殺蟲(chóng)劑的篩選測(cè)定法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多肽，優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅的多肽(DmShal)作為殺蟲(chóng)劑的靶標(biāo)。
【專利說(shuō)明】殺蟲(chóng)劑的篩選測(cè)定法
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年11月5日、發(fā)明名稱為"殺蟲(chóng)劑的篩選測(cè)定法"的中國(guó) 專利申請(qǐng)200980153714. 3 (國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2009/064700)的分案申請(qǐng)。
[0002] 本發(fā)明涉及作為殺蟲(chóng)劑祀標(biāo)的優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅（Drosophila melanogaster)的 具有電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）活性的（DmShal)鉀通道。在 一個(gè)實(shí)施方案中，電壓門(mén)控性鉀通道Shal與其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白），優(yōu) 選地其假定的輔助蛋白CG5890,果蠅屬KChIP(鉀通道相互作用蛋白）直向同源物共表達(dá)。
[0003] 本發(fā)明提供具有優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅（DmShal)昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道 Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）及其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白），優(yōu)選其 假定的輔助蛋白CG5890,果蠅屬KChIP (鉀通道相互作用蛋白）直向同源物活性作為殺蟲(chóng)劑 靶標(biāo)的多肽，提供編碼具有昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）及 其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活性多肽的新核酸序列及其上述核酸序列的功 能等同物。
[0004] 本發(fā)明還涉及具有昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道 相互作用蛋白）活性的多肽，在鑒定降低昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或 Shaker樣）和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活性的殺蟲(chóng)活性化合物的方 法和測(cè)定法中的用途。此外，本發(fā)明涉及通過(guò)上述方法鑒定的殺蟲(chóng)化合物和這些化合物用 作殺蟲(chóng)劑的用途。
[0005] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅Shaker鉀通道活性 的作為殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)的鉀通道。在一個(gè)實(shí)施方案中，Shaker通道與優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅的 HyperkineticP亞基，優(yōu)選H-kvP亞基A或C亞型共表達(dá)。
[0006] 本發(fā)明還提供在殺蟲(chóng)劑篩選測(cè)定法中使用的具有優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅昆蟲(chóng)Shaker 通道和Hyperkinetic^亞基，優(yōu)選H-kvP亞基A或C亞型活性的多肽，提供編碼具有昆 蟲(chóng)Shaker通道和HyperkineticP亞基，優(yōu)選H-kvP亞基A或C亞型活性的多肽的新核酸 序列及其上述核酸序列的功能等同物。
[0007] 本發(fā)明此外還涉及具有昆蟲(chóng)Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基， 優(yōu)選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽分別在鑒定分別降低昆蟲(chóng)Shaker通道和 Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選H-kv β亞基A或C亞型活性的殺蟲(chóng)活性化合物中的方法和測(cè)定 中的用途。此外，本發(fā)明涉及通過(guò)上述方法鑒定的殺蟲(chóng)化合物和這些化合物用作殺蟲(chóng)劑的 用途。
[0008] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅酚乙醇胺受體活性的作為 殺蟲(chóng)劑革巴標(biāo)的G蛋白偶聯(lián)受:體（GPCR)。
[0009] 本發(fā)明還提供殺蟲(chóng)劑的篩選測(cè)定法中使用的具有優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅酚乙醇胺受 體活性的多肽，提供編碼具有優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅酚乙醇胺受體活性的多肽的新核酸序列及 其上述核酸序列的功能等同物。
[0010] 本發(fā)明還涉及具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅〇a2、Oamb、Oct-0-2R和Oct-0-3R 的酚乙醇胺受體活性的多肽，在鑒定降低選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅〇a2、Oamb、Oct-β-2R和 Oct-β-3R的酚乙醇胺受體活性的殺蟲(chóng)活性化合物的方法和測(cè)定中的用途。此外，本發(fā)明涉 及通過(guò)上述方法鑒定的殺蟲(chóng)化合物和這些化合物用作殺蟲(chóng)劑的用途。
[0011] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及作為殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)的SK-通道。
[0012] 本發(fā)明此外提供作為殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)的具有昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多 肽，提供編碼具有昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽的新核酸序列及其上述核酸序 列的功能等同物。
[0013] 本發(fā)明還涉及具有昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽，在鑒定降低昆蟲(chóng)小 電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的殺蟲(chóng)活性化合物的方法和測(cè)定中的用途。此外，本發(fā)明涉及通 過(guò)上述方法鑒定的殺蟲(chóng)化合物和這些化合物用作殺蟲(chóng)劑的用途.
