本發(fā)明涉及植物衰老促進(jìn)劑領(lǐng)域，尤其涉及一種IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

葉片衰老是影響農(nóng)作物產(chǎn)量、品質(zhì)等農(nóng)藝性狀的重要因素。以煙草為例，煙草是重要經(jīng)濟(jì)作物，葉片是其收獲器官，隨著煙草進(jìn)入生育后期，葉片進(jìn)入衰老階段，煙草上部、中部、下部葉片成熟時(shí)期不相同，通常，生產(chǎn)上采用不同部位不同時(shí)期采收的策略完成，拖延了采收時(shí)間；另一方面，環(huán)境因素如接近采收時(shí)期連續(xù)雨天可能會(huì)造成煙葉“二次返青”影響采收。因此，利用衰老促進(jìn)劑，可以促進(jìn)植物葉片衰老，可有效解決不同部位煙草葉片成熟度不一致及返青問(wèn)題。

目前，對(duì)植物衰老控制的應(yīng)用主要集中在對(duì)植物激素的調(diào)節(jié)方面，生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等可抑制葉片衰老，乙烯、脫落酸可促進(jìn)葉片衰老；人為減緩葉片衰老進(jìn)程，一方面可以通過(guò)減少衰老促進(jìn)激素的合成或代謝，另一方面也可增加衰老抑制激素的合成或代謝。

衰老相關(guān)的功能解析的工作已較廣泛和深入的開(kāi)展，大量促進(jìn)葉片衰老的基因被功能解析。例如，擬南芥2-氧化戊二酸依賴(lài)的雙加氧酶基因缺失會(huì)使葉片衰老延遲表型；地塞米松(DEX)誘導(dǎo)該基因過(guò)量表達(dá)后，可使轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片衰老提前；擬南芥AtNAC家族成員NAP基因過(guò)量表達(dá)可使葉片提早衰老，而NAP基因缺失突變體則推遲衰老，同樣，在水稻中該基因也能夠影響葉片衰老；除此之外，植物小RNA，WRKY等轉(zhuǎn)錄因子家族等都可調(diào)控葉片的衰老。但至目前，已報(bào)道的衰老相關(guān)基因真正直接應(yīng)用到作物生產(chǎn)中的還鮮有報(bào)道。

多肽是動(dòng)植物體內(nèi)的一類(lèi)具有調(diào)控作用的小分子物質(zhì)，植物多肽參與了多項(xiàng)發(fā)育過(guò)程，例如根分生組織發(fā)育、莖端分生組織發(fā)育等，但植物多肽是否參與衰老，還未見(jiàn)報(bào)道，成熟多肽是由前體蛋白經(jīng)過(guò)翻譯后剪切、修飾，最終形成只有較短氨基酸組成的功能分子，作為配體與定位在細(xì)胞膜上的受體識(shí)別，啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。成熟多肽直接外施對(duì)植物生長(zhǎng)可產(chǎn)生影響，如根的伸長(zhǎng)。目前成熟多肽在植物尤其是作物上的應(yīng)用研究很少，目前更沒(méi)有將其應(yīng)用在促進(jìn)植物衰老方面的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑、制備方法及應(yīng)用。該IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑可以促進(jìn)植物的葉片衰老，使其衰老加速，并且無(wú)其它額外不良表型。

本發(fā)明一方面提供了IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑，該植物衰老促進(jìn)劑功能成份為IDL4成熟多肽，IDL4成熟多肽的氨基酸序列為Pro-Val-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Ser-Arg-Lys-His-Asn。

優(yōu)選的，所述IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑包括：IDL4成熟多肽，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液為2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物溶解于1/2MS液體培養(yǎng)基或MS液體培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，所述IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑中，IDL4成熟多肽的濃度為8-10μmol/L，2-(N-嗎啉)乙磺酸的濃度為2.5-3mmol/L，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH為5.8-6。

更優(yōu)選的，所述IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑中，IDL4成熟多肽的濃度為10μmol/L，2-(N-嗎啉)乙磺酸的濃度為3mmol/L，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH為5.8。

優(yōu)選的，本發(fā)明的IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑還可加入助劑，優(yōu)選的，助劑為T(mén)riton X-100，加入量為植物衰老促進(jìn)劑總量的1-3‰。

本發(fā)明另一方面提供了IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑的制備方法，具體的，該方法包括如下步驟：

(1)稱(chēng)量IDL4成熟多肽粉末溶解在水或二甲基亞砜溶劑中，配制成濃度為8-10mmol/L的IDL4成熟多肽母液備用；

(2)配制1/2MS液體培養(yǎng)基或MS液體培養(yǎng)基，稱(chēng)取定量的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物，加入到上述1/2MS液體培養(yǎng)基或MS液體培養(yǎng)基中，配制成2.5-3mmol/L的溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值為5.8-6，充分混合溶解均勻得到2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；

