本發(fā)明涉及一種鐵皮石斛擴(kuò)繁方法，具體是利用莖段薄片不經(jīng)歷愈傷組織階段直接分化獲得無(wú)菌苗，進(jìn)而通過(guò)增殖獲得大量的無(wú)菌苗的擴(kuò)繁方法，屬于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物，是傳統(tǒng)名貴中藥材。近年來(lái)隨著人們對(duì)鐵皮石斛的了解越來(lái)越多，對(duì)鐵皮石斛的需求日趨增加，而石斛自然繁殖力極低，種子需與真菌共生才能萌發(fā)，加上長(zhǎng)期采挖，稀缺的野生資源越來(lái)越少。通過(guò)組培方法可快速獲得鐵皮石斛的無(wú)菌苗，并通過(guò)快速增殖，可以快速獲得大量無(wú)菌鐵皮石斛種苗。

目前通過(guò)組培獲得鐵皮石斛無(wú)菌苗的方法有兩種：

一是果莢消毒后在培養(yǎng)基上播種獲得無(wú)菌苗，此方法獲得無(wú)菌植株為雜交后代，每個(gè)個(gè)體的基因型都存在差異，在商品化生產(chǎn)中無(wú)法滿足對(duì)種苗一致性的要求；

二是通過(guò)外植體消毒，經(jīng)過(guò)愈傷組織培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)獲得遺傳背景穩(wěn)定，變異系數(shù)小的大量無(wú)菌植株，此方法經(jīng)歷愈傷組織培養(yǎng)、分化培養(yǎng)兩個(gè)階段，時(shí)間較長(zhǎng)；并且，已報(bào)道的此類方法，需要選擇距離節(jié)左端和右端各0.5-1cm左右的莖段，同樣長(zhǎng)度的外植體獲得的無(wú)菌苗數(shù)量較少。

因而，急需繼續(xù)尋找一種優(yōu)良的鐵皮石斛組培快繁方法，既能快速獲得大量的無(wú)菌植株，又能保持遺傳性狀的穩(wěn)定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明克服了上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種鐵皮石斛利用莖段薄片進(jìn)行擴(kuò)繁的方法。本發(fā)明首先將鐵皮石斛莖段切割成厚度0.2cm以上的莖段薄片，接種于接種培養(yǎng)基上不經(jīng)歷愈傷組織階段直接分化獲得無(wú)菌苗，當(dāng)無(wú)菌苗長(zhǎng)至3-5片葉時(shí)，移植到增殖培養(yǎng)基上，可快速獲得大量無(wú)菌苗。利用該方法進(jìn)行鐵皮石斛的組織培養(yǎng)擴(kuò)繁，可節(jié)約從田間鐵皮石斛植株獲得無(wú)菌苗的時(shí)間，快速獲得大量遺傳背景一致的種苗群體，滿足商品苗對(duì)擴(kuò)繁一致性、穩(wěn)定性的要求。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種鐵皮石斛利用莖段薄片擴(kuò)繁的方法,其特征是,

1)培養(yǎng)基制備

接種培養(yǎng)基為：ms+6-ba0.125-0.25mg/l+naa0.125-0.375mg/l+2,4-d0.5-1.5mg/l+kt0.125-0.25mg/l；

增殖培養(yǎng)基為：蒸餾水+花寶1號(hào)1.4-1.6g/l+花寶2號(hào)0.30-0.35g/l+牛骨蛋白胨1.5-1.6g/l+活性炭1.5-1.6g/l+ms母液中的6、7部分各10-12ml/l+蔗糖18-20g/l+瓊脂粉5.5-6.0g/l+香蕉泥100-120g；

2)外植體預(yù)處理與接種培養(yǎng)

采用健康鐵皮石斛的莖段作為外植體，將外植體洗滌、滅菌后將莖段橫切為厚度0.2cm以上的莖段薄片，然后接種于接種培養(yǎng)基上光培養(yǎng)25±2天，即可見(jiàn)到芽，繼續(xù)光培養(yǎng)使石斛在組培瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)，至55天左右時(shí)，無(wú)菌苗可長(zhǎng)出3-5片葉，可進(jìn)行增殖；

