chǔ)的神經(jīng)細(xì)胞的分化、生存、功能表達(dá)中，對各種神經(jīng)細(xì)胞特異的神經(jīng)營養(yǎng)因子是必需的。神經(jīng)營養(yǎng)因子中最初明確了其存在和功能的是神經(jīng)生長因子(NerveGrowth Factor，以下簡稱為NGF)，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了來源于腦的神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived-neurotrophic Factor)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(Neurotrophin)-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4/5等。
由于NGF是前腦基底部的巨細(xì)胞型膽堿能神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子，因而與阿耳茨海默型癡呆癥之間的關(guān)連受到矚目〔Pharmacia，Vol.22，No.2，147～151(1986)、老年精神醫(yī)學(xué)，Vol.3，No.6，751～758(1986)〕。阿耳茨海默型癡呆癥是指伴有發(fā)育障礙、病灶癥狀、下肢強(qiáng)直痙攣、癲癇樣發(fā)作等臨床癥狀，可見老年斑、阿耳茨海默原纖維變化等病理學(xué)表象的疾病，是老年性癡呆的一種疾病類型。在近年來的高齡化社會中可見增加的趨勢，得到了社會的極大關(guān)心，但是尚未找到這種癥狀的改善方法、治療方法。
確認(rèn)在阿耳茨海默型癡呆癥患者的腦中，以邁內(nèi)特基底核為中心的前腦基底部顯著變性，膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)活性顯著降低〔Annu.Rev.Neurosci.，Vol.3，77(1980)〕。1985年使用大鼠腦的研究表明NGF是腦的這一部位的神經(jīng)營養(yǎng)因子〔EMBO J.，Vol.4，1389(1985)〕，NGF與該疾病的關(guān)連受到注目。另外，亨廷頓氏舞蹈病患者的腦的紋狀體中，GABA能神經(jīng)細(xì)胞的脫落以及膽堿能神經(jīng)細(xì)胞的脫落顯著，表明NGF也作用于紋狀體的內(nèi)在性膽堿能神經(jīng)細(xì)胞〔Science，Vol.234，1341(1986)〕，指出該疾病可能與NGF有關(guān)。有報(bào)道指出用能夠成為各種神經(jīng)疾病模型的大鼠等動(dòng)物研究了NGF的效果，如果大鼠神經(jīng)細(xì)胞顯著變性以前在腦內(nèi)給予NGF，則可以抑制變性，防止CAT活性降低〔J.N eurosci.，Vol.6，2155(1986)、Brain Res.，Vol.293，305(1985)、Science，Vol.235，214(1986)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.83，9231(1986)〕。已經(jīng)證明在末梢的交感神經(jīng)支配組織和腦中生物合成NGF，該NGF的生物合成中末梢組織或腦組織的間質(zhì)細(xì)胞即成纖維細(xì)胞或星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分別發(fā)揮重要作用〔J.Biol.Chem.，Vol.259，1259(1984)、Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.136，57(1986)〕。另外，已經(jīng)明確該成纖維細(xì)胞或星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的NGF的抗原性、分子量、等電點(diǎn)、生物活性與以前進(jìn)行了充分研究的顎下腺NGF相同，而且通過在成纖維細(xì)胞(L-M細(xì)胞)以及星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入各種神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺類(去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺)顯示出NGF產(chǎn)生增強(qiáng)作用〔J.Biol.Chem.，Vol.201，6039(1986)〕。
期待NGF在NGF作為神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮作用的部位發(fā)生變性的神經(jīng)疾病中能夠用作抑制變性的治療藥。另外，如腦血管障礙、腦腫瘤、腦栓塞(腦尖)、頭部外傷變性疾病、麻醉藥物中毒等腦神經(jīng)細(xì)胞一旦發(fā)生變性，則一生也不能恢復(fù)，結(jié)果不僅智力低下、記憶缺陷，還會引起感情障礙、行動(dòng)異常等各種障礙，但是神經(jīng)纖維具有可塑性，如果受到損傷，則由其附近的健康正常纖維發(fā)芽，形成新的突觸代替受傷的突觸，因此這時(shí)期待能夠使用NGF作為促進(jìn)神經(jīng)機(jī)能修復(fù)再生的治療劑。
但是，將NGF應(yīng)用于各種神經(jīng)疾病的治療時(shí)，NGF必須到達(dá)需要NGF的神經(jīng)細(xì)胞非常近的地方，中樞神經(jīng)疾病的場合也必須將NGF送到腦細(xì)胞的患處，但是通過血管系統(tǒng)不能將NGF送入腦內(nèi)。這是由于腦內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞相互緊密結(jié)合(稱為血腦屏障)，水、氣體、脂溶性物質(zhì)以外的物質(zhì)由血液向腦組織的移動(dòng)受到限制，作為高分子物質(zhì)的蛋白質(zhì)(也包括NGF)完全不能通過血腦屏障。即使擁有現(xiàn)在的技術(shù)，采用外科方法將該NGF直接給予腦內(nèi)，危險(xiǎn)也過大。
另一方面，也不斷開發(fā)了增強(qiáng)NGF產(chǎn)生的物質(zhì)，而不直接給予NGF，但是其中多數(shù)是具有很強(qiáng)毒性或出現(xiàn)毒性的濃度與有效濃度非常接近的物質(zhì)，或者是產(chǎn)生神經(jīng)興奮作用等對神經(jīng)系統(tǒng)有非常嚴(yán)重的副作用的物質(zhì)等，存在多種問題，至今尚未達(dá)到實(shí)用化。
接受了部分肝切除的肝臟迅速再生，恢復(fù)到原來的大小。該肝再生因子的本體常年以來一直不明確，但是在嚴(yán)重肝炎患者的血漿中發(fā)現(xiàn)了肝細(xì)胞增殖因子(Hepatocyte growth factorHGF)，并由其患者血漿分離、純化了該肝細(xì)胞增殖因子(Gohda，E.et al.J.Clin.Invest.，88414-419，1988)。而且，也克隆了人HGF的cDNA，明確了HGF的1維結(jié)構(gòu)(Miyakawa，K.et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.，163967-973，1989)。另外，已經(jīng)明確使細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性亢進(jìn)的scatter factor(SF)以及腫瘤細(xì)胞障礙因子即tumor cytotoxicfactor(TCF)與HGF是同一物質(zhì)(Weidner，K.M.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887001-7005，1991，Shima，N.et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.，180 1151-1158，1991)。
HGF不僅促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，而且促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、胃粘膜細(xì)胞等多種上皮細(xì)胞的增殖。并且誘導(dǎo)在上皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性亢進(jìn)或者血管新生、上皮細(xì)胞的管腔形成中可見的形態(tài)形成，HGF是顯示非常多樣的生理活性的多功能活性物質(zhì)。即，HGF在各種臟器中，修復(fù)其臟器的障礙時(shí)促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)性的亢進(jìn)或血管新生等形態(tài)形成等。
HGF顯示肝細(xì)胞增殖作用、蛋白質(zhì)合成促進(jìn)作用、膽汁淤滯改善作用以及預(yù)防藥物引起腎障礙的作用等。HGF的mRNA也在腦、腎臟、肺等中合成。HGF是促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、胃粘膜細(xì)胞等多種上皮細(xì)胞增殖的中胚葉性細(xì)胞生長因子，是具有修復(fù)障礙時(shí)促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖，或誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)性亢進(jìn)、血管新生等形態(tài)形成等非常多樣的生理活性的多功能活性物質(zhì)。而且，HGF也具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)增殖、修復(fù)障礙的作用等。因此，期待通過增加HGF的產(chǎn)生，能夠治療或預(yù)防肝炎、重癥肝炎、劇癥肝炎、肝硬化、肝內(nèi)膽汁淤滯等肝障礙、藥物等引起的腎障礙、胃腸障礙、血管障礙、慢性腎炎、肺炎、創(chuàng)傷、糖尿病、癌癥等。
由于HGF顯示上述各種作用，因此期待HGF自身作為肝炎、重癥肝炎、劇癥肝炎、肝硬化、肝內(nèi)膽汁淤滯等肝障礙、藥物等引起的腎障礙、胃腸障礙、血管障礙、慢性腎炎、肺炎、創(chuàng)傷、糖尿病、癌癥等的治療藥，但是HGF本身作為治療藥并沒有得以實(shí)際應(yīng)用。而且，在基因治療中也嘗試了導(dǎo)入HGF基因的方法，但是由于在不必要的時(shí)間、場所發(fā)揮作用而產(chǎn)生的副作用，因而距離實(shí)際應(yīng)用尚很遙遠(yuǎn)。這樣，認(rèn)為如果能夠任意地增強(qiáng)HGF，而不是從外部給予，則對于治療和預(yù)防肝炎、重癥肝炎、劇癥肝炎、肝硬化、肝內(nèi)膽汁淤滯等肝障礙、藥物等引起的腎障礙、胃腸障礙、血管障礙、慢性腎炎、肺炎、創(chuàng)傷、糖尿病、癌癥等必須增強(qiáng)HGF產(chǎn)生的疾病有效，但是至今尚未實(shí)際應(yīng)用。
因而，雖然認(rèn)為通過增強(qiáng)生長因子能夠治療或預(yù)防與該生長因子有關(guān)的各種疾病，但是目前尚不知道不顯示毒性或副作用，能夠根據(jù)需要適當(dāng)增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生的物質(zhì)、方法等。
也就是說，本發(fā)明涉及〔1〕一種必須增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生的疾病的治療劑或預(yù)防劑，其特征在于，含有下述物質(zhì)作為有效成分(i)選自多元酚類、其衍生物和它們的鹽中的至少1種，或者(ii)選自多元酚類、其衍生物和它們的鹽中的至少1種通過下述處理得到的組合物，(A)與選自金屬、金屬鹽和金屬離子中的至少1種的混合處理，或者(B)氧化處理，
〔2〕如上述〔1〕所述的治療劑或預(yù)防劑，多元酚類是選自類黃酮、沒食子酸、綠原酸、隱綠原酸(cryptochlorogenic acid)、新綠原酸、咖啡酸和二咖啡?？崴嶂械闹辽?種，〔3〕如上述〔2〕所述的治療劑或預(yù)防劑，類黃酮是選自黃酮醇類、黃烷酮、查爾酮和黃烷醇中的至少1種，〔4〕如上述〔3〕所述的治療劑或預(yù)防劑，黃酮醇類是楊梅黃酮和/或五羥黃酮，黃烷酮是異黃腐酚，查爾酮是黃腐酚B和/或黃腐酚D，黃烷醇是表?xiàng)攦翰杷貤斔狨ィ?〕如上述〔1〕～〔4〕中任意一項(xiàng)所述的治療劑或預(yù)防劑，多元酚類的衍生物是多元酚類的羧酸酯和/或糖苷，〔6〕如上述〔5〕所述的治療劑或預(yù)防劑，多元酚類的羧酸酯是咖啡酸甲酯和/或咖啡酸乙酯，多元酚類的糖苷是異東方蓼黃素，〔7〕如上述〔1〕～〔6〕中任意一項(xiàng)所述的治療劑或預(yù)防劑，金屬是選自鐵、錳、鎂、銅、鋅、銀、金、鋁、鈣、鎳、鈷中的至少1種，金屬鹽是含有上述金屬的鹽，金屬離子是上述金屬的離子，〔8〕如上述〔1〕～〔7〕中任意一項(xiàng)所述的治療劑或預(yù)防劑，生長因子是肝細(xì)胞增殖因子或神經(jīng)生長因子，〔9〕一種生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)用的食品、飲料或飼料，其特征在于，含有下述物質(zhì)作為有效成分(i)選自多元酚類、其衍生物和它們的鹽中的至少1種，或者(ii)選自多元酚類、其衍生物和它們的鹽中的至少1種通過下述處理得到的組合物，(A)與選自金屬、金屬鹽和金屬離子中的至少1種的混合處理，或者(B)氧化處理，〔10〕如上述〔9〕所述的食品、飲料或飼料，多元酚類是選自類黃酮、沒食子酸、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、咖啡酸和二咖啡?？崴嶂械闹辽?種，〔11〕如上述〔10〕所述的食品、飲料或飼料，類黃酮是選自黃酮醇類、黃烷酮、查爾酮和黃烷醇中的至少1種，〔12〕如上述〔11〕所述的食品、飲料或飼料，黃酮醇類是楊梅黃酮和/或五羥黃酮，黃烷酮是異黃腐酚，查爾酮是黃腐酚B和/或黃腐酚D，黃烷醇是表?xiàng)攦翰杷貤斔狨?，?3〕如上述〔9〕～〔12〕中任意一項(xiàng)所述的食品、飲料或飼料，多元酚類的衍生物是多元酚類的羧酸酯和/或糖苷，〔14〕如上述〔13〕所述的食品、飲料或飼料，多元酚類的羧酸酯是咖啡酸甲酯和/或咖啡酸乙酯，多元酚類的糖苷是異東方蓼黃素，〔15〕如上述〔9〕～〔14〕中任意一項(xiàng)所述的食品、飲料或飼料，金屬是選自鐵、錳、鎂、銅、鋅、銀、金、鋁、鈣、鎳、鈷中的至少1種，金屬鹽是含有上述金屬的鹽，金屬離子是上述金屬的離子，〔16〕如上述〔9〕～〔15〕中任意一項(xiàng)所述的食品、飲料或飼料，生長因子是肝細(xì)胞增殖因子或神經(jīng)生長因子，〔17〕一種組合物，由選自多元酚類、其衍生物和它們的鹽中的至少1種通過下述處理得到，(A)與選自金屬、金屬鹽和金屬離子中的至少1種的混合處理，或者(B)氧化處理，〔18〕如上述〔17〕所述的組合物，多元酚類是綠原酸和/或咖啡酸，衍生物是上述多元酚類的羧酸酯和/或糖苷，〔19〕如上述〔17〕或〔18〕所述的組合物，金屬是選自鐵、錳、鎂、銅、鋅、銀、金、鋁、鈣、鎳、鈷中的至少1種，金屬鹽是含有上述金屬的鹽，金屬離子是上述金屬的離子，〔20〕如上述〔17〕～〔19〕中任意一項(xiàng)所述的組合物，具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用，〔21〕如上述〔20〕所述的組合物，生長因子是肝細(xì)胞增殖因子或神經(jīng)生長因子。
