本發(fā)明屬于實驗動物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種短期內(nèi)使大鼠具有高脂血癥病理特征的方法；該模型可用于預防高脂血癥功能性食品的研究，也可用于降低血脂藥物的篩選、藥效評價及藥理研究等領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，高脂血癥的發(fā)病率在逐年上升。高脂血癥是脂質(zhì)代謝或運轉(zhuǎn)異常的一種全身性疾病，即血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的增高以及高密度脂蛋白的降低，是脂代謝紊亂的標志，也是動脈粥樣硬化、心臟病、中風和脂肪肝的主要誘因之一，嚴重威脅人類健康。尋找安全有效的降血脂藥物一直是藥學領(lǐng)域的研究重點，如何通過合理的膳食配方來預防高脂血癥也是營養(yǎng)學領(lǐng)域始終關(guān)注的問題，而動物模型在上述研究中必不可少。目前，臨床上根據(jù)血脂水平可將高脂血癥分為以下四類：①高膽固醇血癥：血清總膽固醇水平增高；②混合型高脂血癥：血清總膽固醇與甘油三酯水平均增高；③高甘油三酯血癥：血清甘油三酯水平增高；④低高密度脂蛋白血癥：血清高密度脂蛋白膽固醇水平減低。在目前應用的高血脂癥模型動物中，主要有先天性、轉(zhuǎn)基因和化學物質(zhì)誘導三大類實驗性動物模型。先天性和轉(zhuǎn)基因動物模型穩(wěn)定性較好，比較接近人類發(fā)病機制，但由于成模較難，生產(chǎn)周期長，價格昂貴，限制了這兩類模型的應用；而化學物質(zhì)誘導的實驗動物模型，尤其是高脂飼料飼養(yǎng)或脂肪乳灌胃形成的實驗動物模型在國內(nèi)應用展為廣泛。化學物質(zhì)誘導的高脂血癥模型主要考慮兩個關(guān)鍵因素：一是肝臟合成膽固醇的量占膽固醇總合成量的比例越小越好；二是增加飼料中膽固醇含量不引起膽汁酸合成增加，不擴充膽固醇代謝池，也不因此抑制低密度脂蛋白受體活性，甚至完全抑制肝膽固醇的合成。由高脂飼料或者脂肪乳劑喂養(yǎng)形成的模型是經(jīng)消化道給予，形成時間相對較長，與人類由于膳食結(jié)構(gòu)改變而形成的高脂血癥相似，對于研究營養(yǎng)因素對高血脂癥形成的影響以及調(diào)血脂藥物的開發(fā)具有很高的應用價值。但是，目前以高脂飼料飼喂形成高脂血癥大鼠模型一般需要6-8周的飼養(yǎng)時間，周期過長，相對費用也高；脂肪乳灌胃形成的高脂血癥大鼠模型則存在血清總膽固醇波動性下降等不穩(wěn)定情況。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種短期內(nèi)建立高脂血癥大鼠模型的方法，該方法建模周期短、成本相對低。

一種短期內(nèi)建立高脂血癥大鼠模型的方法，連續(xù)給大鼠飼喂高脂日糧21天，自由飲水；同時每天將按配方配制的脂肪乳按照2mL/100g?day劑量灌胃給大鼠；

所述的大鼠為雄性Sprague Dawley大鼠，體重150±20g；

所述的脂肪乳配方按質(zhì)量體積比為20%吐溫80、20%豬油、10%膽固醇、2%膽酸鈉、20%丙二醇、20%葡萄糖、1%丙基硫氧嘧啶，余量為水。

所述的脂肪乳配制方法如下所述：

1）首先將豬油在80℃水浴中攪拌加熱融化；

2）于液體狀的豬油中加入膽固醇、丙基硫氧嘧啶和葡萄糖，充分攪拌溶解；

3）再加入膽酸鈉和適量蒸餾水，充分攪拌使膽鹽溶解；

4）再加入丙二醇和吐溫80，充分攪拌直至產(chǎn)生乳化現(xiàn)象；

5）緩慢加入37℃的溫水稀釋至100mL。

所述的高脂日糧配方按質(zhì)量百分比為23.31%酪蛋白、0.35% L-胱氨酸、8.48%玉米淀粉、11.65%麥芽糊精、20.17%蔗糖、5.83%纖維素、2.91%大豆油、20.68%豬油、5.23%復合礦物質(zhì)、1.16%復合維生素、0.23%酒石酸氫膽堿。

