本發(fā)明涉及半楓荷組培，尤其涉及一種半楓荷的組織培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、半楓荷(semiliquidambar?cathayensis)為金縷梅科半楓荷屬，是1962年新發(fā)現(xiàn)的我國特有種。半楓荷是優(yōu)良的園林綠化觀賞樹種，并且其木材優(yōu)質(zhì)，旋包性良好，是制作旋創(chuàng)制品的優(yōu)良用材。同時半楓荷的根莖、枝、葉及樹皮和花蜜都具有良好的藥用價值，可以治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、跌打淤積等癥狀，是一種有效的民間地方特色藥。但由于半楓荷自然繁殖率較低，又經(jīng)常被人們砍伐采掘，野生資源日益稀少，種群繁衍趨于瀕危，如何保護與擴大半楓荷資源已成為當(dāng)前亟待解決的關(guān)鍵問題。

2、目前半楓荷的繁殖方法主要為種子繁殖和扦插繁殖，但是傳統(tǒng)種子育苗無法在短時間內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)樹苗，后代也無法穩(wěn)定保持親本優(yōu)良形狀。并且半楓荷屬于較難生根的樹種，扦插成活率較低，因此種子繁殖和扦插繁殖都無法滿足半楓荷優(yōu)良品系大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化需求，限制半楓荷產(chǎn)業(yè)發(fā)展。組織培養(yǎng)相對于種子繁殖和扦插繁殖具有周期短、速度快和穩(wěn)定保持親本優(yōu)良性狀等特點，因此，建立半楓荷的組織培養(yǎng)技術(shù)是解決半楓荷資源短缺，保持其優(yōu)良品種的有效途徑。但是傳統(tǒng)組培方法需要經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)以及煉苗移栽等多個階段，程序較繁瑣、周期較長、成本高，此外，半楓荷增殖培養(yǎng)過程中還易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，導(dǎo)致半楓荷繁殖系數(shù)低、組培苗質(zhì)量差。

3、因此，目前急需尋找一種半楓荷組織培養(yǎng)方法，解決常規(guī)組培方法下半楓荷組培時間較長、程序較繁瑣，以及易出現(xiàn)玻璃化導(dǎo)致繁殖系數(shù)低、苗木質(zhì)量差的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種半楓荷的組織培養(yǎng)方法，解決常規(guī)組培方法下半楓荷組培時間較長、程序較繁瑣，以及易出現(xiàn)玻璃化導(dǎo)致繁殖系數(shù)低、苗木質(zhì)量差的問題。

2、本發(fā)明通過以下技術(shù)手段解決上述技術(shù)問題：

3、一種半楓荷的組織培養(yǎng)方法，所述組織培養(yǎng)方法如下：

4、(1)外植體采集與處理：春季于優(yōu)良母樹上采集生長健壯的新萌枝條，剪取半木質(zhì)化莖段并去除葉片，放入水中洗去表面污漬后放入肥皂水中浸泡清洗10～20min，再用流水沖洗30min得到外植體；

5、(2)外植體消毒：于超凈工作臺上將外植體剪成帶1～2個腋芽、長2～3cm的莖段，放入無菌水中清洗1遍后放入體積分?jǐn)?shù)為75％乙醇溶液中浸泡消毒15～30s，然后無菌水清洗3～5遍后轉(zhuǎn)入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的升汞溶液中消毒5～8min，消毒完成后再用無菌水清洗5～7遍后得到消毒后的外植體；

6、(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)：將消毒后外植體接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)得到不定芽；

7、(4)增殖-生根一體化培養(yǎng)：將誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的不定芽剪取單芽，然后接種至增殖-生根一體培養(yǎng)基中進行增殖-生根一體化培養(yǎng)得到生根苗；

8、(5)煉苗與移栽：將增殖-生根一體化培養(yǎng)得到的根長≥1cm、生根數(shù)≥3根的生根苗進行煉苗，煉苗后將生根苗從組培瓶中取出，洗去根部培養(yǎng)基后用800～1000倍多菌靈溶液浸泡20min，即可移栽至基質(zhì)盤中。

