專利名稱：粘紅酵母乙酰輔酶a羧化酶基因及其克隆、功能驗(yàn)證方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因，本發(fā)明還涉及該基因編碼的蛋白質(zhì)、該基因的克隆方法和功能驗(yàn)證方法以及該基因在轉(zhuǎn)基因油料作物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙酰輔酶A 羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC) (EC 6. 4. I. 2)是催化脂肪酸合成代謝第一步反應(yīng)的限速酶，將乙酰輔酶A羧化生成丙二酰單酰輔酶A，是生物素依賴性酶。該酶存在于大多數(shù)生物組織中，包括細(xì)菌、古菌、真菌、酵母、植物、動(dòng)物和人類。可分為4大類。乙酰輔酶A羧化酶第一大類為多亞基型ACC，即異質(zhì)型，存在于細(xì)菌、雙子葉植物和非禾本科單子葉植物的質(zhì)體中。Escherichia coli的ACC是第一類中的典型代表，由四個(gè)亞基組成，即生物素羧化酶(biotin carboxylase, BC)、生物素羧基載體蛋白(biotin carboxyl carrier protein,BCCP)以及羧基轉(zhuǎn)移酶(carboxyltransferase, CT)的 2 個(gè)亞基α-CT和β-CT。這些亞基結(jié)合在一起形成ACC全酶，可能以(BC)2(BCCP)4(CTa，(Τβ)2 形式存在。第二大類ACC為多功能型ACC，即同質(zhì)型，人類和大多數(shù)真核生物的ACC屬于這一類。此類ACC單體的分子質(zhì)量在200kD以上，BC、BCCP、CT功能域依次存在于一條多肽鏈上。ACC在植物中的分類與定位存在兩種特殊情況，如油菜的葉綠體中同時(shí)含有第一類和第二類ACC，而禾本科植物的質(zhì)體和胞質(zhì)中ACC均屬于第二類。此外,在天藍(lán)色鏈霉菌和谷氨酸棒桿菌中發(fā)現(xiàn)的ACC由a和β兩個(gè)亞基組成，a亞基包含BC和BCCP兩個(gè)功能域，β 亞基包含CT功能域，此為第三類ACC。第四類ACC從古細(xì)菌Metallosphaera sedula中發(fā)現(xiàn)，與異質(zhì)型ACC不同之處為CT由一個(gè)亞基組成。近年來隨著化學(xué)燃料的不斷減少，利用生物組織合成生物能源的方法備受關(guān)注。由于很多油脂微生物產(chǎn)油量極高，人們廣泛利用油脂微生物，如酵母、真菌等作為單細(xì)胞油脂加工廠(Chisti Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol Adv, 2007, 25(3) :294-306)。已報(bào)道的產(chǎn)油微生物以酵母菌和霉菌類居多，其中薛飛燕等(2009， 工業(yè)生物技術(shù)在資源與能源領(lǐng)域應(yīng)用發(fā)展研討及成果交流會論文集)通過對萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、純頂螺旋藻(Spirulina platensi)、釀酒酵母 (Saccharomymyces cerevisiae)和粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)四種產(chǎn)油微生物的研究發(fā)現(xiàn)，粘紅酵母的油脂組成與生物柴油原料油很相似，且生物量在四種微生物中為最高，如果可以進(jìn)一步提高菌體油脂的含量，則可能達(dá)到生物柴油原料油大量生產(chǎn)的要求，所以利用其開辟一條生產(chǎn)生物柴油的新途徑應(yīng)該是可行的，有發(fā)展前景的。而且粘紅酵母培養(yǎng)周期中油脂含量和油脂含率達(dá)到最優(yōu)值所用的時(shí)間相同，這有利于培養(yǎng)條件的優(yōu)化。同時(shí)隨著基因工程的興起，人們可以將油脂微生物中優(yōu)良的ACC基因克隆到油菜、大豆等油料作物中，從而提高油料作物油脂的品質(zhì)和含量(Davis MS, Solbiati J, Cronan JE. Overproduction of acetyl-CoA carboxylase activity increases therate of fatty acid biosynthesis in Escherichia coli. J Biol Chem,2000,275(37) 28593-28598)?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)中想知道一個(gè)酶是否有功能有活性通常都是測定其酶活，乙酰輔酶A 羧化酶活性測定的方法主要有放射性同位素標(biāo)記法、氧化偶聯(lián)法和中間產(chǎn)物法。放射性同位素標(biāo)記法基于如下反應(yīng)
Mg2f/Accase、