在大鼠飼喂開始后第10天，大鼠即出現(xiàn)了以血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇升高、高密度脂蛋白膽固醇降低的癥狀，該癥狀一直持續(xù)到開始后的第14天~第21天；同時，伴隨血清中載脂蛋白A1的降低和載脂蛋白B的升高；并且在大鼠飼喂開始后的第21天，大鼠肝臟出現(xiàn)以彌漫性脂質(zhì)變性和脂肪空泡為特征的病理改變。

本發(fā)明的有益效果：

短期內(nèi)即可形成混合型高脂血癥病理癥狀，其癥狀可持續(xù)穩(wěn)定三周以上的高脂血癥大鼠模型形成方法，克服了傳統(tǒng)方法建模所需時間長、費用過高、血脂水平參差不齊等缺點。采用上述方法誘導建立大鼠高脂血癥動物模型周期短，費用低，重現(xiàn)性好，能較好的模擬人類發(fā)病狀態(tài)，因此，即可用于預防高脂血癥功能性食品的研究，也可用于降低血脂藥物的篩選。

附圖說明

圖1 是試驗期內(nèi)大鼠生長曲線；

圖2 是大鼠血清中總膽固醇濃度；

圖3 是大鼠血清中甘油三酯濃度；

圖4 是大鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇濃度；

圖5 是大鼠血清中高密度脂蛋白膽固醇濃度；

圖6 是大鼠血清中載脂蛋白A1濃度；

圖7 是大鼠血清中載脂蛋白B濃度；

圖8 是大鼠肝臟顏色及組織HE染色切片，其中A部分為對照組和模型組大鼠肝臟顏色，B部分為對照組和模型組大鼠肝臟組織切片HE染色（×200）。

具體實施方式

設計飼料配方：對照組和模型組大鼠飼喂的飼料分別為正常飼料和高脂飼料，具體組分按照表1所列比例進行配制。

設計脂肪乳配方：模型組大鼠灌胃用脂肪乳根據(jù)表2所列比例進行配制。具體配制方法①購買市售豬油，經(jīng)高溫煉制后，冷卻低溫保存?zhèn)溆?；配制脂肪乳時，首先將豬油在80℃水浴中攪拌加熱融化；②于液體狀的豬油中加入膽固醇、丙基硫氧嘧啶和葡萄糖，充分攪拌溶解；③再加入膽酸鈉和適量蒸餾水，充分攪拌使膽鹽溶解；④再加入丙二醇和吐溫80，充分攪拌直至產(chǎn)生乳化現(xiàn)象；⑤緩慢加入37℃的溫水稀釋至100mL，即可成為穩(wěn)定的脂肪乳劑。保存于-20℃冰箱中備用，大鼠灌胃前于80℃水浴中加熱融化。

建模方法：大鼠在溫度22±2℃、濕度52±10%，12h光照與12h黑暗交替的清潔級環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水和采食。對照組大鼠飼喂正常日糧；模型組大鼠飼喂高脂日糧，同時按2mL/100g.day的劑量進行脂肪乳灌胃；飼養(yǎng)期為21天。

