專利名稱：蝦青素合成酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組生產(chǎn)類胡蘿卜素和其中有用的生物物質(zhì)。
Phaffia rhodozyma(P.rhodozyma)是生產(chǎn)蝦青素的生成胡蘿卜素的酵母菌株。蝦青素分布于各種種類的生物體中，如動物(鳥如火烈鳥和scarletibis，和魚如虹鱒和鮭魚)，藻類和微生物。同樣認識到蝦青素具有強烈的抵抗氧自由基的抗氧化特性，氧自由基可期望用于藥物用途以保護活細胞抵抗一些疾病、如癌癥。另外，蝦青素作為色劑的工業(yè)需要增加了，特別是在養(yǎng)殖魚(如鮭)的工業(yè)中，因為蝦青素給予動物明顯的桔紅色，并且能夠滿足市場上消費者的要求。
已知P.rhodozyma是作為生產(chǎn)蝦青素的生成胡蘿卜素的(carotenogenic)酵母菌株。不同于其它生成胡蘿卜素的酵母、紅酵母屬的種，P.rhodozyma可以發(fā)酵一些糖如D-葡萄糖。這是來自工業(yè)應(yīng)用的觀點的重要特征。在最近的分類學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)了P.rhodozyma的有性循環(huán)，并且以Xanthophyllomyces dendrorhous的名稱命名了它的遠距離刺激變形態(tài)(W.I.Golubev；酵母11，101-110，1995)。已經(jīng)進行了從P.rhodozyma獲得蝦青素的超級生產(chǎn)者的一些菌株的改良研究，但在這十年中，已經(jīng)限制這樣的努力為利用常規(guī)誘變和原生質(zhì)體融合的方法。最近，Wery等人利用P.rhodozyma開發(fā)了宿主載體系統(tǒng)，其中利用非復(fù)制質(zhì)粒以多拷貝整合進入P.rhodozyma的核糖體DNA的基因組(Wery等人，基因，184，89-97，1997)。Verdoes等人報道了更加改良的載體以便獲得P.rhodozyma的轉(zhuǎn)化體以及它的編碼催化從香葉焦磷酸到β-胡蘿卜素的反應(yīng)的酶的三個胡蘿卜素生成基因(WO97/23633)。
胡蘿卜素生成的特異的生物合成途徑在重要的中間產(chǎn)物，法尼焦磷酸(FPP)的點從一般的類異戊二烯途徑中分支(


圖1)。通過P.rhodozyma中由crtE編碼的香葉焦磷酸(GGPP)合酶縮合FPP和IPP以便生成GGPP。然后，通過起到八氫番茄紅素合酶和由crtBY編碼的番茄紅素環(huán)化酶和crtI由編碼的八氫番茄紅素去飽和酶的雙倍作用的酶的連續(xù)反應(yīng)將GGPP轉(zhuǎn)化成β-胡蘿卜素。
在細菌中，已經(jīng)分離了參與葉黃素形成的酶和基因并且詳細地鑒定了特征。由crtZ編碼的β-胡蘿卜素羥化酶參與了β-胡蘿卜素的β紫羅酮環(huán)的兩個末端的兩個羥化步驟。從各種生物體如噬夏孢歐文氏菌，(Misawa等人，細菌學(xué)雜志，172，6704-6712，1990)，黃桿菌的種(L.Pasamontes等人，185(1)，35-41，1997)和Agrobacterium aurantiacum(Misawa等人，細菌學(xué)雜志，177(22)，6575-6584，1995)中克隆了crtZ基因。由crtW編碼的β-胡蘿卜素酮酶催化了將氧代基團導(dǎo)入β-胡蘿卜素的β-紫羅酮環(huán)的兩個末端的兩個步驟。Kajiwara等人從Haematococcus bluvialis克隆和測定了對應(yīng)于真細菌中crtW的bkt基因的序列(Kajiwara等人，P.Mol.Biol.，29，343-352，1995)。Harker等人也從聚球藍細菌PCC7942克隆和測定了對應(yīng)于真細菌中的crtW的crtO基因的序列(Harker等人，F(xiàn)EBS通訊，404，129-134，1997)。羥化酶和酮酶這兩種酶具有廣泛的底物特異性，并且這保證了在兩種酶依據(jù)反應(yīng)條件在同時反應(yīng)的情況中，形成各種葉黃素(
圖1)。
如上所述，分離參與從FPP形成β-胡蘿卜素的所有基因，但在P.rhodozyma中在蛋白質(zhì)和DNA的水平上還沒有鑒定出參與從β-胡蘿卜素形成葉黃素的最后步驟的酶和基因。雖然Johnson等人(Crit.Rev.Biotechnol，11(4)，297-326，191)通過假設(shè)由它們分離的一些葉黃素化合物是蝦青素生物合成的中間產(chǎn)物而提出存在兩條獨立的生成蝦青素的途徑，但不能證明這兩條獨立的途徑，因為不能分離出參與這樣的途徑的酶和基因。另外，不能排除的是，這些葉黃素化合物可能已經(jīng)產(chǎn)生于這些化合物的分離步驟中的實驗的人為現(xiàn)象。不能從P.rhodozyma分離出在由β-胡蘿卜素到蝦青素的生物合成途徑中積累中間產(chǎn)物的突變體使得難于澄清從β-胡蘿卜素到蝦青素的生物合成途徑。
本發(fā)明涉及參與由β-胡蘿卜素到蝦青素的蝦青素生物合成的最后步驟的基因和酶。
本發(fā)明提供了分離的DNA，特別是cDNA，所述DNA含有編碼參與在P.rhodozyma中由β-胡蘿卜素到蝦青素的反應(yīng)的蝦青素合酶的核苷酸序列，類似于AST基因。
在一個優(yōu)選的實施方案中，可以鑒定克隆的DNA片段的特征在于(a)所說的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO1中所述的氨基酸序列的所說的酶，或
(b)所說的核苷酸序列編碼選自(i)等位基因變體或(ii)具有一個或多個氨基酸的添加、插入、缺失和/或取代并具有所述的酶活性的酶的所說酶的變體。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，分離的cDNA片段可以來源于Phaffiarhodozyma的基因，并且選自(i)SEQ ID NO2表示的cDNA序列；(ii)SEQ ID NO2表示的cDNA序列的同類編碼或等位基因變體；和(iii)具有一個或多個核苷酸的添加、插入、缺失和/或取代并且編碼具有所說酶活性的多肽的SEQ ID NO2表示的cDNA序列的衍生物。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中涉及了如上所述的分離的cDNA，其特征在于所說的核苷酸序列是(i)SEQ ID NO2表示的核苷酸序列；(ii)由于遺傳密碼的簡并性，編碼具有與由核苷酸序列(i)編碼的相同的氨基酸序列的蝦青素合成酶的核苷酸序列；和(iii)在標(biāo)準雜交條件下與來自i)或ii)的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列。
仍然在另一個優(yōu)選的實施方案中，分離的基因組DNA片段可以起源于Phaffia rhodozyma的基因，并且選自(i)SEQ ID NO3表示的基因組DNA序列；(ii)SEQ ID NO3表示的基因組DNA序列的同類編碼或等位基因變體；和(iii)具有一個或多個核苷酸的添加、插入、缺失和/或取代并且編碼具有所述酶活性的多肽的SEQ ID NO3表示的基因組DNA序列的衍生物。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中涉及了如上所述的分離的基因組DNA，其特征在于所說的核苷酸序列是(i)SEQ ID NO3表示的核苷酸序列；(ii)由于遺傳密碼的簡并性，編碼具有與由核苷酸序列(i)編碼的相同的氨基酸序列的蝦青素合成酶的核苷酸序列；和(iii)在標(biāo)準雜交條件下與來自i)或ii)的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一方面提供了通過如上所述的克隆的DNA片段表達可得的具有參與P.rhodozyma中β-胡蘿卜素到蝦青素的反應(yīng)的蝦青素合成酶活性的重組多肽。
本發(fā)明的重組多肽的一個優(yōu)選的實施方案的特征在于(a)所說的多肽具有如SEQ ID NO1所述的氨基酸序列，或(b)所說的多肽是(a)中定義的肽的變體，所述多肽選自(i)等位基因變體或(ii)具有一個或多個氨基酸的添加、插入、缺失和/或取代并且具有所述的酶活性的酶。
所以，本發(fā)明也涉及本案件中的多肽的變體。這樣的變體是在本發(fā)明的氨基酸序列的基礎(chǔ)上通過添加，插入，缺失和/或取代一個或多個所述序列的氨基酸殘基來定義的，其中這樣的衍生物仍然具有與本發(fā)明相應(yīng)的多肽相同的酶活性類型，或它們是公知的等位基因變異現(xiàn)象的結(jié)果。通過本領(lǐng)域已知的任何測試或本文的具體敘述可以測量這樣的活性。通過本領(lǐng)域已知的化學(xué)肽合成，或通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法如Sambrook等人(分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989)公開的，采用在如本文公開的DNA序列的基礎(chǔ)上的重組手段可以生產(chǎn)這樣的變體。通常不改變所述分子活性的蛋白質(zhì)和肽中氨基酸的交換是本領(lǐng)域已知的并且例如H.Neurath和R.L.Hill在“蛋白質(zhì)”(學(xué)術(shù)出版社，紐約，1979，特別參見圖6，14頁)中敘述的。最常發(fā)生的交換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Thy/Phe，Ala/Pro，Lys/Art.Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly以及相反的交換。
另外，本發(fā)明不僅涉及如在序列表中公開的DNA序列及其互補鏈，而且涉及包括這些序列的那些序列，所述的這些序列為在標(biāo)準條件下與所述序列或其片段雜交的DNA序列和由于遺傳密碼的簡并性，在標(biāo)準條件下與所述序列不雜交但卻編碼確實具有相同的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
在這篇文章中雜交的“標(biāo)準條件”是指本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常用于檢測特異性雜交信號并且如Sambrook等人(s.a.)所述的條件，或優(yōu)選的所謂的嚴格雜交和非嚴格洗滌條件，或更優(yōu)選本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的所謂的嚴格雜交和嚴格洗滌條件，以及如Sambrook等人(s.a.)所述的條件，或更優(yōu)選所謂的中等嚴格條件，例如遵照制造商給出的方案使用DIG(洋地黃毒苷)標(biāo)記試劑盒和Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)的發(fā)光檢測試劑盒并且用雜交溶液
甲酰胺(WAKO，大阪，日本)50％(V/V)5×SSC封閉試劑(Boehringer)2％(W/V)N-月桂酰肌氨酸0.1％(W/V)SDS0.3％(W/V)在42℃的溫度下過夜，隨后如制造商指示的那樣進行洗滌和檢測。
即如PCR反應(yīng)所示，或通過定點誘變(參見，例如Smith，Ann.Rev.Genet.19，423(1985))或如EP747 483所述的合成法，或如Sambrook等人(s.a.)所述的常用分子克隆方法可以制備起源于本發(fā)明DNA序列的DNA序列，因為它們與所述DNA序列(參見上面)雜交或可以利用根據(jù)所述DNA序列設(shè)計的引物通過聚合酶鏈式反應(yīng)來構(gòu)建。
本發(fā)明也涉及含有如上所述的DNA的載體或質(zhì)粒，和由如上所述的DNA或如上所述的載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
本發(fā)明也提供了通過利用攜帶如上所述的DNA的重組DNA轉(zhuǎn)化宿主可得的重組生物體。
本發(fā)明也涉及用于生產(chǎn)能夠催化從β-胡蘿卜素到蝦青素的反應(yīng)的多肽的方法，其中包括在指導(dǎo)生產(chǎn)所述的多肽的條件下培養(yǎng)如上所述的重組生物體。
在本發(fā)明的其它方面提供了用于生產(chǎn)蝦青素的方法，該方法包括在適當(dāng)?shù)乃拗魃矬w中導(dǎo)入一個或多個如上所述的DNA，并且在指導(dǎo)生產(chǎn)蝦青素的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化的生物體。
本發(fā)明的多肽也可用于生產(chǎn)蝦青素的方法，該方法包括將β-胡蘿卜素與具有如上所述的參與從β-胡蘿卜素到蝦青素的反應(yīng)的蝦青素合成酶活性的重組肽在含有合適重建膜的合適反應(yīng)混合物中存在合適電子供體的情況下接觸。在這一方法中，所說的重組多肽可以以從生物膜如微粒體或線粒體膜制備的再構(gòu)成膜的形式存在。重組多肽也可以以再構(gòu)成人工膜、如脂質(zhì)體的形式存在。電子供體、如細胞色素P450還原酶是可以還原本發(fā)明的酶反應(yīng)中心的適當(dāng)?shù)碾娮庸w。
為了進一步說明本發(fā)明，包括了下面的附圖以及下面給出的詳細描述。
圖1顯示了在P.rhodozyma中從乙酰-CoA到蝦青素的生物合成途徑。
圖2顯示了含有部分基因組的AST基因的質(zhì)粒pR16的限制圖。
圖3顯示了在除去跨膜結(jié)構(gòu)域時，在氨基末端加入6×His的AST基因的表達研究。將來自0.1毫升肉湯的細胞進行10％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。泳道1，分子量標(biāo)記(105千道爾頓，82.0千道爾頓，49.0千道爾頓和33.3千道爾頓，從上到下，Bio-RAD，Richmond，美國)；泳道2，大腸桿菌(BL21(DE3)(pLysS)(pAST315)沒有IPTG)；泳道3，大腸桿菌(BL21(DE3)(pLysS)(pAST315)含有1.5毫摩爾/升IPTG)；泳道4，分子量標(biāo)記)。
通常，存在大量克隆編碼生物合成酶的基因的方法。例如，可以利用簡并PCR。簡并PCR是一種克隆其所編碼的氨基酸序列與具有相同或相似功能的來自其它物種的一種已知酶具有高度同源性的感興趣的基因的方法。通過逆翻譯氨基酸序列成對應(yīng)的核苷酸(“簡并”)來設(shè)計在簡并PCR中用作引物系列的簡并引物。在這樣的簡并引物中，通常使用由任意的A，C，G或T組成的混合引物或在不明確的密碼中含有肌苷的引物。在克隆感興趣基因的部分片段后，通過使用克隆的和標(biāo)記的部分DNA片段作為探針可以篩選含有整個基因的遺傳片段。
在克隆編碼其活性可以通過酶測定測量的酶的基因的情況中，通過檢測酶活性純化這樣的酶和測定酶的氨基酸序列是好的方法。這樣獲得的氨基酸序列容易反向翻譯成對應(yīng)的核苷酸序列。在體外利用DNA合成儀可以合成具有對應(yīng)的核苷酸序列的DNA片段并且進行標(biāo)記以直接用作雜交探針。獲得雜交探針的另一可替代的方法是利用氨基酸序列信息的簡并PCR方法。