圖2是來源于當(dāng)歸根部的級分18-3的1H-NMR波譜。
圖3是來源于當(dāng)歸根部的級分28的MS圖譜。
圖4是來源于當(dāng)歸根部的級分28的1H-NMR波譜。
圖5是來源于黃腐酚級分的級分A-5的MS圖譜。
圖6是來源于黃腐酚級分的級分A-5的1H-NMR波譜。
發(fā)明的實(shí)施方式本發(fā)明中的有效成分是(i)選自多元酚類、其衍生物和它們的鹽中的至少1種(以下，有時(shí)稱為多元酚類等)或者(ii)選自多元酚類、其衍生物和它們的鹽中的至少1種通過下述處理得到的組合物，所述處理為(A)與選自金屬、金屬鹽和金屬離子中的至少1種的混合處理，或者(B)氧化處理。該有效成分的生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用是通過多元酚類、其衍生物或它們的鹽發(fā)揮的，這些物質(zhì)可以簡便地制備，根據(jù)其各種生理功能在藥物、食品等廣泛領(lǐng)域非常有用。另外，該多元酚類等通過進(jìn)行上述(A)或(B)的處理，可以增強(qiáng)其生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用。因此，上述組合物更優(yōu)選作為本發(fā)明的有效成分。上述多元酚類等的生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用以及該多元酚類等通過上述處理增強(qiáng)上述作用是本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)的。
另外，在本說明書中，“生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用”以及“生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)活性”分別是指導(dǎo)致生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)以及增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生的功能，在其含義上并沒有特別嚴(yán)格的區(qū)別?！霸鰪?qiáng)”包括與本發(fā)明的有效成分作用前相比，在作用后目的物質(zhì)的量增加的方式，以及通過使本發(fā)明的有效成分發(fā)揮作用產(chǎn)生目的物質(zhì)的方式(誘導(dǎo))。另外，本說明書中作為有效成分列舉的任意一種物質(zhì)可以單獨(dú)或者2種以上混合用于本發(fā)明。
本發(fā)明中使用的多元酚類只要具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用，并沒有特別的限定。例如屬于黃酮醇類、查爾酮、異黃酮、花色素苷、黃烷醇、黃烷酮、黃酮、2-次苯甲基苯并呋喃酮、黃烷酮醇等類黃酮的物質(zhì)，屬于沒食子酸、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、鞣花酸、二咖啡酰奎尼酸等非類黃酮的物質(zhì)均可以使用。另外，原花色素苷等縮合型、棓單寧、鞣花單寧等水解型的聚合物多元酚也包括在本發(fā)明的多元酚中。從表現(xiàn)出本發(fā)明所需的效果的觀點(diǎn)出發(fā)，作為多元酚類，優(yōu)選選自類黃酮、沒食子酸、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、咖啡酸和二咖啡?？崴嶂械闹辽?種。作為二咖啡酰奎尼酸，特別優(yōu)選3，5-二咖啡?？崴?。另外，作為上述類黃酮，優(yōu)選選自黃酮醇類、黃烷酮、查爾酮和黃烷醇中的至少1種。作為上述黃酮醇類有莰非醇(kaemferol)、楊梅黃酮、五羥黃酮等，優(yōu)選楊梅黃酮和/或五羥黃酮。作為上述黃烷酮，優(yōu)選異黃腐酚。作為上述查爾酮，優(yōu)選黃腐酚B和/或黃腐酚D。作為上述黃烷醇，有兒茶素類等，優(yōu)選表?xiàng)攦翰杷貤斔狨ァＡ硗?，只要具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用，光學(xué)異構(gòu)體、酮-烯醇互變異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體等各種異構(gòu)體也可以在本發(fā)明中使用，可以是各種異構(gòu)體的純化物，也可以是其混合物。本發(fā)明中使用的多元酚類可以采用公知的方法制備，例如可以由植物(如艾蒿、當(dāng)歸、竹、洋李、稻、大豆、菊、茼蒿、蛇麻花、mulukhiya(モロヘイヤ)、紫郁金、郁金等)的果實(shí)、種子、種皮、花、葉、莖、根或根莖分離、純化。另外，也可以使用市售的多元酚類。另外，也可以直接使用合有多元酚類的植物的提取物。
作為本發(fā)明中的多元酚類的衍生物沒有特別的限定，例如多元酚類的羧酸酯、糖苷、硫酸化物等，只要具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用，均可以用于本發(fā)明。作為該衍生物，優(yōu)選多元酚類的羧酸酯和/或糖苷。作為上述多元酚類的羧酸酯，例如與具有脂肪族基團(tuán)、芳香族基團(tuán)或芳香脂肪族基團(tuán)的羧酸形成的酯。該羧酸可以是具有不飽和烴的羧酸，也可以是氫原子被鹵素或官能團(tuán)，例如羥基、氨基、酮基等取代的羧酸?？梢允嵌嘣宇愔写嬖诘姆有粤u基全部與羧酸成酯得到的衍生物，可以是這些羥基部分殘留的衍生物。作為多元酚類的羧酸酯，優(yōu)選作為多元酚類上述例舉的適于作為有效成分的化合物的羧酸酯，更優(yōu)選咖啡酸的羧酸酯--咖啡酸甲酯和/或咖啡酸乙酯。另外，作為類黃酮的莰非醇(kaemferol，ケンフエロ-ル)、楊梅黃酮、五羥黃酮、異黃腐酚、黃腐酚B、黃腐酚D或表?xiàng)攦翰杷貤斔狨サ聂人狨ゾ鶅?yōu)選。
另外，作為多元酚類的糖苷，例如葡萄糖、蘇阿糖、核糖、芹菜糖、阿洛糖、鼠李糖、吡喃阿拉伯糖、核酮糖、木糖、半乳糖、甘露糖、塔羅糖、巖藻糖、果糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等單糖，新橙皮糖(neohesperidose)、蕓香糖、瓊脂二糖、異麥芽糖、蔗糖、木二糖(xylobiose)、黑曲霉二糖、麥芽糖、乳糖等二糖，以及瓊脂糖、巖藻依聚糖等多糖等的糖苷。另外，作為糖苷，除了該多元酚類和糖通過O-、N-、S-或C-糖苷鍵結(jié)合的化合物以外，還包括與糖的還原末端以外的碳通過C-C鍵結(jié)合的化合物。作為多元酚類的糖苷，優(yōu)選黃酮的1種即藤黃菌素的糖苷--異東方蓼黃素。另外，作為多元酚類的糖苷，優(yōu)選作為多元酚類上述例舉的適于作為有效成分的化合物的糖苷。另外，作為類黃酮的莰非醇、楊梅黃酮、五羥黃酮、異黃腐酚、黃腐酚B、黃腐酚D或表?xiàng)攦翰杷貤斔狨サ奶擒站鶅?yōu)選。
而且，多元酚類的衍生物也包括例如通過生物體內(nèi)的水解反應(yīng)能夠發(fā)揮生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用的作為所謂前藥發(fā)揮功能的化合物。
上述多元酚類的衍生物可以按照公知的方法適當(dāng)制備。
作為本發(fā)明的多元酚類或衍生物的鹽，例如堿金屬鹽、堿土金屬鹽、與有機(jī)堿形成的鹽等。可以例舉與鈉、鉀、鈣、鎂、銨或二乙醇胺、乙二胺形成的鹽等。這些鹽可以通過例如按照公知的方法使多元酚類的酚性羥基等轉(zhuǎn)變成鹽獲得。作為所述的鹽，優(yōu)選藥理學(xué)上允許的鹽。
另外，作為本發(fā)明的有效成分，優(yōu)選使用上述組合物，即選自多元酚類、其衍生物和它們的鹽中的至少1種通過下述處理得到的組合物，所述處理為(A)與選自金屬、金屬鹽和金屬離子中的至少1種的混合處理，或者(B)氧化處理。通過上述(A)或(B)的處理，能夠增強(qiáng)上述多元酚類等的生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用。因此，該組合物與上述多元酚類等相比更適于作為有效成分。另外，作為多元酚類等，可以例舉作為多元酚類在上述例舉的適于作為有效成分的化合物、該化合物的衍生物以及它們的鹽，其中優(yōu)選綠原酸和/或咖啡酸、它們的衍生物以及它們的鹽。另外，作為衍生物優(yōu)選綠原酸和/或咖啡酸的羧酸酯和/或糖苷。所述組合物自身也包括在本發(fā)明中。
作為本發(fā)明中使用的金屬，沒有特別的限定，優(yōu)選例如選自鐵、錳、鎂、銅、鋅、銀、金、鋁、鈣、鎳和鈷中的至少1種金屬元素單質(zhì)。作為金屬鹽，優(yōu)選含有上述金屬的鹽，例如與該金屬形成的硫酸鹽、醋酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、氯化物等。另外，也可以使用含有絡(luò)離子的絡(luò)鹽。所謂金屬離子是指將這些金屬和/或金屬鹽溶解于例如水性液中生成的金屬離子，優(yōu)選使用選自Fe2+、Fe3+、Mn2+、Mn3+、Mg2+、Cu+、Cu2+、Cu3+、Zn2+、Ag+、Ag2+、Au+、Au3+、Al3+、Ca2+、Ni2+、Co2+和Co3+中的至少1種。
上述多元酚類等的(A)與選自金屬、金屬鹽和金屬離子中的至少1種(以下，有時(shí)稱為金屬等)的混合處理，通過使上述多元酚類等與金屬等接觸進(jìn)行。例如通過下述步驟進(jìn)行，即在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，將多元酚類和金屬鹽混合，使摩爾比(多元酚類/金屬鹽)優(yōu)選達(dá)到0.01～10000，更優(yōu)選達(dá)到1～100，優(yōu)選在0～100℃下，更優(yōu)選在室溫(25℃)下，放置優(yōu)選5分鐘～10天，更優(yōu)選30分鐘～1天。作為該溶劑，例如可以單獨(dú)或者作為混合液使用水、氯仿、乙醇、甲醇、異丙醇等醇類，丙酮、甲乙酮等酮類，乙酸甲酯、乙酸乙酯等親水性或親油性溶劑，優(yōu)選使用水。在混合處理中，優(yōu)選作為處理對象的多元酚類等和金屬等一同溶解于溶劑中。另外，也可以在由植物提取多元酚類的步驟中，通過進(jìn)行上述混合處理，得到上述組合物。例如，通過預(yù)先在提取溶劑中添加上述金屬等，提取后，例如放置數(shù)分鐘～數(shù)小時(shí)，也可以得到上述組合物。
通過混合處理得到的組合物的結(jié)構(gòu)尚不明確，推測是例如多元酚類等與金屬等通過某種結(jié)合生成了例如絡(luò)合物，或者沒有結(jié)合以簡單混合的狀態(tài)存在等。
上述多元酚類等的(B)氧化處理，通過例如將多元酚類供于與氧接觸進(jìn)行氧化、利用氧化劑的氧化、利用氧化酶的氧化、電氧化等工序進(jìn)行。均可以按照公知的方法進(jìn)行。例如，通過與氧接觸進(jìn)行氧化時(shí)，可以通過對溶解于水溶液中的多元酚類經(jīng)由泵送入空氣進(jìn)行。利用氧化劑的氧化，優(yōu)選使用過氧化氫、臭氧、銀、銅、鐵、鎳、錳、鈷、鉻等作為氧化劑進(jìn)行。利用氧化酶的氧化，優(yōu)選使用酪氨酸酶、過氧化物酶等作為氧化酶進(jìn)行。另外，利用氧化酶的氧化中，也包括利用含有上述例舉的氧化酶的微生物進(jìn)行的氧化。另外，進(jìn)行電氧化時(shí)，可以通過使用例如鉑、氧化鉛、碳、石墨、氧化鉑等作為電極的陽極氧化反應(yīng)進(jìn)行氧化。
通過氧化處理得到的組合物的結(jié)構(gòu)尚不明確，推測是多元酚類等簡單氧化，或者發(fā)生聚合作為聚合物存在等。
另外，作為有效成分使用的組合物只要是經(jīng)過上述(A)或(B)處理得到的物質(zhì)，并沒有特別的限定，因此也可以使用通過包括上述(A)或(B)處理步驟的處理方法(即，包括上述(A)或(B)的處理步驟以外的步驟的處理方法)得到的物質(zhì)。另外，上述處理后的上述多元酚類等可以在處理后直接作為組合物使用，另一方面，只要能夠獲得所需的效果，也可以根據(jù)需要按照公知的精制步驟進(jìn)行精制后使用。
本發(fā)明的有效成分也可以與公知的具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用的物質(zhì)組合使用，而且也可以將多元酚類等通過與金屬等進(jìn)行混合處理得到的組合物與多元酚類等通過氧化處理得到的組合物組合使用。
本發(fā)明的有效成分如上所述，均具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用。這種作用的表達(dá)可以通過例如下述實(shí)施例1和17所示的方法進(jìn)行評價(jià)。
本發(fā)明的有效成分如下所述確認(rèn)沒有特別的毒性。另外，也不必?fù)?dān)心產(chǎn)生副作用。因而，可以安全且適當(dāng)?shù)卦鰪?qiáng)生長因子的產(chǎn)生。因此，含有該有效成分的本發(fā)明的治療劑、預(yù)防劑、食品、飲料或飼料對于治療或預(yù)防必須增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生的疾病有效。
