花葉良姜愈傷再生體系建立的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于園林科學(xué)中觀賞植物組培快繁技術(shù)，具體是花葉良姜愈傷組織再生體系建立的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]花葉良姜(學(xué)名:Alpinia zerumbet ‘Variegata’ )又稱花葉艷山姜、彩葉姜、斑紋月桃等，是姜科山姜屬多年生草本植物?；ㄈ~良姜葉色艷麗，花姿優(yōu)美，花香清純，是非常有觀賞價(jià)值的觀葉觀花植物，是園林綠化工程不可或缺的素材。隨著“美麗中國(guó)”的建設(shè)，花葉良姜在園林中的應(yīng)用日益廣泛、工程用量日益增多。傳統(tǒng)分株繁殖的方法存在增殖系數(shù)低的問題，不是高效的繁殖方法，不能滿足市場(chǎng)的需求。所以，需要研究開發(fā)更加高效的繁殖方法。
[0003]目前，花葉良姜的組織培養(yǎng)主要利用根狀莖和莖尖誘導(dǎo)叢生芽、以芽繁芽的方法進(jìn)行繁殖，仍存在增殖系數(shù)較低的問題。如潘梅.花葉艷山姜莖尖離體快繁技術(shù)花葉艷山姜莖尖離體快繁技術(shù)[J].熱帶生物學(xué)報(bào)，2012 (3): 267-270，以莖尖為外植體誘導(dǎo)叢生芽，增殖倍數(shù)為4.0，生根率為93% ;秦麗鳳，文清嵐，宋西娟.花葉良姜組培生產(chǎn)與栽培管理技術(shù)[J].南方園藝2013，24(5)，以花葉良姜塊莖上開始萌發(fā)的芽為外植體，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)得到叢生芽，再依次經(jīng)過繼代增殖、誘導(dǎo)生根培養(yǎng)得到花葉良姜組培苗，增殖倍數(shù)為3.8倍，生根率為100% ;陳玉梅.花葉良姜組培快繁體系建立的探討[J].中國(guó)科技信息，2014 (12):51-52,以花葉良姜根狀莖為組培外植體，經(jīng)過初代培養(yǎng)后得到無菌芽，把芽再進(jìn)行繼代增殖，得到的繼代再經(jīng)過生根誘導(dǎo)培養(yǎng)，最終得到花葉良姜組培苗，此方法的增殖系數(shù)最高為7.03，有效苗率(苗生根率)為62.13%。但是，未見關(guān)于花葉良姜通過誘導(dǎo)愈傷組織和分化不定芽的途徑進(jìn)行植株再生的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供花葉良姜愈傷組織再生體系建立的方法，克服現(xiàn)有組培育苗技術(shù)增殖系數(shù)低的問題，提高組培育苗增殖系數(shù)，降低育苗成本，滿足市場(chǎng)需要。
[0005]本發(fā)明解決現(xiàn)有技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:
花葉良姜愈傷組織再生體系建立的方法，包括以下步驟:
1)外植體選擇及預(yù)處理:選擇成熟、飽滿的當(dāng)年種子作為外植體，用800倍高錳酸鉀浸種20min后清水沖洗lOmin，用濃硫酸進(jìn)行預(yù)處理5min后清水沖洗30min ；
2)無菌萌發(fā):將預(yù)處理的種子用75%乙醇處理lmin后無菌水沖洗3次，0.1%升汞處理lOmin后無菌水沖洗5次，5%次氯酸鈉處理3min后無菌水沖洗5次，接種于萌芽培養(yǎng)基M0,30天后統(tǒng)計(jì)污染率和萌發(fā)率；
3)愈傷組織誘導(dǎo):當(dāng)植株高1?2cm將根切除，接種于愈傷組織培養(yǎng)基Μ:進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，30天后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率；
4)不定芽分化:將愈傷組織接種于不定芽分化培養(yǎng)基％進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，30天后統(tǒng)計(jì)增殖率；
5)生根培養(yǎng):當(dāng)不定芽高3?4cm時(shí)，接種與生根培養(yǎng)基M3進(jìn)行生根培養(yǎng)，30天后統(tǒng)計(jì)生根率。
[0006]所述的萌芽培養(yǎng)基M。，其成分是:K2S04800mg/L，MgS04.7H20 350mg/L,KH2P04180mg/L，NH4N03600mg/ml，MnS04.4H20 22.5mg/L，Ca (N03) 2.4H20 556mg/L，F(xiàn)eS04.7H20 27.8mg/L，Na2EDTA 37.3mg/L，ZnS04.7H20 8.6mg/L，H3B036.2mg/L，CuS04.5H200.25mg/L，Na2Mo04.2HZ0 0.25mg/L，肌醇 100mg/L，甘氛酸 2.0mg/ml，維生素 Bll.0mg/L，維生素 B60.5mg/L，煙酸 0.5mg/L。
[0007]所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基其成分是通。+1?2mg/L苯噻隆+0.5?lmg/L2，4- 二氯苯氧乙酸。
[0008]所述的不定芽分化培養(yǎng)基M2，其成分是:M(j+l?2mg/L苯噻隆+0.05?0.lmg/L2，4- 二氯苯氧乙酸。