[0014] 昆蟲(chóng)引起許多人和動(dòng)物疾病。昆蟲(chóng)還引起相當(dāng)大的農(nóng)業(yè)和財(cái)產(chǎn)損害，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損 失。盡管使用和濫用了所有的昆蟲(chóng)毒藥，但是昆蟲(chóng)還是每年破壞超過(guò)30%的全球糧食作 物。
[0015] 已經(jīng)開(kāi)發(fā)出許多方法以限制由昆蟲(chóng)引起的破壞。
[0016] 一種方法是使用用于昆蟲(chóng)控制的化學(xué)藥品。許多殺蟲(chóng)劑如DDT的問(wèn)題在于它們需 要高濃度應(yīng)用和它們具有非特異的廣譜活性的事實(shí)?；瘜W(xué)殺蟲(chóng)劑通常影響有益和無(wú)益的物 種。它們當(dāng)中許多久存于環(huán)境中并且因此在食物鏈中積累。
[0017] 另一種方法是表達(dá)殺蟲(chóng)毒素，例如來(lái)自細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)蛋白質(zhì)毒素的轉(zhuǎn)基因作物。
[0018] 昆蟲(chóng)害蟲(chóng)有獲得對(duì)所有殺蟲(chóng)劑抗性的傾向，因?yàn)樗鼈兙哂羞m應(yīng)其環(huán)境的罕見(jiàn)能 力，這是因?yàn)樗鼈兙哂性诶ハx(chóng)群體中引起快速出現(xiàn)抗性的機(jī)制，如短生活周期、高繁殖率和 長(zhǎng)距離行進(jìn)的能力?，F(xiàn)在，表現(xiàn)出殺蟲(chóng)劑抗性的害蟲(chóng)在日益增加。
[0019] 因此，仍然有尋找具有對(duì)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)極其特異作用的有效且經(jīng)濟(jì)的殺蟲(chóng)劑的需求。 殺蟲(chóng)劑越有效，其造成的環(huán)境危險(xiǎn)越小。
[0020] 這可以通過(guò)鑒定和分離編碼將會(huì)控制昆蟲(chóng)發(fā)育和/或存活的蛋白質(zhì)的基因?qū)崿F(xiàn)。
[0021] 本發(fā)明提供昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或 其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）作為殺蟲(chóng)劑的新的靶標(biāo)。本發(fā)明還提供用于鑒 定降低昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助蛋白 KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活性的殺蟲(chóng)活性化合物的方法和測(cè)定法。
[0022] 在許多果蠅屬胚胎和幼體神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的外向電壓依賴性K+電流源于Shaker 家族成員 Shaw、Shab 和 Shal 產(chǎn)生的混合電流（Tsunoda，S.和 L. Salkoll (1995) J Neuroscience. March ; 15 (3) : 1741-1754)。Shal 產(chǎn)生這些宏觀 K+ 電流的瞬時(shí)部分（"A-型" 電流）并且通過(guò)例如某些神經(jīng)元中引起延緩的電流脈沖調(diào)整這些電流（Yu，D.，F(xiàn)eng，C.和 A. Guo (1999) J Neurobiology· Aug ;40 (2) : 158-70)。選擇性剪接、翻譯后修飾和其他 Shal 相關(guān)的加工可能部分地負(fù)責(zé)在這些神經(jīng)元中觀察到的廣泛的調(diào)整（Choi，J.C.，Park，D.和 L. C. Griffith (2004) J Neurophysiology. 91:2353-2365)。
[0023] 已經(jīng)證明Kv4. x(Shal)輔助蛋白KChIP可能通過(guò)促進(jìn)四聚體通道組裝急劇增加 Shal向細(xì)胞膜的運(yùn)輸，和引起Shal通道門(mén)控特性的不同變化（Kunjilwar，K. , Strang, C.，DeRubeis，D.和 P.J. Pfaffinger (2004) J Biological Chemistry. Dec ;279 (52): 54542-54551)。
[0024] 不管Shal在神經(jīng)元傳導(dǎo)中的作用如何，對(duì)于該靶標(biāo)的確認(rèn)案例仍有待確立。我 們的原位數(shù)據(jù)表明在胚胎腹神經(jīng)索和內(nèi)臟肌肉組織中低水平表達(dá)。位于Berkeley的果蠅 屬基因組計(jì)劃顯示在胚胎/幼體內(nèi)臟肌肉、縱向內(nèi)臟肌肉纖維、腹中線和胚胎中樞神經(jīng)系 統(tǒng)包括腹神經(jīng)索中有染色。DmShal mRNA是在胚胎中期表達(dá)達(dá)到高峰的罕見(jiàn)轉(zhuǎn)錄物（內(nèi)部 Lynx數(shù)據(jù)）。在哈佛醫(yī)學(xué)院果蠅保藏中心有兩個(gè)內(nèi)含子轉(zhuǎn)座子插入系，但是沒(méi)有與此相關(guān) 的生存力數(shù)據(jù)，并且也得不到其它的Shal突變體。在公眾領(lǐng)域也沒(méi)有微列陣或者northern 數(shù)據(jù)。
[0025] 在市場(chǎng)上還沒(méi)有已經(jīng)鑒定具有Shal鉀通道調(diào)節(jié)作為其主要作用方式的殺蟲(chóng)劑， 這意味著化合物不僅僅通過(guò)殺蟲(chóng)活性的"副作用"起作用，而且其活性是關(guān)鍵的致死作用。
[0026] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分別作為殺蟲(chóng)劑新靶標(biāo)的昆蟲(chóng)Shaker通道和/或 HyperkineticP亞基，優(yōu)選H-kvP亞基A或C亞型。本發(fā)明還提供用于鑒定分別降低昆蟲(chóng) Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β亞基A或C亞型活性的殺蟲(chóng)活性化 合物的方法和測(cè)定法。
[0027] 果蠅Hyperkinetic (Hk)突變改變編碼哺乳動(dòng)物K+通道P亞基同系物的基因。 Wang 等（Biophysical Journal Volume71，Decemberl996, 3167-3176)已經(jīng)證明，Hk P 亞 基調(diào)節(jié)大范圍的 Shaker (Sh)K+ 電流特性。從 CH0UINARD 等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92，pp. 6763-6767, Julyl995Neurobiology)還可知道Hk與Sh在爪蟾卵母細(xì)胞中共表 達(dá)，這證明該共表達(dá)增加電流波幅并且改變電壓依賴性和活化與失活的動(dòng)力學(xué)。