3)無(wú)菌苗接種

當(dāng)無(wú)菌苗長(zhǎng)出3-5片葉時(shí)，將無(wú)菌苗移植到裝有增殖培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶中，光培養(yǎng)15-25天，每棵無(wú)菌苗可分生出20-30棵小苗；

4)壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和出瓶煉苗

將增殖的鐵皮石斛苗經(jīng)壯苗培養(yǎng)8-15天，生根培養(yǎng)3-8天；然后選取根系發(fā)達(dá)及健壯的鐵皮石斛放在溫室馴化2-3天；清洗干凈根部的培養(yǎng)基，移栽至已澆透水的樹(shù)皮基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)至植株長(zhǎng)大。

所述步驟2)的滅菌優(yōu)選為：用75％酒精滅菌30s，后用無(wú)菌水沖洗1次；用0.1％升汞溶液滅菌8min，用無(wú)菌水沖洗3次。

所述步驟3)所述組織培養(yǎng)瓶，規(guī)格有兩種，一種瓶上下內(nèi)徑5.5cm，高9.5cm；另一種瓶上口徑4cm，下瓶徑8.5cm，高13.5cm，根據(jù)增殖系數(shù)選擇適宜的組培瓶，一瓶可接種3-4棵石斛。

所述步驟4)的壯苗培養(yǎng)為：將增殖的鐵皮石斛苗轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1500-1800lux，培養(yǎng)8-15d；所述壯苗培養(yǎng)基為：ms+iba0.3mg/l+naa0.4mg/l+2,4-d0.7mg/l+活性炭5g/l+瓊脂30g/l+香蕉泥20g/l，ph值為5.0-5.5。

所述步驟4)的生根培養(yǎng)為：于生根培養(yǎng)基上光照強(qiáng)度為2500-4500lx下培養(yǎng)3-8天；生根培養(yǎng)基為：ms+iba3mg/l+naa1mg/l+2,4-d0.2mg/l+活性炭10g/l+瓊脂30g/l+香蕉泥20g/l。

優(yōu)選的，所述步驟1)的接種培養(yǎng)基為：ms+6-ba0.125mg/l+naa0.125mg/l+2,4-d0.5mg/l+kt0.125mg/l。

優(yōu)選的，所述步驟1)的增殖培養(yǎng)基為：蒸餾水+花寶1號(hào)1.4g/l+花寶2號(hào)0.30g/l+牛骨蛋白胨1.5g/l+活性炭1.5g/l+ms母液中的6、7部分各取10ml/l+蔗糖18g/l+瓊脂粉5.5g/l+香蕉泥100g/l。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明采用莖段薄片0.2cm以上即可，不需要必須有節(jié)點(diǎn)，大大增加了外植體的獲取數(shù)量，進(jìn)而有利于獲得大量遺傳背景一致的無(wú)菌苗；

(2)采用本發(fā)明的接種培養(yǎng)基，可以不用經(jīng)過(guò)愈傷培養(yǎng)、分化培養(yǎng)，從外植體莖段(不要求有節(jié)點(diǎn))直接獲得無(wú)菌苗，節(jié)約了獲得無(wú)菌苗的時(shí)間，提高了效率；

(3)傳統(tǒng)的增殖培養(yǎng)基僅能分化出2-3棵小苗，繁殖系數(shù)低。難以滿足新品種推廣中種苗需求量大的需要。本發(fā)明采用增殖專用培養(yǎng)基每棵無(wú)菌苗可分生出20-30棵小苗；滿足了商品化生產(chǎn)要求。