[0009]所述的生根培養(yǎng)基M3，其成分是:1/2Mq+0.5?lmg/L ABT1號(hào)生根粉，所述的ABT1號(hào)生根粉是ABT生根粉系列之一，是中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院研制成功的一種新型廣譜高效植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，市面上有售。ABT1號(hào)生根粉，主要用于難生根植物及珍貴植物的扦插育苗，如紅松、泡桐、銀杏、金花茶、蘋果、柑桔、龍眼、荔枝、玉蘭等。
[0010]與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
1.以莖尖和根狀莖誘導(dǎo)叢芽的增殖率最高達(dá)到7倍，而通過愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的增殖率高達(dá)10倍，提高增殖率，提高效率，降低成本。
[0011]2.外植體選取容易、滅菌效果好。
[0012]3.發(fā)明了萌發(fā)培養(yǎng)基、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、不定芽分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，提供一種新的植株再生的方法。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0014]實(shí)施例1
2014年9月15日，選擇成熟、飽滿的種子作為外植體，用清水漂洗，除去漂浮于水面的種子，挑選100粒種子備用。用800倍高猛酸鉀浸種20min后清水沖洗lOmin，用濃硫酸進(jìn)行預(yù)處理5min后清水沖洗30min。將預(yù)處理的種子用75%乙醇處理lmin后無菌水沖洗3次，0.1 %升萊處理lOmin后無菌水沖洗5次，5%次氯酸鈉處理3min后無菌水沖洗5次，接種于萌芽培養(yǎng)基M。。30天后，外植體污染5粒，污染率為5%，萌芽72粒，萌發(fā)率達(dá)75.79%。植株高l_2cm時(shí)將根切除，接種于含MQ+lmg/L苯噻隆+0.5mg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。30天后，62株產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)86.11%。將愈傷組織接種于含Mo+lmg/L苯噻隆+0.05mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。30天后，愈傷組織產(chǎn)生不定芽共496個(gè)，平均為8個(gè)，增殖率達(dá)8倍。當(dāng)不定芽高3-4cm時(shí)，接種于含1/2Mq+0.5mg/L ABT1號(hào)的培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，30天后，472株生根，長(zhǎng)出3條根，根長(zhǎng)2cm，生根率達(dá)95.16%。
[0015]實(shí)施例2
2014年9月30日，選擇成熟、飽滿的種子作為外植體，用清水漂洗，除去漂浮于水面的種子，挑選100粒種子備用。用800倍高猛酸鉀浸種20min后清水沖洗lOmin，用濃硫酸進(jìn)行預(yù)處理5min后清水沖洗30min。將預(yù)處理的種子用75%乙醇處理lmin后無菌水沖洗3次，0.1 %升萊處理lOmin后無菌水沖洗5次，5%次氯酸鈉處理3min后無菌水沖洗5次，接種于萌芽培養(yǎng)基M。。30天后，外植體污染3粒，污染率為3%，萌芽75粒，萌發(fā)率達(dá)77.32%。植株高l_2cm時(shí)將根切除，接種于含M(j+2mg/L苯噻隆+0.8mg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。30天后，64株產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)85.33%。將愈傷組織接種于含M(j+2mg/L苯噻隆+0.07mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。30天后，愈傷組織產(chǎn)生不定芽共556個(gè)，平均為8.7個(gè)，增殖率達(dá)8.7倍。當(dāng)不定芽高3_4cm時(shí)，接種于含1/2Mq+0.8mg/LABTl號(hào)的培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。30天后，541株生根，長(zhǎng)出4條根，根長(zhǎng)2cm，生根率達(dá)97.30%。
[0016] 實(shí)施例3
2014年10月15日，選擇成熟、飽滿的種子作為外植體，用清水漂洗，除去漂浮于水面的種子，挑選100粒種子備用。用800倍高猛酸鉀浸種20min后清水沖洗lOmin，用濃硫酸進(jìn)行預(yù)處理5min后清水沖洗30min。將預(yù)處理的種子用75 %乙醇處理lmin后無菌水沖洗3次，0.1%升萊處理lOmin后無菌水沖洗5次，5%次氯酸鈉處理3min后無菌水沖洗5次，接種于萌芽培養(yǎng)基M。。30天后，外植體污染2粒，污染率為2%，萌芽78粒，萌發(fā)率達(dá)79.59%。植株高l_2cm時(shí)將根切除，接種于含MQ+1.5mg/L苯噻隆+lmg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。