為了克隆其功能不能通過酶法鑒定的基因，已經(jīng)采用了稱為鳥槍(shot-gun)篩選的方法作為常規(guī)的克隆方法。這一方法包括分離缺乏編碼任何感興趣的生物合成酶的特異性基因的突變菌株，和通過從具有對應(yīng)于如此突變的基因的完整基因的生物體制備的DNA轉(zhuǎn)化該突變菌株。為了分離這樣的突變體，經(jīng)常采用常規(guī)的誘變。通過檢測其輔源營養(yǎng)等可以進行同親代菌株一樣的獲得性表現(xiàn)型的證明。在供體DNA含有對應(yīng)于突變菌株中的突變基因的基因的情況下，這樣的基因的轉(zhuǎn)化體獲得了與親代菌株相同的表現(xiàn)型作為遺傳互補的結(jié)果。
作為載體，不管在克隆宿主中是否能夠復(fù)制的任何形式的載體都可以用于鳥槍克隆。為了使用復(fù)制載體，互補的能力是必不可少的，并且這樣的載體不必含有與受體基因組同源的序列。在使用非復(fù)制載體的情況中，這樣的載體必須含有與宿主基因組同源的序列以便使供體與受體DNA之間進行重組。
為了克隆本發(fā)明的DNA，可以采用稱為“顏色互補”的方法。由于通過可以從胡蘿卜素生成生物體如噬夏孢歐文氏菌，草生歐文氏菌等克隆的胡蘿卜素生成基因轉(zhuǎn)化的結(jié)果，非胡蘿卜素生成生物體如大腸桿菌可以獲得胡蘿卜素生成的能力。含有crtE，crtB，crtI和crtY的大腸桿菌可以生產(chǎn)β胡蘿卜素并使細胞成黃色。開發(fā)這樣的特征時，已經(jīng)從各種生成胡蘿卜素的生物體如細菌和植物中克隆許多胡蘿卜素生成基因。例如，為了克隆編碼番茄紅素環(huán)化酶的crtY基因，制備在相對于pUC載體的親和載體上含有crtE，crtB和crtI的大腸桿菌作為轉(zhuǎn)化宿主。這樣的宿主變成紅色，這表明積累了番茄紅素。其次，利用pUC載體可以構(gòu)建來自胡蘿卜素生成生物體的cDNA或基因組文庫。如果對應(yīng)于供體胡蘿卜素生成生物體中的crtY的基因存在于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒中的話，將發(fā)生遺傳互補，并且大腸桿菌將變成黃色，這表明獲得了生產(chǎn)β胡蘿卜素的能力。事實上，通過這一方法從P.rhodozyma克隆了crtE，crtBY和crtI基因(Verdoes等人，WO97/23633)。
關(guān)于參與從β胡蘿卜素到蝦青素的反應(yīng)的基因的克隆，Kajiwara等人在含有來自噬夏孢歐文氏菌的crtE，crtB，crtI和crtY基因的宿主大腸桿菌中構(gòu)建了來自P.rhodozyma的cDNA表達文庫(Kajiwara等人，WO96/28545，1996)。在這樣的克隆系統(tǒng)中，通過判斷表明角黃素或蝦青素積累的紅色素形成，從P.rhodozyma理論上可以克隆出參與β胡蘿卜素到蝦青素的反應(yīng)的基因。但是，迄今還沒有報道這樣的基因。許多研究者推測了膜結(jié)合的胡蘿卜素生成酶將會形成酶復(fù)合物的可能性。在這樣的模型中，在胡蘿卜素生成酶之間的親和力將是有效地生成胡蘿卜素所必須的。根據(jù)這樣的假設(shè)，這一顏色互補方法不適于克隆參與蝦青素生物合成的最后步驟，即從β胡蘿卜素到蝦青素這一步驟的酶，因為外源酶在生成胡蘿卜素的連續(xù)反應(yīng)中可能與Phaffia的胡蘿卜素生成酶不具有親和力。
在本發(fā)明中，將已于1999年2月18日以登記號74486作為布達佩斯條約保藏物再保藏在美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)的并且針對從β胡蘿卜素到蝦青素的反應(yīng)進行了阻斷的P.rhodozymaATCC96815用作轉(zhuǎn)化宿主(Schroeder，W.A.和Johnson，E.A.，J.Ind.Mocrobiol.14，502-507，1995)。將從已經(jīng)在1998年4月8日在美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)以登記號74438作為布達佩斯條約保藏物再保藏的P.rhodozymaATCC96594的野生型菌株的染色體制備的基因組文庫轉(zhuǎn)化這一突變體用于分離生產(chǎn)蝦青素的克隆。在本發(fā)明中，分離出補充P.rhodozym中從β胡蘿卜素到蝦青素的反應(yīng)的這樣的遺傳片段，并且測定它的核苷酸序列。
通過利用基因擴增或啟動子修飾的基因劑量效應(yīng)而不是阻斷的突變的補充可以將本發(fā)明的這樣的基因/DNA用于超量生產(chǎn)蝦青素。
通常，基因由具有不同功能的幾個部分組成。在真核生物中，將編碼對應(yīng)的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄成早熟的信使RNA(pre-mRNA)，這區(qū)別于核糖體RNA(rRNA)，核小RNA(snRNA)和轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)的基因。雖然在這一轉(zhuǎn)錄事件中RNA聚合酶II(PolII)起中心作用，但沒有覆蓋含有啟動子的上游區(qū)和上游激活序列(UAS)的順式元件和反式作用的蛋白質(zhì)因子，PolII不能單獨起始轉(zhuǎn)錄。首先，由幾個基本蛋白質(zhì)成分組成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物識別待表達的基因的5’鄰接區(qū)中的啟動子序列。在這一事件中，在一些特異的調(diào)節(jié)下如熱激反應(yīng)、或適應(yīng)營養(yǎng)饑餓等等時表達的基因的情況中，需要一些其它的參與者。在這樣的情況中，需要UAS存在于啟動子序列周圍的5’未翻譯上游區(qū)中，并且一些陽性或陰性調(diào)節(jié)蛋白識別和結(jié)合UAS。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物與啟動子序列的結(jié)合長度受到啟動子周圍的反式作用因子的結(jié)合的影響，并且這能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。
在由磷酸化激活轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物后，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物從轉(zhuǎn)錄起始位點啟動轉(zhuǎn)錄。從基因的3’方向的啟動子區(qū)分離出轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的一些部分作為延長復(fù)合物(這一步驟稱為啟動子清除事件)，并且延長復(fù)合物繼續(xù)轉(zhuǎn)錄直到它到達位于基因的3’鄰接下游區(qū)中的終止序列。在核中通過在時對應(yīng)于轉(zhuǎn)錄起始位點的帽位點處加入帽結(jié)構(gòu)，和通過在位于3’鄰接下游區(qū)的polyA信號處加入polyA序列來修飾這樣產(chǎn)生的Pre-mRNA。其次，從編碼區(qū)除去內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，并結(jié)合外顯子部分以產(chǎn)生其序列對應(yīng)于相應(yīng)蛋白質(zhì)的初級氨基酸序列的開放讀碼框架。對穩(wěn)定的基因表達而言，其中產(chǎn)生成熟mRNA的這一修飾是必須的。在一般意義上，cDNA對應(yīng)于從這種成熟mRNA序列逆轉(zhuǎn)錄的DNA序列。利用成熟mRNA作為模板通過來源于病毒種類的逆轉(zhuǎn)錄酶可以用實驗方法合成它。
在本發(fā)明中，確定了使P.rhodozyma野生型菌株生產(chǎn)β-胡蘿卜素的P.rhodozymaATCC96815菌株的突變點。從測序的結(jié)果，表明在AST基因的第8內(nèi)含子的剪接序列中堿基的變化引起這樣的表現(xiàn)型，如通過mRNA的不恰當(dāng)?shù)募艚犹禺愋缘胤e累β胡蘿卜素。RT-PCR分析檢測出AST基因的不恰當(dāng)?shù)募艚赢a(chǎn)物，并強烈地支持了突變點的鑒定。
本發(fā)明也提供了可以在不同的宿主生物體、如大腸桿菌中表達的重組AST基因。在本發(fā)明中，在大腸桿菌中表達這樣的重組AST基因，并證實AST基因編碼其大小對應(yīng)于推測的分子量的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。通過利用新的AST基因和這樣的重組DNA技術(shù)可以實現(xiàn)蝦青素的生物生產(chǎn)。
根據(jù)本發(fā)明，從P.rhodozyma的cDNA文庫中克隆了編碼參與蝦青素生物合成的最后步驟的酶的基因，并且確定了它們的核苷酸序列。另外，克隆包括啟動子和終止子的基因組DNA的部分并且可用于克隆包括啟動子和終止子區(qū)的它的整個基因。
通過采用標(biāo)記的cDNA片段作為篩選探針篩選已經(jīng)在適當(dāng)宿主中的噬菌體或質(zhì)粒載體中構(gòu)建的基因組文庫可以克隆出含有它的編碼區(qū)，它的內(nèi)含子以及它的調(diào)節(jié)區(qū)、如啟動子和終止子的完整基因。通常，用于構(gòu)建基因組文庫的一種最常用的宿主菌株是大腸桿菌。作為載體，可以使用噬菌體載體、如λ噬菌體載體，或質(zhì)粒載體如pUC載體。通過使用含有感興趣的基因部分的標(biāo)記的DNA片段作為探針可以篩選以這種方式、例如從P.rhodozymaDNA構(gòu)建的基因組文庫。然后，可以挑選雜交的噬菌斑或菌落，并且用于亞克隆和/或測定其核苷酸序列。
通過利用其DNA序列存在幾種增強感興趣的蛋白質(zhì)的所期望的酶活性的方案。
一個方案是利用呈其天然形式的基因本身。最簡單的途徑是擴增包括它的調(diào)節(jié)序列、如啟動子和終止子的基因組序列。通過將編碼感興趣的酶的基因組片段克隆到含有在P.rhodozyma中起作用的選擇標(biāo)記的適當(dāng)載體中可以進行這一方案。將編碼使宿主在存在有毒的抗生素時能存活的酶的藥物抗性基因經(jīng)常用作選擇標(biāo)記。含于pGB-Ph9中的G418抗性基因(Wery等人，基因，184，89-97，1997)是這樣的載體結(jié)構(gòu)的例子。作為載體，通常可以使用兩種類型的載體。這些類型中的一種是不具有自主復(fù)制序列的整合載體。質(zhì)粒pGB-Ph9是這一類型的載體的例子。因為這樣的載體不具有自我復(fù)制序列，所以上述載體本身不能復(fù)制，并且作為使用載體與染色體之間的同源序列的單交重組的結(jié)果，上述載體只以宿主染色體上的整合形式存在。通過在選擇培養(yǎng)基中增加對應(yīng)的藥物的濃度，只有其中在染色體上擴增整合基因的菌株能夠生存。載體的另一種類型是具有自我復(fù)制序列的可復(fù)制載體。這樣的載體可以多拷貝的狀態(tài)存在。在這一類型的載體中，在具有適當(dāng)?shù)妮o源營養(yǎng)標(biāo)記的宿主中也可以使用營養(yǎng)互補標(biāo)記。生長需要胞苷的P.rhodozyma ATCC24221菌株是這種營養(yǎng)缺陷體的一個例子。通過使用CTP合成酶作為ATCC24221的供體DNA，可以確立利用營養(yǎng)互補的宿主載體系統(tǒng)。
超量表達感興趣的酶的另一個方案是將感興趣的基因布置于強啟動子下。在這樣的方案中，感興趣的基因不必是多拷貝狀態(tài)。另外，也可以使用在適當(dāng)?shù)纳L期和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時期誘導(dǎo)其啟動子活性的啟動子。在生長的后期、如次級代謝物的生產(chǎn)期，蝦青素的生產(chǎn)加速。例如，通過在植物啟動子的控制下布置胡蘿卜素生成基因，在指數(shù)生長期可以誘導(dǎo)這些基因的基因表達，并且蝦青素的生產(chǎn)可以變得與生產(chǎn)菌株的生長有關(guān)。
在本發(fā)明中，作為這樣的組成型啟動子和終止子的一個例子，從P.rhodozyma中克隆丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)基因的啟動子和終止子片段。另外，在轉(zhuǎn)化體中證實了蝦青素生產(chǎn)的恢復(fù)，其中在該轉(zhuǎn)化體中，在生產(chǎn)β胡蘿卜素的P.rhodozyma ATCC96815的染色體上的不同基因座(位于淀粉酶基因上的AMY基因座)上由來源于TPI基因的組成型啟動子和終止子驅(qū)動表達AST基因。
超量表達感興趣的酶的再一個方案是在其調(diào)節(jié)元件中突變。針對這一目的，將一種報道基因(如β半乳糖苷酶基因，螢光素酶基因，編碼綠色熒光蛋白質(zhì)的基因等)插入到需要的基因的啟動子和終止子序列之間，以致包括啟動子、終止子和報道基因的所有部分融合在一起并且一起發(fā)揮作用。在體內(nèi)可以對其中在染色體上或在載體上導(dǎo)入所說報道基因的轉(zhuǎn)化的P.rhodozyma進行誘變處理，以便在需要的基因的啟動子區(qū)內(nèi)誘導(dǎo)突變。通過檢測由報道基因編碼的活性的變化可以監(jiān)測突變。如果在基因的順式元件中發(fā)生突變，那么通過拯救誘變的基因并且測序?qū)⒋_定出突變點。然后，通過在天然的和突變的啟動子序列之間重組，可以向染色體上的啟動子區(qū)導(dǎo)入這一突變。以同樣的方式，可以產(chǎn)生編碼反式作用因子的基因中的突變。
通過啟動子區(qū)中的順式元件的體外誘變也可以誘導(dǎo)突變。在這一途徑中，誘變處理含有報道基因的基因盒，其中將所述報道基因融合到來源于感興趣基因的5’-端的啟動子區(qū)和來自感興趣基因3’-端的終止子區(qū)，然后將其導(dǎo)入P.rhodozyma中。通過檢測報道基因的活性的差異，將篩選有效的突變。通過同樣于體內(nèi)突變途徑情況的方法，在染色體上的天然啟動子區(qū)的序列中可以導(dǎo)入這樣的突變。
作為供體DNA，可以導(dǎo)入編碼催化從β胡蘿卜素到蝦青素的反應(yīng)的酶的基因?？梢允褂门c它的天然序列相同的編碼序列及其等位基因變體、即有一個或多個氨基酸的添加、缺失和/或取代、但其對應(yīng)的酶具有相同類型的酶活性的序列。然后，通過轉(zhuǎn)化可以向P.rhodozyma中導(dǎo)入這樣的載體，并且通過在適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基(如在pGB-Ph9的情況中含有遺傳霉素的YPD瓊脂培養(yǎng)基，或在使用營養(yǎng)缺陷型ATCC24221作為受體的情況中不含胞苷的基本瓊脂培養(yǎng)基)上涂布轉(zhuǎn)化的細胞可以選擇轉(zhuǎn)化體。
在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中可以培養(yǎng)這樣的基因工程化的P.rhodozyma并且評價它的蝦青素的生產(chǎn)率。鑒于它的生產(chǎn)率和通過所述的遺傳工程方法導(dǎo)入的基因或蛋白質(zhì)表達的水平之間的關(guān)系，將證實這樣選擇的蝦青素的超級生產(chǎn)者。
實施例在如下所述的具體的實施例中采用了下列材料和方法菌株P(guān).rhodozymaATCC96594(在1998年4月8日以登記號74438作為布達佩斯條約保藏物已經(jīng)再保藏了這一菌株)。