[0028] 令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，Shaker通道和Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β亞基A或B 亞型的共表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生新的殺蟲(chóng)劑篩選測(cè)定法。
[0029] 在市場(chǎng)上還沒(méi)有已經(jīng)鑒定具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選 H-kv β亞基A或C亞型調(diào)節(jié)作為其主要作用方式的殺蟲(chóng)劑，這意味著化合物不僅僅通過(guò)殺 蟲(chóng)活性的"副作用"起作用，而且其活性是關(guān)鍵的致死作用。
[0030] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct-i3-2R和 Oct-β -3R的昆蟲(chóng)酚乙醇胺受體作為殺蟲(chóng)劑的新靶標(biāo)。本發(fā)明還提供用于鑒定降低選自優(yōu) 選來(lái)自黑腹果蠅〇a2、Oamb、Oct-β -2R和Oct-β -3R的昆蟲(chóng)酚乙醇胺受體活性的殺蟲(chóng)活性 化合物的方法和測(cè)定法。
[0031] 酚乙醇胺是結(jié)構(gòu)上與去甲腎上腺素有關(guān)的生物源單胺，其是在脊椎動(dòng)物外周和中 樞神經(jīng)系統(tǒng)中介導(dǎo)不同生理過(guò)程的主要神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)和神經(jīng)激素。酚乙醇胺與酪胺 一起僅是神經(jīng)活性的非肽遞質(zhì)，其生理作用局限于脊椎動(dòng)物。
[0032] 酚乙醇胺的作用通過(guò)多種受體類別像oa2、Oamb、Oct-β -2R或Oct-β -3R介導(dǎo)。
[0033] 酚乙醇胺受體僅僅/主要發(fā)現(xiàn)于無(wú)脊椎動(dòng)物中這一事實(shí)使得它們成為殺蟲(chóng)劑的 重要的靶標(biāo)。因此，特異性調(diào)節(jié)酚乙醇胺受體的化合物將具有低的脊椎動(dòng)物毒性。除了選 擇性之外，酚乙醇胺受體由于其在神經(jīng)元中表達(dá)而成為殺蟲(chóng)劑的良好靶標(biāo)。酚乙醇胺與酪 胺一起僅是神經(jīng)活性的非肽遞質(zhì)，其生理作用局限于無(wú)脊椎動(dòng)物。
[0034] 雖然酚乙醇胺是昆蟲(chóng)中的主要神經(jīng)介質(zhì)，但是已經(jīng)證明其受體難以克隆。目前，僅 少數(shù)酚乙醇胺受體已經(jīng)被克隆。
[0035] 本發(fā)明提供克隆章魚(yú)堿受體并將其引入優(yōu)選細(xì)胞的膜中的方法。優(yōu)選地，額外連 接的蛋白質(zhì)引入到膜中。
[0036] 取決于受體同種型，酚乙醇胺受體可通過(guò)環(huán)AMP產(chǎn)生或細(xì)胞內(nèi)鈣釋放調(diào)節(jié)它們的 活性。酚乙醇胺受體，優(yōu)選〇a2內(nèi)源性地通過(guò)cAMP傳導(dǎo)信號(hào)。受體活性的檢測(cè)是困難的。
[0037] 因此，本發(fā)明提供強(qiáng)制偶聯(lián)至鈣的方法，這導(dǎo)致當(dāng)其活化時(shí)鈣釋放。鈣釋放通過(guò) 熒光的鈣傳感染料測(cè)量。
[0038] 令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅oa2、0amb、0ct_ β -2R和Oct- β -3R的酚 乙醇胺受體的表達(dá)和泛宿主性G-α蛋白的表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生新的殺蟲(chóng)劑篩選測(cè)定法。
[0039] 當(dāng)配體結(jié)合至GPCR細(xì)胞外部分時(shí)，GPCR介導(dǎo)跨細(xì)胞膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。GPCR的細(xì)胞 內(nèi)部分與G-蛋白相互作用以調(diào)整從細(xì)胞外至細(xì)胞內(nèi)部的信號(hào)傳導(dǎo)。因此，GPCR被稱作"偶 聯(lián)"至G-蛋白。G-蛋白由三個(gè)多肽亞基組成：結(jié)合和水解GTP的α亞基，和二聚體的β γ 亞基。某些G-蛋白被認(rèn)為是"泛宿主性"G-蛋白，因?yàn)樗鼈兊腉亞基允許它們偶聯(lián)至正常 情況下與其它家族G-蛋白偶聯(lián)的GPCR。
[0040] 在市場(chǎng)上還沒(méi)有已經(jīng)鑒定具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅的oa2、Oamb、Oct- β -2R和 Oct-i3_3R的酚乙醇胺受體調(diào)節(jié)作為其主要作用方式的殺蟲(chóng)劑，這意味著化合物不僅僅通 過(guò)殺蟲(chóng)活性的"副作用"起作用，而且其活性是關(guān)鍵的致死作用。
[0041] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供作為殺蟲(chóng)劑的新靶標(biāo)的小電導(dǎo)鈣激活鉀通道。本 發(fā)明還提供用于鑒定降低昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的殺蟲(chóng)活性化合物的方法和測(cè) 定法。
[0042] 鈣激活鉀通道是由細(xì)胞內(nèi)鈣增加所活化的功能多種多樣的一組離子通道。在哺乳 動(dòng)物中，它們主要存在于神經(jīng)細(xì)胞中，在其中它們促進(jìn)動(dòng)作電位的形成并調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮 性。更加具體而言，它們的電流是動(dòng)作電位后超極化的基礎(chǔ)；它們還表現(xiàn)出參與神經(jīng)元放電 頻率精度（對(duì)于綜述見(jiàn)：Stocker 等，Nature Reviews Neuroscience5, 2004)。
[0043] 該類型鉀通道基于單通道導(dǎo)電性存在于三大通用類型中。大、中和小電導(dǎo)通道分 別被稱作BK、IK和SK。在果蠅中，基因分別被稱作slo、slack和SK。
[0044] 每一類型的鉀離子通道表現(xiàn)出不同的藥理學(xué)特性。鉀離子通道與大量生理過(guò)程相 關(guān)，包括心跳的調(diào)節(jié)、動(dòng)脈的擴(kuò)張、胰島素的釋放、神經(jīng)細(xì)胞的興奮和腎電解質(zhì)運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)。 因此，鉀離子通道早已知作為治療大量疾病中的治療靶標(biāo)，如W02005 099711和US2005 0239800中所公開(kāi)。