本發(fā)明中，所謂生長因子只要具有促進(jìn)細(xì)胞生長的活性即可，并沒有特別的限定，例如肝細(xì)胞增殖因子(HGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子、上皮生長因子、來源于乳的生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、來源于腦的成纖維細(xì)胞生長因子、酸性成纖維細(xì)胞生長因子、來源于血小板的生長因子、血小板堿性蛋白質(zhì)、結(jié)締組織活化肽、胰島素樣增殖因子、集落形成刺激因子、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、T細(xì)胞生長因子、白介素類(例如白介素2、3、4、5、7、9、11、15)、B細(xì)胞生長因子、來源于軟骨的因子、來源于軟骨的生長因子、來源于骨的生長因子、骨骼生長因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、來源于內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子、來源于眼的生長因子、來源于睪丸的生長因子、來源于塞爾托利氏細(xì)胞的生長因子、乳腺刺激因子、來源于脊髓的生長因子、來源于巨噬細(xì)胞的生長因子、再循環(huán)間葉生長因子、性狀轉(zhuǎn)化增殖因子-α性狀轉(zhuǎn)化增殖因子-β、肝素結(jié)合性EGF樣增殖因子、雙調(diào)蛋白、SDGF、β-動(dòng)物纖維素(betacellulin)、表皮整聯(lián)配體蛋白(epireguiun)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1，2，3、血管內(nèi)皮增殖因子、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、BDNF、NT-3、NT-4、NT-5、NT-6、NT-7、來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞株的神經(jīng)營養(yǎng)因子、干細(xì)胞因子、midkine、pleiotrophin、Ephrin、血管形成素(Angiopoietin)、活化素、腫瘤壞死因子、干擾素類等。按照本發(fā)明，可以特別好地增強(qiáng)神經(jīng)生長因子(NGF)或肝細(xì)胞增殖因子(HGF)的產(chǎn)生。
HGF是肝細(xì)胞的再生因子，而且也是使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)亢進(jìn)的因子以及腫瘤細(xì)胞障礙因子。HGF不僅促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，而且促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、胃粘膜細(xì)胞等多種上皮細(xì)胞的增殖。另外，HGF顯示誘導(dǎo)在上皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性亢進(jìn)或者血管新生、上皮細(xì)胞的管腔形成中可見的形態(tài)形成等非常多樣的生理活性。因此，通過增強(qiáng)HGF的產(chǎn)生，能夠治療或預(yù)防例如肝炎、重癥肝炎、劇癥肝炎、肝硬化、肝內(nèi)膽汁淤滯等肝障礙、藥物等引起的腎障礙、胃腸障礙、血管障礙、慢性腎炎、肺炎、創(chuàng)傷、糖尿病、癌癥等。
另一方面，NGF是維持神經(jīng)細(xì)胞的生存和功能，或隨著NGF的濃度梯度使神經(jīng)細(xì)胞伸長的內(nèi)因性生長因子，通過增強(qiáng)NGF的產(chǎn)生，可以治療或預(yù)防阿耳茨海默病等老年癡呆癥、末梢神經(jīng)障礙、腦血管障礙、腦腫瘤、腦栓塞(腦尖)、頭部外傷變性疾病、麻醉藥物中毒等引起的需要修復(fù)或再生神經(jīng)功能的疾病。另外，對于治療或預(yù)防肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、藥物障礙性末梢神經(jīng)障礙、糖尿病性末梢神經(jīng)障礙、帕金森氏病、感覺神經(jīng)障礙、色素性視網(wǎng)膜癥、黃斑變性癥等也有用。
作為本發(fā)明中必須增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生的疾病，只要是通過采用含有上述有效成分的治療劑、預(yù)防劑等增強(qiáng)生長因子的產(chǎn)生能夠治療或預(yù)防的疾病即可，并沒有特別的限定，對于如上所述例舉的通過增強(qiáng)HGF或NGF產(chǎn)生能夠治療或預(yù)防的各種疾病特別有效。
作為本發(fā)明的必須增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生的疾病的治療劑或預(yù)防劑，可以例舉將本發(fā)明的上述有效成分與公知的藥用載體組合進(jìn)行制劑得到的物質(zhì)。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，作為有效成分的鹽使用藥學(xué)上允許的鹽。
本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑的制備通常可以通過將上述有效成分與藥學(xué)上允許的液狀或固體狀載體配合進(jìn)行，根據(jù)需要加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑等，制成片劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等固體制劑、常規(guī)溶液劑、懸濁劑、乳劑等液體制劑。另外，也可以制成使用前添加適當(dāng)載體能夠形成液狀的干燥品以及其它外用制劑。
藥用載體可以根據(jù)治療劑或預(yù)防劑的給藥方式和劑型進(jìn)行選擇。制成由固體組合物構(gòu)成的口服制劑的場合，可以制成片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、細(xì)粒劑、顆粒劑等，可以利用例如淀粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機(jī)鹽等。另外，配制口服制劑時(shí)，也可以進(jìn)一步配合粘結(jié)劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、助流劑、矯味劑、著色劑、香料等。例如，制成片劑或丸劑時(shí)，可以根據(jù)需要用蔗糖、明膠、羥丙基纖維素等糖衣或者胃溶性或腸溶性物質(zhì)的膜包覆。制成由液體組合物構(gòu)成的口服制劑的場合，可以制成藥理學(xué)上允許的乳濁劑、溶液劑、懸濁劑、糖漿劑等，可以利用例如蒸餾水、乙醇等作為載體。另外，也可以根據(jù)需要進(jìn)一步添加潤濕劑、懸浮劑等助劑、甜味劑、風(fēng)味劑、防腐劑等。
另一方面，非口服制劑的場合，可以按照常規(guī)方法使本發(fā)明的上述有效成分溶解或懸濁于作為稀釋劑的注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，根據(jù)需要加入殺菌劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、止痛劑等進(jìn)行配制。另外，也可以制備固體組合物，在使用前溶解于無菌水或無菌的注射用溶劑中后進(jìn)行使用。
作為外用制劑，包括經(jīng)皮給藥用或經(jīng)粘膜(口腔內(nèi)、鼻腔內(nèi))給藥用的固體、半固體狀或液體狀的制劑。另外，也包括栓劑等。例如，可以制成乳劑、洗劑等乳濁劑、外用酊劑、經(jīng)粘膜給藥用液體制劑等液體狀制劑、油性軟膏、親水性軟膏等軟膏劑、膜劑、硬膏劑(帶劑)、巴布劑等經(jīng)皮給藥用或經(jīng)粘膜給藥用的貼劑等。
以上各種制劑，可以分別利用公知的藥用載體等，適當(dāng)采用常規(guī)方法進(jìn)行制備。另外，所述制劑中有效成分的含量考慮其給藥形態(tài)、給藥方法等，只要是能夠以下述給藥量范圍給予該有效成分的量即可，并沒有特別的限定。
本發(fā)明的治療劑和預(yù)防劑可以根據(jù)制劑形態(tài)采用適當(dāng)?shù)慕o藥途徑給藥。給藥方法也沒有特別的限定，可以內(nèi)用、外用和注射。注射劑可以在如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)等給藥，關(guān)于外用制劑，例如可以采用其適當(dāng)?shù)慕o藥方法給予栓劑。
本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑的給藥量并不是一定的，可以根據(jù)其制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及該治療劑或預(yù)防劑的給藥對象即患者的年齡、體重、癥狀適當(dāng)設(shè)定。一般，制劑中含有的上述有效成分的給藥量，優(yōu)選成人每天為0.1μg～200mg/kg體重。當(dāng)然給藥量根據(jù)種種條件變化，因此有時(shí)采用低于上述給藥量的量就足夠，或者有時(shí)必須超過上述范圍。在所需的給藥量范圍內(nèi)，可以1日內(nèi)單次給藥，或者分成數(shù)次給藥。另外，本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑除了直接口服給藥之外，也可以添加到任意的飲食品中使之日常攝取。
另外，作為本發(fā)明的另一種方式，還提供含有本發(fā)明的上述有效成分的生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)劑。作為該增強(qiáng)劑，可以是上述有效成分本身，另外也可以是含有上述有效成分的組合物。在本發(fā)明的方式中，作為有效成分的鹽優(yōu)選藥理學(xué)上允許的鹽。生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)劑例如可以將上述有效成分以及能夠用于與該有效成分相同用途的其它成分等配合，按照上述治療劑或預(yù)防劑的制備方法制成通常使用的試劑形態(tài)。所述增強(qiáng)劑中上述有效成分的含量考慮該增強(qiáng)劑的給藥方法、使用目的等，只要是能夠得到本發(fā)明所需效果的量即可，沒有特別的限定。另外，該增強(qiáng)劑的用量也是只要能夠得到本發(fā)明所需的效果即可，沒有特別的限定。特別是給予生物體使用時(shí)，優(yōu)選以能夠在上述治療劑或預(yù)防劑中有效成分的給藥量范圍內(nèi)給予有效成分的量進(jìn)行使用。生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)劑對于必須增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生，特別是增強(qiáng)HGF或NGF產(chǎn)生的疾病中該生長因子的增強(qiáng)有用。另外，該增強(qiáng)劑對于有關(guān)生長因子的疾病用藥物的篩選也有用。另外，該增強(qiáng)劑可以用于上皮細(xì)胞活化方法，該方法對于有關(guān)上皮細(xì)胞機(jī)理的生物化學(xué)研究以及肝臟障礙、腎臟障礙、胃腸障礙、血管障礙的藥物篩選有用。另外，該增強(qiáng)劑對于生長因子的功能研究也有用。
而且，作為本發(fā)明的另一種方式，還提供將本發(fā)明的上述有效成分給予動(dòng)物的生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)方法。在本發(fā)明的方式中，作為有效成分的鹽優(yōu)選藥理學(xué)上允許的鹽。所述方法可以通過對預(yù)測必須增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生或者必須增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生的動(dòng)物，給予上述有效成分進(jìn)行，優(yōu)選作為上述生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)劑給予，通過這種給藥可以增強(qiáng)生長因子的產(chǎn)生。有效成分的給藥方法、給藥量等可以與上述生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)劑的場合同樣。另外，在生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)方法中，也可以使用本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑、下述的食品、飲料或飼料。另外，作為“動(dòng)物”，可以例舉哺乳動(dòng)物的人、狗、貓、牛、豬、馬等，其中優(yōu)選用于人。所述生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)方法對于例如治療或預(yù)防必須增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生的疾病時(shí)增強(qiáng)該生長因子產(chǎn)生是有用的。另外，該增強(qiáng)方法對于有關(guān)生長因子的疾病用藥物的篩選有用。另外，該增強(qiáng)方法對于生長因子的功能研究也有用。
另外，本發(fā)明還提供含有上述有效成分的生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)用食品、飲料或飼料。本發(fā)明的方式中，作為有效成分的鹽優(yōu)選藥學(xué)上允許的鹽、或具有與其同等安全性的鹽。本發(fā)明的食品、飲料或飼料由于其生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用，對于必須增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生的疾病的癥狀改善、預(yù)防非常有用。
另外，本發(fā)明的方式中，“含有”這一用語包括含有、添加、稀釋的含義，“含有”是指食品、飲料或飼料中含有本發(fā)明使用的有效成分這種方式，“添加”是指在食品、飲料或飼料的原料中添加本發(fā)明使用的有效成分這種方式，“稀釋”是指在本發(fā)明使用的有效成分中添加食品、飲料或飼料的原料這種方式。
本發(fā)明的食品、飲料或飼料的制備方法沒有特別的限定。例如可以按照配合、烹調(diào)、加工等一般食品、飲料或飼料的制備方法進(jìn)行，只要可以按照這些制備方法進(jìn)行制備，且制得的食品、飲料或飼料中含有具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用的本發(fā)明上述有效成分即可。