P.rhodozyma ATCC96815(在1999年2月18日以登記號74486作為布達佩斯條約保藏物已經(jīng)再保藏了這一菌株)E.coli DH5alpha F，phi80d，lacZdeltaM15，delta(lacZYA-argF)U169，hsd(rK-，mK+)，recA1，endA1，deoR，thi-1，supE44，gyrA96，relA1(Toyobo，Osaka，Japan)E.coli XL1-Blue MRF’delta(mcrA)183，delta(mcrCB-hsdSMR-mrr)173，endA1，supE44，thi-1，recA1，gyrA96，relA1，lac[F’proAB，lacIqZdeltaM15，Tn10(tetr)](Stratagene，La Jolla，USA)E.coli SOLRe14(mcrA)，delta(mcrCB-hsdSMR-mrr)171，sbcC，recB，recJ，umuCTn5(kanr)，uvrC，lac，gyrA96，relA1，thi-1，endA1，lambdaR，[F’proAB，lacIqZdeltaM15]Su(nonsuppressing)(Stratagene)E.coli TOP10F，mcrA，delta(mrr-hsdRMS-mcrBC)，phi80，delta(lacZM15)，delta(lacX74)，recA1，deoR，araD139，(ara-leu)7697，galU，galK，rpsL(Str)，endA1，nupG(Invitrogen，NV Leek，Netherlands)E.coli BL21(DE3)(pLysS)dcm，ompTrBmB，lon lambda(DE3)，pLysS(Stratagene)載體pUC19(Takara Shuzo，Otsu，Japan)lambdaZAPII(Stratagene)pCR2.1-TOPO(Invitrogen)pET11c(Stratagene)
培養(yǎng)基在YPD培養(yǎng)基(DIFCO，底特律，美國)中常規(guī)維持P.rhodozyma的菌株。在LB培養(yǎng)基(10克細菌用胰蛋白胨，5克酵母提取物(DIFCO)和5克NaCl/升)中維持大腸桿菌菌株。當(dāng)制備瓊脂培養(yǎng)基時，補充的1.5％瓊脂(WAKO，Osaka，日本)。
方法根據(jù)《分子克隆實驗室手冊》第2版(冷泉港實驗室出版社，1989)中敘述的方法進行常用的分子生物學(xué)方法。從TakaraShuzo購買了限制酶和T4DNA連接酶。
根據(jù)制造商提供的方案，通過使用QIAGEN基因組試劑盒(QIAGEN，Hilden，德國)從P.rhodozyma中進行染色體DNA的分離。利用自動DNA分離系統(tǒng)(PI-50，Kurabo有限公司，Osaka，日本)進行來自轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的質(zhì)粒DNA的小量制備。通過使用QIAGEN柱(QIAGEN)進行來自大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA的中量制備(midi-prep)。通過使用QIAquick或QIAEXII(QIAGEN)從瓊脂糖分離和純化DNA片段。
從Pharmacia購買用于DNA測序的熒光DNA引物。利用自動熒光DNA測序儀(ALFred，Pharmacia，Uppsala，瑞士)進行DNA測序。
從Toyobo購買DH5α的感受態(tài)細胞。
從Nippon Bio-Rad實驗室(東京，日本)購買用于biolistic轉(zhuǎn)化P.rhodozyma的儀器和試劑。
實施例1從P.rhodozyma分離基因組DNA為了從P.rhodozyma ATCC96594分離出基因組DNA，根據(jù)制造商詳細說明的方法使用QIAGEN基因組試劑盒。
首先，通過離心(1500×g，10分鐘)從100毫升的YPD培養(yǎng)基中的過夜培養(yǎng)物中收獲P.rhodozymaATCC96594的細胞，并且用TE緩中液(含有1毫摩爾/升EDTA的10毫摩爾/升Tris/HCl(pH8.0))洗滌一次。在QIAGEN基因組試劑盒的8毫升Y1緩沖液中懸浮后，以2毫克/毫升的濃度加入溶細胞酶(SIGMA，圣路易斯，美國)以便通過酶降解使細胞破裂，并且在30℃下溫育反應(yīng)混合物90分鐘，然后進行接下來的提取步驟。最后，獲得20微克基因組DNA。
實施例2從P.rhodozymaATCC96594構(gòu)建基因組文庫如“本發(fā)明的詳細描述”部分中所述，通過在甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)的基因的啟動子和終止子區(qū)之間插入G418抗性結(jié)構(gòu)基因并且將該盒連接到KpnI和HindIII消化的pUC19上來構(gòu)建含有藥物抗性標(biāo)記盒的質(zhì)粒。將這一質(zhì)粒命名為pUC-G418并且進一步使用。然后，將ClaI接頭連接到pUC-G418載體特有的EcoRI位點，并且獲得質(zhì)粒pUC-G418Cl512，并且在Phaffia基因組文庫的構(gòu)建中用作載體主鏈。
然后，在37℃下利用1.6單位的HpaII部分消化如以上實施例1中所述的由P.rhodozyma ATCC96594制備的10微克染色體DNA45分鐘，并且進行瓊脂糖凝膠電泳。在用溴化乙錠染色后，通過使用透析膜的電洗脫回收4到10kb的部分消化的DNA物質(zhì)。在乙醇沉淀出回收的HpaII片段后，獲得1.215微克DNA。
接下來，在37℃下用10個單位的ClaI消化3微克的pG418Cl512共1小時，并且用乙醇沉淀。然后使用小牛小腸堿性磷酸酶使ClaI消化的pG418Cl512去磷酸化。然后，使ClaI消化的并脫磷酸的pG418Cl512載體進行瓊脂糖凝膠電泳，并且根據(jù)制造商的說明采用QIAquick方案回收DNA片段。最后獲得2.62微克ClaI消化的并脫磷酸的pG418Cl512。
將2.62微克ClaI消化的并脫磷酸的pG418Cl512在16℃過夜連接到1.22微克HpaII部分消化的Phaffia基因組DNA上，并且將得到的連接溶液用作用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株的供體DNA。將總的連接混合物(270微升)轉(zhuǎn)移到1毫升感受態(tài)DH52細胞(Toyobo)中。在42℃下熱激處理45秒、接著在冰上維持30分鐘后，將轉(zhuǎn)化的細胞放置于冰上2分鐘，然后在37℃下在加入5毫升SOC培養(yǎng)基的情況下溫育1小時。
SOC培養(yǎng)基0.5％酵母提取物(DIFCO)2％胰化蛋白胨(DIFCO)10毫摩爾/升NaCl2.5毫摩爾/升Kcl10毫摩爾/升MgCl220毫摩爾/升MgSO4
20毫摩爾/升葡萄糖將這樣溫育的細胞轉(zhuǎn)移到100毫升含有100微克/毫升氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中。在37℃繼續(xù)過液培養(yǎng)，然后收獲細胞用于質(zhì)粒的中量制備。
根據(jù)制造商提供的方法，使用QIAGEN中量制備柱從收獲的細胞制備質(zhì)粒文庫。最后，在5毫升的總體積中獲得0.3毫克/毫升的Phaffia基因組文庫，并且在進一步的研究中用作基因組文庫。
實施例3采用biolistic方法轉(zhuǎn)化P.rhodozymaATCC96815根據(jù)《分子生物學(xué)中的方法》中所述的方法進行轉(zhuǎn)化(Johnston等人，53147-153，1996)。作為宿主菌株，在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)P.rhodozymaATCC96815到穩(wěn)定期。在離心肉湯后，用無菌水濃縮細胞10倍，在含有100微克/毫升遺傳霉素及0.75摩爾/升甘露糖醇和山梨醇的YPD培養(yǎng)基上涂布200微升細胞懸浮液。將如實施例2中所述制備的5微克基因組文庫包衣在1.5毫克0.9微米的金顆粒上，并用作biolistic轉(zhuǎn)化的供體DNA。在20℃溫育1星期后，產(chǎn)生約2萬個遺傳霉素抗性克隆(300到500個菌落/平板)。盡管大多數(shù)轉(zhuǎn)化體顯示了黃色(如宿主菌株ATCC96815一樣)，但有三個菌落變成紅色，并且進一步加以使利用。
實施例4從變成紅色的轉(zhuǎn)化體獲得的類胡蘿卜素的分析在試管中，在20℃下，在10毫升YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)從P.rhodozymaATCC96815獲得的變成紅色的轉(zhuǎn)化體。然后，從0.5毫升肉湯中收獲細胞，并用于從細胞中提取類胡蘿卜素。在通過利用所述的玻璃珠破碎來從P.rhodozyma的細胞中提取類胡蘿卜素后，通過HPLC測量P.rhodozyma的類胡蘿卜素含量。在提取后，然后通過離心收集破碎的細胞，并采用HPLC分析得到的上清液的類胡蘿卜素含量。
HPLC柱；Chrompack Lichrosorb si-60(4.6毫米，250毫米)溫度；室溫洗脫液丙酮/己烷(18/82)，并向洗脫液中加入1毫升/升的水注射體積10微升流速2.0毫升/分鐘檢測紫外，在450納米處從SIGMA購買β-胡蘿卜素的樣品，從Hoffman La-Roche(Basel，瑞士)獲得蝦青素。
作為HPLC分析的結(jié)果，證實盡管宿主菌株ATCC96815只生產(chǎn)β-胡蘿卜素，但所有的三個紅色轉(zhuǎn)化體都特異性地生產(chǎn)蝦青素。
實施例5從生產(chǎn)蝦青素的紅色轉(zhuǎn)化體的染色體進行的質(zhì)粒拯救從所有生產(chǎn)蝦青素的轉(zhuǎn)化體制備染色體DNA。為了這一目的，根據(jù)制造商詳細說明的方法，如實施例1所述使用QIAGEN基因組試劑盒。通過HindIII消化這樣制備的5微克的染色體DNA，然后根據(jù)QIAquick方案純化。通過連接DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，然后滌布在含有100微克/毫升氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。從質(zhì)粒的序列分析判斷，所有轉(zhuǎn)化體在它們的質(zhì)粒中都具有相同的插入片段。這表明通過在基因組文庫的供體DNA和染色體DNA之間的相同類型的重組事件產(chǎn)生了起源于P.rhodozymaATCC96815的三種獨立的紅色轉(zhuǎn)化體。將一種這樣拯救的質(zhì)粒命名為pR2-4并且進一步加以使用。
實施例6通過使用pR2-4作為雜交探針篩選原始的基因組文庫因為根據(jù)產(chǎn)生P.rhodozyma的紅色轉(zhuǎn)化體的重組事件的取方，在pR2-4中拯救的片段可能有突變，所以通過使用pR2-4作為雜交探針進行原始基因組文庫的篩選。
為了這一目的，將如實施例2中所述的原始基因組文庫的2萬個大腸桿菌轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到尼龍膜過濾器(Hybond-N+，Amersham，Buckinghamshire，英國)上并且進行菌落雜交。分離出在其插入片段中含有與pR2-4相同的核苷酸序列的三個轉(zhuǎn)化體。將從這些轉(zhuǎn)化體分離的質(zhì)粒命名為pR3，pR5.1和pR16。
接下來，通過pR3，pR5.1和pR16轉(zhuǎn)化P.rhodozymaATCC96815。所有轉(zhuǎn)化體都變成紅色。這一結(jié)果表明分離的質(zhì)?？赡芎芯幋a參與P.rhodozyma中的β胡蘿卜素到蝦青素的反應(yīng)的酶的基因。我們命名這一基因為AST基因。在這些質(zhì)粒中，進一步使用pR16。
實施例7從P.rhodozyma分離出mRNA用于cDNA分析為了分析來自P.rhodozyma的轉(zhuǎn)錄物的模式，通過苯酚提取并結(jié)合用玻璃珠進行細胞破碎從P.rhodozymaATCC96594和ATCC96815分離出總RNA，并且使用mRNA分離試劑盒(Clontech，Palo Alto，美國)純化mRNA。
首先，通過離心(1500×g，10分鐘)從10毫升YPD培養(yǎng)基中的兩天培養(yǎng)物中收獲ATCC96594和ATCC96815菌株的細胞，并用提取緩沖液含有0.1摩爾/升LiCl和0.1毫摩爾/升EDTA的100毫摩爾/升Tris/HCl(pH7.5))洗滌一次。在50毫升一次性離心管(IWAKI Glass，Tokyo，日本)中用同樣的提取緩沖液填充到5.0毫升的細胞懸浮液后，加入1.5毫升isogen-LS(Nippon基因，Toyama，日本)和10克玻璃珠。用水平臺式搖床振蕩含有isogen-LS和玻璃珠的細胞懸浮液的離心管1小時。在這一步驟中，回收300微克的總RNA。
然后，通過使用mRNA分離試劑盒(Clontech)純化mRNA。獲得8.0微克來自P.rhodozyma ATCC96594和ATCC96815菌株的mRNA。
為了合成cDNA，根據(jù)制造商詳細描述的方法，我們使用了SMARTcDNA構(gòu)建試劑盒(Clontech)。我們應(yīng)用2微克純化的mRNA用于第一條鏈的合成，接著進行PCR擴增，并且獲得1毫克cDNA。
實施例8pR16的亞克隆及其插入片段的功能分析在圖2中描繪了pR16的限制圖。將長度為0.7和2.7kb的每個EcoRI片段亞克隆到pUC-G418中并且分別命名為pRS913和pRLR913。
然后，用pRS913轉(zhuǎn)化生產(chǎn)蝦青素的P.rhodozyma ATCC96594菌株。作為這一轉(zhuǎn)化研究的結(jié)果，產(chǎn)生了黃色轉(zhuǎn)化體。這表明0.7kb的EcoRI片段可能含有截短的AST基因，并且通過0.7kb的EcoRI片段與其在P.rhodozyma染色體上的同源序列之間的單交重組的轉(zhuǎn)化將導(dǎo)致P.rhodozyma染色體上的AST基因的基因破壞。
接下來，用pRLR913轉(zhuǎn)化生產(chǎn)β胡蘿卜素的ATCC96815菌株，并且產(chǎn)生了紅色轉(zhuǎn)化體。這表明導(dǎo)致生產(chǎn)蝦青素的野生型菌株生產(chǎn)β胡蘿卜素的菌株ATCC96815的突變點位于最初鄰接pR16中的0.7kbEcoRI片段的2.7kb的EcoRI片段中。
將實施例7中制備的200微克cDNA進行瓊脂糖凝膠電泳，以用于有效的Northern分析。在從ATCC96594和96815制備的cDNA的情況中，通過使用pRLR913的2.7kb的EcoRI片段作為雜交探針，在這兩種情況下都與3.2和2.0kb的兩個帶雜交。這表明ATCC96815的ast突變將是不影響mRNA的長度變化的點突變?nèi)珏e義突變。
在使用pRS913的0.7kb EcoRI片段作為雜交探針的情況中，雜交了2.0kb的帶。從這一研究可見似乎AST基因可能在P.rhodozyma中提供2.0kb的轉(zhuǎn)錄物。
實施例9克隆AST基因的cDNA為了克隆來自P.rhodozyma的AST基因的cDNA，我們從P.rhodozymaATCC96594構(gòu)建了cDNA文庫。通過如實施例7所述的苯酚提取并結(jié)合用玻璃珠進行的細胞破碎來分離總RNA。