Acetyl-CoA+H14C03-+ATP^14[C]Malonyl-CoA+ADP+Pi反應(yīng)PH為8.0-8.5?；钚詼y定反應(yīng)結(jié)束后通過加酸、加熱除去未反應(yīng)的 [H14C03]-，終產(chǎn)物是對酸、對熱穩(wěn)定的14 [C]MalonyI-CoAJf 14 [C]Malonyl-CoA進(jìn)行熒光標(biāo)記，采用KC18F反相層析法進(jìn)行檢測，并通過測定14[C]Malonyl-CoA的含量對乙酰輔酶 A羧化酶活性進(jìn)行評價(jià)。該方法最大的優(yōu)點(diǎn)是檢測周期短、檢測靈敏度高，因此該方法是目前乙酰輔酶A羧化酶活性測定的主要方法，但放射性同位素標(biāo)記法需要昂貴的標(biāo)記試劑， 同時(shí)放射性對境造成的污染以及廢液的處理也較為復(fù)雜，因此在使用時(shí)需要特殊的防護(hù)措施，為實(shí)驗(yàn)操作帶來一定的困難。氧化偶聯(lián)法和中間產(chǎn)物法的原理相似，均是借助反應(yīng)終產(chǎn)物ADP和Pi與PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)偶聯(lián)反應(yīng)生成易檢測的NAD+。此類檢測方法檢測周期短，試劑也較為便宜，但反應(yīng)步驟過多、中間產(chǎn)物復(fù)雜、終產(chǎn)物量少，影響了其靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因以及該基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因的克隆方法。將一個(gè)空載體和一個(gè)含有外源基因功能域的重組質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)入表達(dá)細(xì)胞里，如果該基因表達(dá)且重組菌株的脂肪酸含量提高了，則可證明該外源基因的表達(dá)產(chǎn)物有活性。鑒于粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因核苷酸序列較長，難以進(jìn)行全長表達(dá)且不利于在植物轉(zhuǎn)基因工程的應(yīng)用，因此，本發(fā)明的第三個(gè)目的是根據(jù)粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶含有三個(gè)功能域，將這三個(gè)功能域進(jìn)行分別表達(dá)和共表達(dá)，比較重組菌株的脂肪酸含量進(jìn)而驗(yàn)證該基因的功能。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因在轉(zhuǎn)基因油料作物中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所
/Jn ο本發(fā)明的乙酰輔酶A羧化酶基因有兩個(gè)內(nèi)含子，分別位于42_147bp和315_677bp。 乙酰輔酶A羧化酶的BC功能域位于198-1722bp，BCCP功能域位于1888_2331bp，CT功能域位于4828_6456bp。所述基因來自粘紅酵母(Rhodotorula glutinis),將該基因命名為 RgACCase0所編碼的蛋白質(zhì)命名為RgACCase蛋白質(zhì)。將其序列在NCBI上比對后發(fā)現(xiàn)，此序列未發(fā)表且沒有進(jìn)行功能注釋。粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因的克隆方法，包括以下步驟(I)粘紅酵母總DNA的提?。?2)利用兩對簡并引物IN-F/FY-R、QK-F/WG-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物克隆到載體PMD18-T上，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)，獲得粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因的部分保守序列；(3)利用染色體步移法獲得粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因的未知序列；(4)通過對擴(kuò)增序列的拼接獲得粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因的全長序列，所述的簡并引物IN-F/FY-R、QK-F/WG-R分別為QK-F CAGAAGATYATYGAGGAGGC ；WG-R ACVGAGAAGTAACCCCA ；IN-F ATYGCBAACAACGGNATYGC ；FY-R GAGCCTCCTCRATRATCTTCTG 粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因的功能驗(yàn)證方法，包括以下步驟(I)提取、消化粘紅酵母總RNA，合成cDNA第一鏈；(2)以合成的cDNA第一鏈為模板，用特異性引物分別克隆粘紅酵母ACC三個(gè)功能域基因；(3)構(gòu)建中間表達(dá)載體 