[0045] 特別地，SK通道已經(jīng)顯示具有不同的藥理學(xué)特性。如在W02005 100349中所公開(kāi)， 使用膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同化合物具有臨床相關(guān)的心理活性。所評(píng)價(jià)的化合物結(jié)構(gòu)上與三環(huán) 抗抑郁劑相關(guān)并且包括阿米替林、卡馬西平、氯丙嗪、賽庚啶、丙咪嗪、他克林和三氟拉嗪。 發(fā)現(xiàn)所測(cè)試的每一化合物以微摩爾親和性封閉SK2通道電流。存在影響SK通道的大量神 經(jīng)肌肉抑制劑，如蜂毒明肽、阿曲庫(kù)銨、泮庫(kù)溴銨和筒箭毒堿（Shah等，Br J Pharmac〇1129 : 627-30(2000))。
[0046] 還描述了使用SK通道作為藥物活性化合物靶標(biāo)用于治療疾病的測(cè)定法：
[0047] 重組大鼠腦SK2通道在HEK293哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)以通過(guò)膜片鉗技術(shù)研究中 心作用性肌肉松弛劑化合物如氯唑沙宗的作用（Cao等，J. PharmacoI. Exp. Ther. 296 : 683-689, 2001)。還使用轉(zhuǎn)化的HEK293細(xì)胞通過(guò)膜片鉗技術(shù)研究了金屬離子對(duì)重組人SK4 通道活化的影響（Cao 等，F(xiàn)EBS，446 :137-141，1999)。
[0048] 鑒定增加或降低經(jīng)鈣激活鉀SK通道的鉀離子流的化合物的方法描述于 W098/11139 中。
[0049] 時(shí)至今日，典型的昆蟲(chóng)中的分子靶標(biāo)是乙酰膽堿酯酶、電壓依賴性鈉通道、離子型 受體例如煙喊型乙酸膽喊和GABA受體。Gautier等（J. Pharm. Exp. Therapeutics, jpet. 1 07. 128694,2007)已經(jīng)得到了鈣激活鉀通道作為間接靶標(biāo)參與殺蟲(chóng)劑神經(jīng)毒性的證據(jù)。他 們通過(guò)使用反義寡核苷酸處理蟑螂（美洲蟑螂（Periplaneta americana))DUM(背側(cè)不成 對(duì)中線）神經(jīng)元敲低DUM神經(jīng)元BK通道，指出DMDS (二甲基二硫）抑制鈣激活鉀電流。
[0050] 抑制Ca2+激活鉀通道活性的另外的特異毒素已經(jīng)從幾種生物中鑒定，最熟知的 是如在US5, 607, 843中所述的來(lái)自蜂毒的蜂毒明肽。
[0051] 然而，目前在市場(chǎng)上還沒(méi)有已經(jīng)鑒定具有Ca2+激活鉀通道，優(yōu)選SK通道調(diào)節(jié)作為 其主要作用方式的殺蟲(chóng)劑，這意味著化合物不僅僅通過(guò)殺蟲(chóng)活性的"副作用"起作用，而且 其活性是關(guān)鍵的致死作用。
[0052] 通常，極大地需要檢測(cè)可能組成殺蟲(chóng)劑新靶標(biāo)的多肽。原因是上述抗性問(wèn)題和不 懈的努力以鑒定新的殺蟲(chóng)活性成分，其通過(guò)盡可能寬的作用譜、生態(tài)和毒理學(xué)可接受性和/ 或低應(yīng)用率相區(qū)別。
[0053] 現(xiàn)在本發(fā)明提供昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/ 或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）作為殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)和用于鑒定降低昆蟲(chóng)電壓門(mén) 控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作 用蛋白）活性的殺蟲(chóng)活性化合物的方法和測(cè)定法。
[0054] 本發(fā)明還分別提供Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選H_kv β亞基A 或C亞型作為殺蟲(chóng)劑祀標(biāo)和用于鑒定分別降低Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基， 優(yōu)選H-kv β亞基A或C亞型活性的殺蟲(chóng)活性化合物的方法和測(cè)定法。
[0055] 本發(fā)明還提供選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅oa2、0amb、0ct_P -2R和Oct-β -3R的酚乙 醇胺受體作為殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)和用于鑒定降低選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅〇a2、Oamb、Oct- β -2R和 Oct-β -3R的酚乙醇胺受體活性的殺蟲(chóng)活性化合物的方法和測(cè)定法。
[0056] 本發(fā)明此外提供昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道作為殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)和用于鑒定降低昆 蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的殺蟲(chóng)活性化合物的方法和測(cè)定法。
[0057] 實(shí)際上，新靶標(biāo)的檢測(cè)具有極大困難，因?yàn)槎嚯幕钚缘囊种平?jīng)常對(duì)昆蟲(chóng)的存活無(wú) 進(jìn)一步的影響。這可歸因于昆蟲(chóng)可以轉(zhuǎn)變至替代的活性這一事實(shí)，由此編碼蛋白質(zhì)的基因 的數(shù)量比微生物中的高至少3倍。
[0058] 此外，以SK-通道為例，關(guān)于在人醫(yī)學(xué)中的研究結(jié)果，例如W02005 100349,其教導(dǎo) 甚至對(duì)經(jīng)鉀離子通道的鉀離子流的抑制在治療疾病中是有用的，令人驚奇的是本發(fā)明的SK 通道是殺蟲(chóng)劑的靶標(biāo)，因?yàn)樗鼈冇绊懫浯婊睢?br> [0059] 本發(fā)明的目標(biāo)是鑒定對(duì)于昆蟲(chóng)發(fā)育或存活必需的新靶標(biāo)，和提供適宜鑒定殺蟲(chóng)活 性化合物的方法。