實施例1 大鼠生長性能測定

飼養(yǎng)期內(nèi)，每天對各組中的大鼠進行稱重，計算并記錄每組大鼠體重平均值，繪制體重增長曲線，并計算飼養(yǎng)期內(nèi)大鼠的體增重百分比。在整個試驗期（21天）內(nèi)，隨著飼養(yǎng)時間延長，對照組和模型組中大鼠的體重均呈增長趨勢；在實驗第1~14天期間，兩組大鼠體重保持相對一致的增長速度；但從第14天開始，對照組大鼠體重繼續(xù)保持原有速度增長；而模型組大鼠的體重增速開始減緩（圖1）。根據(jù)整個試驗期內(nèi)大鼠的平均體重可知，在試驗第1天、第10天、第14天時，對照組和模型組大鼠的平均體重沒有顯著差異，而在試驗第21天時，對照組大鼠的平均體重顯著高于模型組大鼠；整個試驗期內(nèi)，對照組大鼠平均體增重百分比為48.26%，顯著高于模型組的40.42%（表3）。模型組大鼠在14天后體重增速減慢的原因，可能是大鼠體內(nèi)高脂的環(huán)境影響了脂代謝和血糖的吸收，導致大鼠血脂代謝紊亂，血糖被脂肪團包裹難以吸收，并可能誘發(fā)糖尿病等因素有關(guān)。

表3 大鼠平均體增重百分比

實施例2 大鼠血清中總膽固醇濃度檢測

飼養(yǎng)期內(nèi)，分別在飼養(yǎng)開始第10天、14天和21天采用眼眶后靜脈叢取血方法取各組大鼠血液，靜置凝固后，3000-5000r/min離心10min，取上層血清置于另一離心管中冷凍保存待測；根據(jù)血清中總膽固醇的說明書，采用生化法在全自動生化分析儀上檢測各血清樣本的吸光度，根據(jù)公式計算樣本中總膽固醇濃度。由圖2可知，在第10天、第14天以及第21天取的大鼠血清中，模型組大鼠血清中總膽固醇濃度均顯著高于對照組；第10天、第14天和第21天時，模型組大鼠血清中總膽固醇的濃度比對照組大鼠分別提高了2.96倍、3.14倍和6.33倍。

實施例3 大鼠血清中甘油三酯濃度檢測

根據(jù)血清中甘油三酯測定試劑盒的說明書，采用生化法在全自動生化分析儀上檢測各血清樣本的吸光度，根據(jù)公式計算樣本中甘油三酯濃度。由圖3可知，在第10天、第14天以及第21天取的大鼠血清中，模型組大鼠血清中甘油三酯濃度均顯著高于對照組；第10天、第14天和第21天時，模型組大鼠血清中甘油三酯濃度比對照組大鼠分別提高了80%、81%和98%。

實施例4 大鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇濃度檢測

根據(jù)血清中低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒的說明書，采用生化法在全自動生化分析儀上檢測各血清樣本的吸光度，根據(jù)公式計算樣本中低密度脂蛋白膽固醇濃度。由圖4可知，在第10天、第14天以及第21天取的大鼠血清中，模型組大鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇濃度均顯著高于對照組；第10天、第14天和第21天時，模型組大鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇濃度比對照組大鼠分別提高了12.83倍、8.26倍和21.52倍。

實施例5 大鼠血清中高密度脂蛋白膽固醇濃度檢測

根據(jù)血清中高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒的說明書，采用生化法在全自動生化分析儀上檢測各血清樣本的吸光度，根據(jù)公式計算樣本中高密度脂蛋白膽固醇濃度。由圖5可知，在第10天、第14天以及第21天取的大鼠血清中，模型組大鼠血清中高密度脂蛋白膽固醇濃度均顯著低于對照組；第10天、第14天和第21天時，模型組大鼠血清中高密度脂蛋白膽固醇濃度分別比對照組大鼠降低了18%、42%和25%。