pETDuet-l-NHl、pETDuet-l-NH3、pETDuet-l-NHl-NH3、 pETDuet-l-NH2 ；(4)構(gòu)建共表達(dá)載體 pETDuet-l-NHl-NH2_NH3 ；(5)將上述獲得的所有中間表達(dá)載體及共表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化；(6)測定三個(gè)功能域共表達(dá)時(shí)重組菌株的脂肪酸含量，所述特異性引物為NHl-B-F CGGGATCCATCAACAAGGTCCTCATCGCTAACAACNHl-N-R AATGCGGCCGCGATAAGCTCATCCAGCCANH2-E-F CGGAATTCGACTTCATCTACGAGGGCCANH2-H-R CCAAGCTTAAGGGCCAAGATACCGAGGATNH3-E-F CGGAATTCCCGAGTACCCTCGAGNH3-H-R : CCCAAGCTTAGCATCCTTCCACACAAG。粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶為同質(zhì)性乙酰輔酶A羧化酶，BC、BCCP、CT三個(gè)功能域依次存在于一條多肽鏈上，該酶是控制脂肪酸合成的關(guān)鍵酶。本發(fā)明公開的乙酰輔酶A基因的核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列以及該基因的克隆方法和原核表達(dá)方法，可以廣泛應(yīng)用在油脂微生物的研究以及油料作物轉(zhuǎn)基因工程中。本發(fā)明直接通過重組菌株脂肪酸含量判斷乙酰輔酶A羧化酶三個(gè)功能域的功能， 克服了放射性同位素標(biāo)記法中容易污染環(huán)境、標(biāo)記試劑昂貴以及操作復(fù)雜等缺陷，也克服了其他方法中步驟多、中間產(chǎn)物復(fù)雜等造成的靈敏度低等缺陷。


圖I為簡并PCR擴(kuò)增粘紅酵母ACC基因部分序列，A :利用引物對QK-F/WG-R進(jìn)行 PCR擴(kuò)增的結(jié)果；B :利用引物對IN-F/FY-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，LaneM DL2000 Maker。圖2為粘紅酵母總RNA的提取。
5
圖3為粘紅酵母ACC三個(gè)功能域cDNA序列的擴(kuò)增，泳道M DL2000Marker ;泳道I : BC功能域cDNA ;泳道2 =BCCP功能域cDNA ;泳道3 CT功能域cDNA。圖4為載體pETDuet-1-NHl的構(gòu)建。圖5為載體pETDuet-l_NH2的構(gòu)建。圖6為載體pETDuet-l_NH3的構(gòu)建。圖7 為載體 pETDuet-l-NHl_NH3 的構(gòu)建。圖8 為載體 pETDuet-l-NHl-NH2_NH3 的構(gòu)建。圖9為粘紅酵母ACC三個(gè)功能域共表達(dá)的SDS-PAGE圖，泳道1、3、5 :三個(gè)重組表達(dá)菌株；泳道2、4、6 :三個(gè)對照菌株。泳道M :蛋白Marker，箭頭代表目的蛋白所在位置。圖10為氣相色譜分析后不同處理菌株脂肪酸含量的對比結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明做詳細(xì)的描述。實(shí)施例I克隆粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因(I)以粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)為實(shí)驗(yàn)材料,提取基因組DNA。(2)如圖I所示，從數(shù)據(jù)庫中在KEGG數(shù)據(jù)庫中下載不同種類酵母和絲狀真菌的乙酰輔酶A羧化酶氨基酸序列，利用軟件Clustal XI. 83進(jìn)行多序列比對后，選取三個(gè)保守區(qū)域 IANNGA、QKIIEEA、WGYFSV 設(shè)計(jì)了兩對簡并引物 IN-F/FY-R、QK_F/WG-R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。引物如下QK-F CAGAAGATYATYGAGGAGGCWG-R ACVGAGAAGTAACCCCAIN-F ATYGCBAACAACGGNATYGCFY-R GAGCCTCCTCRATRATCTTCTGPCR 體系如下(50uL) :10Xbuffer 5uL,2. 5mM dNTPs 4uL，上下游引物各 luL， EXTaq 酶 0. 5uL (5U/uL)，dd H20 37. 5uL。采用降落 PCR 程序94 °C 預(yù)變性 5min ；其后94 °C lmin, 51 V lmin,每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)溫度降低O. 