30天后，69株產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)88.46%。將愈傷組織接種于含M(j+1.5mg/L苯噻隆+0.lmg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸的培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。30天后，愈傷組織產(chǎn)生不定芽共695個(gè)，平均為10.07個(gè)，增殖率達(dá)10.07倍。當(dāng)不定芽高3-4cm時(shí)，接種于含l/^Mflmg/LABTl號(hào)的培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。30天后，687株生根，長(zhǎng)出4條根，根長(zhǎng)3cm，生根率達(dá)98.85 %。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.花葉良姜愈傷組織再生體系建立的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)外植體選擇及預(yù)處理:選取健壯、無病蟲害、成熟植株上飽滿的種子作為外植體，用800倍高猛酸鉀浸種20min后清水沖洗lOmin，用濃硫酸進(jìn)行預(yù)處理5min后清水沖洗30min ； 2)無菌萌發(fā):將預(yù)處理的種子用75%乙醇處理lmin后無菌水沖洗3次，0.1%升汞處理lOmin后無菌水沖洗5次，5%次氯酸鈉處理3min后無菌水沖洗5次，接種于萌芽培養(yǎng)基M0； 3)愈傷組織誘導(dǎo):當(dāng)植株高1?2cm時(shí)將根切除，接種于愈傷組織培養(yǎng)基]^進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)； 4)不定芽分化:將愈傷組織接種于不定芽分化培養(yǎng)基％進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)； 5)生根培養(yǎng):當(dāng)不定芽高3?4cm時(shí)，接種于生根培養(yǎng)基％進(jìn)行生根培養(yǎng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述花葉良姜愈傷組織再生體系建立的方法，其特征是，所述的萌芽培養(yǎng)基M。的成分:K2S04 8 00mg/L，MgS04.7Η20 350mg/L，KH2P04 1 80mg/L，NH4N03 6 00mg/L，MnS04.4H20 22.5mg/L，Ca(N03)2.4H20 556mg/L，F(xiàn)eS04.7H20 27.8mg/L，Na2EDTA 37.3mg/L, ZnS04.7H20 8.6mg/L，H3B03 6.2mg/L，CuS04.5H20 0.25mg/L，Na2Mo04.2HZ0 0.25mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，維生素 B1 1.0mg/L，維生素 B6 0.5mg/L，煙酸 0.5mg/L。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述花葉良姜愈傷組織再生體系建立的方法，其特征是，所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基Mi的成分:Mq+1?2mg/L苯噻隆+0.5?lmg/L 2, 4- 二氯苯氧乙酸。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述花葉良姜愈傷組織再生體系建立的方法，其特征是，所述不定芽分化培養(yǎng)基M2的成分:Mq+1?2mg/L苯噻隆+0.05?0.lmg/L 2, 4- 二氯苯氧乙酸。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述花葉良姜愈傷組織再生體系建立的方法，其特征是，所述生根培養(yǎng)基M3的成分:1/2Mq+0.5?lmg/L ABT1號(hào)生根粉。
【專利摘要】本發(fā)明公開了花葉良姜愈傷組織再生體系建立的方法，以種子為外植體，經(jīng)外植體滅菌、無菌萌發(fā)、愈傷組織的誘導(dǎo)、不定芽的分化和生根培養(yǎng)等步驟，建立其高頻高效的再生體系，污染率控制在5%以下，萌發(fā)率達(dá)79.59%，誘導(dǎo)率達(dá)88.46%，增殖率達(dá)10.07倍，生根率達(dá)98.85%。本發(fā)明可為規(guī)?；⒅苣晟a(chǎn)種苗提供一種新、高效的方法，同時(shí)為育種和遺傳轉(zhuǎn)化等基因工程研究奠定基礎(chǔ)。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號(hào)】CN105409768
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510766101
【發(fā)明人】林茂, 王華新, 龔建英, 孫利娜, 黃欣, 李進(jìn)華, 杜鈴, 蔣濟(jì)剛, 鐘程
【申請(qǐng)人】廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院, 南寧市三塘十里長(zhǎng)廊園林花木專業(yè)合作社
【公開日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2015年11月11日