花曲柳懸浮培養(yǎng)體系的建立方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一種花曲柳(Fraxinus?rhynchophylla?Hance.)愈傷組織團(tuán)塊懸浮培養(yǎng)體系的建立方法。本發(fā)明以優(yōu)良花曲柳莖段和葉片作為原始材料，在添加了激素NAA和TDZ的WPM固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織，將愈傷組織接種到添加了激素NAA和TDZ的WPM液體培養(yǎng)基中，光照振蕩培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)多代定向誘導(dǎo)馴化，建立了生長(zhǎng)量穩(wěn)定，增殖迅速，團(tuán)塊均勻的愈傷組織團(tuán)塊懸浮系。本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)單易行，操作性強(qiáng)，增殖系數(shù)可觀，能夠促進(jìn)花曲柳的快速繁殖的特點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】花曲柳懸淳培養(yǎng)體系的建立方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 一種利用基本培養(yǎng)基和附加激素建立花曲柳懸浮培養(yǎng)體系的方法，本發(fā)明隸屬植 物細(xì)胞工程的【技術(shù)領(lǐng)域】。 【背景技術(shù)】
[0002] 花曲柳（Fraxinus rhynchophylla Hance.)屬于木犀科禪屬落葉大喬木，又稱(chēng)大 葉白蠟、苦櫪白蠟樹(shù)。干燥樹(shù)皮、枝皮為我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材"秦皮"的四種入藥皮料之一， 具有清熱燥濕、明目和止咳平喘的作用。近年來(lái)的分析化學(xué)研究表明，其樹(shù)皮中含有多種 香豆素類(lèi)成分，如秦皮甲素（Esculin)，秦皮乙素（Esculetin)，秦皮苷（Fraxin)，秦皮素 (Fraxetol)等?；ㄇ稍镏ζ?、干皮具有清熱燥濕，明目，收澀的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究 表明，其皮兼有抗菌、消炎、利尿、止咳平喘、鎮(zhèn)靜、祛痰等作用。近年來(lái)，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，香 豆素類(lèi)成分具有抗腫瘤、抗HIV以及免疫調(diào)節(jié)的重要作用。這使得香豆素類(lèi)物質(zhì)的價(jià)值越 來(lái)越多地得以體現(xiàn)。目前常用藥用香豆素類(lèi)化合物主要來(lái)自于木犀科白蠟屬植物，在入藥 的秦皮來(lái)源中，花曲柳樹(shù)皮的香豆素總量含量最多。這使得白蠟屬樹(shù)木資源遭到了破壞，而 樹(shù)木的再生周期較長(zhǎng)，樹(shù)皮再生慢，且易受病蟲(chóng)害侵害，環(huán)剝將造成樹(shù)木死亡，長(zhǎng)此以往，白 蠟屬樹(shù)木資源會(huì)趨于枯竭，違背了科學(xué)發(fā)展觀的可持續(xù)發(fā)展思想。利用植物細(xì)胞工程手段， 培養(yǎng)大量懸浮細(xì)胞并分離其次生代謝產(chǎn)物，提高花曲柳懸浮培養(yǎng)體系中香豆素類(lèi)物質(zhì)的含 量，且不受季節(jié)限制，這將對(duì)花曲柳香豆素類(lèi)藥用成分生產(chǎn)和臨床應(yīng)用及花曲柳物種的保 護(hù)起到積極的推動(dòng)作用。