[0060] 我們發(fā)現(xiàn)，該目標(biāo)通過(guò)使用具有昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或 Shaker樣）和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活性的多肽實(shí)現(xiàn)。
[0061] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及用于鑒定降低具有昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道 Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活 性的多肽的殺蟲(chóng)活性化合物的方法，該方法包括：
[0062] a)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、具有昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道 Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活 性的多肽，
[0063] b)在一側(cè)膜上應(yīng)用懷疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力 的化合物，
[0064] c)檢測(cè)所述多肽的活性，和
[0065] d)鑒定在（b)中應(yīng)用的降低所述多肽活性的化合物。
[0066] 在另一實(shí)施方案中，我們發(fā)現(xiàn)，該目標(biāo)通過(guò)分別使用具有昆蟲(chóng)Shaker通道和/或 HyperkineticP亞基，優(yōu)選-kvP亞基A或C亞型活性的多肽實(shí)現(xiàn)。
[0067] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及用于鑒定分別降低具有昆蟲(chóng)Shaker通道和/或 Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選-kv β亞基A或C亞型活性的多肽活性的殺蟲(chóng)活性化合物的方 法，所述方法包括：
[0068] a)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、分別具有昆蟲(chóng)Shaker通道和/或 HyperkineticP亞基，優(yōu)選-kvP亞基A或C亞型活性的多肽，
[0069] b)在一側(cè)膜上應(yīng)用懷疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力 的化合物，
[0070] c)檢測(cè)所述多肽的活性，和
[0071] d)鑒定在（b)中應(yīng)用的降低所述多肽活性的化合物。
[0072] 在另一實(shí)施方案中，我們發(fā)現(xiàn)，該目標(biāo)通過(guò)使用具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅oa2、 Oamb、Oct-β -2R和Oct-β -3R的昆蟲(chóng)酚乙醇胺受體活性的多肽實(shí)現(xiàn)。
[0073] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及用于鑒定降低具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅oa2、Oamb、 Oct-β -2R和Oct-β -3R的昆蟲(chóng)酚乙醇胺受體活性的多肽活性的殺蟲(chóng)活性化合物的方法， 所述方法包括：
[0074] a)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅oa2、Oamb、 Oct-β -2R和Oct-β -3R的昆蟲(chóng)酚乙醇胺受體活性的多肽，
[0075] b)在一側(cè)膜上應(yīng)用懷疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力 的化合物，
[0076] c)檢測(cè)所述多肽的活性，和
[0077] d)鑒定在（b)中應(yīng)用的降低所述多肽活性的化合物。
[0078] 在另一實(shí)施方案中，我們發(fā)現(xiàn)，該目標(biāo)通過(guò)使用具有昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道 活性的的多肽實(shí)現(xiàn)。
[0079] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及鑒定降低昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的殺蟲(chóng)活 性化合物的方法，所述方法包括：
[0080] a)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、具有昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性 的多肽，
[0081] b)在一側(cè)膜上應(yīng)用懷疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力 的化合物，
[0082] c)檢測(cè)所述多肽的活性，和
[0083] d)鑒定在（b)中應(yīng)用的降低所述多肽活性的化合物。
[0084] 根據(jù)本發(fā)明，膜是類似于半滲透板或?qū)拥慕Y(jié)構(gòu)，其充當(dāng)兩相或溶液之間的屏障， 因此膜是溶劑滲透性的，優(yōu)選水滲透性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，膜是生物的膜、生物膜或 者脂質(zhì)層或者脂質(zhì)雙層。膜優(yōu)選由流體脂質(zhì)雙層組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，膜是細(xì)胞的 外表面、細(xì)胞腔室、泡、脂質(zhì)體（由為兩性分子的磷脂組成的泡）、聚合物囊泡或者合成體 (synthosome)〇
[0085] 聚合物囊泡常常稱作"聚合物體"，其已經(jīng)被詳細(xì)研究并且進(jìn)展已經(jīng)在綜述中總結(jié) [Discher等，Science2002, 297 ;967973]。聚合物體或聚合物囊泡由自組裝的二或三嵌段 共聚物組成。
[0086] 合成體是功能化的納米腔室系統(tǒng)，其已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出用于推定的生物技術(shù)應(yīng)用
[Nardin等，Chem. Commun. 2000,14331434]。合成體是中空球體，其由具有嵌段共聚物膜的 機(jī)械穩(wěn)定囊泡和充當(dāng)選擇性門(mén)的工程改造跨膜蛋白組成。
