蕎麥aflp反應體系的建立方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種蕎麥的AFLP反應體系的建立方法。上述蕎麥AFLP反應體系的建立方法，通過改進AFLP關鍵步驟的反應條件，適當?shù)卦黾恿顺樘岬拇螖?shù)，既將反應液中的雜質(zhì)去除干凈，又減少蕎麥DNA機械斷裂，提高DNA提取的質(zhì)量；設置的酶切時間可充分地將蕎麥基因組DNA進行酶切；設置的Mg2+濃度既可提高產(chǎn)物特異性DNA的產(chǎn)出率，又避免了非特異性DNA擴增，建立了可靠性好、重復性強、可信度高、方便快速的適用于蕎麥的反應體系，只需極少量的DNA樣品，不需要Southern雜交，不需要預先知道DNA的序列信息。該方法工藝簡單、易于操作，并且產(chǎn)出量高、降低了生產(chǎn)成本。
【專利說明】蕎麥AFLP反應體系的建立方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種蕎麥AFLP反應體系的建立方法及其應用。
【背景技術】
[0002]蕎麥是一種糧藥兼用的經(jīng)濟作物，其營養(yǎng)成分豐富，富含蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等，蕎麥蛋白具有高生物效價，其氨基酸組成合理，富含8種人體必需氨基酸，尤其是精氨酸、賴氨酸、色氨酸和組氨酸的含量較高，所以蕎麥與其他谷類糧食有很好的互補性。蕎麥不僅營養(yǎng)全面，而且富含生物類黃酮、多肽、糖醇和D-手性肌醇等高活性藥用成分，具有降糖、降脂、降膽固醇、抗氧化、抗衰老和清除自由基等功能，蕎麥所含的生物活性成分已引起醫(yī)學界的廣泛關注，并已成為新世紀全球重要的保健食品資源。
[0003]目前在全球范圍內(nèi)，作物的育種工作面臨著由于遺傳基礎日趨狹窄而導致作物品種適應環(huán)境非常脆弱的問題，導致種質(zhì)資源遭受日益短缺，因此拓寬作物遺傳基礎已成為當務之急。近年來由于對蕎麥營養(yǎng)及藥用價值的充分認識，國內(nèi)外開始加強了對蕎麥資源形態(tài)、細胞、生化、分子等各個層面的研究和開發(fā)工作。
[0004]擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)技術以其多態(tài)性高、DNA用量少、無需預知基因組序列信息、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，被認為是最有效的分子標記技術之一，廣泛應用于種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、物種親緣關系研究、遺傳圖譜構建、輔助選擇育種、品種鑒定、QTL分析等多方面的研究。國內(nèi)外利用AFLP技術在水稻、玉米、大豆、小麥、谷子等作物的研究上已經(jīng)廣泛應用，但在蕎麥上的應用還鮮有報道。`
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種條件優(yōu)化、專門針對蕎麥AFLP反應體系的建立方法，其可靠性好、重復性強、可信度高。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供蕎麥AFLP反應體系的應用。
[0007]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實施例的技術方案如下:
[0008]將蕎麥葉片加入CTAB提取液反應0.5~2小時，抽提，得到模板DNA;
[0009]將所述模板DNA與內(nèi)切酶體系混合，在35~38°C下反應I~9小時，得到酶切后的DNA ;其中，所述模板DNA與所述內(nèi)切酶體系的容量比為I~2:~9:8，所述模板DNA的OD260-280
值為1.8~2.0;
[0010]將所述酶切后的DNA與連接體系混合，在16~22°C下反應3~10小時，得到連接后的DNA ;其中，所述酶切后的DNA與所述連接體系的容量比為I~2:4~5 ;
[0011 ] 將所述連接后的DNA與預擴增體系混合，進行第一次PCR反應，得到預擴增的DNA ；其中，所述連接后的DNA與所述預擴增體系的容量比為3~5:15~17 ;
[0012]將所述預擴增后的DNA與選擇性擴增體系混合，進行第二次PCR反應，得到擴增后的特異性DNA ;其中，所述預擴增后的DNA與選擇性擴增體系的容量比為3~5:15~17 ;[0013]其中，所述選擇性擴增體系包含濃度為0.2~1.0mmol/L的第一選擇性引物和濃度為0.2~1.0mmol/L的第二選擇性引物、濃度為O~3.0mmol/L的含Mg2+鹽溶液；其中，所述第一選擇性引物和第二選擇性引物與含Mg2+鹽溶液的容量比為4~6:4~6:5~15。