[0003] 以花曲柳懸浮培養(yǎng)愈傷組織團(tuán)塊進(jìn)行細(xì)胞工程、基因工程等研究有明顯優(yōu)勢(shì)，原 因之一是愈傷組織團(tuán)塊取材少，生長(zhǎng)速度快，組織形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高，受 其他細(xì)胞和微環(huán)境影響不大，遺傳學(xué)上也比較穩(wěn)定；其次是愈傷組織團(tuán)塊繼代周期短，增殖 速度快，通過(guò)再分化手段對(duì)再生植株進(jìn)行選擇培養(yǎng)，也可以縮短育種年限，對(duì)保護(hù)物種有重 要意義。目前，花曲柳愈傷組織培養(yǎng)研究外植體材料來(lái)源主要為休眠芽萌發(fā)莖段、無(wú)菌種子 萌發(fā)的莖段。愈傷組織誘導(dǎo)植株再生及懸浮培養(yǎng)體系的建立尚未見(jiàn)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是建立一種花曲柳懸浮培養(yǎng)體系的方法，該法簡(jiǎn)單易行，操作性強(qiáng)，增 殖系數(shù)可觀，能夠促進(jìn)花曲柳的快速繁殖。
[0005] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：
[0006] 步驟一，以花曲柳的莖段和葉片作為外植體，首先用75%酒精浸泡25-30s，然后用 飽和Ca (C10) 2水溶液處理8?12min，最后用無(wú)菌水沖洗4-6次；
[0007] 步驟二，將消毒好的莖段（或葉片）在培養(yǎng)皿中用無(wú)菌刀切割成0.5-lcm(或 cm2)左右的小段（或塊），接種于固體WPM基本培養(yǎng)基附加 NAA(a_naphthalene acetic acid) 1· 2-1. 8mg/L、TDZ (thidiazuron) 0· 05-0. lmg/L、鹿糖 20g/L、瓊脂 5. 3g/L、ρΗ6· 0 ? 6. 5〇
[0008] 步驟三，光照培養(yǎng)，溫度23?26°C，每天光照16h，培養(yǎng)30d ;
[0009] 步驟四，將誘導(dǎo)出的愈傷組織用無(wú)菌刀切成0. 5-lcm2,接種到含有約50mL液體培 養(yǎng)基的100mL的三角瓶中，每瓶接種愈傷組織30-50塊，置于轉(zhuǎn)速為110-140r/min的搖床 上，溫度23-26°C，每天光照16h，培養(yǎng)7-14d繼代一次。培養(yǎng)基使用1/2WPM基本培養(yǎng)基附 加 NAA(a_naphthalene acetic acid) 0.7-1. 4mg/L、TDZ(thidiazuron) 0.03-0. 07mg/L、鹿 糖 20g/L、pH6. 0 ?6. 5。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：利用花曲柳莖段誘導(dǎo)形成的愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)到100%，進(jìn)一 步建立愈傷組織團(tuán)塊懸浮培養(yǎng)體系，每14天增殖3-5倍，愈傷組織緊密，干物質(zhì)含量高，有 利于次生代謝產(chǎn)物的積累，本發(fā)明建立的懸浮體系可用于生物反應(yīng)器培養(yǎng)和擴(kuò)大生產(chǎn)。 [0011] 本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易行，操作性強(qiáng)，增殖系數(shù)可觀，能夠促進(jìn)花曲柳的快速繁殖。。
[0012] 【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】：懸浮培養(yǎng)7d的花曲柳愈傷組織。 【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1花曲柳懸浮細(xì)胞側(cè)面觀察圖
[0014] 圖2花曲柳懸浮細(xì)胞底部觀察圖 【具體實(shí)施方式】：
[0015] 一種水曲柳懸浮培養(yǎng)體系的建立方法，其具體步驟如下：
[0016] 步驟一，以花曲柳莖段和葉片作為外植體，用75%酒精浸泡25s或28s或30s，用飽 和Ca(C10) 2水溶液處理8min或lOmin或12min，用無(wú)菌水沖洗4次或5次或6次；
[0017] 步驟二，將消毒好的莖段和葉片在培養(yǎng)皿中用無(wú)菌刀切割成0.5-lcm(cm2)左右 的小段（塊），接種在固體啟動(dòng)培養(yǎng)基上，WPM培養(yǎng)基附加 NAA (a-naphthalene acetic acid) 1· 2-1. 8mg/L、TDZ (thidiazuron) 0· 05-0. lmg/L、鹿糖 20g/L、瓊脂 5. 3g/L、ρΗ6· 0 ? 6. 5 ；
