哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏測(cè)定儀和測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏測(cè)定儀，包括設(shè)在基座上面的質(zhì)子漏反應(yīng)槽，其特征是：一TPMP＋電極的一端插入所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽上部的TPMP＋電極插入孔；一外參比電極的一端插入所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽上部的外參比電極插入孔；一Clark氧電極的一端插入所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽底部的Clark氧電極插入孔；所述TPMP＋電極的另一端和所述外參比電極的另一端分別通過電極導(dǎo)線與pH/離子計(jì)電連接，該pH/離子計(jì)與計(jì)算機(jī)電連接；所述Clark氧電極的另一端與氧電極信號(hào)轉(zhuǎn)換器電連接。本發(fā)明還涉及哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏的測(cè)定方法。本發(fā)明能夠準(zhǔn)確地測(cè)定線粒體質(zhì)子漏大小，為實(shí)驗(yàn)研究不同狀態(tài)下線粒體功能提供數(shù)據(jù)。
【專利說明】晡乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏測(cè)定儀和測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物能量學(xué)領(lǐng)域，具體涉及哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏測(cè)定儀和測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]線粒體是細(xì)胞能量工廠，合成ATP (三磷酸腺苷)供機(jī)體使用，與生命活動(dòng)息息相關(guān)。線粒體能量合成影響因素涉及到電子傳遞、氧化磷酸化偶聯(lián)以及糖、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的代謝過程，是一個(gè)復(fù)雜而精妙的過程。線粒體呼吸鏈在傳遞電子的過程中消耗氧，同時(shí)將質(zhì)子由線粒體內(nèi)膜的基質(zhì)側(cè)轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜外側(cè)形成跨膜質(zhì)子梯度，即質(zhì)子勢(shì)能(AP),質(zhì)子勢(shì)能驅(qū)動(dòng)質(zhì)子返回基質(zhì)側(cè)并由ATP合成酶合成ATP。但有一部分質(zhì)子不通過ATP酶而回到基質(zhì)，勢(shì)能以熱能的形式釋放，不產(chǎn)生ATP，這個(gè)過程稱為質(zhì)子漏(BrandM D, Chien L F, Ainscow E K，et al.The causes and functions of mitochondrialproton leak.Biochim Biophys Acta, 1994，1187 (I): 132 ?139)。質(zhì)子漏作為一個(gè)生理現(xiàn)象廣泛的存在于人體各個(gè)組織細(xì)胞的線粒體中(Porter R K，Brand M D.Body massdependence of H+leak in mitochondria and its relevance to metabolic rate.Nature, 1993，362(6421):628?630)，隨著線粒體功能狀態(tài)改變而發(fā)生變化，并影響線粒體ATP合成。探測(cè)線粒體質(zhì)子漏大小及其改變是研究線粒體功能的重要指標(biāo)。
[0003]以往的研究多以Clark氧電極所測(cè)定線粒體呼吸氧耗曲線中的4態(tài)呼吸氧耗作為反映質(zhì)子漏的指標(biāo)。但這樣存在兩個(gè)問題:首先，呼吸氧耗的反應(yīng)體系沒有加入寡霉素抑制ATP合成酶的活性，4態(tài)呼吸時(shí)，ATP合成酶仍然少量的合成與分解ATP，這時(shí)的耗氧量不能絕對(duì)代表質(zhì)子漏途徑消耗的氧量；其次，線粒體內(nèi)膜為非歐姆導(dǎo)性膜，內(nèi)膜兩側(cè)電壓差A(yù) V增高到一定程度時(shí)，電子傳遞速度降低而質(zhì)子回漏增加。可見質(zhì)子漏的大小應(yīng)該是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的數(shù)值，而不應(yīng)該由4態(tài)呼吸氧耗這樣一個(gè)靜態(tài)的指標(biāo)表示。因此，需要尋求一種能實(shí)時(shí)準(zhǔn)確反映線粒體質(zhì)子漏大小的裝置和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏測(cè)定儀，其能夠準(zhǔn)確地測(cè)定線粒體質(zhì)子漏大小，為實(shí)驗(yàn)研究不同狀態(tài)下線粒體功能提供數(shù)據(jù)。