[0014]以及，一種上述蕎麥AFLP反應體系的建立方法所獲得的蕎麥特異性DNA在優(yōu)化引物篩選、蕎麥育種、蕎麥品種指紋圖譜的繪制、蕎麥遺傳連鎖圖的構建、蕎麥遺傳多樣性的研究等領域的應用。 [0015]上述蕎麥AFLP反應體系的建立方法，通過改進AFLP關鍵步驟的反應條件，適當?shù)卦黾恿顺樘岬拇螖?shù)，既將反應液中的雜質(zhì)去除干凈，又減少蕎麥DNA機械斷裂，提高DNA提取的質(zhì)量；設置的酶切時間可充分地將蕎麥基因組DNA進行酶切；設置的Mg2+濃度既可提高產(chǎn)物特異性DNA的產(chǎn)出率，又避免了非特異性DNA擴增，建立了可靠性好、重復性強、可信度高、方便快速的適用于蕎麥的反應體系，只需極少量的DNA樣品，不需要Southern雜交，不需要預先知道DNA的序列信息。該方法工藝簡單、易于操作，并且產(chǎn)出量高、降低了生產(chǎn)成本。
[0016]正是由于上述蕎麥AFLP反應體系的建立方法所獲得的蕎麥特異性DNA絕大部分為顯性標記，顯示的多態(tài)性信息量也很高，非常適合應用在優(yōu)化引物篩選、蕎麥育種、蕎麥品種指紋圖譜的繪制、蕎麥遺傳連鎖圖的構建、蕎麥遺傳多樣性的研究等領域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明實施例蕎麥AFLP反應體系的建立方法工藝流程示意圖。
[0018]圖2是本發(fā)明實施例中酚-氯仿不同抽提次數(shù)對基因組DNA的影響的電泳圖(其中柱I和柱2為抽提I次的電泳結果；柱3和柱4為抽提2次的電泳結果；柱5和柱6為抽提3次的電泳結果)。
[0019]圖3是本發(fā)明實施例酶切時間分別為I小時、3小時、5小時、7小時、9小時所獲得
的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。
[0020]圖4是將本發(fā)明實施例弓丨物E-ACC/M-AC對10份蕎麥材料的擴增結果。
[0021]圖 5 是將米用 0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L 濃度的E-GC/M-CCT引物組合進行擴增后得到的特異性DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果圖。
[0022]圖 6 是將 Mg2+ 濃度為 0mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L 時的擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果圖。
[0023]圖7是將預擴增后的DNA不稀釋、稀釋10倍、20倍、30倍、40倍后，采用E-GC/M-CCT引物組合進行選擇性擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果圖。
【具體實施方式】
[0024]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發(fā)明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0025]本發(fā)明實施例提供了一種蕎麥的AFLP反應體系的建立方法。該蕎麥的AFLP反應體系的建立方法的工藝流程如圖1所示，包括如下步驟:
[0026]SOl，制備模板DNA:稱取蕎麥葉片0.2~L Og,加入500~700ul的CTAB提取液反應0.5~2小時，用酚-氯仿液抽提I~3次，得到模板DNA;所述模板DNA的OD26ch28ci值為 1.8 ~2.0 ;
[0027]S02,酶切模板DNA:將2.0~4.0ul步驟SOl獲得的模板DNA與16.0~18.0ul的內(nèi)切酶體系混合，在35~38°C下反應I~9小時，得到酶切后的DNA ；
[0028]S03，連接DNA:將5.0~10.0ul步驟S02獲得的酶切后的DNA與20.0~25.0ul的連接體系混合，在16~22°C下反應3~10小時，得到連接后的DNA ；
[0029]S04,預擴增DNA:將3.0~5.0ul步驟S03獲得的連接后的DNA與15.0~17.0ul的預擴增體系混合，進行第一次PCR反應，得到預擴增的DNA ；
[0030]S05，擴增DNA:將3.0~5.0ul步驟S04獲得的預擴增后的DNA與15.0~17.0ul的擴增體系混合，進行第二次PCR反應，得到擴增后的特異性DNA。
[0031]具體地，上述步驟SOl中，稱取蕎麥葉片后，再加入CTAB提取液之前還有一個預處理的步驟:將蕎麥葉片置于研缽中，通入液氮預冷；然后將葉片置于液氮中研磨均勻，直至全部研磨至粉末；接著裝入離心管中備用。該蕎麥葉片優(yōu)選為新鮮的幼苗期葉片，用量優(yōu)選為0.5g。進一步地，該蕎麥葉片選自由中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物種保存中心提供的10份蕎麥材料，具體如下:陜西白(產(chǎn)自內(nèi)蒙古)、靈丘苦蕎(產(chǎn)自山西)、小蕎(產(chǎn)自甘肅)、金蕎(產(chǎn)自甘肅)、苦蕎(產(chǎn)自四川)、九江苦蕎(產(chǎn)自江西)、黑苦蕎(產(chǎn)自貴州)、刺蕎(產(chǎn)自云南)、米苦蕎(產(chǎn)自云南)、鳳凰苦蕎(產(chǎn)自湖南)。