[0087] 本發(fā)明的優(yōu)選昆蟲(chóng)的電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/ 或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）被裝配入或嵌入、植入或整合入膜中，這些術(shù) 語(yǔ)是同義詞并且可互換。
[0088] 本發(fā)明的優(yōu)選昆蟲(chóng)的Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選_kv β亞基 A或C亞型被分別裝配入或嵌入、植入或整合入膜中，這些術(shù)語(yǔ)是同義詞并且可互換。
[0089] 本發(fā)明的優(yōu)選昆蟲(chóng)的選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R 的酚乙醇胺受體被裝配入或嵌入、植入或整合入膜中，這些術(shù)語(yǔ)是同義詞并且可互換。
[0090] 昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道被裝配入或插入、植入或整合入膜中，這些術(shù)語(yǔ)是同 義詞并且可互換。
[0091] 為了本發(fā)明的目的，通常復(fù)數(shù)旨在包括單數(shù)，反之亦然。
[0092] 除非另外指出，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"核酸"和"核酸分子"在本文上下文中可互換。 除非另外指出，術(shù)語(yǔ)"肽"、"多肽"和"蛋白質(zhì)"在本文上下文中可互換。術(shù)語(yǔ)"序列"將涉 及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白質(zhì)，這取決于術(shù)語(yǔ)"序列"所使用的環(huán)境。如本 文所使用的術(shù)語(yǔ)"一個(gè)或多個(gè)基因"、"多核苷酸"、"核酸序列"、"核苷酸序列"或"一個(gè)或多 個(gè)核酸分子"指任何長(zhǎng)度的聚合形式的核苷酸，或者是核糖核苷酸或者是脫氧核糖核苷酸。 這些術(shù)語(yǔ)僅指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0093] 因此，如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"一個(gè)或多個(gè)基因"、"多核苷酸"、"核酸序列"、"核苷酸 序列"或"一個(gè)或多個(gè)核酸分子"包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。它們還包括已知類型的修飾， 例如具有類似物的一個(gè)或一個(gè)以上天然存在核苷酸的甲基化作用、"加帽"、取代。優(yōu)選地， DNA或RNA序列包含編碼本文所定義多肽的編碼序列。
[0094] "編碼序列"是這樣的核苷酸序列，當(dāng)其置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列控制之下時(shí)被轉(zhuǎn)錄成 RNA，例如調(diào)節(jié)RNA如miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、RNAi、核糖核酸酶等或者被轉(zhuǎn)錄成被翻 譯成多肽的mRNA。編碼序列的邊界通過(guò)位于5' -末端的翻譯起始密碼子和位于3' -末端 的翻譯終止密碼子決定。編碼序列可以包括，但不限于mRNA、cDNA、重組核苷酸序列或基因 組DNA，而在某些情況下也將出現(xiàn)內(nèi)含子。
[0095] 如在本文上下文中所使用，核酸分子還可以包括位于編碼基因區(qū)3'和5'端的非 翻譯序列，例如編碼區(qū)5'端上游序列的至少500、優(yōu)選200、特別優(yōu)選100個(gè)核苷酸和編碼 基因區(qū)3'端下游序列的至少100、優(yōu)選50、特別優(yōu)選20個(gè)核苷酸。在例如反義核酸、RNAi、 snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核糖核酸酶等技術(shù)的情況下，可有利地 使用編碼區(qū)以及5' -和/或3' -區(qū)。
[0096] 然而，僅選擇編碼區(qū)用于克隆和表達(dá)目的常常是有利的。
[0097] "多肽"指氨基酸的聚合物（氨基酸序列）并且不指特定長(zhǎng)度的分子。因此，肽和 寡肽被包括在多肽的定義之內(nèi)。該術(shù)語(yǔ)還指或者包括多肽的翻譯后修飾，例如糖基化、乙酰 化、磷酸化等等。定義所包含的是例如包含一個(gè)或更多個(gè)氨基酸類似物（包括例如非天然 氨基酸等）的多肽、具有取代連接的多肽，以及本領(lǐng)域已知的天然存在或者非天然存在的 其他修飾。
[0098] 術(shù)語(yǔ)"包含"、其語(yǔ)法變體當(dāng)在本說(shuō)明書(shū)中使用時(shí)用于指其所述特征、整數(shù)、步驟或 構(gòu)成成分或基團(tuán)的存在，但不排除其一種或更多種其他特征、整數(shù)、步驟、構(gòu)成成分或基團(tuán) 的存在或加入。
[0099] 術(shù)語(yǔ)"減少"、"阻抑"、"降低"或"抑制"涉及生物、生物部分如組織或細(xì)胞內(nèi)特性 的相應(yīng)改變。"特性的改變"應(yīng)當(dāng)理解為活性以相對(duì)于對(duì)照、參照或野生型相應(yīng)容量或數(shù)量 蛋白質(zhì)的指定容量或指定數(shù)量蛋白質(zhì)的改變。
[0100] 術(shù)語(yǔ)"減少"、"阻抑"、"降低"或"抑制"包括所述特性在僅本發(fā)明受試者的部分中 的改變，例如修飾可以存在于細(xì)胞腔室如細(xì)胞器中或者生物的部分如組織、翼、腿、軀干等 中。優(yōu)選地，"減少"、"阻抑"、"降低"或"抑制"被發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞內(nèi)的，因此術(shù)語(yǔ)"活性的減少、 降低或抑制"涉及與野生型細(xì)胞或者對(duì)照細(xì)胞相比細(xì)胞內(nèi)的減少、降低或抑制。
[0101] 因此，術(shù)語(yǔ)"減少"、"阻抑"、"降低"或"抑制"意思是指，基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)或者調(diào)節(jié) 性RNA比活性以及化合物或如多肽、核酸分子代謝物、離子或編碼mRNA或DNA的量可以在 比容量?jī)?nèi)被減少、降低或抑制。術(shù)語(yǔ)"減少"、"阻抑"、"降低"或"抑制"包括，對(duì)于所述"減 少"、"阻抑"、"降低"或"抑制"的理由可以是向生物或其部分施用的化學(xué)化合物。
[0102] 術(shù)語(yǔ)"減少"、"阻抑"或"降低"是可互換的。如果不另外指出的話，術(shù)語(yǔ)"減少"將 包括術(shù)語(yǔ)"阻抑"，"降低"或"抑制"。