作為本發(fā)明的食品或飲料，沒有特別的限定，例如含有本發(fā)明的上述有效成分的谷類加工品(小麥粉加工品、淀粉加工品、預(yù)混合加工品、面類、通心粉類、面包類、餡類、蕎麥面類、麩子、米粉、粉條、包裝餅等)，油脂加工品(增塑性油脂、油炸用油、色拉油、蛋黃醬類、調(diào)味汁等)，大豆加工品(豆腐類、豆醬、納豆等)，肉類加工品(火腿、熏豬肉、壓縮火腿、香腸等)，水產(chǎn)品(冷凍碎魚肉、魚糕、魚卷、魚肉山芋蒸餅、油炸魚丸子、汆魚丸子、飯卷、魚肉火腿、香腸、干狐鰹、魚子加工品、水產(chǎn)品罐頭、煮的魚貝等)，乳制品(原料乳、乳酪、酸乳、奶油、干酪、煉乳、乳粉、冰淇淋等)，蔬菜·果實(shí)加工品(餡類、果醬類、腌菜類、果類飲料、蔬菜飲料、混合飲料等)，糖果類(巧克力、餅干類、甜點(diǎn)類、蛋糕、年糕、米糕類等)，酒精飲料(日本酒、中國酒、葡萄酒、威士忌酒、日本蒸餾酒、伏特加酒、白蘭地、杜松子酒、朗姆酒、啤酒、清涼醇飲料、果酒、利口酒等)，嗜好飲料(綠茶、紅茶、烏龍茶、咖啡、清涼飲料、乳酸飲料等)，調(diào)料(醬油、辣醬油、醋、料酒等)，罐裝、瓶裝、袋裝食品(牛肉蓋飯、小鍋什錦飯、紅小豆飯、咖哩飯、其它各種烹調(diào)好的食品)，半干燥或濃縮食品(肝醬、其它涂抹果醬的食品、蕎麥·面條的汁、濃縮的湯類)，干燥食品(速食面類、速食咖哩飯、速溶咖啡、果汁粉、湯粉、速食醬類、烹調(diào)好的食品、烹調(diào)好的飲料、烹調(diào)好的湯等)，冷凍食品(素?zé)?、蒸雞蛋羹、烤鰻魚串、漢堡包、燒麥、餃子、各種面條、雞尾酒等)，固態(tài)食品、液態(tài)食品(湯等)，香辣料類等農(nóng)產(chǎn)·林產(chǎn)加工品、畜牧加工品、水產(chǎn)加工品等。
在本發(fā)明的食品或飲料中，上述有效成分可以含有、添加和/或稀釋1種或數(shù)種，只要含有表達(dá)其生長因子增強(qiáng)作用所必需的量，對其形狀沒有特別的限定，包括片狀、顆粒狀、膠囊狀等形狀的可以口服攝取的形狀物。
本發(fā)明的食品或飲料中的上述有效成分的含量沒有特別的限定，可以從其功能和作用表達(dá)的觀點(diǎn)出發(fā)適當(dāng)選擇，例如每100重量份食品優(yōu)選為0.0001重量份以上，更優(yōu)選0.001～10重量份，例如每100重量份飲料優(yōu)選為0.0001重量份以上，更優(yōu)選0.001～10重量份。另外，本發(fā)明的食品或飲料優(yōu)選其中含有的有效成分例如成人每天最好攝取達(dá)到0.01～100mg/kg體重。
另外，本發(fā)明還提供一種含有、添加和/或稀釋上述有效成分而成的具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用的生物用飼料，而且作為另一種方式，還提供一種生物的飼養(yǎng)方法，其特征在于，將上述有效成分給予生物。另外，作為本發(fā)明的另一種方式，還提供一種生物飼養(yǎng)用劑，其特征在于，含有上述有效成分。
在這些發(fā)明中，生物是指例如養(yǎng)殖動(dòng)物、寵物等，作為養(yǎng)殖動(dòng)物，例如家畜、試驗(yàn)動(dòng)物、家禽、魚類、甲殼類或貝類。作為飼料，例如身體狀況的維持和/或改善用飼料。作為生物飼養(yǎng)用劑，例如浸漬用劑、飼料添加劑、飲料用添加劑。
按照這些發(fā)明，對于適用其的以上例舉的生物，基于本發(fā)明使用的上述有效成分的生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用，可以期待出現(xiàn)與本發(fā)明的上述治療劑或預(yù)防劑同樣的效果。也就是說，按照這些發(fā)明，可以期待出現(xiàn)該生物的需要生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用的疾病的治療或預(yù)防效果。
本發(fā)明中使用的上述有效成分通常是每1kg對象生物的體重，每天優(yōu)選給予0.01～2000mg。給藥可以通過例如將該有效成分添加、混合到供給對象生物的人工配合飼料的原料中，或與人工配合飼料的粉末原料混合后，再添加、混合到其它原料中進(jìn)行。另外，上述有效成分在飼料中的含量沒有特別的限定，可以根據(jù)目的適當(dāng)設(shè)定，優(yōu)選0.001～15重量％的比例。
作為人工配合飼料，例如以魚粉、酪蛋白、烏賊粉等動(dòng)物性原料，大豆粕、小麥粉、淀粉等植物性原料，飼料用酵母等微生物原料，鱈魚肝油、烏賊肝油等動(dòng)物性油脂，大豆油、菜籽油等植物性油脂，維生素類、礦物類、氨基酸、抗氧化劑等為原料的人工配合飼料。另外，還例如魚肉絞碎物等魚類用飼料。
本發(fā)明飼料的制備方法沒有特別的限定，另外配合只要按照一般飼料進(jìn)行即可，只要制得的飼料中含有具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用的本發(fā)明的上述有效成分即可。
另外，也可以通過將具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用的本發(fā)明的上述有效成分直接添加到池塘、水槽、貯水池或飼養(yǎng)區(qū)域的水、海水等中，浸漬對象生物給藥。這種浸漬方法在對象生物的飼料攝取量低下時(shí)特別有效。水或海水中具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用的本發(fā)明有效成分的濃度沒有特別的限定，可以根據(jù)目的使用，優(yōu)選0.00001～1重量％的比例。
另外，也可以將含有具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用的本發(fā)明的上述有效成分的飲料作為飼養(yǎng)用飲料使對象生物攝取。該飲料中具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用的本發(fā)明使用的有效成分的濃度沒有特別的限定，可以根據(jù)目的使用，優(yōu)選0.0001～1重量％的比例。含有具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用的本發(fā)明上述有效成分的生物飼養(yǎng)用劑，例如浸漬用劑、飼料添加劑、飲料用添加劑可以按照其本身公知的配合和制備方法制備。該生物飼養(yǎng)用劑中有效成分的含量只要能夠得到本發(fā)明所需的效果即可，并沒有特別的限定。
本發(fā)明可以適用的生物沒有限定，作為養(yǎng)殖動(dòng)物，例如馬、牛、豬、羊、山羊、駱駝、駝羊等家畜，小鼠、大鼠、土撥鼠、兔等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，雞、鴨、火雞、鴕鳥等家禽，真鯛、石鯛、比目魚、鰈魚、魚師魚、黃尾笛鯛、黃條魚師、金槍魚、大甲參、香魚、鮭類、河豚、鰻鱺、泥鰍、鲇魚等魚類，對蝦、黑虎蝦、對蝦(タイシヨウエビ)、青蟹等甲殼類等，鮑、蠑螺、扇貝、牡蠣等貝類，作為寵物，例如狗、貓等，可以廣泛適用于陸上、水中動(dòng)物。
通過使之?dāng)z取含有具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用的本發(fā)明使用的上述有效成分的飼料，或者將對象生物浸漬在含有具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用的本發(fā)明使用的上述有效成分的液體中，能夠良好地維持或改善家畜、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、家禽、魚類、甲殼類、貝類、寵物等的身體狀況。
而且，作為本發(fā)明的另一種方式，提供本發(fā)明的上述有效成分在制備必須增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生的疾病的治療劑或預(yù)防劑、生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)劑或者生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)用食品、飲料或飼料中的用途。作為所述用途的方式，可以例舉上述有效成分在制備本發(fā)明的上述治療劑或預(yù)防劑、生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)劑或者生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)用食品、飲料或飼料中的用途的方式。例如，作為上述有效成分在制備必須增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生的疾病的治療劑或預(yù)防劑或者生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)劑中的用途，可以例舉在制備上述片劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等固體制劑、常規(guī)溶液劑、懸濁劑、乳劑等液體制劑，或使用前添加適當(dāng)載體能夠形成液狀的干燥品中的用途。
本發(fā)明中使用的上述有效成分即使供于表達(dá)其作用的有效量，也確認(rèn)沒有毒性。例如口服給藥的場合，即使將莰非醇、楊梅黃酮、五羥黃酮、異黃腐酚、黃腐酚B、黃腐酚D、表?xiàng)攦翰杷貤斔狨ァ]食子酸、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、二咖啡?？崴帷悥|方蓼黃素、咖啡酸甲酯、咖啡酸乙酯或其光學(xué)活性體或它們的鹽中任意一種對小鼠以1g/kg單次給藥，也確認(rèn)沒有死亡例。
以下結(jié)合實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的任何限定。另外，只要沒有特別的說明，實(shí)施例中的％表示重量％。另外，有時(shí)將級分稱為部分。實(shí)施例1楊梅黃酮和五羥黃酮的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性將懸濁于含有10％胎牛血清的DME培養(yǎng)基中達(dá)到5×104cells/cm2的MRC-5細(xì)胞(CCL 171大日本制藥社制，code.02-021)加入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2存在下培養(yǎng)24小時(shí)后，更換培養(yǎng)基。之后添加試樣，再培養(yǎng)24小時(shí)后，回收培養(yǎng)基，使用Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor(HGF)ELISA Kit(Funakoshi公司制，Code.RS-0641-00)，測定培養(yǎng)基中的HGF的量。作為試樣，添加楊梅黃酮(試樣①)使最終濃度達(dá)到0、1、10、100μM，添加五羥黃酮(試樣②)使最終濃度達(dá)到0、10、100μM。另外，試樣的添加通過預(yù)先配制各種濃度的試樣水溶液，以一定量添加到培養(yǎng)基中，達(dá)到上述最終濃度進(jìn)行。僅添加一定量蒸餾水的孔(試樣的最終濃度為0μM)作為對照，以該細(xì)胞培養(yǎng)液中的HGF濃度作為100％，采用相對值(％)表示HGF產(chǎn)生量。其結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)全部進(jìn)行2次，取其平均值。如表1所示，試樣①、②增強(qiáng)了HGF的產(chǎn)生。而且，黃酮醇的B環(huán)的羥基數(shù)多的楊梅黃酮增強(qiáng)HGF產(chǎn)生的活性強(qiáng)。
由此表明黃酮醇類及其衍生物具有增強(qiáng)HGF產(chǎn)生的活性。表1試樣濃度(μM) HGF產(chǎn)生量(％)試樣① 0 1001 18710 543100 454試樣② 0 10010 139100 304(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為4.80ng/ml。)實(shí)施例2 表?xiàng)攦翰杷貤斔狨サ腍GF產(chǎn)生增強(qiáng)活性采用與實(shí)施例1同樣的方法，測定表?xiàng)攦翰杷貤斔狨サ腍GF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。其中，添加表?xiàng)攦翰杷貤斔狨ナ棺罱K濃度達(dá)到0、1、10μM。其結(jié)果如表2所示。如表2所示，表?xiàng)攦翰杷貤斔狨ピ鰪?qiáng)了HGF的產(chǎn)生。表2濃度(μM) HGF產(chǎn)生量(％)0 1001 17510 160(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為6.78ng/ml。)實(shí)施例3 沒食子酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性采用與實(shí)施例1同樣的方法，測定沒食子酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。其中，添加沒食子酸使最終濃度達(dá)到0、1、10、100μM。其結(jié)果如表3所示。如表3所示，沒食子酸增強(qiáng)了HGF的產(chǎn)生。表3濃度(μM)HGF產(chǎn)生量(％)0 1001 11210 217100 576(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為6.78ng/ml。)實(shí)施例4 綠原酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性采用與實(shí)施例1同樣的方法，測定綠原酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。添加綠原酸(東京化成社制)使最終濃度達(dá)到0、1、10、100、500、1000μM。其結(jié)果如表4所示。如表4所示，綠原酸增強(qiáng)了HGF的產(chǎn)生。表4濃度(μM) HGF產(chǎn)生量(％)0 1001 10510 122100 302500 4791000 624(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為5.16ng/ml。)實(shí)施例5 啡酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性采用與實(shí)施例1同樣的方法，測定咖啡酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。其中，添加咖啡酸(Sigma公司制)使最終濃度達(dá)到0、10、100μM。其結(jié)果如表5所示。如表5所示，咖啡酸增強(qiáng)了HGF的產(chǎn)生。表5濃度(μM)HGF產(chǎn)生量(％)0 10010 117100 196(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為6.27ng/ml。)實(shí)施例6 二咖啡?？崴岬闹苽浜虷GF產(chǎn)生增強(qiáng)活性(1)將艾蒿干燥品(阪本漢方堂社制)40g用50％丙酮500ml提取3次后，減壓濃縮至約15ml。向濃縮液中添加10％構(gòu)櫞酸水溶液35ml，用乙酸乙酯100mL提取3次后，用硫酸鎂干燥有機(jī)層，減壓濃縮。將濃縮物供于硅膠柱色譜，以氯仿∶甲醇∶乙酸＝2∶1∶1(體積比)作為展開溶劑，每8mL分別收集。集中得到的級分7～13，減壓濃縮后，在硅膠板上展開，以氯仿∶甲醇∶乙酸＝1∶1∶0.05作為展開溶劑，回收Rf值0.5附近的在UV 254nm顯示吸收的物質(zhì)225mg。通過1H-NMR解析該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，得知為二咖啡?？崴?3，5-二咖啡酰奎尼酸，3，5-dicaffeoylquinic acid)。