[0032]進一步地，該步驟SOl中，上述CTAB提取液包括如下質(zhì)量百分比的組分:2~2.5%的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、100~150mmol/L的Tris_HCl、20~30mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、1.4~1.6mol/L的NaCl、0.2~1.0%的β -巰基乙醇、1.0~2.0%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。更進一步`地，上述CTAB提取液優(yōu)選為包括如下質(zhì)量百分比的組分:2%的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、100mmol/L的Tris-HCl、20mmol/L%的乙二胺四乙酸(EDTA)、1.4mol/L%的NaCl、1%的β -巰基乙醇、1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。該優(yōu)選的β -巰基乙醇是抗氧化劑，有效去除多糖和防止蕎麥組織中酚類物質(zhì)的氧化成醌，避免褐變，從而使酚容易析出細胞或者組織中的基因組DNA。該優(yōu)選的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是水溶性的，其替代了傳統(tǒng)方法中常用的不溶性PVPP，避免PVPP容易在緩沖液中沉淀從而導致其濃度不一。
[0033]進一步地，該步驟SOl中，將上述蕎麥葉片和CTAB提取液混合后，置于37~65°C的水浴中反應0.5~2小時，優(yōu)選為在恒溫65°C中反應I小時(其間每IOmin顛倒混勻一次)；然后冷卻至室溫，加入上述酚-氯仿溶液中混勻，室溫下12000r/min離心10分鐘，靜止后吸取上清液，將上清液裝入新的EP管；其中，在抽提過程中可將槍頭剪去尖端，裝入新管時沿管壁緩緩加入，都可以減少對DNA的機械剪切。更進一步地，還可以往新EP管中的上清液加入酚-氯仿溶液混勻，室溫下12000r/min離心10分鐘，靜止后再次吸取上清液，將第二次抽提的上清液裝入新的EP管。發(fā)明人發(fā)現(xiàn):可通過增加酚-氯仿的抽提次數(shù)來提高基因組DNA的純度，但酚-氯仿抽提次數(shù)過多又會增加DNA鏈斷裂的幾率，其中第二次抽提的上清液雜質(zhì)殘留最少，且在保證純度的前提下可以減少DNA機械斷裂，從而使蕎麥DNA的完整性最好；而第一次抽取的上清液雜質(zhì)較多，第三次抽取的上清液由于機械剪切作用使DNA斷裂加劇、裂解趨勢增大。該I次抽取、2次抽取和3次抽取對上清液中基因組DNA的影響如圖2所示，其中柱I和柱2為抽提I次的電泳結果，其點樣孔發(fā)亮，雜質(zhì)較多，殘留的雜質(zhì)干擾了基因組DNA獲得整齊的帶型；柱5和柱6為抽提3次的電泳結果，其雖然在純度上能達到要求，但機械剪切作用使DNA斷裂加劇，降解趨勢增大。
[0034]進一步地，該步驟SOl中，將提取后的模板基因組DNA以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，在一 20°C下保存?zhèn)溆谩?br> [0035]具體地，上述步驟S02中，上述內(nèi)切酶體系包括如下容量百分比的組分:0.2~
0.4ul的第一內(nèi)切酶、0.3~0.6ul的第二內(nèi)切酶、2.0~3.0ul的內(nèi)切酶緩沖液、0.2~
0.3ul的牛血清白蛋白、11.7~15.3ul的重蒸水。進一步地，上述第一內(nèi)切酶和第二內(nèi)切酶為限制性內(nèi)切酶，其切點大多很嚴格，并且要求專一的核苷酸順序，其識別順序能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵，進而切斷雙鏈DNA;該第一內(nèi)切酶和第二內(nèi)切酶可以選用如下內(nèi)切酶中的任兩種:BamH1、HindII1、EcoR1、Mse1、PstI或SacI。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，第一內(nèi)切酶為New England Biolabs公司生產(chǎn)的EcoRI，其識別序列是Y G AATTC3'；第二內(nèi)切酶為New England Biolabs公司生產(chǎn)的MseI，其識別序列是Y G TTAASi。更進一步地，上述內(nèi)切酶緩沖液為EcoRI緩沖液或者MseI緩沖液，優(yōu)選為EcoRI緩沖液(EcoRIbuffer)。
[0036]進一步地，該步驟S02中，在選用2ul由步驟SOl獲得的模板DNA (濃度為200ng/ul)時，上述內(nèi)切酶體系包括如下容量百分比的組分:0.3ul的EcoRI (濃度為20U/ul)、
0.5ul 的MseK濃度為 10U/ul)、2.0ul 的 lOXEcoRI 緩沖液(EcoRI buffer),0.2ul 的 IOOX牛血清白蛋白、15.0ul的重蒸水(ddH20)。更進一步地，上述用量的牛血清白蛋白可以結合EcoRI緩沖液或底物DNA中抑制限制性內(nèi)切酶活性的金屬離子和其它化學物質(zhì)，能起到“保護”或“載體”作用，使EcoRI和MseI的活性大幅度提高，從而使酶切更完全，并可實現(xiàn)重復切割。`