[0005]本發(fā)明所述的哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏測(cè)定儀，包括設(shè)在基座上面的質(zhì)子漏反應(yīng)槽，在所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽的上部設(shè)有外參比電極插入孔和TPMP +電極插入孔，在所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽的底部設(shè)有Clark氧電極插入孔，其特征是:
[0006]一 TPMP +電極的一端插入所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽上部的TPMP +電極插入孔；
[0007]—外參比電極的一端插入所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽上部的外參比電極插入孔；
[0008]— Clark氧電極的一端插入所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽底部的Clark氧電極插入孔,Clark氧電極是為測(cè)定水中溶解氧含量而設(shè)計(jì)的一種極譜電極，能反映溶液中的氧含量；
[0009]所述TPMP +電極的另一端和所述外參比電極的另一端分別通過電極導(dǎo)線與pH/離子計(jì)電連接，該pH/離子計(jì)與計(jì)算機(jī)電連接；
[0010]所述Clark氧電極的另一端與氧電極信號(hào)轉(zhuǎn)換器電連接。
[0011]所述的哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏測(cè)定儀，其所述TPMP +電極包括聚氯乙烯套筒、設(shè)在聚氯乙烯套筒底部的TPMP +電極膜、下端插入聚氯乙烯套筒內(nèi)的鉬絲，所述鉬絲的上端，即TPMP +電極的另一端，通過電極導(dǎo)線與pH/離子計(jì)電連接。
[0012]本發(fā)明還提供一種哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏的測(cè)定方法，該方法能實(shí)時(shí)準(zhǔn)確反映線粒體質(zhì)子漏大小，適用于生物器官組織分離線粒體質(zhì)子漏的測(cè)量。
[0013]所述的哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏的測(cè)定方法，以哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體為測(cè)定對(duì)象，包括以下步驟:
[0014]第一步，制備組織勻漿液；
[0015]第二步，分離組織線粒體；
[0016]第三步，制備線粒體懸液；
[0017]第四步，測(cè)定質(zhì)子漏，在所述哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏的測(cè)定儀上進(jìn)行；
[0018]①測(cè)定TPMP +濃度，作標(biāo)準(zhǔn)滴定曲線；
[0019]②測(cè)定質(zhì)子漏；
[0020]③測(cè)定線粒體外的TPMP+含量；
[0021 ] ④繪制線粒體質(zhì)子漏曲線圖。
[0022]本發(fā)明的有益效果:腦線粒體與肝線粒體A P與呼吸氧耗都顯示出非線性關(guān)系，符合線粒體內(nèi)膜的非歐姆導(dǎo)性。同時(shí)，可以看出腦線粒體和肝線粒體在相同A P時(shí)，腦線粒體呼吸氧耗較大。因此表明腦線粒體質(zhì)子漏較肝線粒體質(zhì)子漏大。這樣，我們可以對(duì)線粒體質(zhì)子漏大小進(jìn)行比較，為實(shí)驗(yàn)研究不同狀態(tài)下線粒體功能提供有力的數(shù)據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是測(cè)定哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏測(cè)定儀的示意圖；
[0024]圖2是TPMP +電極和參比電極與離子計(jì)的連接示意圖；
[0025]圖3是質(zhì)子漏反應(yīng)槽的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0026]圖4是標(biāo)準(zhǔn)滴定曲線圖；[圖中:Y為TPMP離子電極電位偏離基線程度，X為L(zhǎng)og(TPMP+)，R為相關(guān)系數(shù)];
[0027]圖5是腦線粒體質(zhì)子漏曲線圖；
[0028]圖6是肝線粒體質(zhì)子漏曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0030]參見圖1、圖2和圖3所示的測(cè)定哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏測(cè)定儀，包括設(shè)在基座9上面的質(zhì)子漏反應(yīng)槽8，在所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽8的上部設(shè)有外參比電極插入孔5和TPMP +電極插入孔6，在所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽8的底部設(shè)有Clark氧電極插入孔7 ；