(2)采用與實(shí)施例1同樣的方法，測定實(shí)施例6-(1)制備的二咖啡?？崴岬腍GF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。其中，添加二咖啡酰奎尼酸使最終濃度達(dá)到0、1、10、100μM。其結(jié)果如表6所示。如表6所示，二咖啡?？崴嵩鰪?qiáng)了HGF的產(chǎn)生。表6濃度(μM)HGF產(chǎn)生量(％)0 1001 14210 206100 290(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為6.27ng/ml。)實(shí)施例7 二咖啡?？崴岬闹苽浜虷GF產(chǎn)生增強(qiáng)活性將春菊約900g的植物試樣冷凍干燥，與80％乙醇2L一起加入到混合器中進(jìn)行磨碎，使用紗布進(jìn)行過濾，將得到的提取液濃縮至200mL，制得春菊粗提取液。將得到的粗提取液中100mL供于XAD-2樹脂(Organo公司制)200mL，依次用0％、30％、40％、60％和100％的甲醇各500mL洗脫。將各級分濃縮至50mL，與實(shí)施例1同樣確認(rèn)各級分的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性，如表7所示，60％甲醇洗脫級分可見HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。通過1H-NMR解析60％甲醇洗脫級分，得知該級分中含有高濃度的3，5-二咖啡?？崴?。另外，添加該級分至最終濃度達(dá)到0、0.1、1％。表7春菊粗提取液60％甲醇級分 HGF產(chǎn)生量(％)(％)0 1000.1 2201 349(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為8.22ng/ml。)實(shí)施例8 異東方蓼黃素的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性將粉碎的竹葉約5g與50％丙酮70mL一起攪拌15分鐘以上，對得到的提取液進(jìn)行抽濾，再用等量的溶劑提取殘?jiān)⒌玫降臑V液100mL中1mL減壓干燥固化后，溶解于DMSO 1mL中，按照與實(shí)施例1同樣的方法考察HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性，如表8所示確認(rèn)有HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。添加粗提取液使最終濃度達(dá)到0、0.1、1％。減壓濃縮粗提取液，將濃縮液用水稀釋至20倍，將其中一部分供于10mL的XAD-2(Organo公司制)上，依次用30％、40％、50％、60％和100％的甲醇各30mL洗脫。按照與實(shí)施例1同樣的方法，測定各級分的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性后，確認(rèn)40％甲醇、30％甲醇級分具有活性。將30％、40％甲醇級分濃縮、干燥固化，供于硅膠柱色譜，以氯仿∶甲醇∶乙酸＝3∶1∶0.025作為展開劑，分別收集每10mL。采用1H-NMR、FAB-MS進(jìn)行分析，結(jié)果由級分第19～35支得到了高濃度含有黃酮的1種即藤黃菌素的糖苷——異東方蓼黃素(isoorientin)的級分，確認(rèn)該級分具有如表9所示的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。另外，添加該級分至最終濃度達(dá)到0、0.1、1mg/ml。1H-NMRisoorientinσ7.57(1H，dd，J＝8.0，2.0Hz)，7.55(1H，d，J＝2.0Hz)，7.02(1H，d，J＝8.0Hz)，6.81(1H，s)，6.63(1H，d，J＝8.0Hz)，4.74(1H，d，J＝10.0Hz)，4.19(1H，t，J＝4.5Hz)FAB-MASS449(M+H)+表8竹葉粗提取液(％)HGF產(chǎn)生量(％)0 1000.1 1951 463(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為9.09ng/ml。)表9異東方蓼黃素高濃度級分 HGF產(chǎn)生量(mg/ml)(％)0 1000.1 1311 318(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為9.62ng/ml。)實(shí)施例9 綠原酸的異構(gòu)體的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性用混合機(jī)將干燥洋李約300g與100％甲醇500mL一起磨碎，通過抽濾得到濾液。將該濾液1mL濃縮干燥固化，溶解于1mL的DMSO中。按照與實(shí)施例1同樣的方法考察該洋李粗提取液的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性，確認(rèn)如表10所示具有活性。添加粗提取液至最終濃度達(dá)到0、0.01、0.1、1％。
將得到的粗提取液濃縮，除去提取溶劑，用水稀釋至1L，供于200mL的XAD-2，用500mL的水洗滌后，用100％甲醇洗脫吸附級分。將得到的洗脫級分濃縮后，溶解于少量的水中，然后供于Cosmosil 140C18-OPN(Nakalaitesque公司制)，按照0％～25％的乙腈/水、合計(jì)800mL的梯度進(jìn)行洗脫，每1級分收集約10mL。通過1H-NMR分析得到的級分，結(jié)果由第26支～第32支的級分和第41支～第48支的級分分別得到高濃度地含有綠原酸的異構(gòu)體——新綠原酸(5-咖啡?？崴幔?-caffeoyl-quinic acid)、隱綠原酸(4-咖啡?？崴?，4-caffeoyl-quinicacid)的級分，確認(rèn)分別如表11、表12所示具有HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。另外，添加這些級分至最終濃度達(dá)到0、0.01、0.1mg/ml。1H-NMR5-caffeoyl-quinicacidσ7.63(1H，d，J＝15.5Hz)，7.19(1H，s)，7.12(1H，d，J＝8.0Hz)，6.93(1H，d，J＝8.0Hz)，5.40(1H，m)，4.18(1H，m)，3.77(1H，dd，J＝9.5，4.5Hz)，2.2～1.6(5H，m)4-caffeoyl-quinic acidσ7.49(1H，d，J＝15.5Hz)，7.04(1H，d，J＝4.0Hz)，6.99(1H，dd，J＝8.0，4.0Hz)，6.73(1H，d，J＝8.0Hz)，6.27(1H，d，16Hz)，4.65(1H，dd J＝8.0，3.0Hz)，4.08(1H，m)，2.2～1.6(5H，m)表10洋李粗提取液(％)HGF產(chǎn)生量(％)0 1000.01 1110.1 2141 306(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為8.02ng/ml。)表11新綠原酸高濃度級分HGF產(chǎn)生量(mg/ml) (％)0 1000.01 1110.1 321(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為9.98ng/ml。)表12隱綠原酸高濃度級分 HGF產(chǎn)生量(mg/ml)(％)01000.01 1030.1 142(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為9.98ng/ml。)實(shí)施例10 注射劑的制備注射劑(1)以1％濃度向生理鹽水中加入楊梅黃酮、五羥黃酮、莰非醇、表?xiàng)攦翰杷貤斔狨?、沒食子酸、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異黃腐酚、黃腐酚B、黃腐酚D、咖啡酸或二咖啡酰奎尼酸，分別制備注射劑。
(2)分別以0.5％和0.1％濃度向生理鹽水中加入楊梅黃酮、五羥黃酮、莰非醇、表?xiàng)攦翰杷貤斔狨?、沒食子酸、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異黃腐酚、黃腐酚B、黃腐酚D、咖啡酸或二咖啡酰奎尼酸以及甘草酸，制備注射劑。
(2)制備分別含有楊梅黃酮、五羥黃酮、莰非醇、表?xiàng)攦翰杷貤斔狨?、沒食子酸、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異黃腐酚、黃腐酚B、黃腐酚D、咖啡酸或二咖啡?？崴?.1mg、甘草酸二鉀10mg以及微晶纖維素適量的片劑，包覆糖衣，制備片劑。實(shí)施例12 鐵對綠原酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性的增強(qiáng)配制綠原酸水溶液達(dá)到100mM的濃度。接著，配制10mM氯化鐵(半井化學(xué)藥品社制)水溶液，與等體積的綠原酸水溶液混合，在室溫下靜置60分鐘。按照與實(shí)施例1同樣的方法測定該鐵處理后的綠原酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。鐵處理后的綠原酸換算成綠原酸進(jìn)行添加，至0、10、100、500μM。另外，試樣的添加，通過預(yù)先配制各種濃度的鐵處理后的綠原酸水溶液，以一定量添加到培養(yǎng)基中，達(dá)到上述最終濃度進(jìn)行。鐵處理后的綠原酸的最終濃度為0μM的試驗(yàn)是添加一定量在不存在綠原酸的條件下進(jìn)行鐵處理得到的水溶液的試驗(yàn)。另外，作為比較，對于未進(jìn)行鐵處理的綠原酸也同樣測定活性。與上述同樣，僅添加一定量蒸餾水的試驗(yàn)(綠原酸的最終濃度為0μM)作為對照，以該細(xì)胞培養(yǎng)液中的HGF濃度作為100％，采用相對值(％)表示HGF產(chǎn)生量。其結(jié)果如表13所示。通過鐵處理增強(qiáng)了綠原酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。表13濃度(μM) 0 10 100 500未進(jìn)行鐵處理 HGF產(chǎn)生量(％) 100 122302 479進(jìn)行鐵處 HGF產(chǎn)生量(％)77 399508 635(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為5.16ng/ml。)實(shí)施例13 錳對綠原酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性的增強(qiáng)配制綠原酸水溶液達(dá)到100mM的濃度。接著，配制10mM氯化錳(II)(Nakalaitesque公司制)水溶液，與等體積的綠原酸水溶液混合，在室溫下靜置60分鐘。按照與實(shí)施例1同樣的方法測定該錳處理后的綠原酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。添加錳處理后的綠原酸達(dá)到培養(yǎng)基的1000分之1的量(綠原酸的最終濃度50μM)。另外，作為比較，對于未進(jìn)行錳處理的綠原酸也同樣測定活性。其結(jié)果如表14所示。通過錳處理增強(qiáng)了綠原酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。表14試樣 HGF產(chǎn)生量(％)綠原酸0μM 100綠原酸50μM 148錳處理后的綠原酸50μM364(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為7.02ng/ml。)實(shí)施例14 銅對綠原酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性的增強(qiáng)配制綠原酸水溶液達(dá)到100mM的濃度。接著，配制10mM硫酸銅(II)(半井化學(xué)藥品社制)水溶液，與等體積的綠原酸水溶液混合，在室溫下靜置60分鐘。按照與實(shí)施例1同樣的方法測定該銅處理后的綠原酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。添加銅處理后的綠原酸達(dá)到培養(yǎng)基的1000分之1的量(綠原酸的最終濃度50μM)。另外，作為比較，對于未進(jìn)行銅處理的綠原酸也同樣測定活性。其結(jié)果如表15所示。通過銅處理增強(qiáng)了綠原酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。表15試樣 HGF產(chǎn)生量(％)綠原酸0μM 100綠原酸50μM148銅處理后的綠原酸50μM 293(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為7.02ng/ml。)實(shí)施例15 綠原酸氧化處理物的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性的增強(qiáng)將綠原酸溶解于100mM碳酸鈉緩沖液(pH9)中，達(dá)到100mM的濃度。