[0037]進一步地，該步驟S02中，酶切模板DNA的步驟優(yōu)選在37°C的恒溫水浴進行，反應的時間為I小時、3小時、5小時、7小時、9小時中的任一種，優(yōu)選為7小時。該優(yōu)選的反應溫度和時間使酶切效果最充分。更進一步地，該步驟S02中，將酶切時間分別為I小時、3小時、5小時、7小時、9小時所獲得的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其酶切結果如圖3所示:當酶切時間為I小時、3小時時，在基因組DNA位置微有發(fā)亮，表明仍有少部分DNA沒有被酶切；當酶切時間為5小時時，在基因組DNA位置較為發(fā)亮，表明酶切的DNA片段稍大；當酶切時間為7小時、9小時時，酶切片段在IOObp~750bp間形成高密度區(qū)，表明酶切充分，符合AFLP反應要求。從時間成本角度考慮，7小時為最佳的酶切時間。
[0038]具體地,上述步驟S03中，上述連接體系包括如下容量百分比的組分:0.2~0.4ul的T4連接酶、2.0~4.0ul T4連接酶緩沖液、1.0~2.0ul的第一內(nèi)切酶接頭、1.0~
2.0ul的第二內(nèi)切酶接頭、7.6~18.8ul的重蒸水(ddH20)。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，第一內(nèi)切酶接頭為北京賽百盛基因技術有限公司生產(chǎn)的EcoRI接頭，其識別序列是5' GAATTC3';第二內(nèi)切酶接頭為北京賽百盛基因技術有限公司生產(chǎn)的MseI接頭，其識別序列是 5' G TTAA3'。
[0039]進一步地，該步驟S03中，在一優(yōu)選的實施例中，在選用5ul由步驟S02獲得的酶切后的DNA時，上述連接體系包括如下容量百分比的組分:2ul的10 X T4連接酶緩沖液、
0.2ul 的 New England Biolabs 公司生產(chǎn)的 T4 連接酶(濃度為 400U/ul )、1.0ul 的 EcoRI 接頭(濃度為50pmol/ul)、l.0ul的MseI接頭(濃度為50pmol/ul )、8.8ul的重蒸水。上述酶切后的DNA片段在T4連接酶的作用下與上述EcoRI接頭、MseI接頭相連接，形成帶有EcoRI接頭、MseI接頭識別序列的特異性片段。
[0040]進一步地，該步驟S03中，將酶切后的DNA與上述連接體系混合后，優(yōu)選在16°C的恒溫水浴中過夜進行連接反應，然后在65°C下滅活10分鐘，在_20°C下保存或直接用于預擴增反應。
[0041]具體地，上述步驟S04中，上述預擴增體系包括如下容量百分比的組分:1.0~
1.2ul的第一引物、1.0~1.2ul的第二引物、2.0~3.0ul的PCR緩沖液、0.4~0.6ul的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、0.2~0.3ul的TaqDNA聚合酶、8.7~12.4ul的重蒸水。進一步地，上述第一引物優(yōu)選為北京賽百盛基因技術有限公司生產(chǎn)的E00，其識別序列是5' GACTGC GTA CCA ATT C3';上述第二引物優(yōu)選為北京賽百盛基因技術有限公司生產(chǎn)的M00，其識別序列是Y GAT GAG TCC TGA GTA A3'。更進一步地，上述dNTP包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP、dUTP中至少一種，優(yōu)選TAKARA公司生產(chǎn)的產(chǎn)品，其在該DNA預擴增步驟的中起原料作用；該TaqDNA聚合酶優(yōu)選TAKARA公司生產(chǎn)的產(chǎn)品，其具有良好的熱穩(wěn)定性，不需要每個循環(huán)加酶，使此預擴增步驟的PCR技術變得非常簡捷，大大降低了成本。
[0042]進一步地，該步驟S04中，在一優(yōu)選的實施例中，在選用4ul由步驟S03獲得的連接了接頭識別序列的特異性片段DNA時，上述預擴增體系包括如下容量百分比的組分:1.0ul 的 EOO 引物(濃度為 10pmol/ul)U.0ul 的 MOO 引物(濃度為 10pmol/ul )、2.0ul 的10XPCR緩沖液、0.4ul的脫氧核糖核苷三磷酸(濃度為10mmol/L)、0.2ul的TaqDNA聚合酶(濃度為5U/ul)、ll.4ul的重蒸水(ddH20)。具體地，該優(yōu)選的較低濃度的dNTP可減少非靶位置啟動和延伸時的核苷酸錯誤摻入。
[0043]進一步地，該步驟S04中，PCR反應的條件為:先在94°C下反應3~5分鐘；然后在94°C下反應30~35秒，接著在55~57°C°C下反應30~35秒，再在72°C下反應I~1.5分鐘，循環(huán)30次；在72°C下反應5~7分鐘；優(yōu)選為先在94°C下反應5分鐘；然后在94°C下反應30秒，接著在57°C下反應30秒，再在72°C下反應I分鐘，循環(huán)30次；在72 °C下反應6分鐘；在41:下保存。