[0031]一 TPMP +電極I的一端插入所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽8上部的TPMP +電極插入孔6 ；
[0032]一外參比電極2的一端插入所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽8上部的外參比電極插入孔5 ；[0033]— Clark氧電極12的一端插入所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽8底部的Clark氧電極插入孔7 ；
[0034]所述TPMP +電極I的另一端和所述外參比電極2的另一端分別通過電極導(dǎo)線4與pH/離子計(jì)3電連接,該pH/離子計(jì)3與計(jì)算機(jī)10電連接；
[0035]所述Clark氧電極12的另一端與氧電極信號(hào)轉(zhuǎn)換器11電連接。
[0036]進(jìn)一步，所述TPMP +電極I包括聚氯乙烯套筒I 一 2、設(shè)在聚氯乙烯套筒底部的TPMP +電極膜I 一 3、下端插入聚氯乙烯套筒內(nèi)的鉬絲I 一 1，所述鉬絲的上端，即TPMP +電極I的另一端，通過電極導(dǎo)線4與pH/離子計(jì)3電連接。
[0037]所述的TPMP +電極選用TPMP + Br作為選擇性陽離子并制作電極，四苯基硼作為與TPMP+相作用的物質(zhì)與多聚氯乙烯以及塑形劑鄰苯二甲酸二辛酯混合后做成膜狀；將膜用四氫呋喃粘貼于聚氯乙烯套子后，將IOmM的TPMPBr溶液置入聚氯乙烯套子里，隨后放入一根I 一 2cm長(zhǎng)的鉬絲，并保證鉬絲與IOmM的TPMPBr溶液接觸，鉬絲事先焊接在有膠皮隔絕的電極導(dǎo)線頭上，把電極導(dǎo)線頭和飽和KCl甘汞電極參比電極連接于PH/離子計(jì)上，將顯示檔調(diào)定于mV位置即可直接讀數(shù) 。
[0038]所述TPMP +電極膜，參照kamo與MD Brand的方法進(jìn)行改進(jìn)，選用TPMP + Br (購于sigma)作為選擇性陽離子并制作電極，四苯基硼作為與TPMP +相作用的物質(zhì)與多聚氯乙烯以及塑形劑鄰苯二甲酸二辛酯混合后做成膜狀。
[0039]實(shí)施例一:哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏的測(cè)定方法，以腦組織分離的線粒體作為測(cè)定對(duì)象，包括以下步驟:
[0040]第一步，制備腦勻漿液:取健康成年SD系大鼠一只，體重為150_200g，取出雙側(cè)大腦半球，重量為30-50g，放入腦線粒體分離介質(zhì)中，將其中的腦組織塊剪碎后，用組織玻璃勻漿器上下勻漿15次，至腦組織塊被完全研磨碎，得到腦勻漿液；所述腦線粒體分離介質(zhì)的成分為 0.25mol/L 蔗糖，10mmol/LTris2HCl, 0.5mmol/L EDTA-2K (乙二胺四乙酸二鉀)pH7.4 ；
[0041]第二步，分離腦線粒體:將得到的腦勻漿液離心處理，棄沉淀，得到含有腦線粒體的粗上清液；取得到的粗上清液重復(fù)離心處理一次，棄沉淀，得到含有腦線粒體的精上清液；取所得的精上清液離心處理，棄上清，得到腦線粒體一次沉淀；將上一步所得的腦線粒體一次沉淀用0.8ml含3%Ficoll400 (聚蔗糖，分子量400000)的溶液溶解形成懸液，將此懸液用Iml移液器轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入3.2ml含6%Ficoll400的溶液上，形成密度梯度，做離心處理，棄上清，得到腦線粒體二次沉淀；將得到的腦線粒體二次沉淀用3 - 5ml的腦線粒體分離介質(zhì)溶解，離心處理得到腦線粒體三次沉淀；
[0042]第三步,制備腦線粒體懸液:將第二步得到的腦線粒體三次沉淀用0.5 — 1.0ml腦線粒體分離介質(zhì)溶解，制備成10-20mg/ml的腦線粒體懸液；
[0043]第四步，測(cè)定質(zhì)子漏:在TPMP +電極與Clark氧電極相結(jié)合的質(zhì)子漏反應(yīng)槽8中進(jìn)行，同時(shí)對(duì)質(zhì)子勢(shì)能A P與線粒體呼吸氧耗進(jìn)行測(cè)量；所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽為所述的測(cè)定哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏測(cè)定儀的質(zhì)子漏反應(yīng)槽；參見圖4、圖5 ;