(3)將步驟(1)得到的IDL4成熟多肽母液加入到步驟(2)制得的2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液中，IDL4成熟多肽母液與2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液體積比為1:1000，玻璃棒攪拌均勻，得到IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑。

優(yōu)選的，步驟(1)中溶劑為二甲基亞砜；步驟(2)中優(yōu)選1/2MS液體培養(yǎng)基；步驟(3)中IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑中加入1-3‰的Triton X-100，用玻璃棒攪拌均勻。

優(yōu)選的，步驟(1)中IDL4成熟多肽母液現(xiàn)用現(xiàn)配，若超過(guò)一月不使用，母液-70℃儲(chǔ)存；若一月之內(nèi)使用，母液-20℃儲(chǔ)存。

本發(fā)明的另一方面還提供了上述IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑在促進(jìn)植物衰老方面的應(yīng)用，施用于植物的葉面，具體的，施用方法為：直接葉面噴灑或用IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑浸泡棉球涂抹葉面，植物葉片完全伸展時(shí)期即可使用，優(yōu)選的，煙草可在成熟前期葉面施用。

本發(fā)明的有益效果在于：(1)本發(fā)明的IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑中的IDL4成熟多肽人工合成方便，獲取便利，可大批量合成；(2)本發(fā)明的植物衰老促進(jìn)劑的配制和使用方法簡(jiǎn)單，田間可操作性強(qiáng)，對(duì)于施用人員不需要經(jīng)過(guò)特殊培訓(xùn)，操作便利、實(shí)用；(3)本發(fā)明的植物衰老促進(jìn)劑對(duì)葉片衰老影響適度，不會(huì)造成不良反應(yīng)，效果有益。

附圖說(shuō)明

圖1為擬南芥上IDL4基因缺失延遲葉片衰老示意圖；

圖2為人工合成的IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑處理擬南芥及煙草離體葉片結(jié)果示意圖；

圖3為IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑處理活體煙草葉片結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑，包括IDL4成熟多肽，IDL4成熟多肽的氨基酸序列為P-V-P-A-S-A-P-S-R-K-H-N，具體的，氨基酸序列為Pro-Val-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Ser-Arg-Lys-His-Asn，該植物衰老促進(jìn)劑包括：8-10μmol/L IDL4成熟多肽，2.5-3mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液為2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液一水合物溶解于1/2MS液體培養(yǎng)基或MS液體培養(yǎng)基，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH為5.8-6。

可以理解的是，IDL4成熟多肽的濃度可以為8、9、10μmol/L，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的濃度可以為2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3mmol/L，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH可以為5.8、5.9、6。

具體的，在本發(fā)明的上述實(shí)施例中，IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑還包括助劑，所述助劑可以為本領(lǐng)域用于葉面潤(rùn)濕和葉面延展的常規(guī)助劑，本發(fā)明加入的助劑為T(mén)riton X-100，加入量為植物衰老促進(jìn)劑總量的1-3‰，但是可以理解的是，本領(lǐng)域任何常用的葉面用助劑均可加入從而促進(jìn)本發(fā)明的IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑的應(yīng)用，例如本領(lǐng)域的表面活性劑、延展劑、潤(rùn)濕劑等。

本發(fā)明的又一實(shí)施例提供了IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑的制備方法，具體的，該方法包括如下步驟：

S1稱(chēng)量IDL4成熟多肽粉末溶解在水或二甲基亞砜溶劑中，配制成濃度為8-10mmol/L的IDL4成熟多肽母液備用。

在本步驟中，由于二甲基亞砜對(duì)多肽的溶解性能更好，可以更好的促進(jìn)多肽的溶解，更好的促進(jìn)多肽提供相應(yīng)功能。由于IDL4成熟多肽對(duì)儲(chǔ)存溫度有較高要求(不易在室溫放置超過(guò)24小時(shí))，因此IDL4成熟多肽母液現(xiàn)用現(xiàn)配，若超過(guò)一月不使用，母液-70℃儲(chǔ)存；若一月之內(nèi)使用，母液-20℃儲(chǔ)存。

S2配制1/2MS液體培養(yǎng)基或MS液體培養(yǎng)基，稱(chēng)取定量的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物，加入到上述1/2MS液體培養(yǎng)基或MS液體培養(yǎng)基中，配制成2.5-3mmol/L的溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值為5.8-6，充分混合溶解均勻得到2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液。