[0044]具體地，上述步驟S05中，上述選擇性擴增體系包含0.8~1.2ul濃度為0.2~
1.0mmol/L的第一選擇性引物和0.8~1.2ul濃度為0.2~1.0mmol/L的第二選擇性特異性引物、1.0~3.0ul含Mg2+濃度為O~3.0mmol/L的鹽溶液，2.0~4.0ul的PCR緩沖液、
0.4~0.8ul的脫氧核糖核苷三磷酸、0.2~0.4ul的TaqDNA聚合酶、4.4~11.8ul的重蒸水(ddH20)。該引物可以選擇性識別上述具有特異配對序列的內(nèi)切酶片段，相互結合后可實現(xiàn)蕎麥DNA特異性擴增。
[0045]進一步地，上述第一選擇性引物為E+2、E+3中的任一種；上述第二選擇性引物為M+2、M+3中的任一種，優(yōu)選為E+2/M+3組合、E+3/M+2組合，此優(yōu)選的選擇性引物組合對于蕎麥遺傳多樣性的分析更有效。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述用3+2的選擇性核苷酸引物組合對蕎麥特異性DNA的擴增最為有效，擴增條帶清晰，多態(tài)性豐富。將E-ACC/M-AC組合擴增10份蕎麥材料后得到的特異性DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其檢測結果如圖4所示。更進一步地，上述選擇性引物組合的濃度為 0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、l.0mmoI/L中的任一種，優(yōu)選為0.8mmol/L，該優(yōu)選濃度的特異性引物組合使擴增的效率最高。將采用 0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L> 1.0mmol/L 濃度的 E-GC/M-CCT 引物組合進行擴增后得到的特異性DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其檢測結果如圖5所示:隨著引物濃度從0.2mmol/L增加到0.8mmol/L，擴增條帶逐漸變亮，表明適量增加引物濃度可以提高擴增效率；當增至1.0mmol/L時擴增效果變化不明顯，從原料成本的角度考慮，選擇擴增引物濃度為0.8mmol/L時最佳。
[0046]進一步地，該步驟S05中，上述含Mg2+的鹽溶液為MgCl溶液，其中Mg2+濃度為Ommol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L 中的任一種，優(yōu)選為 2.Smmol /I,,該優(yōu)選濃度的Mg2+能較大限度地激活上述TaqDNA聚合酶的活性，從而提高產(chǎn)物DNA的特異性。將 Mg2+濃度為 Ommol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L 時的擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖6所示:隨著Mg2+濃度從Ommol/L逐漸增加至2.5mmol/L，擴增條帶逐漸變亮；但增至3.0mmol/L時，擴增效果變化反而不明顯，這是由于過高濃度的Mg2+會抑制上述TaqDNA聚合酶的活性，從而使非特異性DNA的擴增增強。因此選擇最佳Mg2+ 濃度為 2.5mmol/L0
[0047]進一步地，該步驟S05中的ddH20和TaqDNA的作用如上所述，在此不再贅述。
[0048]更進一步地，該步驟S05中，在一優(yōu)選的實施例中，在選用3.0ul由步驟S04獲得的預擴展后的特異性片段DNA時，上述選擇性擴增體系包括如下容量百分比的組分:1.0ul含Mg2+濃度為2.5mmol/L的鹽溶液，2.0ul的PCR緩沖液、0.4ul的脫氧核糖核苷三磷酸(ddH20)、1.0ul的TaqDNA聚合酶、11.4ul的重蒸水(ddH20)。更進一步地，該步驟S05中，在將步驟S04獲得的預擴增后的DNA與選擇性擴增體系混合之前，還可以包含稀釋預擴增后DNA的步驟:將上述預擴增后的DNA不稀釋、稀釋10倍、20倍、30倍、40倍。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，不同稀釋倍數(shù)的模板DNA濃度對擴增結果并無顯著影響，從原料成本的角度考慮，優(yōu)選為將上述預擴增后的DNA稀釋20倍，這樣既提供了足夠的DNA模板，又得到了清晰的電泳圖譜。將上述預擴增后的DNA不稀釋、稀釋10倍、20倍、30倍、40倍后，采用E-GC/M-CCT引物組合進行選擇性擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖7所示:不同稀釋倍數(shù)的模板DNA濃度對擴增結果并無顯著影響。