綜上，本發(fā)明采用0.2cm以上莖段薄片作為外植體，采用本發(fā)明的接種培養(yǎng)基不經(jīng)過(guò)愈傷培養(yǎng)、分化培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗；再采用本發(fā)明的增殖專用培養(yǎng)基每棵無(wú)菌苗可分生出20-30棵小苗，可節(jié)約從田間鐵皮石斛植株獲得無(wú)菌苗的時(shí)間，快速獲得大量遺傳背景一致的種苗群體，滿足商品苗對(duì)擴(kuò)繁一致性、穩(wěn)定性的要求。

附圖說(shuō)明

圖1為篩選可以分化出無(wú)菌苗的最薄莖段圖；兩個(gè)鐵皮石斛地方栽培種(福建栽培種和廣西栽培種)，圖中顯示莖段厚度0.2cm時(shí)均可直接分化出無(wú)菌苗。圖1中a、b、c為鐵皮石斛福建栽培種1cm、0.5cm、0.2cm莖段直接分化出無(wú)菌苗照片；d、e為鐵皮石斛廣西栽培種1cm、0.2cm莖段直接分化出無(wú)菌苗照片。

圖2為本發(fā)明與對(duì)照組增殖培養(yǎng)基增殖效果對(duì)比圖；其中左圖采用的是對(duì)照培養(yǎng)基培養(yǎng)的無(wú)菌苗，右圖為本發(fā)明的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)的無(wú)菌苗。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)說(shuō)明其效果。其中6-ba：6-芐氨基腺嘌呤；naa：萘乙酸；2,4-d：2,4-二氯苯氧乙酸；kt：激動(dòng)素，6-糖基氨基嘌呤；iba：吲哚丁酸。

ms母液中的6部分為：硼酸0.62g/l，硫酸錳1.86g/l，硫酸鋅0.86g/l，碘化鉀0.083g/l，鉬酸鈉0.025g/l，硫酸銅0.0125g/l，氯化鈷0.0125g/l，其余為水。

ms母液中的7部分為：肌醇10g/l，甘氨酸0.2g/l，煙酸0.05g/l，鹽酸吡哆辛0.03g/l，鹽酸硫胺素0.02g/l，其余為水。

實(shí)施1：莖段薄片分化培養(yǎng)基篩選

(1)選配培養(yǎng)基

將鐵皮石斛莖段用洗衣粉溶液浸泡20分鐘，后用流水沖洗20分鐘；然后用75％酒精滅菌30s，后用無(wú)菌水沖洗1次；用0.1％升汞溶液滅菌8min，用無(wú)菌水沖洗3次；然后將莖段切割成1cm左右的莖段(沒(méi)有節(jié)間)，每瓶放置3-4段，放置在如表1所示的不同配方培養(yǎng)基上，每個(gè)處理重復(fù)4瓶。統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基配方對(duì)沒(méi)有節(jié)間的鐵皮石斛莖段的分化率，結(jié)果如表1所示。

表1不同培養(yǎng)基配方及分化效率

從表1可以看出：處理6和處理11均具有較高分化率，而處理6培養(yǎng)基的激素含量較少，因此選擇處理6為最適分化培養(yǎng)基。

(2)篩選可以分化出無(wú)菌苗的最薄莖段

利用兩個(gè)鐵皮石斛地方栽培種(福建栽培種和廣西栽培種)進(jìn)行如上所示的洗滌和消毒，莖段滅菌后切割成0.2cm、0.5cm、1cm的莖段，不考慮是否有節(jié)間，然后放置于上述處理6的培養(yǎng)基中光培養(yǎng)25±2天，篩選可以分化出無(wú)菌苗的最薄莖段；篩選結(jié)果如圖1所示，從圖1可以看出：0.2cm厚度無(wú)節(jié)間的莖段(圖1中c和e)即可滿足要求。

(3)增殖培養(yǎng)基制備

對(duì)照為報(bào)道的培養(yǎng)基配方：ms+香蕉100g/l+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l。