首先，通過離心(1500×g，10分鐘)從50毫升YPD培養(yǎng)基中的2天培養(yǎng)物中收獲ATCC96594菌株的細胞，并用提取緩沖液(含有0.1摩爾/升LiCl和0.1毫摩爾/升EDTA的100毫摩爾/升Tris/HCl(pH7.5))洗滌一次。在50毫升一次性離心管(IWAKI Glass)中用同樣的提取緩沖液填充到5.0毫升的細胞懸浮液后，加入1.5毫升isogen-LS(Nippon基因)和10克玻璃珠。用水平臺式搖床振蕩含有isogen-LS和玻璃珠的細胞懸浮液的離心管1小時。在這一步驟中，回收1.8毫克的總RNA。
然后，根據(jù)制造商詳細說明的方法，通過使用PolyATractmRNA分離系統(tǒng)(Promega公司，麥迪生，美國)純化mRNA。最后，我們從P.rhodozymaATCC96594菌株獲得了8.0微克mRNA。
為了構(gòu)建cDNA文庫，采用制造商詳細說明的方案，在COPY試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，美國)中使用8.0微克純化的mRNA。在連接EcoRI銜接頭(Stratagene)后，將合成的cDNA進行瓊脂糖凝膠電泳。在切下覆蓋了1.9到2.3kb的cDNA長度的瓊脂糖凝膠片后，通過QIAEX II(QIAGEN)純化收集的cDNA物質(zhì)。將這種按大小進行了分級分離的cDNA與EcoRI消化的并脫磷酸的λZAP II(Stratagene)連接。用GigapackIII金提取物(Stratagene)體外包裝過夜連接的混合物并且用于感染大腸桿菌XL1-BlueMRF’菌株。
使用如實施例8所述的2.7和0.7kb的EcoRI片段作為雜交探針對6000個噬菌斑進行常規(guī)的噬菌斑篩選。根據(jù)制造商詳細說明的方法，一個噬菌斑與這些探針強烈地雜交，用無菌牙簽挑出該噬菌斑，并將洗脫的噬菌體顆粒用于體內(nèi)切除。最后，分離出顯示了抗氨芐青霉素抗性的感染的大腸桿菌SOLR細胞的轉(zhuǎn)化體。在測定了從這些轉(zhuǎn)化體獲得的分離的質(zhì)粒的序列后，原來是這些質(zhì)粒含有與實施例6中所述的pR16序列的一部分相同的片段。
測定了AST基因的cDNA序列的完整，并且表示為SEQ ID NO2，它的推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID NO1。
實施例10在大腸桿菌中AST基因的表達為了證實AST基因的ORF真正編碼了蛋白質(zhì)，在大腸桿菌表達系統(tǒng)中進行了AST基因的表達研究。首先，為了使下面的純化步驟容易，在AST產(chǎn)物的羧基末端加入6×組氨酸(His)標(biāo)記。合成了在表1中列出其序列的PCR引物。
表1用于克隆問其中加入6×His標(biāo)記的AST基因的3’部分的PCR引物ast13；GTTCAAAGTTCATTTATGGA(有意義引物)(SEQ ID NO4)ast14；GGATCCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGACCGGCTTGACCTGCA(反義引物)(SEQ ID NO5)接下來，將pAST1207的1.5kb的NdeIEcoRI片段和pAST114的0.3kb的EcoRIBamHI片段連接到用NdeI和BamHI消化的pET11c上，并且將連接的DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109菌株中。通過限制酶切分析檢測6個獨立的氨芐青霉素抗性克隆，并且發(fā)現(xiàn)6個克隆中的5個具有包含AST基因的重組表達質(zhì)粒的正確結(jié)構(gòu)。選擇其中的一個進行進一步的研究(pAST120)，然后將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)(pLysS)菌株中。表明由限制酶切分析檢測的所有氨芐青霉素抗性克隆適當(dāng)?shù)鼐哂衟AST120。接下來，當(dāng)在600納米處的光密度(OD)達到0.8時，通過向大腸桿菌BL21(DE3)(pLysS)(pAST120)生長培養(yǎng)物中加入1毫摩爾/升IPTG來進行表達研究。在37℃連續(xù)培養(yǎng)4小時后，通過離心收獲細胞，并通過在SDS樣品緩沖液(125毫摩爾/升Tris-HCl，pH6.8，20％甘油，4％SDS，0.005％溴酚蘭，5％巰基乙醇)中煮沸來溶解。然后，使該溶胞產(chǎn)物進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。在由考馬斯亮蘭染色(快速染色CBB試劑盒，nacalai tesque，Kyoto，日本)后，沒有觀察到表達的蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)未顯示)。
通常，據(jù)報道需要在P450蛋白質(zhì)的氨基末端區(qū)中的氨基酸序列進行一些修飾，以便在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達P450蛋白質(zhì)。事實上，在大腸桿菌中沒有表達具有完整序列的AST基因(數(shù)據(jù)未顯示)，并且發(fā)現(xiàn)在AST基因以及其它P450酶的情況中氨基末端序列的一些修飾是必須的。作為重組AST基因表達的下一步方案，進行了構(gòu)建，其中在位于AST基因氨基末端的疏水的錨序列缺失的基礎(chǔ)上，將6×His標(biāo)記序列加入AST蛋白質(zhì)的氨基末端上。
為了在氨基末端缺失的錨序列的基礎(chǔ)上，在AST蛋白質(zhì)的氨基末端加入6×His標(biāo)記序列，合成了下面的PCR引物并且用于PCR克隆。
表2用于克隆在加入6×His標(biāo)記的5’部分缺乏錨序列的AST基因的PCR引物ast32；CATATGCACCACCACCACCACCACCTGTATAACCTTCAGGGGCCC(用于克隆AST基因5’端的有意義引物)(SEQ ID NO6)ast2；GTAACAACACCATCTCCGGT(用于克隆AST基因5’端的反義引物)(SEQ ID NO7)ast13；GTTCAAAGTTCATTTATGGA(用于克隆AST基因3’端的有意義引物)(SEQ ID NO4)ast3 3；GGATCCTCAACTCATTCGACCGGCTT(用于克隆AST基因3’端的反義引物)(SEQ ID NO8)PCR的條件如下在94℃下25次循環(huán)共15秒，在55℃下循環(huán)30秒，在72℃下循環(huán)30秒。使用質(zhì)粒pAST1207作為PCR模板。將具有所需長度的PCR片段克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中，并測定具有預(yù)期插入片段的6個獨立的克隆的插入序列。結(jié)果，所述克隆中的兩個克隆分別具有準確的插入序列，選擇一個克隆，并用于進一步的研究(針對AST基因的3’末端為pAST228，而針對AST基因的5’末端為pAST302#3202)。將來自pAST302#3202的0.2kb的NdeISphI片段、來自pAST1207的1.5kb的SphIEcoRI片段和來自pAST228的0.05kb的KpnIBamHI片段連接到由NdeI和BamHI消化的pET11c中，并將連接的混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。作為對6個獨立的克隆進行限制分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)所有的克隆都具有針對其表達的含有AST基因的正確結(jié)構(gòu)。選擇一個克隆，并用于進一步的研究(pAST315)。接下來，將pAST315轉(zhuǎn)移到表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)(pLysS)中。作為限制分析的結(jié)果，證實了所有6個轉(zhuǎn)化體都準確地具有pAST315。
接下來，當(dāng)在600納米處的光密度(OD)達到0.93時，通過向大腸桿菌BL21(DE3)(pLysS)(pAST315)生長培養(yǎng)物中加入1.5毫摩爾/升的IPTG進行表達研究。在37℃連續(xù)培養(yǎng)4小時后，通過離心收獲細胞，通過在SDS樣品緩沖液中煮沸來溶解細胞。然后，將溶胞產(chǎn)物進行PAGE。在考馬斯亮蘭染色后，觀察到分子量恰好對應(yīng)于其推定的氨基酸序列(約60千道爾頓)的表達的蛋白質(zhì)(圖3)。從這一結(jié)果，證實了AST基因編碼由它的推定的開放讀碼框架預(yù)期的蛋白質(zhì)。
實施例11AST基因產(chǎn)物的體外特性記述對于AST基因產(chǎn)物的酶的特性記述，可以使用用于描述P450酶的特性的標(biāo)準測定。為了這一目的，需要反應(yīng)混合物含有再構(gòu)成膜。作為再構(gòu)成膜，經(jīng)常使用天然的分離物(如線粒體膜或微粒體)和人工膜。在任何情況中必須在電子受體和供體之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移。作為電子供體，向反應(yīng)混合物中經(jīng)常加入細胞色素P450還原酶。作為電子受體，加入氧分子。在存在電子來源(如還原的NADPH+)的情況下，可以將作為蝦青素合成酶底物的，β胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成蝦青素。用HPLC分析可以定性和定量地測定產(chǎn)生的蝦青素。
實施例12含有AST基因的基因組片段的克隆為了測定含有AST基因的基因組序列，通過使用引物步查行方法進行測序?qū)嶒?。pRS913的測序分析顯示pRS913不含AST基因的3’末端。為了獲得靠近AST基因的3’鄰接基因組片段，進行了基因組步查實驗。為此，根據(jù)制造商詳細說明的方法采用了通用的基因組行走試劑盒(Clontech)。作為PCR的模板，使用了在實施例1中制備的染色體DNA。合成了如表3中所列序列的基因特異性引物ast15，并且用作PCR引物；表3用于AST基因的基因組行走的引物的序列ast15；TAGAGAGAAGGAGGGGTACCAGATGC(SEQ ID NO9)從EcoRV和StuI文庫獲得了具有適當(dāng)長度(小于1kb)的PCR片段，將其純化并且克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中。作為測序的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這兩個片段都含有包含AST基因的基因組片段。根據(jù)位于AST基因中離開polyA位點200bp的序列，設(shè)計出如表4所列的PCR引物。
表4
用于克隆靠近AST基因的3’鄰接片段的引物的序列ast18；CCCCGGATTGTGGAGAAACT(SEQ ID NO10)通過使用ast15和ast18引物作為PCR引物和實施例1中制備的染色體DNA作為PCR模板，進行PCR。校正聚合酶(HF聚合酶，Clontech)保證了具有準確序列的PCR片段的擴增。PCR條件如下；在94℃下25次循環(huán)其15秒，55℃下循環(huán)30秒，72℃下循環(huán)30秒。具有400bp插入片段的6個獨立的克隆顯示出相同的序列。
通過結(jié)合pRS913和pRL913的序列，測定了含有包含474bp的啟動子區(qū)和269bp的終止子區(qū)的AST基因的3.9kb的序列(SEQ ID NO3)。結(jié)果，AST基因顯示出了富含內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)(17個內(nèi)含子)。
實施例13確定β胡蘿卜素生產(chǎn)菌株P(guān).rhodozymaATCC96815中的突變點為了證實由AST基因內(nèi)的突變引起了P.rhodozymaATCC96815菌株產(chǎn)生β胡蘿卜素的事實，測定了含有從ATCC96815及其親代菌株P(guān).rhodozymaATCC24230獲得的AST基因的基因組序列。為此，合成了如表5中所列序列的PCR引物，并且用于PCR克隆；表5用于克隆整個基因組AST基因的PCR引物；ast21；ATGTTCATCTTGGTCTTGCT(有意義引物)(SEQ ID NO11)ast4；ACGTAGAAGTCATAGCGCCT(反義引物)(SEQ ID NO12)通過使用HF聚合酶(Clontech)作為PCR聚合酶和使用通過與實施例1同樣的方法從菌株ATCC96815和ATCC24230制備的染色體DNA作為PCR模板，在如下的條件下進行PCR94℃下循環(huán)25次共15秒，55℃下循環(huán)30秒，和72℃下循環(huán)4分鐘。將所得的長度約為3.5kb的PCR片段克隆列pCR2.1-TOPO中，并且通過引物行走方法測定它們的整個序列。在P.rhodozymaATCC96594菌株和ATCC24230菌株的序列之間發(fā)現(xiàn)了7個堿基的變化。在它的外顯子序列中發(fā)現(xiàn)了4個堿基的變化，但那些變化沒有造成任何氨基酸的變化。在它的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了3個堿基的變化。在β胡蘿卜素生產(chǎn)菌株ATCC96815和它的親代菌株ATCC24230之間的比較，發(fā)現(xiàn)位于第8個內(nèi)含子中的5’剪接序列上的一個堿基的變化(GTAAGT＞GTAAAT)。這可能表明賦予生產(chǎn)蝦青素的P.rhodozyma積累β胡蘿卜素的表現(xiàn)型的突變是由AST基因的mRNA的不恰當(dāng)剪接引起的。
為了證實這一假設(shè)，通過使用從P.rhodozymaATCC96815制備的cDNA作為PCR模板進行RT-PCR。通過與實施例9相同的方案，從P.rhodozymaATCC96815分離出mRNA，并且用于cDNA的合成。為了通過PCR方法從由ATCC96815制備的這種mRNA獲得cDNA，根據(jù)供應(yīng)商詳細說明的方法，使用SMART PCR cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(Clontech)。合成了如表6中所列序列的，并且覆蓋了第8個內(nèi)含子的下列引物，并且用作PCR引物。
表6用于檢測AST基因的不恰當(dāng)剪接產(chǎn)物的RT-PCR的PCR引物ast7；TTTGACTCAAGGATTAGCAG(有意義引物)(SEQ ID NO13)ast26；TGTCTTCTGAGAGTCGGTGA(反義引物)(SEQ ID NO14)RT-PCR條件如下；94℃下25次循環(huán)共15秒，55℃下循環(huán)30秒，72℃下循環(huán)30秒。作為PCR的結(jié)果，擴增了300bp的PCR產(chǎn)物，并且克隆到pCR2.1-TOPO中。測定了具有300bp插入片段的兩個獨立的克隆的序列。結(jié)果，證實在P.rhodozymaATCC96815菌株中合成了AST基因的不恰當(dāng)?shù)募艚赢a(chǎn)物。AST基因的第8個內(nèi)含子的不恰當(dāng)?shù)募艚涌赡茉斐杀日_剪接的AST蛋白質(zhì)更短的截短的AST蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，因為終止密碼子位于第8個內(nèi)含子中。這一結(jié)果表明突變點位于不能正確剪接的AST基因內(nèi)。