[0049]進一步地，該步驟S05中，PCR反應的條件為:先在94°C下反應3~5分鐘；然后在94°C°C下反應30~35秒，接著在65°C下反應30~35秒，再在72°C下反應I~1.5分鐘，循環(huán)10~12次，每循環(huán)一次溫度下降0.70C ;然后在94°C下反應30~35秒，接著在55~57°C下反應30~35秒，再在72°C下反應I~1.5分鐘，循環(huán)25-30次；在72°C下反應5~7分鐘；優(yōu)選為先在94°C下反應5分鐘；然后在94°C下反應30秒，接著在65°C下反應30秒，下降0.7°C，再在72°C下反應I分鐘，循環(huán)12次；在94°C下反應30秒，在56°C下反應30秒，在72°C下反應I分鐘，循環(huán)25次；在72°C下反應6分鐘；在4°C下保存。
[0050]上述蕎麥AFLP反應體系的建立方法，通過改進AFLP關鍵步驟的反應條件，適當?shù)卦黾恿顺樘岬拇螖?shù)，既將反應液中的雜質(zhì)去除干凈，又減少蕎麥DNA機械斷裂，提高DNA提取的質(zhì)量；設置的酶切時間可充分地將蕎麥基因組DNA進行酶切；設置的Mg2+濃度既可提高產(chǎn)物特異性DNA的產(chǎn)出率，又避免了非特異性DNA擴增，建立了可靠性好、重復性強、可信度高、方便快速的適用于蕎麥的反應體系，，只需極少量的DNA樣品，不需要Southern雜交，不需要預先知道DNA的序列信息。
[0051]本發(fā)明實施例進一步提供了上述蕎麥AFLP反應體系的建立方法所獲得的蕎麥特異性DNA在優(yōu)化引物篩選、蕎麥育種、蕎麥品種指紋圖譜的繪制、蕎麥遺傳連鎖圖的構建、蕎麥遺傳多樣性的研究等領域的應用
[0052]正是由于上述蕎麥AFLP反應體系的建立方法所獲得的蕎麥特異性DNA絕大部分為顯性標記，顯示的多態(tài)性信息量也很高，非常適合應用在優(yōu)化引物篩選、蕎麥育種、蕎麥品種指紋圖譜的繪制、蕎麥遺傳連鎖圖的構建、蕎麥遺傳多樣性的研究等領域。
[0053]現(xiàn)以具體的蕎麥的AFLP反應體系的建立方法為例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。
[0054]實施例1
[0055]蕎麥的AFLP反應體系的建立方法，參見圖1所示,包括如下步驟:
[0056]S11，制備模板DNA:稱取產(chǎn)自內(nèi)蒙古的陜西白種蕎麥新鮮葉片0.5g，置于研缽中，通入液氮預冷，然后將葉片置于液氮中研磨均勻，直至全部研磨至粉末；然后加入600ul的CTAB提取液在恒溫65°C中反應I小時，其中，該CTAB提取液包含2.5%的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、150mmol/L 的 Tris-HCl、30mmol/L 的乙二胺四乙酸(EDTA)、1.6mol/L 的 NaCl、1%的β -巰基乙醇、2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP);然后冷卻至室溫，加入上述酚-氯仿溶液抽提2次，得到模板DNA;將提取后的模板基因組DNA以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，在一 20°C下保存?zhèn)溆茫?br> [0057]S12，酶切模板DNA:將2ul由步驟Sll獲得的模板DNA與18ul的內(nèi)切酶體系混合，該內(nèi)切酶體系包括如下容量百分比的組分:0.3ul的EcoRK濃度為20U/ul)、0.5ul的MseI(濃度為 10U/ul)、2.0ul 的 10XEcoRI 緩沖液(EcoRI buffer)、0.2ul 的 IOOX 牛血清白蛋白、15.0ul的重蒸水(ddH20);在37°C的恒溫水浴。C下反應7小時，得到酶切后的DNA ；
[0058]S13，連接DNA:將2ul步驟S12獲得的酶切后的DNA與15ul的連接體系混合，該連接體系包括如下容量百分比的組分:2u`l的10XT4連接酶緩沖液、0.2ul的New EnglandBiolabs公司生產(chǎn)的T4連接酶(濃度為400U/ul )、1.0ul的EcoRI接頭(濃度為50pmol/ul )、
1.0ul的MseI接頭(濃度為50pmol/ul)、8.8ul的重蒸水；在16°C的恒溫水浴中過夜反應，得到連接后的DNA ;然后在65°C下滅活10分鐘，在_20°C下保存；
[0059]S14,預擴增DNA:將4ul步驟S13獲得的連接后的DNA與16ul的預擴增體系混合，該預擴增體系包括如下容量百分比的組分:1.0ul的EOO引物(濃度為10pmol/ul)、l.0ul的MOO引物(濃度為10pmol/ul)、2.0ul的10XPCR緩沖液、0.4ul的脫氧核糖核苷三磷酸(濃度為10mmol/l)、0.2ul的TaqDNA聚合酶(濃度為5U/ul)、lL 4ul的重蒸水(ddH20);進行PCR反應，反應條件為:先在94°C下反應5分鐘；然后在94°C下反應30秒，接著在57°C下反應30秒，再在72°C下反應I分鐘，循環(huán)30次；在72°C下反應6分鐘；在4°C下保存；得到預擴增的DNA ；
