美國野豌豆高頻再生體系建立的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)栽培生物技術(shù)領域，特別涉及一種美國野豌豆高頻再生體系建立的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]美國野豌豆(Vicia sepium Linn)，植物界，雙子葉植物綱，豆科，多年生草本，多花，是一種良好的蜜源植物，以全草入藥。夏季采，曬干或鮮用。根可以生吃，煮熟后味道更好。種子含油。葉及花果藥用有清熱、消炎解毒之效。植株秀美、花色艷麗，可作觀賞花卉。現(xiàn)蕾期出現(xiàn)較早，這時分枝甚少，莖枝低矮、細嫩柔軟，其營養(yǎng)成分粗蛋白質(zhì)高達26.9%，而此時產(chǎn)草量也高。開春以后，隨著氣溫升高，植株開始迅猛生長，4月14日進入結(jié)莢期，植株高達83.5cm，莖葉雖尚為綠色，這時叩割產(chǎn)草量高，但營養(yǎng)成分卻降低了，粗纖維增加，粗蛋白質(zhì)則降低為18.55%。從植株分枝情況來看，秋播時在結(jié)實期的分枝數(shù)可達30 - 40個，而春播時在結(jié)莢期分枝僅20個左右。因而最適宜收刈時期應在結(jié)莢期，從收刈時期來看也較同屬植物早20天左右，這在南方水稻區(qū)推廣，對緩解前后茬矛盾上是很有利的。在我國南方旱作區(qū)推廣尚可解決收種和牧草的矛盾；因此，野豌豆可望培育成南方農(nóng)田推廣的綠肥新品種。野豌豆莖葉含鈣、磷比較豐富，用作青飼、青貯和調(diào)制干草。美國野豌豆的種植既可以滿足生態(tài)環(huán)境建設的需要，更是促進畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要措施。
[0003]植物的高頻再生體系是以植物幼莖扦插技術(shù)為主要手段，在整個體系上需要保證再生體系的培養(yǎng)能夠完整實施，主要的技術(shù)手段一是選擇恰當植物外植體材料，二是對各階段培養(yǎng)基生根組分的選擇與優(yōu)化。
[0004]專利號為CN102144559A的專利公布了一種扁穗牛鞭草高頻再生體系建立方法，以扁穗牛鞭草幼莖或幼葉為外植體建立高頻再生體系，依照愈傷組織誘導、愈傷組織繼代培養(yǎng)、愈傷組織分化培養(yǎng)、再生苗增殖培養(yǎng)、再生苗生根培養(yǎng)、再生苗煉苗移栽的操作流程建立扁穗牛鞭草高頻再生體系。
[0005]專利號為CN103947548A的專利公布了一種百子蓮高頻再生體系建立的方法，以百子蓮幼小花蕾為外植體建立高頻再生體系。
[0006]雖然目前已有植物愈高頻再生體系研究的報道，但目前關于美國野豌豆高頻再生體系建立的方法還未有研究和專利公布。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種美國野豌豆(Vicia sepium Linn)高頻再生體系建立的方法，該方法重復性好、再生率高，不僅可以迅速地獲得大量優(yōu)質(zhì)的美國野豌豆，還可以為以后用作生物技術(shù)和基因工程方法對植物進行遺傳改良。美國野豌豆的種植也可以滿足生態(tài)環(huán)境建設的需要，更是促進畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要措施。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]美國野豌豆高頻再生體系建立的方法，包括以下步驟:
[0009]I)外植體的選取與處理:選取美國野豌豆的幼莖為外植體，消毒后蘸取愈傷培養(yǎng)基SI ;
[0010]2)生根培養(yǎng):將步驟I)處理后的外植體轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基S2中處理20-26小時；
[0011]3)生苗生根培養(yǎng):將步驟2)處理后的外植體插入生苗生根培養(yǎng)基S3浸拌處理的濕沙基質(zhì)中，置于20-25°C恒溫條件育苗，得到幼苗。
[0012]外植體選取材料幾乎包括了植物體的各個部位，如莖尖、莖段、花瓣、根、葉、子葉、鱗莖、胚珠和花藥等。不同種類的植物以及同種植物不同的器官對誘導條件的反應是不一致的。選取材料時要對所培養(yǎng)植物各部位的誘導及分化能力進行比較，從中篩選出合適的、最易表達全能性的部位作為植體。本發(fā)明選取性美國野豌豆的幼莖為外植體，其生長速度快，繁殖率高，不容易發(fā)生變異，是獲得脫毒苗木的有效途徑。
[0013]進一步，步驟I)所述消毒的處理的試劑包括75%的酒精和0.1%的氯化汞，所述外植體在中0.1 %的氯化汞中消毒時間為4-7分鐘。
[0014]作為一種優(yōu)選，將所述外植體置于75%的酒精中滅菌20-35秒，取出后用無菌水沖洗3次，再浸于0.1 %的氯化汞中滅菌4-7分鐘，取出后用無菌水沖洗4-6次。不同消毒方法對外植體的影響不同，0.1%的氯化汞消毒效果隨滅菌時間的增加而加強，外植體消毒1min污染率為0，消毒7min外植體出現(xiàn)枯死，消毒1min枯死數(shù)量明顯增加。所以本發(fā)明外植體在中0.1 %的氯化汞中消毒時間為4-7分鐘效果較好。