本發(fā)明增殖專用培養(yǎng)基：蒸餾水+花寶1號(hào)1.4g/l+花寶2號(hào)0.3g/l+牛骨蛋白胨1.5g/l+活性炭1.5g/l+ms母液中的6、7部分各取10ml/l+蔗糖18g/l+瓊脂粉5.5g/l+香蕉泥100g/l。

當(dāng)無(wú)菌苗長(zhǎng)至3-5片葉時(shí)，在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)分別將無(wú)菌苗接種到本發(fā)明增殖專用培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基上，一瓶可接種3-4棵；光培養(yǎng)20天，觀察結(jié)果，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出：采用本發(fā)明的增殖專用培養(yǎng)基每棵無(wú)菌苗可分生出20-30棵小苗；而對(duì)照組每棵無(wú)菌苗可分生出2-3棵小苗。

實(shí)例2

1)培養(yǎng)基制備

接種培養(yǎng)基為：ms+6-ba0.125mg/l+naa0.125mg/l+2,4-d0.5mg/l+kt0.125mg/l；

2)外植體選取與預(yù)處理

選取健康的鐵皮石斛植株，用洗衣粉溶液浸泡20分鐘，后用流水沖洗20分鐘，備用；

3)外植體滅菌

用75％酒精滅菌30s，后用無(wú)菌水沖洗1次；用0.1％升汞溶液滅菌8min，用無(wú)菌水沖洗3次；

4)接種

在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)對(duì)已滅菌的鐵皮石斛莖段橫切為厚度0.2cm以上的莖段薄片，用鑷子將莖段薄片輕輕放在接種培養(yǎng)基(培養(yǎng)基裝在組培瓶?jī)?nèi))上，輕壓使之與接種培養(yǎng)基緊貼；

5)培養(yǎng)環(huán)境控制

光培養(yǎng)25天，即可見(jiàn)到芽，繼續(xù)光培養(yǎng)使石斛在組培瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)，至55天左右時(shí)，無(wú)菌苗可長(zhǎng)出3-5片葉，可用于進(jìn)行增殖；

6)增殖培養(yǎng)基制備

增殖培養(yǎng)基：蒸餾水+花寶1號(hào)1.4g/l+花寶2號(hào)0.3g/l+牛骨蛋白胨1.5g/l+活性炭1.5g/l+ms母液中的6-7部分各取10ml+蔗糖18g/l+瓊脂粉5.5g/l+香蕉泥100g/l；

7)接種

當(dāng)無(wú)菌苗長(zhǎng)至3-5片葉時(shí)，在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)將無(wú)菌苗移植到增殖培養(yǎng)基上，一瓶可接種3-4棵；組培瓶規(guī)格有兩種，一種瓶上下內(nèi)徑5.5cm，高9.5cm；另一種瓶上口徑4cm，下瓶徑8.5cm，高13.5cm；

8)培養(yǎng)環(huán)境控制

光培養(yǎng)15-25天，每棵無(wú)菌苗可分生出20-30棵小苗；

9)壯苗培養(yǎng)

將增殖的鐵皮石斛苗轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1500-1800lux，培養(yǎng)8-15d；

所述壯苗培養(yǎng)基為：ms+iba0.3mg/l+naa0.4mg/l+2,4-d0.7mg/l+活性炭5g/l+瓊脂30g/l+香蕉泥20g/l，ph值為5.0-5.5；

10)生根培養(yǎng)

然后于生根培養(yǎng)基上光照強(qiáng)度為2500-4500lx下培養(yǎng)3-8天；生根培養(yǎng)基為：ms+iba3mg/l+naa1mg/l+2,4-d0.2mg/l+活性炭10g/l+瓊脂30g/l+香蕉泥20g/l；

11)出瓶煉苗

選取根系發(fā)達(dá)及健壯的鐵皮石斛放在溫室馴化2-3天，取出幼苗清洗干凈根部的培養(yǎng)基，移栽至已澆透水的樹(shù)皮基質(zhì)中。邊移栽邊覆蓋白色無(wú)紡布遮光。