5°C,72°C lmin, 11個(gè)循環(huán)；然后 940C lmin, 460C lmin，72°C lmin，19 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0將擴(kuò)增得到的保守區(qū)片段連接pMD18-T，4°C過夜，按照pMD18_T載體試劑盒操作， 說明書連接體系如下目的片段3uLpMD18T-vector IuLSolution I 5uLddH20 IuL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞后，采用藍(lán)白斑篩選法篩選陽性克隆子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的菌落進(jìn)行測序，獲得粘紅酵母部分保守序列。(3)分別用四種平末端限制性內(nèi)切酶EcoR V、Pvu II、Dra I、Stu I消化基因組 DNA以構(gòu)建Genome walking酶切文庫,酶切體系如下基因組DNA
限制性內(nèi)切酶
I Ox限制性內(nèi)切酶Buffer
25 uL (O. I ug/uL) 8 uL (10 units/uL)
10 uL
ddH2057 uL純化后的酶切產(chǎn)物與Genome walker Adaptor相連,體系如下
純化后的酶切產(chǎn)物
4 uL
Genome walker Adaptor (25 uM)
9
IOxligation buffer T4 DNA ligase (6 units/uL)
UL
5
ο·
UL
6以適當(dāng)稀釋的Genome walking文庫DNA為模板,用引物API和外側(cè)特異性引物進(jìn)行首輪 PCR，體系如下:DNA 酶切文庫 luL, 10XLA buffer5uL, 2. 5mM dNTPs 4uL，IOuM 夕卜側(cè)引物 luL，APl luL, LA Taq 酶 0. 5uL(5U/uL)，dd H20 37. 5uL ;再以適當(dāng)稀釋的首輪 PCR 產(chǎn)物為模板，用引物AP2和內(nèi)側(cè)特異性引物進(jìn)行次輪的巢式PCR，體系同前。瓊脂糖凝膠電泳回收適當(dāng)大小的特異性巢式PCR產(chǎn)物，測序驗(yàn)證。引物如下API GTAATACGACTCACTATAGGGC 外側(cè)接頭引物AP2 ACTATAGGGCACGCGTGGT內(nèi)側(cè)接頭引物將染色體步移得到的片段序列拼接獲得了粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因的全長序列。實(shí)施例2粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因三個(gè)功能域的克隆和共表達(dá)(I)如圖2所示，用E. Z. N. A. Yeast RNA Kit試劑盒提取粘紅酵母總RNA0(2)參照 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書首先用 DNase I 消化總 RNA,體系如下RNA lug, IOXDNase I reaction buffer with MgC12 luL, DEPC Water 加至 9uL，DNase I luL。總體積 10uL。37°C溫育 30min，加入 luL25mM EDTA65°C IOmin 終止反應(yīng)。取lug總RNA為模板，加入oligo(dT)18作為反轉(zhuǎn)錄引物，加DEPC處理水至 12uL后，輕微混勻，65°C溫育5min,短暫冰浴。依次加入下列組分5XReaction Buffer 4uL, Ribolock RNase Inhibitor(200u/uL)luL,IOmM dNTP Mix 2uL, RevertAid M-MuL V Reverse Transcriptase (200u/uL) luL。輕微混勻。42°C lh。72°C 5min 終止反應(yīng)。合成的 cDNA第一鏈立即使用或_70°C備用。如圖3所示，以合成的cDNA第一鏈為模板，用特異性引物分別克隆粘紅酵母ACC 三個(gè)功能域基因。體系同前2. 2. 3。擴(kuò)增條件如下94°C 3min ；94°C 30s, 45°C 45s, 72°C 2min 進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，再按94°C 30s, 58°C 45s, 72°C 2min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。 引物如下NHl-B-F CGGGATCCATCAACAAGGTCCTCATCGCTAACAACNHl-N-R AATGCGGCCGCGATAAGCTCATCCAGCCA
NH2-E-FCGGAATTCGACTTCATCTACGAGGGCCA
NH2-H-RCCAAGCTTAAGGGCCAAGATACCGAGGAT
NH3-E-FCGGAATTCCCGAGTACCCTCGAG
NH3-H-RCCCAAGCTTAGCATCCTTCCACACAAG