[0044]①測(cè)定TPMP+濃度，作標(biāo)準(zhǔn)滴定曲線；在所述的哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏測(cè)定儀的質(zhì)子漏反應(yīng)槽8中加入4ml含有120mmol/L KCl、50mmol/L鹿糖、10mmol/LNaH2PO4^ lmmol/L EDTA> lOmmol/L 葡萄糖、lOmmol/L 丁二酸鈉、80ng/L 尼日利亞素,配制成PH7.2的質(zhì)子漏反應(yīng)介質(zhì)，質(zhì)子漏反應(yīng)槽的溫度保持37°C ;此時(shí)，pH/離子計(jì)3顯示的讀數(shù)即為基線值，而后，分9次加入lumol/L的TPMPBr，每次5ul，以TPMP +濃度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以離子計(jì)讀數(shù)與基線值偏離程度值為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)滴定曲線；
[0045]②測(cè)定質(zhì)子漏；在質(zhì)子漏反應(yīng)槽中加入第三步分離的腦線粒體懸液50ul，再加入
2.8ug/ml的寡霉素4ul抑制FtlF1-ATP (為線粒體內(nèi)ATP合成的關(guān)鍵酶)酶活性；這時(shí)，由于腦線粒體懸液中的FtlF1-ATP酶活性被抑制，氫離子只能通過質(zhì)子漏途徑返回線粒體基質(zhì)，氧化磷酸化底物丁二酸鈉進(jìn)入腦線粒體的三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生的NADH (尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸)和FADH2 (黃素腺嘌呤二核苷酸)所攜帶的電子傳遞給O2與質(zhì)子漏途徑返回機(jī)制的H +發(fā)生還原反應(yīng)生成水，而不生成ATP ;這樣，保證了實(shí)驗(yàn)中氧的消耗只與質(zhì)子漏途徑有關(guān)；
[0046]③測(cè)定線粒體外的TPMP+含量；分7次加入濃度為lOmmol/L丙二酸鈉2ul，作為丁二酸鈉的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑；丙二酸的加入將引起質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)能的改變，TPMP+受勢(shì)能影響其在線粒體內(nèi)、外的分布將發(fā)生改變，通過離子計(jì)的讀數(shù)，可從標(biāo)準(zhǔn)滴定曲線上讀出TPMP +的濃度，并將其進(jìn)行l(wèi)og換算，得到反應(yīng)介質(zhì)中TPMP+含量，即線粒體外的TPMP+含量；同時(shí)，每加入一次記錄一次呼吸耗氧量，呼吸耗氧量以nmolO/min/mg表示；質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)能根據(jù)TPMP+分布利用nersnt方程(能斯特方程，表述細(xì)胞膜內(nèi)外的電化學(xué)勢(shì)差與離子濃度差之間的關(guān)系)進(jìn)行計(jì)算:
[0047]質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)能AP=61.51og{[加入的TPMP + —線粒體外的TPMP+含量]} XTPMP +結(jié)合系數(shù)/(0.001 Xmg蛋白/mix線粒體外TPMP +的含量)；
[0048]根據(jù)nersnt方程，溫度保持在37°C時(shí)，系數(shù)RT/nF為一常數(shù)61.5 (R:氣體常數(shù)，其值為8.314J ? mol-1 ? K-1 ；n:離子化合價(jià)；F:法拉弟常數(shù)(96485焦耳? v_l ? mol-1)；
[0049]腦組織線粒體中的TPMP +結(jié)合系數(shù)為0.3 (參考文獻(xiàn)Brand M D, Chien LF，Ainscow E K，et al.The causes and functions of mitochondrial proton leak.Biochim Biophys Acta, 1994，1187(1):132 ~139)；
[0050]④繪制線粒體質(zhì)子漏曲線圖；在質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)能AP達(dá)到一定數(shù)值以后，呼吸氧耗量與AP之間呈非線性關(guān)系。內(nèi)膜在此時(shí)表現(xiàn)為非歐姆特性的導(dǎo)體。因此，質(zhì)子漏是一個(gè)動(dòng)態(tài)的指標(biāo)，在我們的模型中，由于已經(jīng)將排除質(zhì)子從FtlF1-ATP返回線粒體內(nèi)膜的可能性，不同的A P對(duì)應(yīng)的呼吸氧耗僅僅表示通過質(zhì)子漏消耗的氧耗，所以我們以質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)能A P作為橫坐標(biāo)，呼吸耗氧量為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，能清楚的反應(yīng)此時(shí)呼吸氧耗量與AP之間的這種非線性關(guān)系，這條曲線也被命名為線粒體質(zhì)子漏曲線圖；該曲線圖反映了線粒體質(zhì)子漏隨質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)能變化的關(guān)系。如果我們需要定量比較腦線粒體在不同狀態(tài)(比如正常與缺血缺氧狀態(tài)下)下質(zhì)子漏的差異，我們則需要在有效范圍內(nèi)確定一個(gè)A P值(比如150mV)，然后比較在這個(gè)確定的A P的條件下氧耗量的大小。在同一A P值水平下,氧耗量大提示所消耗的氧產(chǎn)生的質(zhì)子全部通過質(zhì)子漏回流到線粒體內(nèi)膜，意味著氧耗量大的哪一組質(zhì)子漏更多。