通過蠕動(dòng)泵向該溶液中通入空氣12小時(shí)，配制綠原酸的氧化處理物。按照與實(shí)施例1同樣的方法測定該氧化處理后的綠原酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。氧化處理后的綠原酸換算成綠原酸進(jìn)行添加，至0、1、10、100、1000μM。另外，氧化處理后的綠原酸的最終濃度為0μM的試驗(yàn)是添加一定量在不存在綠原酸的條件下進(jìn)行氧化處理得到的水溶液的試驗(yàn)。另外，作為比較，對于未進(jìn)行氧化處理的綠原酸也同樣測定活性。其結(jié)果如表16所示。通過氧化處理增強(qiáng)了綠原酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。表16濃度(μM) 01 10 100 1000未進(jìn)行氧化處理 HGF產(chǎn)生量(％) 100 105 122 302 624進(jìn)行氧化處理 HGF產(chǎn)生量(％) 100 198 541 704 687(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為5.16ng/ml。)實(shí)施例16 咖啡酸氧化處理物的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性的增強(qiáng)將咖啡酸溶解于100mM碳酸鈉緩沖液(pH9)中，達(dá)到100mM的濃度。通過蠕動(dòng)泵向該溶液中通入空氣12小時(shí)，配制咖啡酸的氧化處理物。按照與實(shí)施例1同樣的方法測定該氧化處理后的咖啡酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。氧化處理后的咖啡酸換算成咖啡酸進(jìn)行添加，至0、1、10、100、1000μM。另外，作為比較，對于未進(jìn)行氧化處理的咖啡酸也同樣測定活性。其結(jié)果如表17所示。通過氧化處理增強(qiáng)了咖啡酸的HGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。表17濃度(μM) 0110 100 1000未進(jìn)行氧化處理HGF產(chǎn)生量(％)100 85 117 196 92進(jìn)行氧化處理HGF產(chǎn)生量(％) 100 307 353 411 555(其中，對照的HGF產(chǎn)生量為6.27ng/ml。)實(shí)施例17 鐵對綠原酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性的增強(qiáng)(1)配制綠原酸(東京化成社制)水溶液達(dá)到100mM的濃度。接著，配制10mM氯化鐵(半井化學(xué)藥品社制)水溶液，與等體積的綠原酸水溶液混合，在室溫下靜置60分鐘，制得鐵處理綠原酸。采用以下方法測定該鐵處理綠原酸對NGF產(chǎn)生帶來的影響。
將小鼠成纖維細(xì)胞L-M細(xì)胞(ATCC CCL-1.2)在含有0.5％細(xì)胞培養(yǎng)用蛋白胨(Gibco公司制)的M199培養(yǎng)基(ICN公司制)中懸濁至1.5×105細(xì)胞/ml，在96孔板中分別接種0.1ml，進(jìn)行無菌培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，除去培養(yǎng)基，更換至含有0.5％牛血清白蛋白(Sigma公司制)的M199培養(yǎng)基中。向其中添加上述鐵處理后的綠原酸達(dá)到培養(yǎng)基的100分之1的量(綠原酸的最終濃度500μM)，培養(yǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過酶免疫測定法(NGF Emax Immuno Assay SystemPromega公司制)測定培養(yǎng)液中的NGF的濃度。另外，鐵處理后的綠原酸的最終濃度為0μM的試驗(yàn)是添加一定量在不存在綠原酸的條件下進(jìn)行鐵處理得到的水溶液的試驗(yàn)。另外，作為比較，對于未進(jìn)行鐵處理的綠原酸也同樣測定活性。與上述同樣，僅添加一定量蒸餾水的試驗(yàn)(未進(jìn)行鐵處理的綠原酸的最終濃度為0μM)作為對照，以該細(xì)胞培養(yǎng)液中的NGF濃度作為100％，采用相對值(％)表示NGF產(chǎn)生量。其結(jié)果如表18所示。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2次，取其平均值。通過鐵處理增強(qiáng)了綠原酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。表18濃度(μM) 0500未進(jìn)行鐵處理 NGF產(chǎn)生量(％) 100 351.1進(jìn)行鐵處理NGF產(chǎn)生量(％) 98.8476.7(其中，對照的NGF產(chǎn)生量為0.174ng/ml。)實(shí)施例18 鐵對綠原酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性的增強(qiáng)(2)配制綠原酸水溶液達(dá)到100mM的濃度。接著，分別配制5、10、20mM氯化鐵水溶液，與等體積的綠原酸水溶液混合，在室溫下靜置60分鐘。按照與實(shí)施例17同樣的方法測定該鐵處理后的綠原酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。添加鐵處理后的綠原酸達(dá)到培養(yǎng)基的100分之1的量(綠原酸的最終濃度500μM)。另外，作為比較，對于未進(jìn)行鐵處理的綠原酸也同樣測定活性。其結(jié)果如表19所示。鐵濃度依賴性地增強(qiáng)了綠原酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。表19濃度(μM) 0500500500500鐵濃度(μM)0 0 25 50100NGF產(chǎn)生量(％)100 351.1 355.0 441.6 472.6(其中，對照的NGF產(chǎn)生量為0.176ng/ml。)實(shí)施例19 錳對綠原酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性的增強(qiáng)(1)配制綠原酸水溶液達(dá)到25、50、100mM的濃度。接著，配制10mM氯化錳(II)(Nakalaitesque公司制)水溶液，與等體積的綠原酸水溶液混合，在室溫下靜置60分鐘。按照與實(shí)施例17同樣的方法測定該錳處理后的綠原酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。添加錳處理后的綠原酸達(dá)到培養(yǎng)基的100分之1的量(綠原酸的最終濃度125、250、500μM)。另外，作為比較，對于未進(jìn)行錳處理的綠原酸也同樣測定活性。其結(jié)果如表20所示。通過錳處理增強(qiáng)了綠原酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。表20濃度(μM) 0 125250500未進(jìn)行錳處理 NGF產(chǎn)生量(％) 100 124.6 308.5 382.2進(jìn)行錳處理NGF產(chǎn)生量(％) 94.0 495.3 691.0 877.4(其中，對照的NGF產(chǎn)生量為0.145ng/ml。)實(shí)施例20 錳對綠原酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性的增強(qiáng)(2)配制綠原酸水溶液達(dá)到100mM的濃度。接著，配制2.5、5、10mM氯化錳(II)水溶液，與等量的綠原酸水溶液混合，在室溫下靜置60分鐘。按照與實(shí)施例17同樣的方法測定該錳處理后的綠原酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。添加錳處理后的綠原酸達(dá)到培養(yǎng)基的100分之1的量(綠原酸的最終濃度500μM)。另外，作為比較，對于未進(jìn)行錳處理的綠原酸也同樣測定活性。其結(jié)果如表21所示。錳濃度依賴性地增強(qiáng)了綠原酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。表21濃度(μM)0 500500 500500錳濃度(μM) 0 0 12.5 25 50NGF產(chǎn)生量(％)100 328.5 567.5 647.6 661.6(其中，對照的NGF產(chǎn)生量為0.186ng/ml。)實(shí)施例21 錳對咖啡酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性的增強(qiáng)配制咖啡酸(Sigma公司制)水溶液達(dá)到12.5、25、50mM的濃度。接著，配制10mM氯化錳(II)水溶液，與等體積的咖啡酸水溶液混合，在室溫下靜置60分鐘。按照與實(shí)施例17同樣的方法測定該錳處理后的咖啡酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。添加錳處理后的咖啡酸達(dá)到培養(yǎng)基的100分之1的量(咖啡酸的最終濃度62.5、125、250μM)。另外，作為比較，對于未進(jìn)行錳處理的咖啡酸也同樣測定活性。其結(jié)果如表22所示。通過錳處理增強(qiáng)了咖啡酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。表22濃度(μM) 0 62.5125 250未進(jìn)行錳處理 NGF產(chǎn)生量(％) 10097.8 199.5 221.2進(jìn)行錳處理NGF產(chǎn)生量(％) 96.4 188.2 235.2 267.4(其中，對照的NGF產(chǎn)生量為0.253ng/ml。)實(shí)施例22 綠原酸氧化處理物的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性的增強(qiáng)將綠原酸溶解于100mM碳酸鈉緩沖液(pH9)中，達(dá)到100mM的濃度。通過蠕動(dòng)泵向該溶液中通入空氣12小時(shí)，配制綠原酸的氧化處理物。按照與實(shí)施例17同樣的方法測定該氧化處理后的綠原酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。氧化處理后的綠原酸換算成綠原酸進(jìn)行添加，至0、250、500、1000μM。另外，氧化處理后的綠原酸的最終濃度為0μM的試驗(yàn)是添加一定量在不存在綠原酸的條件下進(jìn)行氧化處理得到的水溶液的試驗(yàn)。另外，作為比較，對于未進(jìn)行氧化處理的綠原酸也同樣測定活性。其結(jié)果如表23所示。通過氧化處理增強(qiáng)了綠原酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。表23濃度(μM) 0250500 1000未進(jìn)行氧化處理 NGF產(chǎn)生量(％)100 192.8 231.9 256.2進(jìn)行氧化處理 NGF產(chǎn)生量(％)100 211.0 368.7 642.7(其中，對照的NGF產(chǎn)生量為0.166ng/ml。)實(shí)施例23 啡酸氧化處理物的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性的增強(qiáng)將咖啡酸溶解于100mM碳酸鈉緩沖液(pH9)中，達(dá)到100mM的濃度。通過蠕動(dòng)泵向該溶液中通入空氣12小時(shí)，配制咖啡酸的氧化處理物。按照與實(shí)施例22同樣的方法測定該氧化處理后的咖啡酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。氧化處理后的咖啡酸換算成咖啡酸進(jìn)行添加，至0、250、500、1000μM。另外，作為比較，對于未進(jìn)行氧化處理的咖啡酸也同樣測定活性。其結(jié)果如表24所示。通過氧化處理增強(qiáng)了咖啡酸的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。表24濃度(μM) 0250500 1000未進(jìn)行氧化處理NGF產(chǎn)生量(％) 100 227.8 287.9 269.3進(jìn)行氧化處理 NGF產(chǎn)生量(％) 100 275.3 449.5 655.2(其中，對照的NGF產(chǎn)生量為0.218ng/ml。)實(shí)施例24 咖啡酸酯的合成和NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性(1)咖啡酸甲酯的合成將0.1g咖啡酸溶解于含有10％硫酸的甲醇中，在無水硫酸鈉存在下，100℃加熱1小時(shí)。由反應(yīng)液過濾除去無水硫酸鈉，用旋轉(zhuǎn)式汽化器濃縮干燥固化。接著，采用反相色譜法精制反應(yīng)物。其條件如下所述。柱使用TSK gel ODS-80Ts(直徑21.5mm×長度30cmTosoh公司制)。溶劑A(將蒸餾水和乙腈按體積比2比3混合得到的溶劑，含有0.1％三氟醋酸)和溶液B(將蒸餾水和乙腈按體積比1比4混合得到的溶劑，含有0.1％三氟醋酸)的洗脫比為0分鐘至30分鐘將溶劑B比直線地由25％上升至45％，接著使溶劑B比在45％保持15分鐘。洗脫速度為5ml/分鐘，檢測在215nm進(jìn)行。收集含有保留時(shí)間19.8分鐘的峰的級分，濃縮干燥固化，得到3.7mg的化合物。通過NMR解析得到的化合物，確認(rèn)化合物為咖啡酸甲酯。NMR波譜、質(zhì)譜的測定結(jié)果如下所示。
1H-NMRδ3.67(3H，s，OCH3)，6.26(1H，d，J＝16.0Hz，2’-H)，6.74(1H，d，J＝8.0Hz，5-H)，6.99(1H，dd，J＝2.0，8.0Hz，6-H)，7.04(1H，d，J＝2.0Hz，2-H)，7.47(1H，d，J＝16.0Hz，3’-H)，9.16(1H，s，3-0H)，9.63(1H，s，4-OH)其中，試樣溶解于重二甲基亞砜中，將殘留二甲基亞砜的化學(xué)位移值表示為2.49ppm。
