用于哺乳動(dòng)物囊胚細(xì)胞凋亡檢測(cè)的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于哺乳動(dòng)物囊胚細(xì)胞凋亡檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包括含0.5％BSA的PBS液、含2％多聚甲醛的PBS液、含0.5％Triton?X-100和0.05％Tween20的PBS液、含10％山羊血清和0.05％Tween20的PBS液、兔抗caspase-3一抗、帶有Alexa?Fluor594紅色熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，以及含20μM?H33342的PBS液。本發(fā)明主要基于免疫熒光技術(shù)，以細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要的半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)為靶點(diǎn)，采用針對(duì)caspase-3一抗和攜帶熒光素的二抗進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，對(duì)胚胎中的凋亡細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記和計(jì)數(shù)；再用DNA染料著色所有細(xì)胞的細(xì)胞核，從而計(jì)算出囊胚細(xì)胞的凋亡率。本發(fā)明結(jié)合熒光顯微鏡，能對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量檢測(cè)，靈敏度高、特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，效率高。
【專利說(shuō)明】用于晡乳動(dòng)物囊胚細(xì)胞凋亡檢測(cè)的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域及免疫熒光技術(shù)，具體地說(shuō)，涉及一種用于哺乳動(dòng)物囊胚細(xì)胞凋亡檢測(cè)的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞凋亡(apoptosis)是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)形成的一種自我死亡過(guò)程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控等作用。大量的光鏡及超微結(jié)構(gòu)的研究分析證明哺乳動(dòng)物附植前的胚胎就可以觀察到細(xì)胞凋亡的發(fā)生，胚胎細(xì)胞的凋亡有利于胚胎去除發(fā)育異常的細(xì)胞，但研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與胚胎發(fā)育的停滯相關(guān)，超出某一程度的凋亡不利于胚胎的發(fā)育。因此研究著床前胚胎細(xì)胞的凋亡將有助于正確理解胚胎的發(fā)育過(guò)程，改進(jìn)體外培養(yǎng)體系，提高胚胎質(zhì)量，解決哺乳動(dòng)物胚胎流產(chǎn)率高的問(wèn)題。
[0003]囊胚細(xì)胞的凋亡程度是評(píng)判胚胎質(zhì)量的重要指標(biāo)，一般地常用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP斷口標(biāo)記(TUNEL)方法檢測(cè)胚胎細(xì)胞的凋亡。TUNEL法不需特殊設(shè)備，是目前應(yīng)用較為廣泛的方法。但由于壞死細(xì)胞也有DNA斷裂點(diǎn)形成，亦呈TUNEL反應(yīng)陽(yáng)性；細(xì)胞代謝中DNA重組、修復(fù)、有絲分裂，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的人為因素如樣本固定、蛋白酶預(yù)處理等均可造成假陽(yáng)性，因此實(shí)驗(yàn)須設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照。另外，在操作過(guò)程中，需要摸索細(xì)胞的固定及消化時(shí)間，以提高該技術(shù)的敏感性和獲得較低的背景值。
[0004]細(xì)胞程序化死亡就是在預(yù)定的時(shí)間和位點(diǎn)去除一些特殊的細(xì)胞，這些被去除的細(xì)胞所表現(xiàn)出的形態(tài)和生化方面的變化就定義為“凋亡”。哺乳動(dòng)物胚胎細(xì)胞的凋亡在哺乳動(dòng)物繁殖和發(fā)育中具有重要的作用。
[0005]在胚胎著床前的發(fā)育過(guò)程中，凋亡的一個(gè)重要作用是去除少數(shù)異常的、有害的或過(guò)剩的細(xì)胞，以此控制胚胎細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量。體外受精與體細(xì)胞核移植胚胎的囊胚發(fā)育率低，許多胚胎移植后不能著床，胚胎細(xì)胞凋亡可能是其原因之一。Pomar等研究發(fā)現(xiàn)，體外生產(chǎn)的胚胎與體內(nèi)獲得的胚胎相比具有較高的凋亡率，而克隆的胚胎又比體外受精的胚胎具有較高的凋亡比率。Betts等證明，胚胎細(xì)胞的凋亡能指示胚胎是否培養(yǎng)在適度的環(huán)境及壓力下，凋亡的增加指示胚胎培養(yǎng)在不適應(yīng)的環(huán)境下，如不適合的培養(yǎng)液成分或不適合的培育密度。
[0006]凋亡的卵裂球被排到卵周隙或囊胚腔中，凋亡細(xì)胞發(fā)生皺縮，染色質(zhì)凝集，DNA斷裂。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的的dUTP斷口標(biāo)記(TUNEL)法能有效地標(biāo)記DNA的斷裂，顯示出凋亡的細(xì)胞，因此其是目前檢測(cè)胚胎細(xì)胞凋亡的常用方法。對(duì)牛體內(nèi)和體外培養(yǎng)的囊胚，TUNEL法檢測(cè)到91-100%的胚胎含有凋亡細(xì)胞；豬體內(nèi)發(fā)育的囊胚中有56-71 %的胚胎含有凋亡細(xì)胞，而體外培養(yǎng)的囊胚中90 %的胚胎含有凋亡細(xì)胞。關(guān)于凋亡細(xì)胞的類型，對(duì)于牛、小鼠和大鼠的囊胚，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞凋亡率要高一些；對(duì)于人和豬的囊胚，凋亡細(xì)胞均勻地分布于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層。徐薇等采用TUNEL方法證明熱應(yīng)激能增加牛孤雌激活胚胎的凋亡數(shù)，孫國(guó)杰等研究表明，轉(zhuǎn)基因胚胎的凋亡率也顯著高于非轉(zhuǎn)基因胚胎?？傊c體內(nèi)發(fā)育的囊胚相比，體外培養(yǎng)的囊胚的細(xì)胞凋亡率要高。