[0051]實(shí)施例二:哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏的測(cè)定方法，以肝分離線粒體作為測(cè)定對(duì)象，包括以下步驟:`[0052]第一步，制備肝勻漿液:取健康SD系大鼠的肝組織塊，重量為lg，放入帶冰渣的肝線粒體分離介質(zhì)中，并將肝組織塊剪碎后，勻漿至肝組織塊被完全研磨碎，得到肝勻漿液；所述肝線粒體分離介質(zhì)的成分為0.25mol/L鹿糖，10mmol/L HEPES, lmmol/L EDTA_2NapH7.4 ；
[0053]第二步，分離肝線粒體:將肝勻漿液在離心機(jī)上離心處理，棄沉淀，得到含有肝臟線粒體的上清液；將所得的含有肝線粒體的上清液，在離心機(jī)上離心處理，棄上清，得到肝線粒體一次沉淀；將得到的肝線粒體一次沉淀以2ml肝線粒體分離介質(zhì)懸浮，在離心機(jī)上離心，棄上清，得到肝線粒體二次沉淀；
[0054]第三步，制備肝線粒體懸液:肝線粒體二次沉淀用同樣組分的肝線粒體分離介質(zhì)清洗兩遍后，以0.5 — 1.0ml肝線粒體分離介質(zhì)懸浮,制備成10-20mg/ml的肝線粒體懸液，并采用Folin —酚法測(cè)定肝線粒體蛋白濃度(以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn))；
[0055]第四步，測(cè)定質(zhì)子漏:在TPMP +電極與Clark氧電極相結(jié)合的質(zhì)子漏反應(yīng)槽8中進(jìn)行，同時(shí)對(duì)質(zhì)子勢(shì)能A P與線粒體呼吸氧耗進(jìn)行測(cè)量；所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽為所述的測(cè)定哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏測(cè)定儀的質(zhì)子漏反應(yīng)槽；參見圖4、圖6 ;
[0056]①測(cè)定TPMP+濃度，作標(biāo)準(zhǔn)滴定曲線；在所述的哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏測(cè)定儀的質(zhì)子漏反應(yīng)槽8中加入4ml含有120mmol/L KCl、50mmol/L鹿糖、10mmol/LNaH2P04、lmmol/L EDTA、lOmmol/L葡萄糖、lOmmol/L 丁二酸鈉、80ng/L尼日利亞素，pH7.2 的質(zhì)子漏反應(yīng)介質(zhì)，質(zhì)子漏反應(yīng)槽的溫度保持37°C ;此時(shí)，pH/離子計(jì)3顯示的讀數(shù)即為基線值，而后，分9次加入lumol/L的TPMPBr，每次5ul，以TPMP +濃度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以離子計(jì)讀數(shù)與基線值偏離程度值為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)滴定曲線；
[0057]②測(cè)定質(zhì)子漏；在質(zhì)子漏反應(yīng)槽中加入分離的肝線粒體懸液50ul，再加入2.8ug/ml的寡霉素4ul抑制FtlF1-ATP酶活性；這時(shí)，由于肝線粒體FtlF1-ATP酶活性被抑制，氫離子只能通過質(zhì)子漏途徑返回線粒體基質(zhì)，底物丁二酸鈉進(jìn)入線粒體的三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生的NADH (尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸)和FADH2 (黃素腺嘌呤二核苷酸)所攜帶的電子傳遞給O2與質(zhì)子漏途徑返回機(jī)制的H+發(fā)生還原反應(yīng)生成水，而不生成ATP;這樣，保證了實(shí)驗(yàn)中氧的消耗只與質(zhì)子漏途徑有關(guān)；
[0058]③測(cè)定線粒體外的TPMP+含量；分7次加入10mmol/L的丙二酸鈉2ul丙二酸鈉，作為丁二酸鈉的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑；每加入一次記錄一次呼吸耗氧量與質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)能；呼吸耗氧量以nmolO/min/mg表示；質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)能根據(jù)TPMP+分布利用nersnt方程進(jìn)行計(jì)算:
[0059]質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)能AP=61.51og{[加入的TPMP + —線粒體外的TPMP+含量]} XTPMP +結(jié)合系數(shù)/(0.001 Xmg蛋白/mix線粒體外TPMP +的含量)；
[0060]根據(jù)nersnt方程，溫度保持在37°C時(shí)，系數(shù)RT/nF為一常數(shù)61.5 (R:氣體常數(shù)，其值為8.314J ? mol-1 ? K-1 ；n:離子化合價(jià)；F:法拉弟常數(shù)(96485焦耳? v_l ? mol-1)；
[0061]肝組織線粒體中的TPMP +結(jié)合系數(shù)為0.42 (參考文獻(xiàn)Brand M D, Chien LF，Ainscow E K，et al.The causes and functions of mitochondrial proton leak.Biochim Biophys Acta, 1994，1187(1):132 ~139)；
[0062]④繪制線粒體質(zhì)子漏曲線圖； 在質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)能AP達(dá)到一定數(shù)值以后，呼吸氧耗量與AP之間呈非線性關(guān)系。內(nèi)膜在此時(shí)表現(xiàn)為非歐姆特性的導(dǎo)體。因此，質(zhì)子漏是一個(gè)動(dòng)態(tài)的指標(biāo)，在我們的模型中，由于已經(jīng)將排除質(zhì)子從FtlF1-ATP返回線粒體內(nèi)膜的可能性，不同的A P對(duì)應(yīng)的呼吸氧耗僅僅表示通過質(zhì)子漏消耗的氧耗，所以我們以質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)能A P作為橫坐標(biāo)，呼吸耗氧量為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，能清楚的反應(yīng)此時(shí)呼吸氧耗量與AP之間的這種非線性關(guān)系，這條曲線也被命名為線粒體質(zhì)子漏曲線圖；該曲線圖反映了線粒體質(zhì)子漏隨質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)能變化的關(guān)系。如果我們需要定量比較肝線粒體在不同狀態(tài)(比如正常與肝硬化狀態(tài)下)下質(zhì)子漏的差異，我們則需要在有效范圍內(nèi)確定一個(gè)A P值(比如150mV)，然后比較在這個(gè)確定的A P的條件下氧耗量的大小。在同一A P值水平下,氧耗量大提示所消耗的氧產(chǎn)生的質(zhì)子全部通過質(zhì)子漏回流到線粒體內(nèi)膜，意味著氧耗量大的哪一組質(zhì)子漏更多。
[0063]實(shí)施例一和實(shí)施例二中所述的TPMP +電極選用TPMP+ Br(購于sigma公司)作為選擇性陽離子并制作電極，四苯基硼作為與TPMP+相作用的物質(zhì)與多聚氯乙烯以及塑形劑鄰苯二甲酸二辛酯混合后做成膜狀。將膜I 一 3用四氫呋喃粘貼于聚氯乙烯套子后，將IOmM的TPMP+溶液置入聚氯乙烯套子I 一 2里，隨后放入一根I 一 2cm長(zhǎng)的鉬絲I 一 1，保證鉬絲與IOmM的TPMP+溶液接觸，鉬絲事先焊接在有膠皮隔絕的電極導(dǎo)線頭上，把電極導(dǎo)線頭和KCl甘汞參比電極連接于pH/離子計(jì)(蕭山市科學(xué)儀器廠制造PHS-10C)上，將顯示檔調(diào)定于mV位置即可直接讀數(shù)。
[0064]測(cè)量時(shí)需要注意以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟:
[0065](I)尼日利亞素為線粒體內(nèi)膜上H + -K+離子交換載體，能將A P中的化學(xué)勢(shì)能(z AH)轉(zhuǎn)化為電勢(shì)能(A V)，使通過測(cè)量電勢(shì)能(A HO即能表示A P大小。
[0066](2)寡霉素的加入能抑制FtlF1-ATP酶活性，使實(shí)驗(yàn)中絕對(duì)無ATP生成，是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。
[0067](3)丙二酸與琥珀酸是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，丙二酸的存在使琥珀酸不能被琥珀酸脫氫酶催化，從而不能完成三羧酸循環(huán)生成NADH和FADH2量。通過人為的改變?nèi)人嵫h(huán)產(chǎn)生的NADH和FADH2量，控制線粒體內(nèi)膜兩側(cè)H+離子梯度，這樣可以觀察在不同的質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)下面，氧氣消耗量的多少，反映質(zhì)子漏大小，符合線粒體內(nèi)膜的非歐姆導(dǎo)性特點(diǎn)，真實(shí)的表現(xiàn)出線粒體質(zhì)子漏的本質(zhì)。
