專利名稱：獲得天然芳香族羧酸、脂肪族羧酸和硫代羧酸的發(fā)酵方法及其所用微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過用醇氧化酶把相應的酶促氧化來以非常高的產(chǎn)率制備不同羧酸的生物方法。醇氧化酶是由葡糖桿菌屬(Gluconobacter)細菌、優(yōu)選葡糖桿菌sp.HR 101(DSM 12884)形成的。因此，例如苯甲酸是用苯甲醇制得的，丁酸是用正丁醇制得的，異丁酸是用異丁醇制得的，異戊酸是用異戊醇制得的，2-甲基丁酸是用2-甲基丁醇制得的，3-甲基硫代丙酸是用3-甲基硫代丙醇制得的，苯乙酸是用苯乙醇制得的，丙酸是用丙醇制得的，肉桂酸是用肉桂醇制得的。
除了通過用醋桿菌屬(Acetobacter)細菌將乙醇氧化成乙酸來制備醋的長久以來就已知的方法外，還有幾種用醋桿菌屬或葡糖桿菌屬細菌或酵母來制備幾種羧酸的方法。
例如，DE 3713668描述了通過用玫瑰葡糖桿菌(Gluconobacterroseus)種細菌將脂肪醇通過微生物氧化來制備脂肪族羧酸的方法。在該方法中，24小時以上的生長期之后，把醇直接加到具有微生物的培養(yǎng)基中。所指出的優(yōu)選pH范圍是4-4.5。僅獲得了正丁酸13g/l、異丁酸21g/l、2-甲基丁酸7g/l和3-甲基丁酸17g/l發(fā)酵溶液的低產(chǎn)量。
DE 19503598描述了制備丙酸或丁酸或其鹽的方法。其中使用了氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)細菌。培養(yǎng)9-10小時后，將正丙醇或正丁醇作為pO2值的函數(shù)分多次重復加入。通過該方法，所獲得的產(chǎn)量是正丙酸43.7g/l和丁酸49g/l。
EP 0563346描述了通過用糖酵母屬(Saccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、或克魯維氏酵母屬(Kluyvermyces)酵母菌將相應的醇或醛氧化來制備羧酸的方法。該方法的缺點是，使用這些酵母菌，僅能獲得低的產(chǎn)物濃度，必須采用非常高的生物質(zhì)濃度和長的處理時間。例如，4天后，僅獲得了不到0.6g/l 3-甲基硫代丙酸，并且要使0.01％異戊醇轉(zhuǎn)化90％，需要6天。
J.Chem.Tech.Biotechnol.1997，68，214-218描述了使用乙酸醋桿菌(Acetobacter aceti)細菌將幾種脂肪醇和2-苯基乙醇生物轉(zhuǎn)化成相應的酸。該方法的缺點也是獲得的產(chǎn)物濃度很低。例如，其中描述，對于將丁醇氧化成丁酸，60分鐘后獲得的最大產(chǎn)物濃度是39.3g/l。
J.Chem.Tech.Biotechnol.1997，70，294-298描述了巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)用于氧化制備一些羧酸。該方法的缺點是需要使用注氣生物反應器，因為充氣和將培養(yǎng)物充分混合所需的高氣流會導致?lián)]發(fā)性原料和產(chǎn)物遺失。出于該原因而在下游連接的含液氮冷阱在工業(yè)規(guī)模上是不實用的。
我們已經(jīng)發(fā)明了在生物反應器中制備脂肪族羧酸、芳香族羧酸和硫代羧酸的方法，其特征在于，使用含有葡糖桿菌屬細菌的培養(yǎng)物。
令人驚奇的是，通過使用新的葡糖桿菌屬微生物，不僅能以非常高的產(chǎn)率制得脂肪族羧酸，而且也能以非常高的產(chǎn)率制得芳香族羧酸和硫代羧酸。這不僅可從溶液中產(chǎn)物濃度、原料的摩爾轉(zhuǎn)化百分比、還能從時空產(chǎn)率獲得認證。其中，除了培養(yǎng)基組成和維持在pH6.4的pH以外，對于本發(fā)明方法特別重要的參數(shù)是連續(xù)加入底物的方式。
用于本發(fā)明方法的優(yōu)選細菌是葡糖桿菌sp.HR 101(DSM12884)。
優(yōu)選在純培養(yǎng)物中使用細菌。
依據(jù)本發(fā)明使用的生物合適營養(yǎng)培養(yǎng)基是合成、半合成或復合培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基可含有含碳和含氮化合物、無機鹽、以及任選含有微量元素和維生素。