FAB-MSm/z 195(M+H)+(其中，基質(zhì)使用甘油。)(2)咖啡酸乙酯的合成將0.1g咖啡酸溶解于含有10％硫酸的乙醇中，與實(shí)施例24-(1)同樣進(jìn)行加熱反應(yīng)、精制操作，收集反相色譜上含有保留時(shí)間23.8分鐘的峰的級分，濃縮干燥固化，得到2.7mg的化合物。通過NMR解析得到的化合物，確認(rèn)化合物為咖啡酸乙酯。NMR波譜、質(zhì)譜的測定結(jié)果如下所示。
1H-NMRδ1.22(3H，t，J＝7.0Hz，2”-H)，4.14(2H，q，J＝7.0 Hz，1”-H)，6.24(1H，d，J＝16.0Hz，2’-H)，6.74(1H，d，J＝8.0Hz，5-H)，6.99(1H，dd，J＝2.0，8.0Hz，6-H)，7.03(1H，d，J＝2.0Hz，2-H)，7.45(1H，d，J＝16.0Hz，3’-H)，9.15(1H，s，3-OH)，9.62(1H，s，4-OH)其中，試樣溶解于重二甲基亞砜中，將殘留二甲基亞砜的化學(xué)位移值表示為2.49ppm。
FAB-MSm/z 209(M+H)+(其中，基質(zhì)使用甘油。)(3)咖啡酸甲酯和咖啡酸乙酯的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性按照與實(shí)施例17同樣的方法測定實(shí)施例24-(1)和(2)合成的咖啡酸甲酯和咖啡酸乙酯的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。
添加咖啡酸甲酯使最終濃度達(dá)到0、0.0625、0.125mg/ml，另一方面添加咖啡酸乙酯使最終濃度達(dá)到0、0.0625mg/ml。結(jié)果如表25所示?？Х人峒柞ズ涂Х人嵋阴ピ鰪?qiáng)了L-M細(xì)胞的NGF產(chǎn)生。表25試樣 濃度 NGF產(chǎn)生量(mg/ml) (％)0 100咖啡酸甲酯0.0625 824.40.125 889.6咖啡酸乙酯 0 1000.0625 1279.1(其中，對照的NGF產(chǎn)生量為0.109ng/ml。)實(shí)施例25 咖啡酸甲酯的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性(1)由當(dāng)歸根部制備水提取低分子級分XAD-2處理物向干燥當(dāng)歸(Angelica keiskei koidz.)根部粉末5.8kg中加入24L的乙酸乙酯，室溫下提取3小時(shí)。向抽濾后的殘?jiān)屑尤?8L的乙醇，室溫下提取一夜。接著，向抽濾后的殘?jiān)屑尤?2L的蒸餾水，在60℃下提取3小時(shí)。將除去固態(tài)殘?jiān)囊后w部分用旋轉(zhuǎn)式汽化器濃縮，向得到的物質(zhì)中加入2.5倍量的乙醇，4℃下靜置一夜。然后，通過抽濾分級成沉淀物和液體部分。將液體部分用旋轉(zhuǎn)式汽化器濃縮干燥固化，得到當(dāng)歸根部水提取低分子級分。接著，將當(dāng)歸根部水提取低分子級分供于Amberlite XAD-2(Organo公司制樹脂量2L)，用蒸餾水30L充分沖洗非吸附物，接著用16L的甲醇洗脫吸附物。將甲醇洗脫液用旋轉(zhuǎn)式汽化器濃縮干燥固化，得到當(dāng)歸根部水提取低分子XAD-2級分處理物。(2)當(dāng)歸根部水提取低分子級分XAD-2處理物引起的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)按照與實(shí)施例17相同的方法測定實(shí)施例25-(1)制備的當(dāng)歸根部水提取低分子級分XAD-2處理物的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。添加當(dāng)歸根部水提取低分子級分XAD-2處理物，使之達(dá)到0、0.85、1.7、3.4mg/ml。如表26所示，當(dāng)歸根部水提取低分子級分XAD-2處理物濃度依賴性地增強(qiáng)了L-M細(xì)胞的NGF產(chǎn)生。表26當(dāng)歸根部水提取低分子級分XAD-2處理物 NGF產(chǎn)生量(mg/ml) (％)0 1000.85655.31.7 858.83.4 1127.6(其中，對照的NGF產(chǎn)生量為0.074ng/ml。)(3)當(dāng)歸根部水提取低分子級分XAD-2處理物通過Cosmosil 140色譜進(jìn)行的分級使用反相色譜將實(shí)施例25-(1)制備的當(dāng)歸根部水提取低分子級分XAD-2處理物的活性成分分級。其條件如下所述。樹脂使用Cosmosil 140 C18-OPN(Nakalaitesque公司制樹脂量400ml)。供給當(dāng)歸根部水提取低分子級分XAD-2處理物，依次用1L的蒸餾水、20％乙腈水溶液、25％乙腈水溶液、40％乙腈水溶液、甲醇作為展開劑進(jìn)行洗脫，減壓濃縮各洗脫級分。(4)當(dāng)歸根部水提取低分子級分XAD-2處理物的Cosmosil 140色譜分級物引起的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)按照與實(shí)施例17相同的方法測定實(shí)施例25-(3)制備的Cosmosil140色譜分級物的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。結(jié)果表明20％乙腈水溶液洗脫級分、25％乙腈水溶液洗脫級分、40％乙腈水溶液洗脫級分具有NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。其結(jié)果如表27所示。表27級分 濃度 NGF產(chǎn)生量(mg/ml)(％)20％乙腈水溶液洗脫級分4.05 301.08.1 436.716.2 1263.325％乙腈水溶液洗脫級分0.7 161.71.5 1028.82.8 2110.440％乙腈水溶液洗脫級分 0.575 465.31.15 653.12.3 1226.2(其中，對照的NGF產(chǎn)生量，20％乙腈洗脫級分為0.074ng/ml，25％和40％乙腈洗脫級分為0.087ng/ml。)(5)Cosmosil 140的25％乙腈水溶液洗脫級分通過ODS-80Ts色譜進(jìn)行的分級使用反相色譜將實(shí)施例25-(3)制備的Cosmosil 140的25％乙腈水溶液洗脫級分的活性成分分級。其條件如下所述。柱使用TSK gelODS-80Ts(直徑21.5mm×長度30cmTosoh公司制)。溶劑A(蒸餾水)和溶劑B(將蒸餾水和乙腈按體積比1比1混合得到的溶劑)的洗脫比為0分鐘到120分鐘將溶劑B比直線地從25％上升至100％，接著將溶劑B比在100％保持20分鐘，最后使溶劑B比為25％，保持20分鐘。洗脫速度為5ml/分鐘，檢測在235nm進(jìn)行。以紫外線吸收為指標(biāo)收集級分。(6)Cosmosil 140的25％乙腈水溶液洗脫級分的ODS-80Ts色譜分級物引起的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)按照與實(shí)施例17相同的方法測定實(shí)施例25-(5)得到的Cosmosil25％乙腈水溶液洗脫級分的ODS-80Ts色譜分級物的活性。結(jié)果表明多數(shù)級分具有NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。其結(jié)果如表28所示。表28分離級分 濃度NGF產(chǎn)生量(檢測峰分鐘) (mg/ml) (％)1(46.0、47.2、49.0) 2.00 250.82(53.2) 2.00 275.23(54.0) 2.00 318.74(54.9、55.5、56.4) 2.00 293.05(57.6) 2.00 320.56(58.6) 2.00 297.87(59.3) 2.00 324.88(60.5) 2.00 324.89(61.3) 2.00 402.810(62.2) 2.00 565.511(63.0) 2.00 616.912(64.1) 2.00 575.413(66.9) 2.00 805.314(68.4) 2.00 819.615(69.2) 2.00 510.216(70.3) 1.00 389.217(71.3、71.9)1.00 609.118(73.0、73.8、74.9) 0.50 100 2.519(75.4) 0.50 851.320(76.5) 1.00 838.521(77.7) 1.00 249.422(79.6、80.5)0.50 234.323(82.4) 0.25 359.124(84.1) 0.25 285.825(85.5) 0.0625359.126(86.9、87.5)0.10 411.627(89.1) 0.50 443.328(91.4) 0.05 1058.129(92.8) 0.20 672.030(93.8、95.8、97.5、100.0、100.6)0.50 593.6(其中，對照的NGF產(chǎn)生量，級分1～9為0.355ng/ml，級分10～18為0.382ng/ml，級分19～27為0.415ng/ml，級分28～30為0.450ng/ml。)(7)級分18通過反相色譜進(jìn)行的分級使用反相色譜將實(shí)施例25-(6)中確認(rèn)了強(qiáng)活性的級分18(含有保留時(shí)間73.0、73.8、74.9分鐘的檢測峰的級分)進(jìn)一步分級。其條件如下所述。柱使用TSK gel ODS-80TsQA(直徑4.6mm×長度25cmTosoh公司制)。溶劑A(含有0.1％三氟醋酸的蒸餾水)和溶劑B(將蒸餾水和乙腈按體積比1比1混合得到的溶劑，含有0.1％的三氟醋酸)的洗脫比為將溶劑B比在50％保持20分鐘。洗脫速度為1ml/分鐘，檢測在235nm進(jìn)行，以紫外線吸收為指標(biāo)收集級分。(8)級分18的ODS-80TsQA色譜分級物引起的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)按照與實(shí)施例17相同的方法測定實(shí)施例25-(7)中用TSK gel ODS-80TsQA色譜分級得到的級分的活性。結(jié)果表明含有9.3、10.1、10.6、10.9、11.2、12.0、12.8、13.3、14.0、15.2、16.1、18.6分鐘的檢測峰的級分具有NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。其結(jié)果如表29所示。表29分離級分濃度NGF產(chǎn)生量(檢測峰分鐘) (mg/ml) (％)18-1(9.3)0.20 1489.618-2(10.1) 0.50 2222.918-3(10.6) 0.25 3039.618-4(10.9) 0.0375 2510.418-5(11.2) 0.125610.418-6(12.0) 0.50 560.418-7(12.8) 0.50 681.318-8(13.3) 0.40 339.618-9(14.0) 1.00 410.418-10(15.2) 1.00 2510.718-11(16.1) 1.00 3360.718-12(18.6) 1.00 1189.3(其中，對照的NGF產(chǎn)生量，18-1～9為0.027ng/ml，18-10～12為0.015ng/ml。)通過質(zhì)量分析儀(DX302日本電子社制)，采用FAB-MS方法，測定在實(shí)施例25-(7)中制備并在實(shí)施例25-(8)中確認(rèn)了活性的來源于當(dāng)歸根部的級分18-3的質(zhì)譜(MS)。使用甘油作為基質(zhì)。結(jié)果檢測出m/z 195(M+H)+的峰。

圖1表示來源于當(dāng)歸根部的級分18-3的MS波譜。在圖1中，橫軸表示m/z值，縱軸表示相對強(qiáng)度。(9)級分18-3的1H-NMR解析使用核磁共振(NMR)波譜裝置(JNM-A500日本電子社制)，測定各種NMR波譜，對于在實(shí)施例25-(7)中制備并在實(shí)施例25-(8)中確認(rèn)了活性的來源于當(dāng)歸根部的級分18-3進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。NMR的歸屬信號如下所示。
1H-NMRδ3.68(3H，s，OCH3)，6.25(1H，d，J＝16.0Hz.2’-H)，6.75(1H，d，J＝8.0 Hz，5-H)，6.98(1H，dd，J＝2.0，8.0Hz，6-H)，7.03(1H，d，J＝2.0，2-H)，7.46(1H，d，J＝16.0 Hz，3’-H)，9.10(1H，s，3-OH)，9.56(1H，s，4-OH)其中，試樣溶解于重二甲基亞砜中，將殘留二甲基亞砜的化學(xué)位移值表示為2.49ppm。圖2表示來源于當(dāng)歸根部的級分18-3的1H-NMR波譜。圖2中，橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)，縱軸表示信號強(qiáng)度。(10)確定級分18-3的結(jié)構(gòu)對于在實(shí)施例25-(7)中制備并在實(shí)施例25-(8)中確認(rèn)了活性的來源于當(dāng)歸根部的級分18-3進(jìn)行質(zhì)譜解析、NMR波譜解析，結(jié)果確認(rèn)活性成分為咖啡酸甲酯(分子量194)。實(shí)施例26 咖啡酸乙酯的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性(1)級分28的MS解析通過質(zhì)量分析儀(DX 302日本電子社制)，采用FAB-MS方法，測定在實(shí)施例25-(5)中制備并在實(shí)施例25-(6)中確認(rèn)了活性的來源于當(dāng)歸根部的級分28(含有保留時(shí)間91.4分鐘的檢測峰的級分)的質(zhì)譜(MS)。使用甘油作為基質(zhì)。結(jié)果檢測出m/z 209(M+H)+的峰。圖3表示來源于當(dāng)歸根部的級分28的MS波譜。在圖3中，橫軸表示m/z值，縱軸表示相對強(qiáng)度。(2)級分28的1H-NMR解析使用核磁共振(NMR)波譜裝置(JNM-A500日本電子社制)，測定各種NMR波譜，對于在實(shí)施例25-(5)中制備并在實(shí)施例25-(6)中確認(rèn)了活性的來源于當(dāng)歸根部的級分28進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。NMR的歸屬信號如下所示。