實施例14在生產(chǎn)β胡蘿卜素的Phaffia rhodozyma中AST基因的表達為了證實AST基因編碼參與從β胡蘿卜素到蝦青素的轉(zhuǎn)化的酶的事實，將AST基因克隆到β胡蘿卜素生產(chǎn)菌株中。為了排除在染色體上的AST基因的天然基因座上重組的可能性，構(gòu)建在Phaffia rhodozyma染色體的AMY基因座上的AST基因的表達質(zhì)粒。為此，需要從Phaffia rhodozyma克隆一些遺傳元件。
1)從Phaffia rhodozyma克隆組成型啟動子和終止子為了從Phaffia rhodozyma克隆組成型啟動子和終止子，采用了簡并PCR方法。在經(jīng)常在酵母遺傳學(xué)中用作組成型啟動子和終止子的基因之中，嘗試克隆編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的TPI基因。在Blocks數(shù)據(jù)庫(http//www.blocks.fhcrc.org/)中登記的保守的氨基酸序列之中，選擇兩個基元序列(Arg-Thr-Phe-Phe-Val-Gly-Gly-Asn和Asp-Val-Asp-Gly-Phe-Leu-Val-Gly-Gly-Ala)并且如下合成了它們的簡并引物。
表7用于從P.rhodozyma克隆TPI基因的簡并PCR引物tp1；MGNACNTTYTTYGTNGGNGGNAAY(有意義引物)(SEQ IDNO15)tp6；GCNCCNCCNACNARRAANCCRTCNACRTC(反義引物)(SEQ IDNO16)(M＝A或C；N＝A，C，G或T；Y＝C或T；R＝A或G)PCR條件如下94℃下25次循環(huán)共15秒，46℃下循環(huán)30秒，72℃下循環(huán)15秒。將ExTaq聚合酶(TakaraShuzo)用作PCR聚合酶。作為PCR模板，通過使用SMART PCR cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(Clontech)從由P.rhodozymaATCC96594分離出的mRNA制備cDNA庫。純化0.7kb的PCR片段，并將其克隆到pCR2.1-TOPO中。從限制分析判斷，6個獨立的克隆具有所需長度的插入片段。測定其中兩個的序列，并且證實它們都具有與來自不同生物體的已知的TPI基因具有顯著的同源性的插入序列。選擇其中一個用于進一步的研究(pTPI923)。
接下來，根據(jù)pTPI923的插入序列，合成了表8中所列序列的幾個PCR引物用于基因組行走，以便克隆TPI基因的啟動子和終止子。對于這一實驗，根據(jù)制造商詳細說明的方法使用了通用的基因組行走試劑盒(Clontech)。
表8用于基因組行走以克隆TPI啟動子和終止子的PCR引物tp9；GCTTACCTCGCTTCCAACGTTTCCCAG(終止子克隆，初級)(SEQID NO17)tp10；GGATCTGTCTCTGCCTCCAACTGCAAG(終止子克隆，嵌套)(SEQID NO18)tp11；GGGTCAATGTCGGCAGCGAGAAGCCCA(啟動子克隆，初級)(SEQ ID NO19)tp12；ATGTACTCGGTAGCACTGATCAAGTAG(啟動子克隆，嵌套)(SEQID NO20)PCR條件如下；在94℃下循環(huán)7次共4秒，74℃下循環(huán)3分鐘，接著在94℃下循環(huán)32次共4秒，69℃下循環(huán)3分鐘并且在69℃連續(xù)延伸4分鐘。將KOD聚合酶(TOYOBO)用作PCR聚合酶。將從P.rhodozymaATCC96594制備的染色體DNA用作PCR模板。結(jié)果，從EcoRV和StuI文庫獲得了終止子區(qū)的候選物。對這些候選物的測序分析表明兩個克隆都具有含有TPI結(jié)構(gòu)基因的推定了3’末端和終止子區(qū)的TPI基因的下游序列。在克隆啟動子區(qū)的情況中，從EcoRV文庫獲得的候選物含有TPI結(jié)構(gòu)基因的推定的5’末端和啟動子區(qū)。
然后，為了構(gòu)建來源于TPI基因的啟動子盒與終止子盒，合成了表9中所列序列的PCR引物。
表9構(gòu)建TPI啟動子和TPI終止子盒子的PCR引物tp13；GCGGCCGCATCCGTCTCGCCATCAGTCT(啟動子盒子的有義引物)(SEQ ID NO21)tp14；CCTGCAGGTCTAGAGATGAATAAATATAAAGAGT(啟動子盒子的反義引物)(SEQ ID NO22)tp15；CCTGCAGGTAAATATATCCAGGGATTAACCCCTA(終止子盒子的有義引物)(SEQ ID NO23)tp16；GGTACCCGTGCGCAGTCGACCGAGACAT(終止子盒子的反義引物)(SEQ ID NO24)PCR條件如下；在94℃下循環(huán)25次共15秒，55℃下循環(huán)30秒和72℃下循環(huán)30秒。將HF聚合酶(Clontech)用作PCR聚合酶，并將產(chǎn)生的PCR片段克隆到pCR2.1-TOPO中。作為限制酶切和測序分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)獲得了具有相同序列的克隆。各選擇一個克隆用于進一步的研究(啟動子盒子選擇pTPIP1104，而終止子盒子選擇pTPIT1104)。
2)從Phaffia rhodozyma克隆部分的淀粉酶基因為了在P.rhodozyma的染色體上定位和表達外源基因，從P.rhodozyma克隆淀粉酶基因。在基本將會克隆外源基因的表達載體可能含有與P.rhodozyma的染色體序列(如淀粉酶基因)同源的遺傳片段的情況中，在單交重組后，在P.rhodozyma的染色體的同源區(qū)上可以整合表達載體。
從Entrez數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)選擇來自不同生物體的淀粉酶的11個氨基酸序列，并且通過Clustal W用于氨基酸的對比(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.，核酸研究，224673-4680，1994)。表10中列出了在該數(shù)據(jù)庫登記了其淀粉酶序列的11種生物體。
表10用于Clustal W分析的在數(shù)據(jù)庫登記的各種淀粉酶基因黑色曲霉泡盛變種amyA基因(登記號X52755)黑色曲霉泡盛變種amyB基因(登記號X52756)川地曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶基因(登記號AB008370)米曲霉amyl基因(登記號X12725)Aspergillus shirousamiiα-淀粉酶基因(登記號P30292)隱球酵母屬的種的α淀粉酶基因(登記號D83541)Lipomyces kononenkoae subsp.spencermartinsiae α-淀粉酶基因(登記號U30376)Debaryomyces occidentalis amyl基因(登記號X16040)肋狀復(fù)膜孢糖酵母ALP1基因(登記號X05791)粟酒裂殖糖酵母α-淀粉酶基因(登記號Z64354)選擇淀粉酶的兩個保守的氨基酸序列(Asp-Tyr-Ile-Gln-Gly-Met-Gly-Phe-Asp/Thr-Ala-Ile-Trp和Asp-Gly-Ile-Pro-Ile-Ile-Tyr-Tyr-Gly-Thr-Glu-Gln)，以便通過簡并PCR方法從P.rhodozyma克隆淀粉酶基因。然后，合成在表11中所列序列的PCR引物用于從P.rhodozyma克隆AMY基因。
表11用于從P.rhodozyma克隆淀粉酶(AMY)基因的簡并PCR引物amy1；GAYTAYATHCARGGNATGGGNTTYRMNGCNATHTG(有意義引物)(SEQ ID NO25)amy2；TGYTCNGTNCCRTARTADATDATNGGDATNCCRTC(反義引物)(SEQ ID NO26)(Y＝C或T；H＝A，C或T；R＝A或G；N＝A，C，G或T；M＝A或C；D＝A，G或T)PCR條件如下；在94℃下循環(huán)25次共15秒，50℃下循環(huán)30秒和72℃下循環(huán)2分鐘。使用ExTaq聚合酶(Takara Shuzo)作為PCR聚合酶。作為PCR模板，使用了實施例1中制備的染色體DNA和通過使用SMART PCRcDNA文庫構(gòu)建試劑盒(Clontech)從由P.rhodozymaATCC96594分離出的mRNA制備的cDNA庫。當(dāng)使用染色體和cDNA作為PCR模板時，分別產(chǎn)生了1.7kb和0.9kb的PCR片段。純化這兩個片段并且克隆到pCR2.1-TOPO中。從限制分析判斷，6個獨立的克隆具有所需長度的插入片段。測定其中兩個的序列，并證實它們都具有與來自不同生物體的已知的淀粉酶基因具有顯著的同源性的插入序列。選擇其中含有染色體AMY片段的一個克隆用于進一步的研究(pAMY216)。為了構(gòu)建部分淀粉酶盒，根據(jù)pAMY216的插入片段的內(nèi)部序列，合成了表12中所列序列的兩個PCR引物。
表12構(gòu)建部分AMY盒子的PCR引物amy101；CCGCGGCATTGATACCTCTACCCCGT(AMY盒子的有義引物)(SEQ ID NO27)amy102；GCGGCCGCCTGCAATCCTGGATCCACCG(AMY盒子的反義引物)(SEQ ID NO28)PCR條件如下；在94℃下循環(huán)25次共15秒，55℃下循環(huán)30秒，及72℃下循環(huán)2分鐘。將HF聚合酶(Clontech)和染色體DNA分別用作PCR聚合酶和PCR模板。將產(chǎn)生的PCR片段克隆進pCR2.1-TOPO中。作為限制酶切和測序分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)獲得了具有正確序列的克隆。選擇一個克隆用于進一步的研究(pAMY1113)。
3)構(gòu)建在Phaffia rhodozyma中起作用的AST基因的表達載體通過限制酶切消化和連接每個遺傳成分來構(gòu)建AST基因的表達質(zhì)粒。首先，將來自pTPIT1104的0.3kb的KpnIPstI片段和來自pG418Sa512的1.7kb的SacIKpnI片段連接到由用SacI和PstI消化的pGEM-T質(zhì)粒中。發(fā)現(xiàn)作為限制酶切消化的結(jié)果，12個轉(zhuǎn)化體中有9個克隆具有正確的結(jié)構(gòu)，選擇其中一個用于進一步的研究(pTPITG1120)。
接下來，進行AST基因的PCR克隆，以便在兩個末端加入適當(dāng)?shù)南拗莆稽c。合成了在表13中所列序列的PCR引物。
表13克隆整個AST基因盒的PCR引物ast11；TCTAGAATGTTCATCTTGGTCTTGCTCA(有義引物)(SEQ IDNO29)ast12；CCTGCAGGTCATTCGACCGGCTTGACCT(反義引物)(SEQ IDNO30)
PCR條件如下；在94℃下循環(huán)25次共15秒，55℃下循環(huán)30秒，及在72℃下循環(huán)2分鐘。將HF聚合酶(Clontech)和pAST1207分別用作PCR聚合酶和PCR模板。將產(chǎn)生的PCR片段克隆到pCR2.1-TOPO中。作為限制酶切和測序分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)獲得了具有正確序列的一個克隆。選擇這個克隆用于進一步的研究(pAST113)。
最后，來自pAMY1113的將1.6kb的SacIINotI片段、來自pTPIP1104的0.3kb的NotIXbaI片段和來自pAST113的1.5kb的XbaISse8387I片段連接進入利用SacII和Sse8387I消化的pTPITG1120。作為限制分析的結(jié)果，證實了所有5個測試的轉(zhuǎn)化體都具有正確的結(jié)構(gòu)，并且選擇其中一個用于進一步的研究(pAATG123)。
4)在生產(chǎn)β胡蘿卜素的Phaffia rhodozyma中恢復(fù)蝦青素的生產(chǎn)將AST基因的表達質(zhì)粒(pAATG123)轉(zhuǎn)化進入生產(chǎn)β胡蘿卜素的PhaffiarhodozymaATCC96815中。如實施例3所述進行biolistic轉(zhuǎn)化。挑選出變成紅色的兩個遺傳霉素抗性菌落，進行選擇用于進一步的研究。為了證實在P.rhodozyma染色體上AMY基因座上的整合，合成了其序列列于表14的PCR引物。
表14證實在P.rhodozyma染色體上的AMY基因座上整合表達質(zhì)粒的PCR引物amy5；CTCTCCTGTTCACAAAAACA(有義引物)(SEQ ID NO31)從這些轉(zhuǎn)化體制備染色體，并將其用作PCR模板。PCR條件如下；94℃下循環(huán)25次共15秒，55℃下循環(huán)30秒，及72℃下循環(huán)2分鐘。將ExTaq聚合酶(Takara Shuzo)用作PCR聚合酶。在將從變成紅色的轉(zhuǎn)化體獲得的染色體用作模板DNA的PCR反應(yīng)中產(chǎn)生了陽性2.0kb的PCR帶。在將起源于宿主菌株P(guān).rhodozyma ATCC96815的染色體用作PCR模板的PCR反應(yīng)混合物中沒有觀察到PCR帶。
5)通過在生產(chǎn)β胡蘿卜素的P.rhodozyma的染色體上整合了重組AST基因的重組體的燒瓶發(fā)酵在燒瓶發(fā)酵中評價蝦青素的生產(chǎn)率。燒瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基配方如下。
表15用于燒瓶發(fā)酵的種子培養(yǎng)基配方葡萄糖 30.0克/升NH4Cl 4.83克/升KH2PO41.0克/升MgSO4-7H2O 0.88克/升NaCl 0.06克/升CaCl2-2H2O 0.2克/升鄰苯二甲酸氫鉀KH phthalate 20.0克/升FeSO4-7H2O 28毫克/升檸檬酸-1H2O 15.0毫克/升ZnSO4-7H2O 40.0毫克/升CuSO4-5H2O 0.75毫克/升MnSO4-4，5H2O0.6毫克/升H3BO30.6毫克/升Na2MoO4-2H2O0.6毫克/升KI 0.15毫克/升肌醇 60.0毫克/升煙酸 3.0毫克/升D-泛酸鈣 3.0毫克/升維生素B1(鹽酸硫胺素) 3.0毫克/升對氨基苯甲酸 1.8毫克/升維生素B6(鹽酸吡哆醇) 0.3毫克/升生物素 0.048毫克/升7毫升/試管(直徑21毫米)表16用于燒瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基配方MgSO4-7H2O 2.1克/升CaCl2-2H2O 0.865克/升(NH4)2SO43.7克/升FeSO4-7H2O 0.28克/升葡萄糖(單獨滅菌) 22克/升
KH2PO4(單獨滅菌) 14.25克/升檸檬酸-1H2O 0.21克/升ZnSO4-7H2O 70.14毫克/升CuSO4-5H2O 10.5毫克/升MnSO4-4，5H2O8.4毫克/升H3BO38.4毫克/升Na2MoO4-2H2O8.4毫克/升KI 2.1毫克/升肌醇 0.374克/升煙酸 18.7毫克/升D-泛酸鈣 28.05毫克/升維生素B1(鹽酸硫胺素) 18.7毫克/升對氨基苯甲酸 11.22毫克/升維生素B6(鹽酸吡哆醇) 1.87毫克/升生物素 1.122毫克/升CaCO310克/升向每個燒瓶中加入1滴Actcol(Takeda化學(xué)工業(yè)有限公司，Osaka，日本)。