合適的含碳化合物是碳水化合物、碳氫化合物、或標準有機化學品?？蓛?yōu)選使用的化合物的實例是糖、醇、糖醇、有機酸或復合混合物。
糖優(yōu)選為葡萄糖?？蓛?yōu)選使用的有機酸是檸檬酸或乙酸。復合混合物包括例如麥芽汁、酵母浸出物、酪蛋白或酪蛋白水解產(chǎn)物。
合適的含氮底物是無機化合物。其實例是硝酸鹽和銨鹽。也可使用有機含氮源。有機含氮源包括酵母浸出物、大豆粉、酪蛋白、棉籽粉、酪蛋白水解產(chǎn)物、小麥麩質(zhì)和玉米漿。
可使用的無機鹽的實例是硫酸鹽、硝酸鹽、氯化物、碳酸鹽和磷酸鹽。在所述鹽中優(yōu)選存在的金屬是鈉、鉀、鎂、錳、鈣、鋅和鐵。
培養(yǎng)溫度優(yōu)選為10-40℃。更優(yōu)選為20-35℃。
培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為4-8。更優(yōu)選為6.2-6.5。
原則上講，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有生物反應器來實施本發(fā)明方法。優(yōu)選使用適于浸沒處理的任意裝置。這表示，根據(jù)本發(fā)明，可使用具有或不具有機械混合裝置的容器。不具有機械混合裝置的容器的實例包括震動器、和鼓泡塔反應器或環(huán)流反應器。具有機械混合裝置的容器優(yōu)選包括裝配有任意設(shè)計攪拌器的所有已知器具。
本發(fā)明方法可連續(xù)或間歇進行。獲得最大量產(chǎn)物所需的發(fā)酵時間取決于所用的微生物的具體性質(zhì)。然而，大體來說，發(fā)酵時間為2-200小時。
可用本發(fā)明方法制備的脂肪族羧酸是丁酸、異丁酸、異戊酸、2-甲基丁酸和丙酸。
可用本發(fā)明方法制備的芳香族羧酸是苯甲酸、苯乙酸和肉桂酸。
可用本發(fā)明方法制備的硫代羧酸是3-甲基硫代丙酸。
根據(jù)本發(fā)明方法，優(yōu)選制備得到丁酸、異丁酸、異戊酸、2-甲基丁酸、丙酸、苯乙酸和3-甲基硫代丙酸。
根據(jù)本發(fā)明方法，特別優(yōu)選制備得到異丁酸、異戊酸、2-甲基丁酸和苯乙酸。
通過下述實施例更詳細地舉例說明本發(fā)明。
實施例實施例1-制備預培養(yǎng)物用由1.25g D-甘露糖醇和0.75g酵母浸出物組成且pH為6.5的100ml無菌培養(yǎng)基和0.9ml葡糖桿菌sp.HR 101(DSM 12884)的甘油培養(yǎng)基給具有擋板的500ml錐形瓶接種。將該錐形瓶在旋轉(zhuǎn)震動器上于30℃和140rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)16小時。該預培養(yǎng)物中的微生物數(shù)目是約2×109CFU/ml。
實施例2-由天然正丁醇制備天然正丁酸在10升發(fā)酵器中將125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.91水中，加入10ml止泡劑，將pH調(diào)節(jié)至6.3。將由此制備的培養(yǎng)基在121℃滅菌30分鐘。
攪拌器速度為500rpm；充氣速度為5升/分鐘；溫度為30℃。將所有這些參數(shù)設(shè)定完畢后，使用實施例1預培養(yǎng)物進行接種。
發(fā)酵17小時后，開始通過泵加入正丁醇。通過流量控制器控制該底物的計量加入。依據(jù)下表加入正丁醇表1 在進料期間，用NH4+將pH恒定地維持在6.2-6.4。
74小時后發(fā)酵完成。通過HPLC分析測定的正丁酸的終濃度為95g/l。摩爾轉(zhuǎn)化率為剛好低于90％。
實施例3-由天然異丁醇制備天然異丁酸在10升發(fā)酵器中將125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.9升水中，加入10ml止泡劑，將pH調(diào)節(jié)至6.3。將由此制備的培養(yǎng)基在121℃滅菌30分鐘。
攪拌器速度為500rpm；充氣速度為5升/分鐘；溫度為30℃。將所有這些參數(shù)設(shè)定完畢后，使用實施例1預培養(yǎng)物進行接種。