9、在傳統(tǒng)組織培養(yǎng)方法下，需要進行誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)以及煉苗移栽等步驟，操作較繁雜、成本高、時間長，因此本發(fā)明制備增殖-生根一體培養(yǎng)基進行增殖-生根一體化培養(yǎng)，可以有效縮短半楓荷組培時間，并且降低轉(zhuǎn)接操作成本，進而提高半楓荷的組培繁殖效率。

10、進一步，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基組分為：ms+1.0～1.2mg/l?6-ba+0.2～0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.8g/l瓊脂，ph＝5.8。

11、進一步，所述步驟(4)中增殖-生根一體培養(yǎng)基為固液雙層培養(yǎng)基，其中上層為液體增殖培養(yǎng)基，下層為固體生根培養(yǎng)基，所述增殖-生根一體培養(yǎng)基包括以下原料：

12、上層液體增殖培養(yǎng)基：ms+0.2-0.3mg/l?6-ba+0.05～0.15mg/l?naa+30g/l蔗糖+2～3g/l環(huán)己胺+2～3g/l醋酸異丙酯+3-4g/l聚乙二醇+8～15g/l穩(wěn)定劑，ph＝5.8；

13、下層固體生根培養(yǎng)基：ms+0.6～0.8mg/l?iba+0.4mg/l?naa+0.6mg/labt+30g/l蔗糖+6.8g/l瓊脂，ph＝5.8。

14、進一步，所述增殖-生根一體培養(yǎng)基制備方法如下：

15、按照下層固體生根培養(yǎng)基的組分配比于ms培養(yǎng)基中加入iba、naa和abt，混合均勻后加入瓊脂，然后加熱至瓊脂溶解后加入蔗糖攪拌溶解混合均勻，調(diào)節(jié)ph至5.8后裝入培養(yǎng)瓶中，121℃下高溫滅菌20min；按照上層液體增殖培養(yǎng)基的組分配比于ms培養(yǎng)基中加入6-ba、naa、蔗糖、環(huán)己胺、醋酸異丙酯以及聚乙二醇攪拌混合均勻后再加入穩(wěn)定劑混合均勻，121℃高溫滅菌20min，待培養(yǎng)瓶內(nèi)下層固體生根培養(yǎng)基凝固后加入，得到增殖-生根一體培養(yǎng)基。

16、進一步，所述穩(wěn)定劑包括以下原料：

17、海藻酸鈉、6-ba、naa、2wt％氯化鈣溶液、米糠蠟、三乙胺、硫脲、2,4,6-三(二甲胺基甲基)苯酚、環(huán)氧樹脂。

18、進一步，所述穩(wěn)定劑制備方法如下：

19、a：將海藻酸鈉加水溶解制成5wt％海藻酸鈉溶液后加入6-ba、naa混合均勻，然后緩慢滴入2wt％氯化鈣溶液中膠凝得到海藻酸鈉包覆球，無菌水清洗3遍后于45℃下干燥20-30min得到半干燥海藻酸鈉包覆球，待用；

20、b：將米糠蠟研磨過300目篩得到米糠蠟微粒；將三乙胺、硫脲、2，4，6-三(二甲胺基甲基)苯酚放入反應(yīng)釜中混合均勻，升溫至110～130℃反應(yīng)0.5～1h，然后冷卻至55℃后加入環(huán)氧樹脂充分混合均勻后再加入米糠蠟微粒混合均勻得到包覆液；

21、c：將包覆液噴涂至干燥的海藻酸鈉包覆球表面，于陰涼通風(fēng)處靜置12～24h，然后于60～70℃溫度下放置2～3h使包覆球表面米糠蠟微粒熔融流出，再用去離子水清洗3～5遍得到穩(wěn)定劑。

22、進一步，所述步驟a中海藻酸鈉溶液、6-ba、naa的質(zhì)量比為(160-300)：(0.03-0.05)：(0.01-0.02)。

23、進一步，所述步驟b中三乙胺、硫脲、2，4，6-三(二甲胺基甲基)苯酚、環(huán)氧樹脂、米糠蠟微粒的質(zhì)量比為(8～16)：(10～20)：(10～20)：(50～70)：(10～20)。

24、進一步，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度為25～27℃，光照時間為8～12h/d，光照強度為2000～3000lx；所述增殖-生根一體化培養(yǎng)溫度為25～27℃，光照時間為8～12h/d，光照強度為4500-5000lx。