[0103] 減少還理解為意思是指活性的修飾。在該上下文中，功能或活性，如"功能性活性" 或"生物學(xué)活性"與對(duì)照、參照或野生型相比減少至少10%、有利的20%、優(yōu)選30%、特別 優(yōu)選40%、50%或60%、非常特別優(yōu)選70%、80%、85%或90%或更多，非常特別優(yōu)選的是 95%，更優(yōu)選地是99%或更高。最優(yōu)選地，活性的減少、降低或缺失總計(jì)基本上100%。因 此，特別有利的實(shí)施方案是失活，例如化合物如多肽或核酸分子功能的抑制。
[0104] 術(shù)語(yǔ)"野生型"、"對(duì)照"或"參照"可互換并且可以是沒(méi)有根據(jù)本文所述方法修飾或 處理的生物的細(xì)胞或部分，例如細(xì)胞器或組織，或者生物，特別是昆蟲(chóng)。因此，用作野生型、 對(duì)照或參照的生物的細(xì)胞或部分，例如細(xì)胞器或組織，或者生物，特別是昆蟲(chóng)盡可能對(duì)應(yīng)于 其細(xì)胞、生物或部分并且除了本發(fā)明方法的結(jié)果，在任何其他性質(zhì)中盡可能與本發(fā)明的主 題相同。因此，野生型、對(duì)照或參照被同樣地處理或者盡可能相同的處理，也就是說(shuō)，僅條件 或特性將不同，這不影響所測(cè)試特性的性質(zhì)。
[0105] 優(yōu)選地，任何比較在相似條件下開(kāi)展。術(shù)語(yǔ)"相似條件"意思是指所有條件例如培 養(yǎng)或生長(zhǎng)條件、測(cè)定條件（例如緩沖液組成、溫度、底物、病原體品種、濃度等等）在待比較 的實(shí)驗(yàn)之間保持相同。
[0106] "參照"、"對(duì)照"或"野生型"優(yōu)選沒(méi)有用本發(fā)明所述方法修飾或處理的并且具有與 本發(fā)明受試者盡可能相似的任何其他特性的受試者，例如細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、生物、特別是 昆蟲(chóng)。參照、對(duì)照或野生型在其基因組、轉(zhuǎn)錄物組、蛋白質(zhì)組或代謝物組上盡可能與本發(fā)明 受試者相似。優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)"參照"、"對(duì)照"或"野生型"細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或生物涉及遺傳上 與本發(fā)明的細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或者生物或其部分幾乎相同，優(yōu)選95%、更優(yōu)選98%、甚至 更優(yōu)選 99.00%、特別是99.10%、99.30%、99.50%、99.70%、99.90%、99.99%、99.999% 或更高相同的細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或者生物。最優(yōu)選地，"參照"、"對(duì)照"或"野生型"是除了負(fù) 責(zé)核酸分子活性賦予核酸分子或它們所編碼的基因產(chǎn)物根據(jù)本發(fā)明的方法被修正、操作、 交換或引入之外，與根據(jù)本發(fā)明方法使用的生物、細(xì)胞或細(xì)胞器遺傳上相同的受試者，例如 細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、生物。
[0107] 優(yōu)選地，參照、對(duì)照或野生型與本發(fā)明的受試者僅在本發(fā)明多肽或者本發(fā)明方法 中所使用多肽的活性上不同。
[0108] "顯著降低"：關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的核酸序列所編碼多肽的活性，其應(yīng)理解為意思是 指，與對(duì)照相比，例如與沒(méi)有與測(cè)試化合物溫育的多肽活性相比，以測(cè)試化合物處理的多肽 以測(cè)量誤差之外的量度降低。
[0109] 關(guān)于離子通道的"功能活性"應(yīng)當(dāng)理解為離子通道表現(xiàn)出或者參與的任何一個(gè)或 更多個(gè)功能和/或特性。
[0110] 關(guān)于酚乙醇胺受體的"功能活性"應(yīng)當(dāng)理解為酚乙醇胺受體表現(xiàn)出或者參與的任 何一個(gè)或更多個(gè)功能和/或特性。
[0111] 在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)具有昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或 Shaker樣）和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活性的多肽的"功能性活性" 或"生物學(xué)活性"通過(guò)鉀離子的跨膜運(yùn)輸定義。
[0112] 在另一實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)分別具有昆蟲(chóng)Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基， 優(yōu)選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽的"功能性活性"或"生物學(xué)活性"通過(guò)鉀離子跨 膜的運(yùn)輸定義。
[0113] 在另一實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅的oa2、Oamb、Oct-0_2R和 Oct- β -3R的酚乙醇胺受體活性的多肽的"功能性活性"或"生物學(xué)活性"通過(guò)這樣的事實(shí) 定義，即酚乙醇胺受體被α-腎上腺素能拮抗劑選擇性封閉和被α-腎上腺素能激動(dòng)劑活 化。
[0114] 在另一實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)具有昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽的"功能性 活性"或"生物學(xué)活性"通過(guò)鉀離子跨膜的運(yùn)輸定義。該運(yùn)輸被鈣離子以選自200-1000nM、 300-900nM、300-800nM和400-800nM間隔的半最大活化或Ca2+敏感性K0. 5活化。本發(fā)明 的SK通道具有選自2-20pS、3-20pS、4-15pS、5-12pS和5-10pS間隔的單通道電導(dǎo)。本發(fā)明 多肽的生物學(xué)活性是蜂毒明肽不敏感性的。
[0115] 術(shù)語(yǔ)化合物的"活性"指生物系統(tǒng)中，例如細(xì)胞、器官或者生物內(nèi)化合物的功能。例 如，術(shù)語(yǔ)化合物的"活性"指化合物的酶功能、調(diào)節(jié)功能或其作為結(jié)合配偶體、轉(zhuǎn)運(yùn)體、調(diào)節(jié) 物或者載體等的功能。