[0068]關(guān)于TPMP+結(jié)合系數(shù)的測(cè)定。TPMP+屬于親脂性陽離子。它在通過線粒體內(nèi)膜時(shí)會(huì)吸附到內(nèi)膜表面，而影響nernst方程的準(zhǔn)確性，所以必須用TPMP+陽離子結(jié)合系數(shù)進(jìn)行修正，陽離子結(jié)合系數(shù)與線粒體基質(zhì)體積密切相關(guān)。
[0069](1)基質(zhì)體積的計(jì)算；
[0070]3H2O能夠通過線粒體內(nèi)膜進(jìn)入到基質(zhì)，而[14C]蔗糖卻不能通過內(nèi)膜，僅能達(dá)到膜間腔。因此他們分布空間相減除以蛋白濃度即為基質(zhì)體積(ul/mg)。含有Iml反應(yīng)介質(zhì)(120mmol/L Kcl, Smmol /T, Hepes, lmmol/L EGTA, 5umol/L 魚藤麗? pH7.2)的 EP 管中加入2mg線粒體蛋白(約40ul懸液)，隨后加入IOul (IuCi)的3H2O, IOul (0.1uCi)的[14C]蔗糖，水浴2min(37°C )。12000g離心后取0.5ml上清于5ml閃爍瓶中，然后加入3.5ml閃爍液。沉淀用40ul的5% SDS溶解后亦加入3.5ml閃爍液。用液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定其放射活性。分布空間=DPM沉淀XV上清/DPM上清。
[0071](2) TPMP+結(jié)合系數(shù)測(cè)定；
[0072]86Rb通過線粒體內(nèi)膜不產(chǎn)生吸附，能全部進(jìn)入線粒體內(nèi)膜。因此{(lán)[3H]TPMP+分布空間一 [14C]蔗糖分布空間}/{86Rb分布空間一 [14C]蔗糖分布空間}就代表了進(jìn)入線粒體內(nèi)膜而沒有附著于內(nèi)膜上的TPMP+的百分比，再除以基質(zhì)體積即為TPMP+結(jié)合系數(shù)(mg/ul)。兩只含有Iml的反應(yīng)介質(zhì)的EP管中各加入Iul表霉素(0.lug)，分別加入IOul86RbCl (0.025uCi)和 IOul [3H]TPMP+Cl。隨后，兩管中都加入[14C]蔗糖 IOul (0.1uCi)以及IOul 丁二酸鹽(5mmol/L)后37°C水浴兩分鐘后離心，根據(jù)上訴方法計(jì)算分布空間后，帶入公式計(jì)算TPMP+結(jié)合系數(shù)。
[0073]關(guān)于TPMP +電極，實(shí)驗(yàn)表明:基于四苯硼鈉為中性載體的陽離子選擇性電極對(duì)TPMP + (triphenylmethyIphosphonium (甲基三苯磷酸鹽陽離子)具有良好的電位響應(yīng)特性，在PH7.2的氯化鉀緩沖液中。電極電位呈近能斯特(就是近似于能斯nerst，這是化學(xué)中計(jì)算電極電位的方程)響應(yīng)，線型相應(yīng)范圍為5X10_7-1X10 —2mol/L,平均斜率為33.16 (30°C),檢出限(檢出TPMP +的濃度下限)為1X10 —7mol/L。該電極響應(yīng)時(shí)間短(<5s)，對(duì)TPMP+反應(yīng)敏感，pH范圍寬(4.5-8.0)，抗干擾能力強(qiáng)，適用于TPMP+離子濃度測(cè)定。 [0074]TPMP+作為兼性陽離子(準(zhǔn)確說應(yīng)該是親脂性陽離子)，能夠迅速的分布于生物膜系統(tǒng)兩側(cè)，符合Nerst (能斯特)方程。因此，檢測(cè)生物膜兩側(cè)TPMP+濃度可以計(jì)算出膜電位的大小。這可以通過放射性核素(3H或14C標(biāo)記TPMP+中的H或C)標(biāo)記TPMP+加以實(shí)現(xiàn)，但存在核素放射污染的問題，PVC (給出中文名稱聚氯乙烯)膜離子選擇性電極同樣可以通過電化學(xué)電池電勢(shì)的數(shù)值以檢測(cè)膜電位，(根據(jù)電極電位反映兩側(cè)TPMP+濃度，從而計(jì)算出膜兩側(cè)電勢(shì)差一即膜電位)，且體積小巧、適用范圍廣、不存在放射線污染。我們根據(jù)Brand MD(給出中文名稱馬丁 ?布蘭德)的方法加以改進(jìn)，構(gòu)建出合適檢測(cè)生物膜電位的TPMP+電極。并利用TPMP+電極對(duì)大鼠腦線粒體膜電位和質(zhì)子漏進(jìn)行檢測(cè)。
[0075]TPMPBr (溴化甲基三苯磷酸鹽)，F(xiàn)CCP (羰基氰對(duì)三氟基苯腙)，尼日利亞素，寡霉素(以上皆購自Sigma (西格馬)公司)，羧基蒼鼠苷CAT(默克公司)，四苯硼鈉，鄰苯二甲酸二辛酯，PVC粉皆購自上海試劑一廠。其余試劑均為分析純。水為去離子水。
[0076]TPMP+電極制作步驟:
[0077](I)將6ml四苯硼鈉溶液(IOmM溶于四氫呋喃)和20ml聚氯乙烯溶液(IgPVC粉溶于四氫呋喃)加入玻璃容器中，用力攪拌，隨后加入3ml塑形劑鄰苯二甲酸二辛酯得到混合溶液；
[0078](2)將上一步得到的混合溶液傾倒入五個(gè)玻璃平皿上，放置在水平臺(tái)上24 - 48小時(shí)使其溶液水分蒸發(fā)形成膜狀物，所得到的膜應(yīng)該無色、透明、有韌性；
[0079](3)準(zhǔn)備一些PVC管作為電極的套子；