[0060]S15，擴增DNA:將3.0ul步驟S14獲得的預擴增后的DNA稀釋20倍，與17.0ul的擴增體系混合，該擴增體系包含2.0ul濃度為0.8mmol/L的E+2/M+3引物組合、1.0ul含Mg2+濃度為2.5mmol/L的MgCl溶液，2.0ul的PCR緩沖液、0.4ul的脫氧核糖核苷三磷酸、0.2ul的TaqDNA聚合酶、11.4ul的重蒸水(ddH20);進行PCR反應，反應條件為:先在94°C下反應5分鐘；然后在94°C下反應30秒，接著在65°C下反應30秒，下降0.7°C，再在72°C下反應I分鐘，循環(huán)12次；在94°C下反應30秒，在56°C下反應30秒，在72°C下反應I分鐘，循環(huán)25次；在72°C下反應6分鐘；在4°C下保存；得到擴增后的特異性DNA。
[0061]實施例2[0062]蕎麥的AFLP反應體系的建立方法，參見圖1所示,包括如下步驟:
[0063]S21,制備模板DNA:稱取產(chǎn)自山西的靈丘苦蕎新鮮葉片0.5g,置于研缽中，通入液氮預冷，然后將葉片置于液氮中研磨均勻，直至全部研磨至粉末；然后加入550ul的CTAB提取液在恒溫65°C中反應I小時，其中，該CTAB提取液包含2%的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、150mmol/L 的 Tris-HCl、20mmol/L 的乙二胺四乙酸(EDTA)、1.6mol/L 的 NaCl、1% 的β -巰基乙醇、1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP);然后冷卻至室溫，加入上述酚-氯仿溶液抽提3次，得到模板DNA;將提取后的模板基因組DNA以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，在一20°C下保存?zhèn)溆茫?br> [0064]S22，酶切模板DNA:將2ul由步驟S21獲得的模板DNA與18ul的內(nèi)切酶體系混合，該內(nèi)切酶體系包括如下容量百分比的組分:0.3ul的EcoRK濃度為20U/ul)、0.5ul的MseI(濃度為 10U/ul)、2.0ul 的 10XEcoRI 緩沖液(EcoRI buffer),0.2ul 的 IOOX 牛血清白蛋白、15.0ul的重蒸水(ddH20);在37°C的恒溫水浴。C下反應9小時，得到酶切后的DNA ；
[0065]S23，連接DNA:將2ul步驟S22獲得的酶切后的DNA與15ul的連接體系混合，該連接體系包括如下容量百分比的組分:2ul的10XT4連接酶緩沖液、0.2ul的New EnglandBiolabs公司生產(chǎn)的T4連接酶(濃度為400U/ul )、1.0ul的EcoRI接頭(濃度為50pmol/ul )、
1.0ul的MseI接頭(濃度為50pmol/ul)、8.8ul的重蒸水；在16°C的恒溫水浴中過夜反應，得到連接后的DNA ;然后在65°C下滅活10分鐘，在_20°C下保存；
[0066]S24，預擴增DNA:將4ul步驟S23獲得的連接后的DNA與16ul的預擴增體系混合，該預擴增體系包括如下容量百分比的組分:1.0ul的EOO引物(濃度為10pmol/ul)、l.0ul的MOO引物(濃度為10pmol/ul)、2.0ul的10XPCR緩沖液、0.4ul的脫氧核糖核苷三磷酸(濃度為10mmol/l)、0.2ul的TaqDNA聚合酶(濃度為5U/ul)、lL 4ul的重蒸水(ddH20);進行PCR反應，反應條件為:先在94`°C下反應5分鐘；然后在94°C下反應30秒，接著在57°C下反應30秒，再在72°C下反應I分鐘，循環(huán)30次；在72°C下反應6分鐘；在4°C下保存；得到預擴增的DNA ；
[0067]S25，擴增DNA:將4.0ul步驟S24獲得的預擴增后的DNA稀釋30倍，與16.0ul的擴增體系混合，該擴增體系包含2.4ul濃度為0.6mmol/L的E+3/M+2引物組合、2.0ul含Mg2+濃度為2mmol/L的MgCl溶液，4.0ul的PCR緩沖液、0.6ul的脫氧核糖核苷三磷酸(ddH20)、
0.4ul的TaqDNA聚合酶、6.6ul的重蒸水；進行PCR反應，反應條件為:先在94°C下反應5分鐘；然后在94°C下反應30秒，接著在65°C下反應30秒，下降0.7°C，再在72°C下反應I分鐘，循環(huán)12次；在94°C下反應30秒，在56 °C下反應30秒，在72 °C下反應I分鐘，循環(huán)25次；在72°C下反應6分鐘；在4°C下保存；得到擴增后的特異性DNA。
[0068]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權利要求】
1.一種蕎麥的AFLP反應體系的建立方法，包括如下步驟: 將蕎麥葉片加入CTAB提取液反應0.5~2小時，抽提，得到模板DNA; 將所述模板DNA與內(nèi)切酶體系混合，在35~38°C下反應I~9小時，得到酶切后的DNA ;其中，所述模板DNA與所述內(nèi)切酶體系的容量比為I~2:9~8，所述模板DNA的OD260-280值為1.8~2.0; 將所述酶切后的DNA與連接體系混合，在16~22°C下反應3~10小時，得到連接后的DNA ;其中，所述酶切后的DNA與所述連接體系的容量比為I~2:4~5 ; 將所述連接后的DNA與預擴增體系混合，進行第一次PCR反應，得到預擴增的DNA ;其中，所述連接后的DNA與所述預擴增體系的容量比為3~5:15~17 ; 將所述預擴增后的DNA與選擇性擴增體系混合，進行第二次PCR反應，得到擴增后的特異性DNA ;其中，所述預擴增后的DNA與選擇性擴增體系的容量比為3~5:15~17 ; 其中，所述選擇性擴增體系包含濃度為0.2~1.0mmol/L的第一選擇性引物和濃度為0.2~1.0mmol/L的第二選擇性引物、濃度為O~3.0mmol/L的含Mg2+鹽溶液；其中，所述第一選擇性引物、第二選擇性引物與含Mg2+鹽溶液的容量比為4~6:4~6:5~15。