[0018] 步驟三，待愈傷組織長(zhǎng)到1cm?2cm3,轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基WPM培養(yǎng)基附加 NAA1. Omg/ L、TDZ(thidiazuron)0· lmg/L、鹿糖 20g/L、瓊脂 5. 3g/L、ρΗ6· 0 ?6· 5 ;每天光照 16h，溫度 23°C ?26°C，培養(yǎng) 30d ;
[0019] 步驟四，將愈傷組織用無(wú)菌刀切成0. 5?1cm(或cm2)左右的小段（或塊），接種到 含有50mL液體培養(yǎng)基的100mL的三角瓶中，每瓶接種愈傷組織3g，，置于轉(zhuǎn)速為110-140r/ min的搖床上，溫度23°C?26°C，每天光照16h，培養(yǎng)7-14d繼代一次。懸浮培養(yǎng)基為1/2WPM 基本培養(yǎng)基附加 ΝΑΑ0. 7-1. 4mg/L、TDZ0. 03-0. 07mg/L、蔗糖 20g/L、ρΗ6· 0-6. 5。
[0020] 步驟五，繼代培養(yǎng)3-5次后，即可獲得穩(wěn)定懸浮培養(yǎng)系，每代增殖3-5倍。
【權(quán)利要求】
1. 一種花曲柳（Fraxinus rhynchophylla Hance.)愈傷組織團(tuán)塊懸浮體系建立的方 法，其特征在于它包括如下步驟： (1) 外植體制備 材料消毒：在超凈工作臺(tái)上將取下的花曲柳莖段和葉片在75%酒精浸泡25-30s，無(wú)菌 水沖洗2次，每次5分鐘，置入飽和Ca (C10) 2水溶液處理8-12min，用無(wú)菌水沖洗4-6次，每 次5分鐘，無(wú)菌濾紙上吸干； (2) 愈傷組織誘導(dǎo) 將（1)處理好的花曲柳莖段（或葉片）切割成〇· 5-lcm(或cm2)左右的小段（或塊）， 接入誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織； (3) 懸浮培養(yǎng)體系建立 將（2)獲得的愈傷組織切割成0. 5-lcm3,接種到適合懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基中，置 于轉(zhuǎn)速為110-140r/min的搖床上，溫度23-26°C，每天光照16h，培養(yǎng)7-14d繼代一次。
2. 按照權(quán)利要求1所述的一種花曲柳愈傷組織團(tuán)塊懸浮體系建立的方法，其特征在 于，步驟（1)中所述的花曲柳外植體為花曲柳休眠芽萌發(fā)的莖段和葉片。
3. 按照權(quán)利要求1所述的一種花曲柳愈傷組織團(tuán)塊懸浮體系建立的方法，其特征在 于，步驟（2)中所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在1升WPM培養(yǎng)基中加入下述的原料及配比 制成： 蔗糖 20-30g 瓊脂 5.2-5.5g 沒(méi)乙^(a-naphdiale.ne acetic acid ) 1.2-1.8mg/L N-苯從-N-l,2..3-_ :丨咔 Uhidiazuron) 0.05-0.lmg/L
4. 按照權(quán)利要求1所述的一種花曲柳愈傷組織團(tuán)塊懸浮體系建立的方法，其特征在 于，步驟（3)中所述的懸浮細(xì)胞液體培養(yǎng)基為在1升1/2WPM基本培養(yǎng)基中加入下述原料及 配比制成： 鹿糖 20-30g 蔡乙酸（a-naphthalene acetic acid) 0. 7-1. 4mg/L N-苯基-N_l, 2, 3-噻二唑（thidiazuron) 0· 03-0. 07mg/L。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104094840SQ201310111904
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月2日
【發(fā)明者】詹亞光, 劉孚婧, 齊鳳慧, 尹靜, 曾凡鎖, 范桂枝 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué), 詹亞光, 劉孚婧