發(fā)酵22.5小時后，開始通過泵加入異丁醇。通過流量控制器控制該底物的計量加入。依據(jù)下表加入異丁醇表2 在進料期間，用NH4+將pH恒定地維持在6.2-6.4。
74小時后發(fā)酵完成。通過HPLC分析測定的異丁酸的終濃度為92.7g/l。摩爾轉(zhuǎn)化率為剛好低于88％。
實施例4-由天然2-甲基丁醇制備天然2-甲基丁酸在10升發(fā)酵器中將125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.9升水中，加入10ml止泡劑，將pH調(diào)節(jié)至6.3。將由此制備的培養(yǎng)基在121℃滅菌30分鐘。
攪拌器速度為500rpm；充氣速度為5升/分鐘；溫度為30℃。將所有這些參數(shù)設(shè)定完畢后，使用實施例1預培養(yǎng)物進行接種。
發(fā)酵17小時后，開始通過泵加入2-甲基丁醇。通過流量控制器控制該底物的計量加入。依據(jù)下表加入2-甲基丁醇
表3 在進料期間，用NH4+將pH恒定地維持在6.2-6.4。
通過HPLC分析測定的2-甲基丁酸的終濃度為80g/l。摩爾轉(zhuǎn)化率為剛好低于89％。
實施例5-由天然異戊醇制備天然異戊酸在10升發(fā)酵器中將125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.9升水中，加入10ml止泡劑，將pH調(diào)節(jié)至6.3。將由此制備的培養(yǎng)基在121℃滅菌30分鐘。
攪拌器速度為500rpm；充氣速度為5升/分鐘；溫度為30℃。將所有這些參數(shù)設(shè)定完畢后，使用實施例1預培養(yǎng)物進行接種。
發(fā)酵17小時后，開始通過泵加入異戊醇。通過流量控制器控制該底物的計量加入。依據(jù)下表加入異戊醇
表4 在進料期間，用NH4+將pH恒定地維持在6.2-6.4。
70.5小時后發(fā)酵完成。將發(fā)酵溶液后處理后，異戊酸的終濃度為82g/l。摩爾轉(zhuǎn)化率為剛好低于85％。
實施例6-由天然正丙醇制備天然丙酸在10升發(fā)酵器中將125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.9升水中，加入10ml止泡劑，將pH調(diào)節(jié)至6.3。將由此制備的培養(yǎng)基在121℃滅菌30分鐘。
攪拌器速度為500rpm；充氣速度為51/分鐘；溫度為30℃。將所有這些參數(shù)設(shè)定完畢后，使用實施例1預培養(yǎng)物進行接種。
發(fā)酵17小時后，開始通過泵加入正丙醇。通過流量控制器控制該底物的計量加入。依據(jù)下表加入正丙醇
表5 在進料期間，用NH4+將pH恒定地維持在6.2-6.4。
92小時后發(fā)酵完成。通過HPLC分析測定的丙酸的終濃度為94g/l。摩爾轉(zhuǎn)化率為88.3％。
實施例7-由天然苯乙醇制備天然苯乙酸在10升發(fā)酵器中將125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.9升水中，加入10ml止泡劑，將pH調(diào)節(jié)至6.3。將由此制備的培養(yǎng)基在121℃滅菌30分鐘。
攪拌器速度為500rpm；充氣速度為5升/分鐘；溫度為30℃。將所有這些參數(shù)設(shè)定完畢后，使用實施例1預培養(yǎng)物進行接種。
發(fā)酵17小時后，開始通過泵加入苯乙醇。通過流量控制器控制該底物的計量加入。依據(jù)下表加入苯乙醇
表6 在進料期間，用NH4+將pH恒定地維持在6.2-6.4。
48小時后達到最大產(chǎn)物濃度。通過HPLC分析測定的苯乙酸的終濃度為54g/l。摩爾轉(zhuǎn)化率為88.5％。
以200升規(guī)模重復該操作，獲得了52g/l的產(chǎn)物濃度；摩爾轉(zhuǎn)化率為95％。
實施例8-由苯甲醇制備天然苯甲酸在10升發(fā)酵器中將125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.9升水中，加入10ml止泡劑，將pH調(diào)節(jié)至6.3。將由此制備的培養(yǎng)基在121℃滅菌30分鐘。