實施例6 大鼠血清中載脂蛋白A1濃度檢測

根據(jù)血清中高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒的說明書，采用生化法在全自動生化分析儀上檢測各血清樣本的吸光度，根據(jù)公式計算樣本中載脂蛋白A1濃度。由圖6可知，在第10天、第14天以及第21天取的大鼠血清中，模型組大鼠血清中載脂蛋白A1濃度均低于對照組；第10天、第14天和第21天時，模型組大鼠血清中載脂蛋白A1濃度分別比對照組大鼠降低了1%、15%和5%。

實施例7 大鼠血清中載脂蛋白B濃度檢測

根據(jù)血清中高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒的說明書，采用生化法在全自動生化分析儀上檢測各血清樣本的吸光度，根據(jù)公式計算樣本中載脂蛋白B濃度。由圖7可知，在第10天、第14天以及第21天取的大鼠血清中，模型組大鼠血清中載脂蛋白B濃度均顯著高于對照組；第10天、第14天和第21天時，模型組大鼠血清中載脂蛋白B濃度分別比對照組大鼠提高了12%、10%和18%。

實施例8 大鼠肝臟組織形態(tài)學觀察

肝臟石蠟切片制作：飼養(yǎng)期結(jié)束后，將大鼠麻醉腹主動脈取血后，解剖取大鼠肝臟，觀察其外形、質(zhì)地和色澤情況，剪取1×1cm肝臟組織置于4%多聚甲醛固定24h。將組織從固定液取出，在通風櫥內(nèi)將肝臟組織修平整，將修切好的組織和對應的標簽放于脫水盒內(nèi)；將脫水盒放進吊籃里于脫水機內(nèi)依次梯度酒精進行脫水：75%酒精4h→85%酒精2h→90%酒精2h→95%酒精1h→無水乙醇I 30min→無水乙醇II 30min→醇苯5-10min→二甲苯I 5-10min→二甲苯II 5-10min→蠟I 1h→蠟II 1h蠟III 1h。將浸好蠟的組織于包埋機內(nèi)進行包埋：先將融化的蠟放入包埋框，待蠟凝固之前將組織從脫水盒內(nèi)取出按照包埋面的要求放入包埋框并貼上對應的標簽；于-20°冰箱冷卻，蠟凝固后將蠟塊從包埋框中取出并修整蠟塊。將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上切片，片厚4μm。切片漂浮于攤片機40℃ 溫水上將組織展平，用載玻片將組織撈起，并放進60℃ 烘箱內(nèi)烤片。

肝臟組織切片HE染色：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ20min→無水乙醇Ⅰ10min→無水乙醇Ⅱ10min→95%酒精5min→90%酒精5min-80%酒精5min→70%酒精5min-蒸餾水洗。切片入Harris蘇木素染3-8min，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗。切片入伊紅染液中染細胞質(zhì)，染色1-3min。將切片依次放入95%酒精I 5min→95%酒精II 5min→無水乙醇Ⅰ5min→無水乙醇Ⅱ5min→二甲苯Ⅰ5min →二甲苯Ⅱ5min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。

肝組織切片的形態(tài)學觀察：采用光學顯微鏡對染色好的肝臟組織切片進行觀察。由圖2中結(jié)果可知，對照組中大鼠肝臟成暗紅色褐色，表面光滑，色澤光亮；模型組大鼠肝臟顏色泛白，表面不光滑（圖8A部分）。在光學顯微鏡下觀察肝臟組織切片，經(jīng)HE染色，細胞漿呈紅色，細胞核呈藍紫色；對照組中大鼠肝臟的細胞漿和細胞核分布均勻，肝細胞的大小一致，肝索排列整齊，肝竇清晰呈長條狀；模型組大鼠肝細胞腫脹，有大量大小不一的空泡狀脂肪滴，將細胞核推擠到一側(cè)，肝索排列紊亂，肝竇變小或消失（圖8B部分）。

最后應當說明的是，以上內(nèi)容僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)進行的若干改進與潤飾，均視為本發(fā)明的保護范圍。