25、進一步，所述穩(wěn)定劑粒徑為0.5-1mm。

26、半楓荷組織培養(yǎng)時，在增殖階段容易出現(xiàn)玻璃化，玻璃化苗表現(xiàn)為含水量高、干物質(zhì)和纖維素積累低等狀況，生長情況差難以進一步生根，移栽后也難成活，大大降低繁殖系數(shù)。因此本發(fā)明在增殖-生根一體培養(yǎng)基制備時于上層液體增殖培養(yǎng)基中添加醋酸異丙酯、環(huán)己胺和聚乙二醇，環(huán)己胺通過調(diào)整培養(yǎng)基的電荷性質(zhì)來增強培養(yǎng)基中養(yǎng)分與組培苗根系的離子交換作用，進一步醋酸異丙酯作用于細(xì)胞膜，改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)排列以增加細(xì)胞膜的透過性，進而培養(yǎng)基中養(yǎng)分在更強的離子交換作用下通過透性增強的細(xì)胞膜進入組培苗中，以加速組培苗的干物質(zhì)積累、促進組培苗的木質(zhì)化，提高苗木質(zhì)量；同時添加的聚乙二醇可以調(diào)整培養(yǎng)基滲透勢以調(diào)控組培苗體內(nèi)水分，進而培養(yǎng)基中各組分共同作用減輕半楓荷組培苗的玻璃化，使其更好生根得到優(yōu)質(zhì)生根苗。

27、為了縮短組培時間、提高繁殖效率，本發(fā)明制備了雙層培養(yǎng)基進行增殖-生根一體化培養(yǎng)，但是上層液體增殖培養(yǎng)基中組分經(jīng)較長時間后容易向下沉積滲透進入下層固體生根培養(yǎng)基，其中6-ba、naa是添加的少量激素成本，滲透進入下層生根培養(yǎng)基后會導(dǎo)致增殖所需激素不足，在上層液體增殖培養(yǎng)基中增添更多量的激素又會進一步導(dǎo)致玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生。

28、基于前述問題，本發(fā)明采用海藻酸鈉凝膠化包埋特定比例的6-ba和naa制備穩(wěn)定劑加入上層液體增殖培養(yǎng)基中，海藻酸鈉凝膠包埋的6-ba和naa緩慢釋放進入上層液體增殖培養(yǎng)基中供組培苗利用，不會因為長時間沉積進入下層生根增殖培養(yǎng)基中，保證了培養(yǎng)基中激素的適宜量供給。但是海藻酸鈉包覆球進入培養(yǎng)基后容易快速吸水溶脹造成6-ba和naa的突釋，因此本發(fā)明對海藻酸鈉包覆球進行半干燥后噴涂含有米糠蠟的環(huán)氧樹脂包覆液，環(huán)氧樹脂固化后在海藻酸鈉包覆球表面形成硬殼層，進而抑制海藻酸鈉包覆球的溶脹，較好解決了溶脹突釋的問題，而米糠蠟熔融形成的孔洞結(jié)構(gòu)則能讓內(nèi)部釋放的激素成分順利進入培養(yǎng)基中供組培苗利用。

29、有益效果：

30、1.本發(fā)明于半楓荷組培過程中對培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)光照時間和強度進行有效把控，抑制半楓荷玻璃化苗的產(chǎn)生，提高半楓荷組培繁殖系數(shù)，提高組培苗質(zhì)量，對促進半楓荷產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有很重要意義。

31、2.本發(fā)明制備增殖-生根一體培養(yǎng)基進行增殖生根一體化培養(yǎng)，可以有效縮短組培時間，降低轉(zhuǎn)接操作成本；并且對增殖-生根一體培養(yǎng)基中上層液體增殖培養(yǎng)基進一步進行改進，以維持培養(yǎng)基中激素的適宜濃度，促進組培苗干物質(zhì)積累、抑制苗木體內(nèi)水分含量的過度升高，進一步抑制組培苗玻璃化的同時，更好提升了組培苗質(zhì)量，進而有效提高生根率和移栽成活率高，提高繁殖系數(shù)。