[0007]隨著對(duì)細(xì)胞凋亡分子機(jī)制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)家族的基因調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡，即Bcl-2家族和天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶(cysteinylaspartate specific proteinase, caspases)家方矣。前者包括促凋亡成員(Bax、Bcl_Xs、Bak、Bad等)和抗凋亡成員(Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W)兩大類。Bcl_2家族成員主要與核膜、線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合，該家族的基因通過(guò)死亡特異性酶來(lái)啟動(dòng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。多數(shù)死亡特異性酶都是caspase家族的成員，其存在于胞漿或核內(nèi)的半胱氨酸/天冬氨酸特異性蛋白酶，其中caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵元件，其激活與超常表達(dá)均引起細(xì)胞凋亡，可通過(guò)與眾多蛋白因子的相互作用調(diào)控細(xì)胞凋亡。另外，Caspase-3處于凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是最重要的效應(yīng)型Caspase，是Caspase家族中的最重要的凋亡執(zhí)行者之一，因此Caspase-3常被用作細(xì)胞凋亡檢測(cè)的標(biāo)志物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種用于哺乳動(dòng)物囊胚細(xì)胞凋亡檢測(cè)的試劑盒。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的用于哺乳動(dòng)物囊胚細(xì)胞凋亡檢測(cè)的試劑盒，其中包括含0.5% BSA的PBS液、含2%多聚甲醛的PBS液、含0.5% Triton X-100和0.05%Tween20的PBS液、含10%山羊血清和0.05% Tween20的PBS液、兔抗caspase-3 —抗、帶有Alexa Fluor594紅色熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗，以及含20 μ M Η33342的PBS液。
[0010]其中，兔抗caspase-3 —抗是用合成的人caspase-3蛋白中靠近Aspl75的氨基末端殘基的多肽抗原免疫兔子獲得的多克隆抗體。兔抗caspase-3 —抗按1:500的體積比稀釋于封閉液中。所述封閉液為含10%山羊血清和0.05% Tween20的PBS液。
[0011]山羊抗兔IgG 二抗按1:500的體積比稀釋于上述封閉液中。
[0012]本發(fā)明中涉及的哺乳動(dòng)物包括但不限于牛、豬、鼠等。優(yōu)選為牛。
[0013]本發(fā)明主要基于免疫熒光技術(shù)，以細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要的半胱氨酸蛋白酶3 (caspase-3)為祀點(diǎn)，采用針對(duì)caspase-3 —抗和攜帶突光素的二抗進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，對(duì)胚胎中的凋亡細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記和計(jì)數(shù)；再用DNA染料著色所有細(xì)胞的細(xì)胞核，從而計(jì)算出囊胚細(xì)胞的凋亡率。本發(fā)明結(jié)合熒光顯微鏡，能對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量檢測(cè)，靈敏度高、特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，效率高。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中牛囊胚中的凋亡細(xì)胞染色結(jié)果。
[0015]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中牛囊胚總細(xì)胞染色結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0016]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0017]以下實(shí)施例中使用的兔抗caspase-3 —抗是用合成的人caspase-3蛋白中靠近Aspl75的氨基末端殘基的多肽抗原免疫兔子獲得的多克隆抗體，購(gòu)自Cell SignalTechnology有限公司，貨號(hào)9661。
[0018]實(shí)施例1用于牛囊胚細(xì)胞凋亡檢測(cè)的試劑盒及應(yīng)用
[0019]基于免疫熒光技術(shù)，開發(fā)出用于牛囊胚細(xì)胞凋亡檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒中包括以下試劑:
[0020]1、洗液:含 0.5% BSA 的 PBS 液；
[0021]2、固定液:含2%多聚甲醛(PFA)的PBS液；
[0022]3、通透液:含 0.5% Triton Χ_100、0.05% Tween20 的 PBS 液；
[0023]4、封閉液:含10%山羊血清、0.05% Tween20的PBS液；
[0024]5、一抗:兔抗caspase-3抗體(按1:500的體積比稀釋于封閉液中)；
[0025]6、二抗:標(biāo)記有Alexa Fluor594紅色突光素的山羊抗兔IgG (按1:500的體積比稀釋于封閉液中)；
[0026]7、H33342 染色液:含 20 μ M Η33342 的 PBS 液。
[0027]差異染色程序如下(以下所有染色操作均在四孔板中完成):
[0028]a.將牛囊胚在37°C洗液中洗3次；