在發(fā)酵7天后從發(fā)酵肉湯中收獲含有緩沖(buffles)細胞的50毫升(含有5％接種物的最后體積)/500毫升燒瓶，并且通過如實施例4所述的HPLC分析其蝦青素和β胡蘿卜素的積累。結(jié)果概括在表17中。
表17通過其中整合了AST基因的重組體導(dǎo)致蝦青素生產(chǎn)的恢復(fù)(將數(shù)據(jù)表示為相對于由P.rhodozymaATCC96815積累的β胡蘿卜素的效價的蝦青素和β胡蘿卜素的相對效價)相對效價(％)菌株蝦青素 β胡蘿卜素ATCC96815pR1634.0％18.6％ATCC96815pAATG12316.3％56.3％ATCC968150％ 100％由ATCC96815pAATG123生產(chǎn)蝦青素的部分恢復(fù)表明TPI啟動子的啟動子強度對于蝦青素生產(chǎn)的完全恢復(fù)是不夠強的。
序列表<110>F.HOFFMANN-LAROCHE.AG<120>蝦青素生產(chǎn)的改進和其中利用的生物物質(zhì)<130>P450ast<140><141><160>32<170>PatentIn Ver2.0<210>1<211>557<212>PRT<213>Phaffia rhodozyma<220><221>TRANSIT<222>(1)..(26)<400>1Met Phe Ile Leu Val Leu Leu Thr Gly Ala Leu Gly Leu Ala Ala Phe30 1 5 10 15Ser Trp Ala Ser Ile Ala Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Ala Pro Arg Arg2025 3035 Ser Ser Leu Tyr Asn Leu Gln Gly Pro Asn His Thr Asn Tyr Phe Thr35 40 45Gly Asn Phe Leu Asp Ile Leu Ser Ala Arg Thr Gly Glu Glu His Ala50 55 6040Lys Tyr Arg Glu Lys Tyr Gly Ser Thr Leu Arg Phe Ala Gly Ile Ala65 70 75 80Gly Ala Pro Val Leu Asn Ser Thr Asp Pro Lys Val Phe Asn His Val45 85 90 95Met Lys Glu Ala Tyr Asp Tyr Pro Lys Pro Gly Met Ala Ala Arg Val
100 105 110Leu Arg Ile Ala Thr Gly Asp Gly Val Val Thr Ala Glu Gly Glu Ala115 120 125His Lys Arg His Arg Arg Ile Met Ile Pro Ser Leu Ser Ala Gln Ala130 135 140Val Lys Ser Met Val Pro Ile Phe Leu Glu Lys Gly Met Glu Leu Val145 150155 160Asp Lys Met Met Glu Asp Ala Ala Glu Lys Asp Met Ala Val Gly Glu165 170 175Ser Ala Gly Glu Lys Lys Ala Thr Arg Leu Glu Thr Glu Gly Val Asp180 185 190Val Lys Asp Trp Val Gly Arg Ala Thr Leu Asp Val Met Ala Leu Ala195 200 205Gly Phe Asp Tyr Lys Ser Asp Ser Leu Gln Asn Lys Thr Asn Glu Leu210 215 220Tyr Val Ala Phe Val Gly Leu Thr Asp Gly Phe Ala Pro Thr Leu Asp225 230 235 240Ser Phe Lys Ala Ile Met Trp Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Thr Met245 250 255Lys Arg Arg His Glu Ile Pro Leu Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Arg260 265 270Arg Val Gly Ile Glu Leu Met Glu Gln Lys Lys Gln Ala Val Leu Gly275 280 285Ser Ala Ser Asp Gln Ala Val Asp Lys Lys Asp Val Gln Gly Arg Asp290 295 300Ile Leu Ser Leu Leu Val Arg Ala Asn Ile Ala Ala Asn Leu Pro Glu305 310 315 320Ser Gln Lys Leu Ser Asp Glu Glu Val Leu Ala Gln Ile Ser Asn Leu325 330 335Leu Phe Ala Gly Tyr Glu Thr Ser Ser Thr Val Leu Thr Trp Met Phe340 345 350His Arg Leu Ser Glu Asp Lys Ala Val Gln Asp Lys Leu Arg Glu Glu
355 360 365Ile Cys Gln Ile Asp Thr Asp Met Pro Thr Leu Asp Glu Leu Asn Ala370 375 380Leu Pro Tyr Leu Glu Ala Phe Val Lys Glu Ser Leu Arg Leu Asp Pro385 390 395 400Pro Ser Pro Tyr Ala Asn Arg Glu Cys Leu Lys Asp Glu Asp Phe Ile405 410 415Pro Leu Ala Glu Pro Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Val Ile Asn Glu420 425 430Val Arg Ile Thr Lys Gly Thr Met Val Met Leu Pro Leu Phe Asn Ile435 440 445Asn Arg Ser Lys Phe Ile Tyr Gly Glu Asp Ala Glu Glu Phe Arg Pro450 455 460Glu Arg Trp Leu Glu Asp Val Thr Asp Ser Leu Asn Ser Ile Glu Ala465 470 475 480Pro Tyr Gly His Gln Ala Ser Phe Ile Ser Gly Pro Arg Ala Cys Phe485 490 495Gly Trp Arg Phe Ala Val Ala Glu Met Lys Ala Phe Leu Phe Val Thr500 505 510Leu Arg Arg Val Gln Phe Glu Pro Ile Ile Ser His Pro Glu Tyr Glu515 520 525His Ile Thr Leu Ile Ile Ser Arg Pro Arg Ile Val Gly Arg Glu Lys530 535540Glu Gly Tyr Gln Met Arg Leu Gln Val Lys Pro Val Glu545 550 555<210>2<211>1932<212>DNA<213>Phaffia rhodozyma<220><221>CDS<222>(33)..(1706)<220><221>polyA-位點<222>(1871)<220><221>mRNA<222>(14)..(1891)<400>210 gaattcggca cgaggccacc tactttctcc at atg ttc atc ttg gtc ttg ctc 53Met Phe Ile Leu Val Leu Leu1 5aca ggt gct tta ggc ctg gct gct ttc tca tgg gca tcc ata gcg ttc 10115 Thr Gly Ala Leu Gly Leu Ala Ala Phe Ser Trp Ala Ser Ile Ala Phe10 15 20ttc agt ctt tac ctc gct ccg agg cga tct tca ctg tat aac ctt cag 149Phe Ser Leu Tyr Leu Ala Pro Arg Arg Ser Ser Leu Tyr Asn Leu Gln20 25 30 35ggc ccg aat cat acc aac tac ttt aca ggc aat ttt tta gac atc ctc 197Gly Pro Asn His Thr Asn Tyr Phe Thr Gly Asn Phe Leu Asp Ile Leu40 45 50 5525tca gct cgt aca ggt gaa gag cat gcg aag tac aga gaa aaa tac gga 245Ser Ala Arg Thr Gly Glu Glu His Ala Lys Tyr Arg Glu Lys Tyr Gly60 65 7030 agc acc ctc cgg ttt gct ggg atc gct gga gca ccc gtc ttg aac tcg 293Ser Thr Leu Arg Phe Ala Gly Ile Ala Gly Ala Pro Val Leu Asn Ser75 80 85acc gat ccg aaa gtc ttc aac cat gtg atg aaa gaa gcc tac gac tat 34135 Thr Asp Pro Lys Val Phe Asn His Val Met Lys Glu Ala Tyr Asp Tyr90 95 100ccg aaa cct ggt atg gcc gct cga gtg ctc aga att gct acc gga gat 389Pro Lys Pro Gly Met Ala Ala Arg Val Leu Arg Ile Ala Thr Gly Asp105 110 115ggt gtt gtt acg gcg gaa ggt gaa gct cat aag cga cat cga agg atc 437Gly Val Val Thr Ala Glu Gly Glu Ala His Lys Arg His Arg Arg Ile120 125 130 135atg atc ccc tct ctg tcc gct cag gcc gtt aag tcg atg gtc cca att 485Met Ile Pro Ser Leu Ser Ala Gln Ala Val Lys Ser Met Val Pro Ile140 145 150ttc tta gaa aaa ggt atg gaa ctt gtc gac aag atg atg gag gat gcg 533Phe Leu Glu Lys Gly Met Glu Leu Val Asp Lys Met Met Glu Asp Ala155 160 165gct gag aag gat atg gcc gtg gga gag tcg gcc ggt gaa aag aag gca 581Ala Glu Lys Asp Met Ala Val Gly Glu Ser Ala Gly Glu Lys Lys Ala170 175 180acc aga ctc gag acc gaa gga gtc gat gta aag gat tgg gtc ggt cga 629Thr Arg Leu Glu Thr Glu Gly Val Asp Val Lys Asp Trp Val Gly Arg185 190 195gct act ctg gac gtc atg gct ctt gca gga ttt gac tat aag agc gac 677Ala Thr Leu Asp Val Met Ala Leu Ala Gly Phe Asp Tyr Lys Ser Asp200 205 210 215tcg ctc cag aac aag acc aat gag ctc tat gtc gct ttt gtc gga ctt 725Ser Leu Gln Asn Lys Thr Asn Glu Leu Tyr Val Ala Phe Val Gly Leu220 225 230acc gat ggg ttt gct cct acc ttg gac tcg ttc aag gct atc atg tgg 773Thr Asp Gly Phe Ala Pro Thr Leu Asp Ser Phe Lys Ala Ile Met Trp235 240 245gat ttt gta cct tac ttc cga act atg aaa cgg aga cat gag ata cct 821Asp Phe Val Pro Tyr Phc Arg Thr Met Lys Arg Arg His Glu Ile Pro250 255 260ttg act caa gga tta gca gtt tcc cga cga gtt ggg atc gag ctt atg 869Leu Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Arg Arg Val Gly Ile Glu Leu Met265 270 275gag caa aag aag cag gcc gtg ctt ggc tca gct tcc gat cag gct gtt 917Glu Gln Lys Lys Gln Ala Val Leu Gly Ser Ala Ser Asp Gln Ala Val280 285 290 295gat aaa aag gat gtt caa ggt cgg gat ate cta agt ctc cta gtg aga 965Asp Lys Lys Asp Val Gln Gly Arg Asp Ile Leu Ser Leu Leu Val Arg300 305 310gca aac atc gcc gcc aac ctg cct gaa tct caa aag ctg tcc gat gag 1013Ala Asn Ile Ala Ala Asn Leu Pro Glu Ser Gln Lys Leu Ser Asp Glu315320 325gag gta ctc gct cag atc agt aac ctg tta ttt gct gga tat gaa act 1061Glu Val Leu Ala Gln Ile Ser Asn Leu Leu Phe Ala Gly Tyr Glu Thr330 335 340tct tcg aca gtc ttg aca tgg atg ttt cac cga ctc tca gaa gac aaa 1109Ser Ser Thr Val Leu Thr Trp Met Phe His Arg Leu Ser Glu Asp Lys345 350 355gcc gtt cag gat aaa ctt cga gaa gaa att tgt cag atc gac acg