[0080](4)滴一滴四氫呋喃在膜上面并馬上垂直放置(就是把PVC管子放置在膜表面，讓膜粘在PVC管上)一個(gè)多聚氯乙烯(PVC)套子在這一滴四氫呋喃上面，在四氫呋喃沒有干之前，要支持固定(用手拿著支持固定，可以用小風(fēng)扇加速四氫呋喃干燥)多聚氯乙烯管子；
[0081](5)將管子放置24 - 48小時(shí)等待下一步處理；
[0082](6)用刀片切下粘好在多聚氯乙烯管子上的膜，將多聚氯乙烯管子和膜一起取下，用眼科剪修剪邊角，使其平滑；
[0083](7)用微量注射器將IOmM的TPMP ( ?即10mmol/L的TPMPBr水溶液)置入電極套子里，注意:防止氣泡的產(chǎn)生；將電極套浸泡在IOmM的溶液里至少48小時(shí)(越長(zhǎng)的時(shí)間越好，更能增加電極對(duì)TPMP的敏感程度)。
[0084](8)要使用電極套的時(shí)候，將一根I 一 2cm長(zhǎng)的鉬絲放入其中；鉬絲事先焊接在有膠皮隔絕的電極導(dǎo)線頭的軸上面。電極套能夠和導(dǎo)線頭很好的吻合；為了避免在放入時(shí)電極內(nèi)壓力變化導(dǎo)致膜破損，放置一個(gè)一次性的毛細(xì)移液吸頭在電極套和導(dǎo)線頭空隙處；
[0085](9)把電極導(dǎo)線頭和一個(gè)KCl飽和甘汞參比電極接到pH/離子計(jì)上面，并輸出到可以繪制曲線的走紙儀；
[0086](10)測(cè)試電極的靈敏度和穩(wěn)定程度的方法:將TPMP電極和參比電極放置在一個(gè)攪拌的介質(zhì)(已準(zhǔn)備120mM Kcl。5mM HEPES, ImM EGTA)里面，加入Iul的ImM TPMP (最終濃度達(dá)到luM)，檢測(cè)到有信號(hào)，繼續(xù)加入lul，重復(fù)幾次，每次都會(huì)有小的改變，當(dāng)濃度達(dá)到5uM TPMP+的時(shí)候，信號(hào)會(huì)達(dá)到穩(wěn)定以及低噪聲。不使用的情況下，將TPMP電極保存在含有uM級(jí)數(shù)量單位的TPMPBr介質(zhì)里。
【權(quán)利要求】
1.哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏測(cè)定儀，包括設(shè)在基座(9)上面的質(zhì)子漏反應(yīng)槽(8),在所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽(8)的上部設(shè)有外參比電極插入孔(5)和TPMP +電極插入孔(6)，在所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽(8)的底部設(shè)有Clark氧電極插入孔(7)，其特征是: 一 TPMP +電極(I)的一端插入所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽(8)上部的TPMP +電極插入孔(6)； 一外參比電極(2)的一端插入所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽(8)上部的外參比電極插入孔(5)； 一 Clark氧電極(12)的一端插入所述質(zhì)子漏反應(yīng)槽(8)底部的Clark氧電極插入孔(7)； 所述TPMP +電極(I)的另一端和所述外參比電極(2)的另一端分別通過電極導(dǎo)線(4)與PH/離子計(jì)(3)電連接,該P(yáng)H/離子計(jì)(3)與計(jì)算機(jī)(10)電連接； 所述Clark氧電極(12)的另一端與氧電極信號(hào)轉(zhuǎn)換器(11)電連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏測(cè)定儀，其特征是:所述TPMP +電極(I)包括聚氯乙烯套筒(1- 2)、設(shè)在聚氯乙烯套筒底部的TPMP +電極膜(1-3)、下端插入聚氯乙烯套筒內(nèi)的鉬絲(1- 1)，所述鉬絲的上端，即TPMP +電極(I)的另一端，通過電極導(dǎo)線(4)與PH/離子計(jì)(3)電連接。
3.哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏的測(cè)定方法，以哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體為測(cè)定對(duì)象，包括以下步驟: 第一步，制備組織勻漿液； 第二步，分離組織線粒體； 第三步，制備線粒體懸液； 第四步，測(cè)定質(zhì)子漏，在權(quán)利要求1或2所述哺乳動(dòng)物組織分離的線粒體質(zhì)子漏的測(cè)定儀上進(jìn)行； --測(cè)定TPMP +濃度，作標(biāo)準(zhǔn)滴定曲線； --測(cè)定質(zhì)子漏； --測(cè)定線粒體外的TPMP +含量； ④繪制線粒體質(zhì)子漏曲線圖。
【文檔編號(hào)】G01N27/416GK103529109SQ201310462402
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】徐瑜, 柳君澤, 劉煜亮, 胡義德, 錢桂生, 王長(zhǎng)征, 王關(guān)嵩, 郜攀 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院