[0029]b.使用固定液室溫固定20min,四孔板每孔最多25枚囊胚；
[0030]c.在通透液中室溫處理30min,每孔500 μ L通透液,每孔最多25枚囊胚；
[0031]d.取出囊胚，在洗液中清洗3次；
[0032]e.在 2M HCl 中室溫處理 20min ；
[0033]f.在 10mM Tris-HCl 中室溫處理 20min ；
[0034]g.取出囊胚，在洗液中清洗3次；
[0035]h.放入封閉液中，4°C過(guò)夜；
[0036]1.取出囊胚移入兔抗caspase-3 —抗中，室溫孵育2h ；
[0037]j.取出囊胚，在洗液中洗3次，每次5min以上；
[0038]k.將囊胚放入標(biāo)記Alexa Fluor594的山羊抗兔IgG中，室溫孵育2h，避光；
[0039]1.取出囊胚，在洗液中洗3次，每次5min以上；
[0040]m.將囊胚放入H33342染色液中，室溫染色1min ；
[0041]η.取出囊胚，洗液洗3次；
[0042]ο.使用DABCO封片，壓片，熒光顯微鏡下拍照。
[0043]牛囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù):熒光顯微鏡下分別統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)和囊胚總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡率(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))來(lái)評(píng)估囊胚質(zhì)量。
[0044]牛囊胚細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì):實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次隨機(jī)選取10個(gè)牛囊胚，分別在綠色、紫外激發(fā)光照射下，對(duì)凋亡細(xì)胞(圖1)、囊胚總細(xì)胞(圖2)進(jìn)行計(jì)數(shù)，兩者相比得出凋亡率。牛囊胚總細(xì)胞數(shù)的平均值為64.50個(gè)，凋亡率為5.67%，可見胚胎凋亡比例較低，胚胎質(zhì)量?jī)?yōu)秀，后期發(fā)育能力較好。(表I)
[0045]表I牛囊胚細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果
[0046]
胚胎數(shù)(個(gè)) 總細(xì)胞數(shù)(個(gè)) 凋亡細(xì)胞數(shù)(個(gè))凋亡率(％)
_10_64.50_166_5.67
[0047]注:凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)X 100/總細(xì)胞數(shù)
[0048]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0049]參考文獻(xiàn)
[0050]Pomar FJj Teerds KJj Kidson A，Colenbrander B，Tharasanit T，AguilarB，Roelen BA.Differences in the incidence of apoptosis between in vivo and invitro produced blastocysts of farm animal species: a comparative study.Ther1genology.2005，63:2254-2268.
[0051]Betts DH，King WA.Genetic regulat1n of embryo death and senescence.Ther1genology.
[0052]2001，55:171-91.
[0053]徐薇，唐爽，呂志一等.熱激損傷對(duì)牛孤雌激活胚胎后續(xù)發(fā)育的影響.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào).
[0054]2010,41:1253-1259.
[0055]孫國(guó)杰，李榮，戴蘊(yùn)平等.轉(zhuǎn)基因和再克隆對(duì)克隆胚胎細(xì)胞凋亡的影響.自然科學(xué)進(jìn)展.2009，19:266-274.
[0056]羅婷等.哺乳動(dòng)物附植前胚胎細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展.中國(guó)畜牧獸醫(yī).2012，39:125-130。
【權(quán)利要求】
1.用于哺乳動(dòng)物囊胚細(xì)胞凋亡檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括含0.5%BSA 的PBS液、含 2%多聚甲醛的 PBS液、含0.5% Triton X-100 和 0.05% Tween20 的 PBS液、含 10% 山羊血清和 0.05% Tween20 的 PBS 液、兔抗 caspase-3 —抗、帶有 Alexa Fluor594紅色熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗，以及含20 μ M Η33342的PBS液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述兔抗caspase-3—抗是用合成的人caspase-3蛋白中靠近Aspl75的氨基末端殘基的多肽抗原免疫兔子獲得的多克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒,其特征在于,所述兔抗caspase-3—抗按1:500的體積比稀釋于封閉液中；其中，所述封閉液為含10%山羊血清和0.05% Tween20的PBS液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述山羊抗兔IgG二抗按1:500的體積比稀釋于封閉液中；其中，所述封閉液為含10%山羊血清和0.05% Tween20的PBS液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物包括但不限于牛、豬、鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物為牛。
【文檔編號(hào)】G01N33/533GK104198720SQ201410355901
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】杜衛(wèi)華, 孫尉俊 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所