本步驟中MS或1/2MS液體培養(yǎng)基不僅能夠充分溶解2-(N-嗎啉)乙磺酸，從而保證在植物表面形成一定的滲透式，為多肽的作用提供基礎(chǔ)，同時(shí)，該液體培養(yǎng)基作為溶劑還能提供相應(yīng)的大中量元素營(yíng)養(yǎng)，保證作用效果。

S3將步驟(1)得到的IDL4成熟多肽母液加入到步驟(2)制得的2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液中，IDL4成熟多肽母液與2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液體積比為1:1000，玻璃棒攪拌均勻，得到IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑。

本步驟中可加入1-3‰的Triton X-100，相應(yīng)的助劑能夠促進(jìn)上述溶液盡快的在植物表面進(jìn)行延展和滲透濕潤(rùn)。本步驟即為將IDL4成熟多肽母液用2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液稀釋1000倍。

本發(fā)明的又一實(shí)施例提供了該IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑在促進(jìn)植物衰老方面的應(yīng)用，施用方法為：直接葉面噴灑或用IDL4成熟多肽促進(jìn)劑浸泡棉球涂抹葉面，植物葉片完全伸展時(shí)期即可使用，優(yōu)選的，煙草可在成熟前期葉面施用。

噴灑或浸泡該IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑的棉球涂抹植物葉片，可使植物生長(zhǎng)狀態(tài)不受影響的前提下，促進(jìn)植物葉片衰老，特別有利于葉片不同步衰老作物的一致性采收，例如煙草。

上述實(shí)施例的IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑中IDL4成熟多肽人工合成方便，獲取便利，可大批量合成；配制和使用方法簡(jiǎn)單，田間可操作性強(qiáng)，對(duì)于施用人員不需要經(jīng)過(guò)特殊培訓(xùn)，操作便利、實(shí)用；該植物衰老抑制劑對(duì)葉片衰老影響適度，不會(huì)造成不良反應(yīng)，尤其在煙草上具備顯著的應(yīng)用效果。

為了更清楚詳細(xì)地介紹本發(fā)明實(shí)施例所提供的IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑，下面將結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行描述。

實(shí)施例1

IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑，包括：10μmol/L IDL4成熟多肽，3mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液為2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液一水合物溶解于1/2MS液體培養(yǎng)基或MS液體培養(yǎng)基，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH為5.8。

制備方法如下：

(1)稱(chēng)量IDL4成熟多肽粉末溶解在二甲基亞砜溶劑中，配制成濃度為10mmol/L的IDL4成熟多肽母液備用；

(2)配制1/2MS液體培養(yǎng)基，稱(chēng)取定量的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物，加入到上述1/2MS液體培養(yǎng)基中，配制成3mmol/L的溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值為5.8，充分混合溶解均勻得到2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；

(3)將步驟(1)得到的IDL4成熟多肽母液取50μL加入到步驟(2)制得的2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液50mL中，玻璃棒攪拌均勻，得到50mL的IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑。

實(shí)施例2

IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑，包括：8μmol/L IDL4成熟多肽，2.5mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液為2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液一水合物溶解于MS液體培養(yǎng)基，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH為5.9。

制備方法如下：

(1)稱(chēng)量IDL4成熟多肽粉末溶解在二甲基亞砜溶劑中，配制成濃度為8mmol/L的IDL4成熟多肽母液備用；

(2)配制MS液體培養(yǎng)基，稱(chēng)取定量的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物，加入到上述MS液體培養(yǎng)基中，配制成2.5mmol/L的溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值為5.9，充分混合溶解均勻得到2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；

(3)將步驟(1)得到的IDL4成熟多肽母液取100μL加入到步驟(2)制得的2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液100mL中，玻璃棒攪拌均勻，得到100mL的IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑。

實(shí)施例3

IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑，包括：9μmol/L IDL4成熟多肽，2.7mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液為2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液一水合物溶解于MS液體培養(yǎng)基，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH為6。

制備方法如下：

(1)稱(chēng)量IDL4成熟多肽粉末溶解在水中，配制成濃度為9mmol/L的IDL4成熟多肽母液備用；

(2)配制1/2MS液體培養(yǎng)基，稱(chēng)取定量的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物，加入到上述1/2MS液體培養(yǎng)基中，配制成2.7mmol/L的溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值為6，充分混合溶解均勻得到2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；

(3)將步驟(1)得到的IDL4成熟多肽母液取20μL加入到步驟(2)制得的2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液20mL中，玻璃棒攪拌均勻，加入1‰的Triton X-100，得到20mL的IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑。

實(shí)施例4

IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑，包括：9μmol/L IDL4成熟多肽，2.7mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液為2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液一水合物溶解于MS液體培養(yǎng)基，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH為6。