(3)首先，用Nde I和EcoR V分別雙酶切表達(dá)載體pETDuet-Ι和
PMD-18T-GBD-NH1,回收帶粘性末端的pETDuet_l和GBD-NH1，兩者在DNA Ligase的作用下 16°C過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌宿主細(xì)胞DH5a。菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。 將重組質(zhì)粒命名為pETDuet-1-NHl (如圖4所示)。用EcoR I和Not I分別雙酶切表達(dá)載體pETDuet-Ι和pMD-18T-GBD-NH3，回收帶粘性末端的pETDuet_l和GBD-NH3，用上述相同的方法構(gòu)建載體pETDuet-l-NH3 (如圖6所示)。然后用EcoR I和Not I分別雙酶切表達(dá)載體 pETDuet-1-NHl 和 pMD-18T-GBD_NH3，回收帶粘性末端的 pETDuet-1-NHl 和 GBD-NH3， 用上述相同的方法構(gòu)建載體pETDuet-l-NHl-NH3 (如圖7所示)。用Not I和Afl II分別雙酶切 pETDuet-Ι 和 pMD-18T-GBD-NH2，構(gòu)建載體 pETDuet-l_NH2 (如圖 5 所示)。如圖8所示，以表達(dá)載體pETDuet-l_NH2為模板，采用引物T7-pDuet-bccp-f/ T7-pDuet_bccp-r 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增(T7-pDuet-bccp-f ataagaatgcggccgctaatacgact cactatagggga ；T7-pDuet~bccp-r aatccccttaagttaaagggccaagataccgaggat) , _ ^lJ 片段GBD-NH2-2帶上一個(gè)T7啟動(dòng)子序列，最后將帶有Not I和AfI II粘性末端的 GBD-NH2-2連接到帶相同粘性末端的pETDuet-l-NHl-NH3上，構(gòu)建獲得的表達(dá)載體命名為 pETDuet-l-NHl-NH2-NH3-2,該表達(dá)載體中每個(gè)目的片段都帶有一個(gè)啟動(dòng)子。(4)將上述獲得的所有中間表達(dá)載體及共表達(dá)載體pETDuet-l-NHl-NH2-NH3分別轉(zhuǎn)化Transetta (DE3)感受態(tài),涂布含50 μ g/mL Amp的LB固體平板,37°C過夜培養(yǎng)。菌落 PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例3測定三個(gè)功能域共表達(dá)時(shí)重組菌株的脂肪酸含量進(jìn)而驗(yàn)證該基因的功倉泛大量誘導(dǎo)表達(dá)重組菌株，離心收集菌體，_80°C冷凍3h，然后抽真空冷凍干燥。采用水浴法(Li et al. , 2006)抽提菌體脂肪酸,步驟如下(I)試劑配制5% (體積百分比)濃硫酸/甲醇溶液；0· 2% (質(zhì)量百分比)BHT/ 甲醇溶液；2.5mg/mL碳十七脂肪酸甲酯/石油醚(90°C _120°C )溶液；O. 9% (質(zhì)量百分比)NaCl/水溶液；(2)將干燥的菌體用研缽研碎后用分析天平稱取50mg加入20mL鉗口頂空瓶中，加入5%濃硫酸甲醇溶液2mL(分兩次加，每次ImL)，將玻棒沖洗干凈后依次向瓶中加入如下試劑0. 2% BHT 溶液 25 μ L,甲苯 300 μ L ；(3)用壓蓋器將頂空瓶用帶聚四氟乙烯墊的鋁蓋封好，將上述混合物輕微晃動(dòng)混勻，然后于恒溫水浴鍋中90-95°C水浴I. 5h提取；(4)提取結(jié)束后取出冷卻至室溫,用啟蓋器啟蓋后加入5 μ L10mg/mL碳二十二脂肪酸甲酯作內(nèi)標(biāo)，再加入O. 9% NaC12mL，稍微振蕩，用3mL正己烷萃取，萃取時(shí)用移液槍取上清液再吹入瓶中，反復(fù)3-4次以保證萃取完全，將上清液轉(zhuǎn)移至IOmL離心管中；(5)得到的萃取物在氮吹儀下吹干，然后用ImL的正己烷溶解定容，渦旋2_3s，再離心(轉(zhuǎn)速4500rpm、時(shí)間5min、溫度4°C )取上清液；
(6)進(jìn)行氣相色譜分析(氣相色譜儀的工作條件FID氫火焰離子化檢測器， HP-INNOWax色譜柱，進(jìn)樣口溫度250°C，分流比10 1，檢測器溫度260°C，色譜柱初溫 210°C,9min,程序升溫20°C /min,升至230°C,并在此溫度下維持8min)每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)，同時(shí)取空載體轉(zhuǎn)化菌株做對照，油脂計(jì)算方法如下
Six#