1H-NMRδ1.23(3H，t，J＝7.0Hz，2”-H)，4.14(2H，q，J＝7.0 Hz，1”-H)，6.24(1H，d，J＝16.0Hz，2’-H)，6.74(1H，d，J＝8.0Hz，5-H)，6.98(1H，dd，J＝2.0，8.0Hz，6-H)，7.03(1H，d，J＝2.0Hz，2-H)，7.45(1H，d，J＝16.0Hz，3’-H)，9.11(1H，s，3-0H)，9.57(1H，s，4-OH)其中，試樣溶解于重二甲基亞砜中，將殘留二甲基亞砜的化學(xué)位移值表示為2.49ppm。圖4表示來源于當(dāng)歸根部的級分28的1H-NMR波譜。圖4中，橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)，縱軸表示信號強(qiáng)度。(3)確定級分28的結(jié)構(gòu)對于在實(shí)施例25-(5)中制備并在實(shí)施例25-(6)中確認(rèn)了活性的來源于當(dāng)歸根部的級分28進(jìn)行質(zhì)譜解析、NMR波譜解析，結(jié)果確認(rèn)活性成分為咖啡酸乙酯(分子量208)。實(shí)施例27 異黃腐酚的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性(1)將來源于蛇麻花的黃腐酚級分(ホツプシユタイナ-公司制)0.4g用氯仿3ml溶解，供于硅膠色譜。依次用氯仿(1000ml)、氯仿∶甲醇＝50∶1(1000ml)、氯仿∶甲醇＝20∶1(1000ml)進(jìn)行梯度洗脫，每1級分收集8ml。將得到的級分67～100減壓濃縮，得到來源于蛇麻花的黃腐酚級分——級分A。再使用反相色譜，純化來源于蛇麻花的黃腐酚級分——級分A。其條件如下所述。柱使用TSK gel ODS-80Ts(直徑21.5mm×長度30cmTosoh公司制)。溶劑A(將蒸餾水和乙腈按體積比3比2混合得到的溶劑，含有0.1％三氟醋酸)和溶劑B(將蒸餾水和乙腈按體積比1比4混合得到的溶劑，含有0.1％三氟醋酸)的洗脫比為0分鐘到60分鐘將溶劑B比直線地由50％上升至100％，接著將溶劑B比在100％保持20分鐘，最后使溶劑B比為50％，保持20分鐘。洗脫速度為5ml/分鐘，檢測在370nm進(jìn)行，每1分鐘收集1級分。將含有保留時(shí)間42.5分鐘的檢測峰的級分濃縮干燥固化，制得高純度的黃腐酚(Xanthohumol)(19.4mg)。
(2)將實(shí)施例27-(1)制得的黃腐酚3.5mg溶解于二甲基亞砜溶液0.75ml中，將得到的物質(zhì)添加至200ml的10mM醋酸鈉緩沖液(pH5.5，含有10％的蔗糖)中，在100℃下加熱2小時(shí)。冷卻后，使用反相色譜對反應(yīng)液進(jìn)行分級。其條件如下所述。樹脂使用Cosmosil 140C18-OPN(Nakalaitesque公司制樹脂量20ml)。將反應(yīng)液供于柱，依次用50ml的蒸餾水、20％、30％、40％、50％、60％、70％的乙腈水溶液、甲醇作為展開劑進(jìn)行洗脫。結(jié)果，將40％乙腈水溶液洗脫級分濃縮干燥固化，得到高純度的異黃腐酚(Isoxanthohumol)(2.1mg)。使用核磁共振(NMR)波譜裝置(JNM-A500日本電子社制)，通過測定各種NMR波譜，對得到的化合物進(jìn)行解析，確認(rèn)結(jié)構(gòu)。NMR波譜、質(zhì)譜的測定結(jié)果如下所示。
1H-NMRδ1.52(3H，s，3”-CH3)，1.57(3H，s，3”-CH3)，2.54(1H，dd，J＝3.0，16.5Hz，3-H)，2.92(1H，dd，J＝12.5 16.5Hz，3-H)，3.09(2H，d，J＝7.0Hz，1”-H)，3.68(3H，s，5-0CH3)，5.07(1H，t，J＝7.0Hz，2”-H)，5.30(1H，dd，J＝3.0，12.3Hz，2-H)，6.12(1H，s，6-H)，6.76(2H，d，J＝8.5Hz，3’-H和5’-H)，7.27(2H，d，J＝8.5Hz，2’-H和6’-H)，9.53(1H，s，4’-OH)，10.43(1H，brs，7-OH)其中，試樣溶解于重二甲基亞砜中，將殘留二甲基亞砜的化學(xué)位移值表示為2.49ppm。
FAB-MSm/z 355(M+H)+(其中，基質(zhì)使用甘油。)(3)按照與實(shí)施例17相同的方法測定實(shí)施例27-(2)制得的異黃腐酚的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。其結(jié)果如表30所示。添加異黃腐酚至0、50、100、200μM。異黃腐酚濃度依賴性地增強(qiáng)了L-M細(xì)胞的NGF產(chǎn)生。表30
濃度 NGF產(chǎn)生量(μM) (％)010050 110.7100 121.4200 198.0(其中，對照的NGF產(chǎn)生量為0.181ng/ml。)
(2)再使用反相色譜純化、分離上述黃腐酚級分——級分A。其條件如下所述。柱使用TSK gel ODS-80Ts(直徑21.5mm×長度30cmTosoh公司制)。溶劑A(將蒸餾水和乙腈按體積比3比2混合得到的溶劑，含有0.1％三氟醋酸)和溶劑B(將蒸餾水和乙腈按體積比1比4混合得到的溶劑，含有0.1％三氟醋酸)的洗脫比為0分鐘到60分鐘將溶劑B比直線地由50％上升至100％，接著將溶劑B比在100％保持20分鐘，最后使溶劑B比為50％，保持20分鐘。洗脫速度為5ml/分鐘，檢測在370nm進(jìn)行，每1分鐘收集1級分。
(3)按照與實(shí)施例17相同的方法測定上述黃腐酚級分——級分A的反相色譜級分的NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。結(jié)果表明含有21.1、22.2、24.2、25.7、28.6分鐘的檢測峰的級分具有NGF產(chǎn)生增強(qiáng)活性。其結(jié)果如表31所示。表31級分(保留時(shí)間分鐘) 濃度(mg/ml)NGF產(chǎn)生量(％)A-1(21.1) 0.02592.40.05 151.4A-2(22.2) 0.05 109.50.1 136.20.2 208.6A-3(24.2) 0.0125 134.30.025151.40.05 202.90.1 298.1A-4(25.7) 0.025197.10.05 345.70.1 416.2A-5(28.6) 0.0125 145.70.025189.50.05 229.50.1 517.1(其中，對照的NGF產(chǎn)生量為0.093ng/ml。)(4)通過質(zhì)量分析儀(DX302日本電子社制)，采用FAB-MS方法，測定上述級分A-5(含有保留時(shí)間28.6分鐘的檢測峰的級分)的質(zhì)譜(MS)。使用甘油作為基質(zhì)。結(jié)果檢測出m/z 371(M+H)+的峰。圖5表示來源于黃腐酚級分的級分A-5的MS波譜。在圖5中，橫軸表示m/z值，縱軸表示相對強(qiáng)度。
再使用核磁共振(NMR)波譜裝置(JNM-A500日本電子社制)，測定各種NMR波譜，進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，結(jié)果確認(rèn)活性成分為黃腐酚B(分子量370)和黃腐酚D(分子量370)的混合物(混合比1∶1.65)。NMR的歸屬信號如下所示。黃腐酚B1H-NMRδ1.21(3H，s，6-H)，1.27(3H，s，6-H)，2.70(2H，m，4-H)，3.65((1H，m，5-H)，3.87(3H，s，6-OCH3)，6.00(1H，s，5-H)，6.80(2H，m，3-H和5-H)，7.55(2H，m，2-H和6-H)，7.70(1H，m，β-H)，7.75(1H，m，α-H)，10.12(1H，s，4-OH)，14.18(1H，s，2-OH)黃腐酚D1H-NMRδ1.71(3H，s，5-H)，2.60(2H，m，1-H)，3.85(3H，s，6-OCH3)，4.20(1H，m，2-H)，4.58(1H，s，4-H)，4.61(1H，s，4-H)，6.04(1H，s，5-H)，6.80(2H，m，3-H和5-H)，7.55(2H，m，2-H和6-H)，7.70(1H，m，β-H)，7.75(1H，m，α-H)，10.09(1H，s，4-OH)，10.58(1H，s，4-OH)，14.69(1H，s，2-OH)其中，試樣溶解于重二甲基亞砜中，將殘留二甲基亞砜的化學(xué)位移值表示為2.49ppm。圖6表示來源于黃腐酚級分的級分A-5的1H-NMR波譜。圖6中，橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)，縱軸表示信號強(qiáng)度。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供一種用于治療或預(yù)防必須增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生的疾病的治療劑或預(yù)防劑、食品、飲料和飼料，其中以多元酚類、其衍生物和/或其鹽；或者多元酚類、其衍生物和/或其鹽通過(i)與金屬、金屬鹽和/或金屬離子進(jìn)行混合處理或(ii)進(jìn)行氧化處理得到的組合物作為有效成分。上述有效成分特別是對肝細(xì)胞增殖因子和神經(jīng)生長因子的產(chǎn)生增強(qiáng)作用優(yōu)良，因此按照本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供一種用于治療或預(yù)防必須增強(qiáng)肝細(xì)胞增殖因子和神經(jīng)生長因子產(chǎn)生的疾病的治療劑或預(yù)防劑、食品、飲料和飼料。
權(quán)利要求
1.一種必須增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生的疾病的治療劑或預(yù)防劑，其特征在于，含有下述物質(zhì)作為有效成分(i)選自多元酚類、其衍生物和它們的鹽中的至少1種，或者(ii)選自多元酚類、其衍生物和它們的鹽中的至少1種通過下述處理得到的組合物，(A)與選自金屬、金屬鹽和金屬離子中的至少1種的混合處理，或者(B)氧化處理。
2.如權(quán)利要求1所述的治療劑或預(yù)防劑，多元酚類是選自類黃酮、沒食子酸、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、咖啡酸和二咖啡?？崴嶂械闹辽?種。
3.如權(quán)利要求2所述的治療劑或預(yù)防劑，類黃酮是選自黃酮醇類、黃烷酮、查爾酮和黃烷醇中的至少1種。
4.如權(quán)利要求3所述的治療劑或預(yù)防劑，黃酮醇類是楊梅黃酮和/或五羥黃酮，黃烷酮是異黃腐酚，查爾酮是黃腐酚B和/或黃腐酚D，黃烷醇是表?xiàng)攦翰杷貤斔狨ァ?br> 5.如權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的治療劑或預(yù)防劑，多元酚類的衍生物是多元酚類的羧酸酯和/或糖苷。
6.如權(quán)利要求5所述的治療劑或預(yù)防劑，多元酚類的羧酸酯是咖啡酸甲酯和/或咖啡酸乙酯，多元酚類的糖苷是異東方蓼黃素。
7.如權(quán)利要求1～6中任意一項(xiàng)所述的治療劑或預(yù)防劑，金屬是選自鐵、錳、鎂、銅、鋅、銀、金、鋁、鈣、鎳、鈷中的至少1種，金屬鹽是含有上述金屬的鹽，金屬離子是上述金屬的離子。
8.如權(quán)利要求1～7中任意一項(xiàng)所述的治療劑或預(yù)防劑，生長因子是肝細(xì)胞增殖因子或神經(jīng)生長因子。
9.一種生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)用的食品、飲料或飼料，其特征在于，含有下述物質(zhì)作為有效成分(i)選自多元酚類、其衍生物和它們的鹽中的至少1種，或者(ii)選自多元酚類、其衍生物和它們的鹽中的至少1種通過下述處理得到的組合物，(A)與選自金屬、金屬鹽和金屬離子中的至少1種的混合處理，或者(B)氧化處理。
10.如權(quán)利要求9所述的食品、飲料或飼料，多元酚類是選自類黃酮、沒食子酸、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、咖啡酸和二咖啡酰奎尼酸中的至少1種。
11.如權(quán)利要求10所述的食品、飲料或飼料，類黃酮是選自黃酮醇類、黃烷酮、查爾酮和黃烷醇中的至少1種。
12.如權(quán)利要求11所述的食品、飲料或飼料，黃酮醇類是楊梅黃酮和/或五羥黃酮，黃烷酮是異黃腐酚，查爾酮是黃腐酚B和/或黃腐酚D，黃烷醇是表?xiàng)攦翰杷貤斔狨ァ?br> 13.如權(quán)利要求9～12中任意一項(xiàng)所述的食品、飲料或飼料，多元酚類的衍生物是多元酚類的羧酸酯和/或糖苷。
14.如權(quán)利要求13所述的食品、飲料或飼料，多元酚類的羧酸酯是咖啡酸甲酯和/或咖啡酸乙酯，多元酚類的糖苷是異東方蓼黃素。
15.如權(quán)利要求9～14中任意一項(xiàng)所述的食品、飲料或飼料，金屬是選自鐵、錳、鎂、銅、鋅、銀、金、鋁、鈣、鎳、鈷中的至少1種，金屬鹽是含有上述金屬的鹽，金屬離子是上述金屬的離子。
16.如權(quán)利要求9～15中任意一項(xiàng)所述的食品、飲料或飼料，生長因子是肝細(xì)胞增殖因子或神經(jīng)生長因子。
17.一種組合物，由選自多元酚類、其衍生物和它們的鹽中的至少1種通過下述處理得到，(A)與選自金屬、金屬鹽和金屬離子中的至少1種的混合處理，或者(B)氧化處理。
18.如權(quán)利要求17所述的組合物，多元酚類是綠原酸和/或咖啡酸，衍生物是上述多元酚類的羧酸酯和/或糖苷。
19.如權(quán)利要求17或18所述的組合物，金屬是選自鐵、錳、鎂、銅、鋅、銀、金、鋁、鈣、鎳、鈷中的至少1種，金屬鹽是含有上述金屬的鹽，金屬離子是上述金屬的離子。
20.如權(quán)利要求17～19中任意一項(xiàng)所述的組合物，具有生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)作用。
21.如權(quán)利要求20所述的組合物，生長因子是肝細(xì)胞增殖因子或神經(jīng)生長因子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于治療或預(yù)防必須增強(qiáng)生長因子產(chǎn)生的疾病的治療劑和預(yù)防劑，以及生長因子產(chǎn)生增強(qiáng)用食品、飲料和飼料，其中以多元酚類、其衍生物和/或其鹽；或者多元酚類、其衍生物和/或其鹽通過(i)與金屬、金屬鹽和/或金屬離子進(jìn)行混合處理或(ii)進(jìn)行氧化處理得到的組合物作為有效成分。
文檔編號A23L1/304GK1436074SQ01810992
公開日2003年8月13日 申請日期2001年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月11日
發(fā)明者大野木宏, 小林英二, 西村香織, 白發(fā)正宏, 李拖平, 佐川裕章, 加藤郁之進(jìn) 申請人:寶生物工程株式會社