[0015]進一步，步驟I)所述愈傷培養(yǎng)基SI包含蜂蜜原液。蜂蜜原液由于含有高濃度葡萄糖和果糖等單糖，具有較高的滲透壓，可防止植株傷口流失水分，促進傷口愈合的作用。
[0016]進一步，步驟2)所述生根培養(yǎng)基S2包含100-1000mg/L的α -萘乙酸鈉和100-1000mg/L吲哚丁酸鉀的水溶液，pH為5_9。
[0017]a_萘乙酸鈉為生長素類植物生長調(diào)節(jié)劑，是光譜性的植物生長調(diào)節(jié)劑，促進細胞分裂和組織分化，用于果實膨大及塊根塊莖的膨大。誘導根和不定根的形成，用于加快扦插枝條生根和種子發(fā)根。還可以用于保花保果，提高產(chǎn)量，增強抗逆能力等，是一種廣譜、高效、低毒的植物生長調(diào)理劑。吲哚丁酸鉀是一種促生根類植物生長調(diào)節(jié)劑，主要用于插條生根劑，誘導作物形成不定根，具有長效性與專一性的特點，并集中在生長點部位，促進細胞分裂，誘導形成不定根，表現(xiàn)為根多，根直，根粗，根毛多。易溶于水，活性比吲哚乙酸高，穩(wěn)定性好，使用安全。
[0018]進一步，步驟2)所述生根培養(yǎng)基S2包含100_600mg/L的α -萘乙酸鈉和100-600mg/L吲哚丁酸鉀的水溶液，pH為5-9。
[0019]進一步，步驟3)所述生苗生根培養(yǎng)基S3包含100-1000mg/L的α-萘乙酸鈉、100-1000mg/L吲噪丁酸鉀和100-1000mg/L磷酸二氫鉀的水溶液，pH為5-9。
[0020]磷酸二氫鉀是一種培養(yǎng)劑，可用于配制培養(yǎng)基，植物生長需要磷和鉀，磷酸二氫鉀做為緩沖劑，在培養(yǎng)基中可提供增加K和P元素。培養(yǎng)基中含有外植體生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，是組織培養(yǎng)中外植體賴以生存和發(fā)展的基礎。外在組織培養(yǎng)的各個階段，基本培養(yǎng)基都是最重要的因素，因此選擇合適的培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)成功與否的關鍵因素。
[0021]進一步，步驟3)中所述外植體插入基質(zhì)中的lcm。
[0022]進一步，步驟3)所述育苗的日光照度為2000-30001x，時間為16-22天，16小時/天。
[0023]進一步，美國野豌豆高頻再生體系建立的方法，還包括步驟:
[0024]4)將步驟3)所述幼苗進行煉苗培養(yǎng)和移栽。
[0025]進一步，所述煉苗培養(yǎng)的時間為5-15天，所述移栽基質(zhì)為沙土。
[0026]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供了一種美國野豌豆高頻再生體系建立的方法，所建立的美國野豌豆高頻再生體系具有更良好的技術(shù)效果，具有生長繁殖快、重復性高、操作簡單、條件易于控制等特點。在優(yōu)選條件下，上述方法可以通過對各培養(yǎng)階段中培養(yǎng)基組分的優(yōu)化提高美國野豌豆高頻再生體系在各階段的產(chǎn)出率與產(chǎn)物品質(zhì)。試驗數(shù)據(jù)顯示，蘸取SI培養(yǎng)基，再在S2培養(yǎng)基上處理24小時后，插入以S3培養(yǎng)基浸拌處理的濕沙基質(zhì)中1CM，置于20-25°C恒溫條件育苗，10天后生根率可達100%，移栽成活率也可達100%。不僅可以迅速地獲得大量優(yōu)質(zhì)的美國野豌豆，還可以為以后用作生物技術(shù)和基因工程方法對植物進行遺傳改良。美國野豌豆的種植也可以滿足生態(tài)環(huán)境建設的需要，更是促進畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要措施。
【附圖說明】
[0027]圖1為用本發(fā)明方法建立再生體系系統(tǒng)移栽后的美國野豌豆示意圖。
【具體實施方式】
[0028]以下將結(jié)合附圖，對本發(fā)明作詳細的說明。為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。所舉實施例是為了更好地對本發(fā)明的內(nèi)容進行說明，但并不是本發(fā)明的內(nèi)容僅限于所舉實施例。所以，熟悉本領域的技術(shù)人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
對實施方案進行非本質(zhì)的改進和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0029]美國野豌豆高頻再生體系的建立
[0030]材料
[0031](I)植物外植體材料:以美國野豌豆的幼莖為外植體材料。
[0032](2)主要試劑:
[0033]取α-萘乙酸鈉0.1-1g和吲哚丁酸鉀0.l_lg，用少量無水乙醇溶解后，加蒸餾水配成lmg/L的母液，于4°