gat 1157Ala Val Gln Asp Lys Leu Arg Glu Glu Ile Cys Gln Ile Asp Thr Asp360 365 370 375atg cct acg cta gac gaa ctt aat gcg ttg cct tat ctc gaa gcg ttt 1205Met Pro Thr Leu Asp Glu Leu Asn Ala Leu Pro Tyr Leu Glu Ala Phe380 385 390gtt aag gag tct ctt cgt cta gac cct cct agt ccg tat gct aac cgt 1253Val Lys Glu Ser Leu Arg Leu Asp Pro Pro Ser Pro Tyr Ala Asn Arg395 400 405gaa tgc tta aag gat gaa gac ttc atc cca ctt gcc gag cct gtc att 1301Glu Cys Leu Lys Asp Glu Asp Phe Ile Pro Leu Ala Glu Pro Val Ile410 415 420ggt cga gat ggg tcg gtc atc aac gag gtc cgg atc acg aaa gga acg 1349Gly Arg Asp Gly Ser Val Ile Asn Glu Val Arg Ile Thr Lys Gly Thr425 430 435atg gtc atg ctt ccg ttg ttc aac atc aat cgt tca aag ttc att tat 1397Met Val Met Leu Pro Leu Phe Asn Ile Asn Arg Ser Lys Phe Ile Tyr440 445 450 455gga gaa gat gca gaa gaa ttc aga ccg gag agg tgg ctt gag gac gta 1445Gly Glu Asp Ala Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Trp Leu Glu Asp Val460 465 470aca gac tcg ctc aac agt att gaa gca ccc tat gga cac cag gcg agc 1493Thr Asp Ser Leu Asn Ser Ile Glu Ala Pro Tyr Gly His Gln Ala Ser475 480 485ttt atc tct gga ccc aga gct tgc ttt ggt tgg cga ttt gct gtc gcc 1541Phe Ile Ser Gly Pro Arg Ala Cys Phe Gly Trp Arg Phe Ala Val Ala490 495 500gag atg aag gcc ttc ttg ttt gtc act ctc cgt cgg gtc cag ttc gag 1589Glu Met Lys Ala Phe Leu Phe Val Thr Leu Arg Arg Val Gln Phe Glu505 510 515ccc atc atc tct cat cca gag tac gag cac atc acc ttg atc att tcc 1637Pro Ile Ile Ser His Pro Glu Tyr Glu His Ile Thr Leu Ile Ile Ser520525 530535cgt cct cga atc gtt ggt aga gag aag gag ggg tac cag atg cgt ttg 1685Arg Pro Arg Ile Val Gly Arg Glu Lys Glu Gly Tyr Gln Met Arg Leu540545 550cag gtc aag ccg gtc gaa tga gttgattctt catatgttaa gagaagttct 1736Gln Val Lys Pro Val Glu555atatctgaga atgtgtgact aggacaatgc cttctttgta tcgatttgtt tctcataccc 1796gggcaggcgc tatgacttct acgtcgtcta tcgtcgctct ggactctctt cttaccctat 1856atattattcc atccgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagcggc cgctcgagcc 1916ggctcgtgccgaattc1932<210>3<211>3969<212>DNA<213>Phaffia rhodozyma<220><221>5’UTR<222>(517)…(518)<223>實驗<220><221>外顯子<222>(535)..(652)<220><221>內(nèi)含子<222>(653)..(734)<220><221>外顯子<222>(735)..(783)<220><221>內(nèi)含子<222>(784)..(898)<220><221>外顯子<222>(899)..(1015)<220><221>intron<222>(1016)..(1087)<220><221>exon<222>(1088)..(1179)<220><221>intron<222>(1180)..(1302)<220><221>exon<222>(1303)..(1517)<220><221>intron<222>(1518)..(1600)<220><221>exon<222>(1601)..(1634)<220><221>intron<222>(1635)..(1723)<220><221>exon<222>(1724)..(1866)<220><221>intron<222>(1867)..(1939)<220><221>exon<222>(1940)..(1999)<220><221>intron<222>(2000)..(2081)<220><221>exon<222>(2082)..(2181)<220><221>intron<222>(2182)..(2257)<220><221>exon<222>(2258)..(2354)<220><221>intron<222>(2355)..(2431)<220><221>exon<222>(2432)..(2542)<220><221>intron<222>(2543)..(2618)<220><221>exon<222>(2619)..(2652)<220><221>intron<222>(2653)..(2742)<220><221>exon<222>(2743)..(2814)<220><221>intron<222>(2815)..(2962)<220><221>exon<222>(2963)..(3050)<220><221>intron<222>(3051)..(3113)<220><221>exon<222>(3114)..(3171)<220><221>intron<222>(3172)..(3247)<220><221>exon<222>(3248)..(3321)<220><221>intron<222>(3322)..(3398)<220><221>exon<222>(3399)..(3423)<220><221>intron<222>(3424)..(3513)<220><221>exon<222>(3514)..(3700)<220><221>polyA_site<222>(3865)..(3866)<223>EXPERIMENTAL<400>4cggaccgaag cctcgccagc agttgatcaa gcgaaccaag ccgaacaatc ctggcgcgcc 60tggaggagcg ggagcgggag gagcagcagg tgatgcatcg ggtggacaga atcagtagtg 120tgtgtgtatg tgtgtagtgt agttgggttg tcccatgtgc ttcttcttat catcatcatt 180tctttaaaat ctctacattg aatgtttacc ggaacgggct ttgatgatac tacggaccac 240gttgtgtaac cagttcgatt gagattacga ttagatagcc gatccgtcga tcagatctcg 300atctagagcg acatctggct cgatcggtcc ttgccgaaaa tcagggcacc gatcagggca 360gaggaacgcc gaggccgaac gagacagaca caccatcatc atcagccatg tcttttttgt 420gatcgttttt acatactacc cgtcgattct aaccttcttt cttcttctct tgccatcttt 480gcattctcta tctcgtgtaa catcgatccg attcttgcca cctactttct ccat atg 537ttc atc ttg gtc ttg ctc aca ggt gct tta ggc ctg gct gct ttc tca 585tgg gca tcc ata gcg ttc ttc agt ctt tac ctc gct ccg agg cga tct 633tca ctg tat aac ctt cag g gtaagaattg agctctggaa tcatgcttgt682gtaaatccta taatctcatt catcctattc ctcttcttca tcctctcttc ag gc ccg 739aat cat acc aac tac ttt aca ggc aat ttt tta gac atc ctc tc783gtgagttttc atcattggct cagtcgtcca atcttaacga tcatcgctaa cgacctttcg 843gacgcgttct tctttctatg tgaaatctga tctttggttt gttacgagag cacag a899gct cgt aca ggt gaa gag cat gcg aag tac aga gaa aaa tac gga agc 947acc ctc cgg ttt gct ggg atc gct gga gca ccc gtc ttg aac tcg acc 995gat ccg aaa gtc ttc aac ca gtttgtccat ccgaaccctc atcctcctct 1045gctgatcaat tcaactgtag ttaacgcact ttgaatggac ag t gtg atg aaa gaa 1100gcc tac gac tat ccg aaa cct ggt atg gcc gct cga gtg ctc aga att 1148gct acc gga gat ggt gtt gtt acg gcg gaa g gtgcttttca agttctctta 1199tatcacatct aatccactcg gcgcgattga actcaacatt tctgacgagc ctgtcacctt 1259gttttcactt catggtctcg gtgcatcttg tctcatctca tag gt gaa gct cat1313aag cga cat cga agg atc atg atc ccc tct ctg tcc gct cag gcc gtt 1361aag tcg atg gtc cca att ttc tta gaa aaa ggt atg gaa ctt gtc gac 1409aag atg atg gag gat gcg gct gag aag gat atg gcc gtg gga gag tcg 1457gcc ggt gaa aag aag gca acc aga ctc gag acc gaa gga gtc gat gta 1505aag gat tgg gtc gtgagtaccc gcctattcct tcaccttgat ggacgaagca 1557tatcaaggaa aggttcattg actgacaaac actatcttac cag ggt cga gct act 1612ctg gac gtc atg gct ctt gca g gtcagtctac tctctcttat aaatgctcca1664catatgtatg catgtactga catgctcttc ctatattcga tacgacgtca tatgtccag 1723ga ttt gac tat aag agc gac tcg ctc cag aac aag acc aat gag ctc1770tat gtc get ttt gtc gga ctt acc gat ggg ttt gct cct acc ttg gac 1818tcg ttc aag gct atc atg tgg gat ttt gta cct tac ttc cga act atg 1866gtatgtctgc cattctttga tatccaaaga ttatggatag gttacttgct aaaatttcac 1926ctatcgtgaa cag aaa cgg aga cat gag ata cct ttg act caa gga tta1975gca gtt tcc cga cga gtt ggg atc gtaagtgcca gatcaagcct ctctgaatat 2029tcttggtcat catcttaacc tcctaggctc attcatccat ggtgcgcaat ag gag ctt 2087atg gag caa aag aag cag gcc gtg ctt ggc tca gct tcc gat cag gct 2135gtt gat aaa aag gat gtt caa ggt cgg gat atc cta agt ctc cta g 2181gttagtaacg tttttaaacg tatatacaga gcggcgacat tctttccctg acaactgtca 2241acatgctcgt tactag tg aga gca aac atc gcc gcc aac ctg cct gaa tct 2292caa aag ctg tcc gat gag gag gta ctc gct cag atc agt aac ctg tta 2340ttt gct gga tat ga gtgtgtatcc tttcccctct ctatccttag ctgattaaaa2394gcactaatag aggtctttat gtttcctgtt tgatcag a act tct tcg aca gtc2447ttg aca tgg atg ttt cac cga ctc tca gaa gac aaa gcc gtt cag gat 2495aaa ctt cga gaa gaa att tgt cag atc gac acg gat atg cct acg ct2542gtgaggatgt ttttgatgct aaattacttc ttcttgcaaa tgactaaaac ggccttccat 2602tcttgatcca ttttag a gac gaa ctt aat gcg ttg cct tat ctc gaa gcg 2652gttggttctc gattcttggt cttgtcttcc aaatacaata cggattattg ctcatctgat 2712ttgcgtctac gggctgtgga atttaactag