菌體油脂含量(%)= S2XMSI :總峰面積S2:內(nèi)標(biāo)峰面積N:內(nèi)標(biāo)用量M :菌體質(zhì)量圖10為氣相色譜分析后不同處理菌株脂肪酸含量的對比結(jié)果。表達(dá)不同功能域的重組菌株的脂肪酸含量如圖10所示。圖中的Ck是空載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株，即不含有外源基因的載體pETDuet-Ι轉(zhuǎn)化Transetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞后測的的
脂肪酸含量。
權(quán)利要求
1.粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQID N0:2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因的克隆方法，其特征在于包括以下步驟(1)粘紅酵母總DNA的提??；(2)利用兩對簡并引物IN-F/FY-R、QK-F/WG-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物克隆到載體PMD18-T上，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)，獲得粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因的部分保守序列；(3)利用染色體步移法獲得粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因的未知序列；(4)通過對擴(kuò)增序列的拼接獲得粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因的全長序列，所述的簡并引物IN-F/FY-R、QK-F/WG-R分別為QK-F CAGAAGATYATYGAGGAGGC ；WG-R ACVGAGAAGTAACCCCA ；IN-F ATYGCBAACAACGGNATYGC ；FY-R GAGCCTCCTCRATRATCTTCTG
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因的功能驗(yàn)證方法，其特征在于包括以下步驟(1)提取、消化粘紅酵母總RNA，合成cDNA第一鏈；(2)以合成的cDNA第一鏈為模板，用特異性引物分別克隆粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶的三個(gè)功能域基因；(3)構(gòu)建中間表達(dá)載體pETDuet-l-NHl、pETDuet-l_NH3、pETDuet-l-NHl_NH3、 pETDuet-l-NH2 ；(4)構(gòu)建共表達(dá)載體pETDuet-l-NHl-NH2-NH3 ；(5)將上述獲得的所有中間表達(dá)載體及共表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化；(6)測定三個(gè)功能域共表達(dá)時(shí)重組菌株的脂肪酸含量，所述特異性引物為NHl-B-F CGGGATCCATCAACAAGGTCCTCATCGCTAACAAC NHl-N-R AATGCGGCCGCGATAAGCTCATCCAGCCA NH2-E-F CGGAATTCGACTTCATCTACGAGGGCCA NH2-H-R CCAAGCTTAAGGGCCAAGATACCGAGGAT NH3-E-F CGGAATTCCCGAGTACCCTCGAG NH3-H-R :CCCAAGCTTAGCATCCTTCCACACAAG。
5.權(quán)利要求I所述的粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因在轉(zhuǎn)基因油料作物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因以及該基因編碼的蛋白質(zhì)、該基因的克隆方法和功能驗(yàn)證方法。本發(fā)明粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，所編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明通過測定粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因三個(gè)功能域分別表達(dá)和共表達(dá)時(shí)重組菌株的脂肪酸含量，進(jìn)而驗(yàn)證該基因的功能。本發(fā)明公開的乙酰輔酶A基因的核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列以及該基因的克隆方法和原核表達(dá)方法，可以廣泛應(yīng)用在油脂微生物的研究以及油料作物轉(zhuǎn)基因工程。
文檔編號G01N30/02GK102586289SQ201110396148
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月2日
發(fā)明者喻子牛, 張吉斌, 李潔瓊, 王利兵, 鄭世學(xué) 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)