攪拌器速度為500rpm；充氣速度為5升/分鐘；溫度為30℃。將所有這些參數(shù)設(shè)定完畢后，使用實施例1預培養(yǎng)物進行接種。
發(fā)酵21.25小時后，開始通過泵加入苯甲醇。通過流量控制器控制該底物的計量加入。依據(jù)下表加入苯甲醇表7 在進料期間，用NH4+將pH恒定地維持在6.2-6.4。
68小時后發(fā)酵完成。通過HPLC分析測定的苯甲酸的終濃度為51g/l。事實上所有原料都轉(zhuǎn)化了。
實施例9-由肉桂醇制備天然肉桂酸在10升發(fā)酵器中將125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.9升水中，加入10ml止泡劑，將pH調(diào)節(jié)至6.3。將由此制備的培養(yǎng)基在121℃滅菌30分鐘。
攪拌器速度為500rpm；充氣速度為5升/分鐘；溫度為30℃。將所有這些參數(shù)設(shè)定完畢后，使用實施例1預培養(yǎng)物進行接種。
發(fā)酵17小時后，開始通過泵加入肉桂醇。為了使肉桂醇在液相中，將原料加熱。依據(jù)下表加入肉桂醇
表8 44小時后發(fā)酵完成。通過HPLC分析測定的肉桂酸的終濃度為27g/l。事實上所有原料都轉(zhuǎn)化了。
實施例10-由3-甲基硫代丙醇制備天然3-甲基硫代丙酸在10升發(fā)酵器中將125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于10升水中，加入10ml止泡劑，將pH調(diào)節(jié)至6.3。將由此制備的培養(yǎng)基在121℃滅菌30分鐘。
攪拌器速度為500rpm；充氣速度為5升/分鐘；溫度為27℃。將所有這些參數(shù)設(shè)定完畢后，使用實施例1預培養(yǎng)物進行接種。
發(fā)酵16小時后，開始通過泵加入3-甲基硫代丙醇。依據(jù)下表計量加入底物
表9 在進料期間，用NH4+將pH恒定地維持在6.2-6.4。
65小時后發(fā)酵完成。通過HPLC分析測定的3-甲基硫代丙酸的終濃度為82.6 g/l。摩爾轉(zhuǎn)化率幾乎為100％。
實施例12-比較本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)方法的時空產(chǎn)率在下述實施例(表9)中，為了證實本發(fā)明方法的優(yōu)越性，比較使用葡糖桿菌sp.DSM 12884的新制備方法與已知方法的時空產(chǎn)率。表10
如表10所示，在已經(jīng)描述過的醇氧化中依據(jù)本發(fā)明使用葡糖桿菌屬sp.DSM 12884使得時空產(chǎn)率和絕對產(chǎn)物濃度都有很大增加。例如，對于丁酸，本發(fā)明方法(測試No.5)與現(xiàn)有技術(shù)方法的最佳結(jié)果(測試No.4)相比，時空產(chǎn)率提高了94％，產(chǎn)物濃度提高了58％。對于丙酸，時空產(chǎn)率提高了52％，產(chǎn)物濃度提高了57％。對于異丁酸，提高的幅度甚至更大，時空產(chǎn)率提高了150％，產(chǎn)物濃度提高了341％。對于異戊酸和2-甲基丁酸，二者的時空產(chǎn)率與產(chǎn)物濃度分別提高了132％和82％、與214％和82％。
雖然為了舉例說明，上文已經(jīng)詳細地描述了本發(fā)明，但是應當理解，這種詳細說明僅是為了舉例說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的情況下可作出各種改變，本發(fā)明保護范圍由權(quán)利要求書限定。
權(quán)利要求
1．在生物反應器中制備脂肪族羧酸、芳香族羧酸和硫代羧酸的方法，其中將包含葡糖桿菌屬細菌的培養(yǎng)物與營養(yǎng)培養(yǎng)基反應。
2．權(quán)利要求1的方法，其中使用由葡糖桿菌屬細菌組成的純培養(yǎng)物。
3．權(quán)利要求2的方法，其中所述葡糖桿菌屬細菌是葡糖桿菌sp.HR 101(DSM 12884)。
4．權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含合成、半合成或復合底物。