ttt gtt aag gag tct ctt cgt cta 2766gac cct cct agt ccg tat gct aac cgt gaa tgc tta aag gat gaa gac 2814gtatgttggc ttcatcacgc ataattttca tttcatattc ctttgtacat acgcatacag 2874gctgaccgag ctcaaattcc ggcttcctct tctgtgcttc tttttctggc ctttcttatc 2934ttcattcttc aaccaaaatt tgtcacag ttc atc cca ctt gcc gag cct gtc2986att ggt cga gat ggg tcg gtc atc aac gag gtc cgg atc acg aaa gga 3034acg atg gtc atg ctt c gtaagttttc ctttatttca tctcgtccat gaaatagttt 3090ctgatagacg cggaccaatt cag cg ttg ttc aac atc aat cgt tca aag ttc 3142att tat gga gaa gat gca gaa gaa ttc ag gtacaattcg ttttctttta 3191aaagccaatc ggtttcgtat cgtaattgac cgggctctct tttaatttct cgaaag a 3248ccg gag agg tgg ctt gag gac gta aca gac tcg ctc aac agt att gaa 3296gca ccc tat gga cac cag gcg agc t gtatgtttta ttgattttat 3341ctttgtgaat tttgcaaaac gttgaacttc gcgcttccct tgttgttgaa atcccag tt 3400atc tct gga ccc aga gct tgc tt gtaagtttct tctcatctgg cgccttagca 3453gtatccgatc agccatctag ttctttgtac gattgtttct gactctctcg actttcgcag 3513t ggt tgg cga ttt gct gtc gcc gag atg aag gcc ttc ttg ttt gtc act 3562ctc cgt cgg gtc cag ttc gag ccc atc atc tct cat cca gag tac gag 3610cac atc acc ttg atc att tcc cgt cct cga atc gtt ggt aga gag aag 3658gag ggg tac cag atg cgt ttg cag gtc aag ccg gtc gaa tga 3700gttgattctt catatgttaa gagaagttct atatctgaga atgtgtgact aggacaatgc 3760cttctttgta tcgatttgtt tctcataccc gggcaggcgc tatgacttct acgtcgtcta 3820tcgtcgctct ggactctctt cttaccctat atattattcc atccgtctgt atatttgtct 3880atcacgacgt ctgtgtcgtc aactcaatat tcagcctctt catgcttctg tgtctccata 3940gatgtgatct tcatgtttgt cgactgcag3969
<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于在大腸桿菌中表達AST基因的有意義引物<400>4gttcaaagtt catttatgga 20<210>5<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于在大腸桿菌中表達AST基因的反義引物<400>5ggatcctcag tggtggtggt ggtggtgttc gaccggcttg acctgca47<210>6<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于在大腸桿菌中表達修飾的AST基因的5’有意義引物<400>6catatgcacc accaccacca ccacctgtat aaccttcagg ggccc 45<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于在大腸桿菌中表達修飾的AST基因的5’反義引物<400>7gtaacaacac catctccggt 20<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于在大腸桿菌中表達修飾的AST基因的3’反義引物<400>8ggatcctcaa ctcattcgac cggctt26<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于克隆AST基因的基因組行走引物<400>9tagagagaag gaggggtacc agatgc26<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于克隆AST基因的終止子區(qū)的反義引物<400>10ccccggattg tggagaaact 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于克隆基因組AST基因的有意義引物<400>11atgttcatct tggtcttgct20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于克隆基因組AST基因的反義引物<400>12acgtagaagt catagcgcct20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于AST基因的RT-PCR的有意義引物<400>13tttgactcaa ggattagcag20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于AST基因的RT-PCR的反義引物<400>14tgtcttctga gagtcggtga 20<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于克隆TPI基因的簡并有意義引物<400>15mgnacnttyt tygtnggngg naay 24<210>16<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于克隆TPI基因的簡并反義引物<400>16gcnccnccna cnarraancc rtcnacrtc29<210>17<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于克隆TPI終止子的初級行走引物<400>17gcttacctcg cttccaacgt ttcccag 27<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于克隆TPI終止子的嵌套行走引物<400>18ggatctgtct ctgcctccaa ctgcaag27<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于克隆TPI啟動子的初級行走引物<400>19gggtcaatgt cggcagcgag aagccca27<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于克隆TPI啟動子的嵌套行走引物<400>20atgtactcgg tagcactgat caagtag27<210>21<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于構(gòu)建TPI啟動子盒子的有意義引物<400>21gcggccgcat ccgtctcgcc atcagtct 28<210>22<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于構(gòu)建TPI啟動子盒子的反義引物<400>22cctgcaggtc tagagatgaa taaatataaa gagt34<210>23<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于構(gòu)建TPI終止子盒的有意義引物<400>23cctgcaggta aatatatcca gggattaacc ccta34<210>24<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于構(gòu)建TPI終止子盒子的反義引物<400>24ggtacccgtg cgcagtcgac cgagacat 28<210>25<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于克隆AMY基因的簡并有意義引物<400>25gaytayathc arggnatggg nttyrmngcn athtg 35<210>26<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于克隆AMY基因的簡并反義引物<400>26tgytcngtnc crtartadat datnggdatn ccrtc35<210>27<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于構(gòu)建部分AMY盒子的有意義引物<400>27ccgcggcatt gatacctcta ccccgt 26<210>28<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于構(gòu)建部分AMY盒子的反義引物<400>28gcggccgcct gcaatcctgg atccaccg28<210>29<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于構(gòu)建AST盒子的有意義引物<400>29tctagaatgt tcatcttggt cttgctca28<210>30<211>28
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于構(gòu)建AST盒子的反義引物<400>30cctgcaggtc attcgaccgg cttgacct28<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述通過PCR分析證實在AMY基因座上的整合的有意義引物<400>31ctctcctgtt cacaaaaaca 20
權(quán)利要求
1.一種分離的DNA，所述DNA含有編碼一種酶的核苷酸序列，所述的酶具有優(yōu)選在P.rhodozyma中催化β胡蘿卜素到蝦青素的反應(yīng)的蝦青素合成酶的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的DNA，它的特征是(a)所說的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的所說的酶，或(b)所說的核苷酸序列編碼選自(i)等位基因變體或(ii)具有一個或多個氨基酸的添加、插入、缺失和/或取代但仍然具有相同類型的酶活性的酶的所說酶的變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的DNA，其特征在于所說的核苷酸序列是(i)SEQ ID NO2中表示的核苷酸序列；(ii)由于遺傳密碼的簡并性，編碼具有與所述核苷酸序列(i)編碼的相同的氨基酸序列的蝦青素合成酶的核苷酸序列；和(iii)在標(biāo)準雜交條件下，與來自(i)或(ii)的所述核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的DNA，其特征在于所說的核苷酸序列是(i)SEQ ID NO3中表示的核苷酸序列；(ii)由于遺傳密碼的簡并性，編碼具有與所述核苷酸序列(i)編碼的相同的氨基酸序列的蝦青素合成酶的核苷酸序列；和(iii)在標(biāo)準雜交條件下，與來自(i)或(ii)的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列。
5.一種載體或質(zhì)粒，所述的載體或質(zhì)粒含有如權(quán)利要求1到4的任何一個所要求保護的分離的DNA。
6.一種宿主細胞，所述的宿主細胞是由如權(quán)利要求1到4的任何一個所要求保護的分離的DNA或如權(quán)利要求5要求保護的載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的。
7.一種多肽，所述多肽是由如權(quán)利要求1到4的任何一個要求保護的分離的DNA編碼的。
8.一種用于生產(chǎn)具有蝦青素合成酶活性的多肽的方法，該方法包括在指導(dǎo)所說的酶的生產(chǎn)的條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求5中要求保護的轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
9.一種用于生物生產(chǎn)蝦青素的方法，該方法包括向合適的宿主生物體中導(dǎo)入一個或多個如權(quán)利要求1到4的任何一個要求保護的分離的DNA，在指導(dǎo)生產(chǎn)蝦青素的條件下培養(yǎng)所獲得的生物體，并且從培養(yǎng)物中回收蝦青素。
10.一種用于生產(chǎn)蝦青素的方法，該方法包括在含有合適的再構(gòu)成膜的合適的反應(yīng)混合物中，在有合適的電子供體存在下，將β胡蘿卜素與具有蝦青素合成酶活性的多肽接觸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的多肽以再構(gòu)成膜的形式存在，而所述再構(gòu)成膜是從生物膜、如微粒體或線粒體膜制備的。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的多肽的再構(gòu)成的人工膜、如脂質(zhì)體的形式存在。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所說的電子供體是可以還原其反應(yīng)中心的合適的電子供體、如細胞色素P450還原酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及對從β胡蘿卜素制備蝦青素有用的遺傳物質(zhì),比如具有蝦青素合酶活性的多肽、編碼蝦青素合酶的DNA片段,重組生物體等。這些新的遺傳物質(zhì)可以來源于Phaffia rhodozyma。本發(fā)明還提供了一種用于生產(chǎn)蝦青素的方法。
文檔編號C12N5/10GK1266101SQ0010375
公開日2000年9月13日 申請日期2000年3月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月9日
發(fā)明者端野立夫, 小島一之, 世戶口豐 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司