制備方法如下：

(1)稱(chēng)量IDL4成熟多肽粉末溶解在水中，配制成濃度為9mmol/L的IDL4成熟多肽母液備用；

(2)配制1/2MS液體培養(yǎng)基，稱(chēng)取定量的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物，加入到上述1/2MS液體培養(yǎng)基中，配制成2.7mmol/L的溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值為6，充分混合溶解均勻得到2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；

(3)將步驟(1)得到的IDL4成熟多肽母液取200μL加入到步驟(2)制得的2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液200mL中，玻璃棒攪拌均勻，加入3‰的Triton X-100，得到200mL的IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑。

試驗(yàn)測(cè)試

通過(guò)進(jìn)行擬南芥上IDL4基因缺失處理，參見(jiàn)圖1。模式雙子葉植物擬南芥中IDL4基因缺失突變體idl4，與野生型對(duì)照在相同條件下表型分析：持續(xù)光照生長(zhǎng)25天，植物材料生長(zhǎng)狀態(tài)整體表型觀察及葉片采摘后比較觀察，結(jié)果表明，圖1的A、B圖可以看出IDL4基因缺失突變體延遲葉片衰老，同時(shí)，利用乙醇法測(cè)定不同材料相同葉位(第6葉位)葉綠素含量，進(jìn)一步分析各材料衰老表征參數(shù)，結(jié)果如圖1的C圖，野生型較idl4突變體葉綠素含量偏低；另外，對(duì)不同材料各取30株統(tǒng)計(jì)，對(duì)葉片衰老情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)圖1的D圖表明野生型較idl4突變體葉片衰老較為明顯，綜上說(shuō)明，當(dāng)IDL4基因缺失后，植物表現(xiàn)出了晚衰的癥狀，進(jìn)一步說(shuō)明IDL4多肽在促進(jìn)葉片衰老方面的作用。

取實(shí)施例1制備的IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑，按照施用方法分別處理擬南芥、煙草的離體葉片和煙草的活體葉片。

處理1：處理擬南芥葉片：持續(xù)光照生長(zhǎng)擬南芥35天左右，獲取同葉位離體葉片(第六葉位)，將其平放在濾紙上，多肽試劑均勻、充分噴灑，同時(shí)，對(duì)照為3mM 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)處理，1/2MS水溶液處理，觀察表型。

處理2：煙草旺長(zhǎng)期，處理離體葉片，處理方式為噴灑，對(duì)照與處理1相同處理

處理3：煙草旺長(zhǎng)期，處理煙草活體葉片，處理方式為用棉球涂抹煙草葉片，對(duì)照與處理1相同處理，表型觀察。

參見(jiàn)圖2，用鑷子選取長(zhǎng)勢(shì)一致的相同葉位(第六蓮座葉)擬南芥葉片，較規(guī)則的放在培養(yǎng)皿中，IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑以噴灑的方式處理，同時(shí)加對(duì)照相同方式處理，持續(xù)光照下放置5天，結(jié)果可以看出，圖A、B表明IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑促進(jìn)擬南芥葉片衰老，擬南芥離體葉片3天后噴灑有IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑的葉片有明顯早衰表型，同時(shí)利用乙醇法測(cè)定葉綠色含量，發(fā)現(xiàn)對(duì)照較IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑處理的葉片葉綠素含量明顯多；另外，圖C表明IDL4成熟多肽衰老促進(jìn)劑促進(jìn)煙草葉片衰老，選取旺長(zhǎng)期煙草長(zhǎng)勢(shì)一致的葉片，利用IDL4衰老促進(jìn)劑及對(duì)照噴灑，煙草離體葉片5天后有可見(jiàn)早衰性狀。綜上表明，IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑對(duì)植物離體葉片有促進(jìn)衰老的作用。

參見(jiàn)圖3，以生長(zhǎng)在持續(xù)光照，27℃條件下生長(zhǎng)約25天的本氏煙草為材料，棉球浸泡分別在IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑工作液及對(duì)照中5分鐘，使其完全浸透，處理過(guò)的棉球處理活體煙草葉片13天后有可見(jiàn)早衰性狀，參見(jiàn)圖A；同時(shí)，利用乙醇法測(cè)定涂抹IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑及對(duì)照后13、21天煙草葉片葉綠素含量，結(jié)果表明與對(duì)照相比，IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑處理后的煙草葉片葉綠素含量都降低，參見(jiàn)圖B。綜上表明，IDL4成熟多肽植物衰老促進(jìn)劑確實(shí)對(duì)活體植物葉片有明顯促進(jìn)衰老的作用。