5．權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中所述底物選自含碳和含氮化合物、無機鹽、微量元素和/或維生素或它們的混合物。
6．權(quán)利要求5的方法，其中所述含碳化合物選自糖、糖醇、醇、有機酸、復合混合物、油、或兩種或兩種以上這些物質(zhì)的混合物。
7．權(quán)利要求6的方法，其中所述底物選自葡萄糖、甘油、甘露糖醇、檸檬酸、麥芽汁、酵母浸出物、酪蛋白、酪蛋白水解產(chǎn)物和蓖麻油或兩種或兩種以上這些物質(zhì)的混合物。
8．權(quán)利要求1-7任一項的方法，其中所述底物包含無機化合物和/或有機化合物。
9．權(quán)利要求8的方法，其中所述底物選自硝酸鹽、銨鹽、酵母浸出物、大豆粉、棉籽粉、酪蛋白、酪蛋白水解產(chǎn)物、小麥麩質(zhì)和玉米漿。
10．權(quán)利要求1-9任一項的方法，其中所述底物選自金屬鈉、鉀、鎂、錳、鈣、鋅和鐵的硫酸鹽、硝酸鹽、氯化物、碳酸鹽和磷酸鹽或者兩種或多種這些化合物的混合物。
11．權(quán)利要求1-10任一項的方法，其中所述營養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為10-40℃。
12．權(quán)利要求1-11任一項的方法，其中所述營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH為4-8。
13．稱為葡糖桿菌sp.HR 101(DSM 12884)的菌株。
14．權(quán)利要求1的方法，其中所述底物的摩爾轉(zhuǎn)化率大于60％。
15．權(quán)利要求1的方法，其中所述酸是脂肪酸。
16．權(quán)利要求15的方法，其中所述酸是天然丁酸。
17．權(quán)利要求15的方法，其中所述酸是異丁酸。
18．權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述酸是異戊酸。
19．權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述酸是2-甲基丁酸。
20．權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述酸是丙酸。
21．權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述酸是異戊酸。
22．權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述酸是芳香族酸。
23．權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述酸是苯甲酸。
24．權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述酸是苯乙酸。
25．權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述酸是肉桂酸。
26．權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述酸是硫代羧酸。
27．權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述酸是3-甲基硫代丙酸。
28．權(quán)利要求16-27任一項的方法，其中使用包含葡糖桿菌屬細菌的細菌。
29．權(quán)利要求16-27任一項的方法，其中使用由葡糖桿菌屬細菌組成的純培養(yǎng)物。
30．權(quán)利要求16-27任一項的方法，其中所述屬細菌是葡糖桿菌sp.HR 101(DSM 12884)。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備脂肪族羧酸、芳香族羧酸、和硫代羧酸的方法,其中使用包含葡糖桿菌屬細菌的培養(yǎng)物。
文檔編號C12R1/01GK1286307SQ0012605
公開日2001年3月7日 申請日期2000年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月25日
發(fā)明者J·拉本霍爾斯特, I·L·加特菲爾德, J·M·希爾默 申請人:哈爾曼及賴默股份有限公司