2.根據(jù)權利要求1所述的蕎麥AFLP反應體系的建立方法，其特征在于，所述第一選擇性引物為E+2、E+3中的任一種，所述第二選擇性引物為M+2、M+3中的任一種。
3.根據(jù)權利要求1~2所述的蕎麥AFLP反應體系的建立方法，其特征在于，在所述預擴增后的DNA與所述選擇性擴增體系混合之前，還包含稀釋所述預擴增后DNA的步驟:將所述預擴增后的DNA稀釋O~40倍。
4.根據(jù)權利要求1~2所述的蕎麥AFLP反應體系的建立方法，其特征在于，所述選擇性擴增體系還包含如下的組分:PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、TaqDNA聚合酶、重蒸水；其中，所述PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、第一選擇性引物、第二選擇性引物、TaqDNA聚合酶、重蒸水的容量比為I~2:0.2~0.4:0.4~0.6:0.4~0.6:0.1~0.2:2.2~5.9。
5.根據(jù)權利要求1~2所述的蕎麥AFLP反應體系的建立方法，其特征在于，所述CTAB提取液包括如下質(zhì)量百分比的組分'2~2.5%的十六烷基三甲基溴化銨、100~150mmol/L 的 Tris-HCl、20 ~30mmol/L 的乙二胺四乙酸、1.4 ~1.6mol/L 的 NaCl、0.2 ~1.0% 的β -巰基乙醇、1.0~2.0%的聚乙烯吡咯烷酮。
6.根據(jù)權利要求1~2所述的蕎麥AFLP反應體系的建立方法，其特征在于，所述內(nèi)切酶體系包括如下組分第一內(nèi)切酶、第二內(nèi)切酶、內(nèi)切酶緩沖液、牛血清白蛋白、重蒸水；其中，所述第一內(nèi)切酶、第二內(nèi)切酶、內(nèi)切酶緩沖液、牛血清白蛋白、重蒸水的容量比為0.2~0.4:0.3 ~0.6:2.0 ~3.0:0.2 ~0.3:11.7 ~15.3。
7.根據(jù)權利要求1~2所述的蕎麥AFLP反應體系的建立方法，其特征在于，所述連接體系包括如下組分:T4連接酶、Τ4連接酶緩沖液、第一內(nèi)切酶接頭、第二內(nèi)切酶接頭、重蒸水；其中，所述Τ4連接酶、Τ4連接酶緩沖液、第一內(nèi)切酶接頭、第二內(nèi)切酶接頭、重蒸水的容量比為 0.1 ~0.2:1 ~2:0.5 ~1:0.5 ~1:3.8 ~9.4。
8.根據(jù)權利要求1~2所述的蕎麥AFLP反應體系的建立方法，其特征在于，所述預擴增體系包括如下容量百分比的組分:第一引物、第二引物、PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、TaqDNA聚合酶、重蒸水；其中，所述第一引物、第二引物、PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、TaqDNA聚合酶、重蒸水的容量比為1.0~1.2:1.0~1.2:2.0~3.0:0.4~0.6:0.2~,0.3:8.7 ~12.4。
9.根據(jù)權利要求1~2所述的蕎麥AFLP反應體系的建立方法，其特征在于，第一次PCR反應的條件為:先在94°C下反應3~5分鐘；然后在94°C下反應30~35秒，接著在55~57°C下反應30~35秒，再在72°C下反應I~1.5分鐘，循環(huán)30次；在72°C下反應5~7分鐘；和/或 所述第二次PCR反應的條件為:先在94°C下反應3~5分鐘；然后在94°C下反應30~35秒，接著在65°C下反應30~35秒，再在72°C下反應I~1.5分鐘，循環(huán)10_12次，每循環(huán)一次下降0.70C ;然后在94°C下反應30~35秒，接著在55~57°C下反應30~35秒，再在72°C下反應I~1.5分鐘，循環(huán)25-30次；在72°C下反應5~7分鐘。
10.如權利要求1~9所述的蕎麥AFLP反應體系的建立方法所獲得的蕎麥特異性DNA在優(yōu)化引物篩選、蕎麥育種、蕎麥品種指紋圖譜的繪制、蕎麥遺傳連鎖圖的構建、蕎麥遺傳多樣性的研究等領域的應用 。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484449SQ201310422761
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月16日 優(yōu)先權日:2013年9月16日
【發(fā)明者】潘韻, 侯雅君, 李永新, 鄭文官, 陳義昆, 唐明輝 申請人:深圳市圣西馬生物技術有限公司