[0116] 化合物的殺蟲(chóng)活性指所述化合物殺死或者麻痹昆蟲(chóng)的能力，或者以昆蟲(chóng)提供較少 損害的方式抑制昆蟲(chóng)發(fā)育或者生長(zhǎng)的能力。具有殺蟲(chóng)活性的化合物也被稱為對(duì)昆蟲(chóng)具有毒 性?；衔锏臍⑾x(chóng)活性不只引起昆蟲(chóng)的死亡，還包括對(duì)昆蟲(chóng)的其它有害作用，例如疾病、抗 飼育劑活性、生長(zhǎng)遲緩、降低的繁殖能力和降低的生殖力。
[0117] 如本文所使用的具有殺蟲(chóng)活性的化合物是"殺蟲(chóng)劑"。術(shù)語(yǔ)"殺蟲(chóng)劑"通常指不利 影響昆蟲(chóng)生存力的化學(xué)藥品、生物學(xué)試劑和其他化合物，其例如殺死、麻痹農(nóng)作物保護(hù)、人 和動(dòng)物健康區(qū)的昆蟲(chóng)物種、使其不育消滅或者致殘。
[0118] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自下列的核酸分子編碼的至少一種 多肽的膜實(shí)現(xiàn)：
[0119] a)編碼SEQ ID N0:2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子；
[0120] b)SEQ ID N0:l、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29 中所示核酸分子；
[0121] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID N0:2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；
[0122] d)與包含SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29所示核酸分子的多核苷酸的 核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0123] e)核酸分子，編碼與核酸分子（a)至（c)所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分別具有昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或 其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活性的多肽；
[0124] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0125] g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族 物1或Shaker樣）和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活性的多肽產(chǎn)生；
[0126] h)核酸分子，其編碼包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所述共有序列或SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 中分別所述一個(gè)或更多個(gè)基 序的多膚；
[0127] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :3、4 ;7、8 ;11、 12 ;15、16 ;19、20 ;23、24 ;27、28和/或31、32中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組 文庫(kù)得到；
[0128] 和
[0129] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，探針包含 (a)或（b)核酸分子的互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互補(bǔ)并編碼分別具有昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或 其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白）活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。
[0130] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、 i)或j)項(xiàng)所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物的膜實(shí)現(xiàn)，例如Shal_ delN突變體，其具有2-40個(gè)氨基酸編碼區(qū)的N末端缺失。
[0131] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用包含具有SEQ ID N0:2、6、10、14、18和/或 22所述電壓門(mén)控性鉀通道Shal或其同源物活性的多肽的至少一種功能等同物或同源物和 /或Shal_delN突變體的膜實(shí)現(xiàn)，Shal_delN突變體具有連接至具有SEQ ID NO :26和/或 30中所述其輔助蛋白KChIP或其同源物活性的多肽的2-40個(gè)氨基酸編碼區(qū)的N末端缺失。
[0132] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自下列的核酸分子編碼的至少一種 多肽的膜實(shí)現(xiàn)：
[0133] a)編碼包含SEQ ID勵(lì)：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核 酸分子；
[0134] b)包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子的核酸分 子；
[0135] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自包含根據(jù)SEQ ID NO :73、75、 77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；
[0136] d)與包含SEQ ID勵(lì)：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷 酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0137] e)核酸分子，編碼與（a)至（c)核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分別具有昆蟲(chóng)Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β亞基A或 C亞型活性的多肽；
[0138] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0139] g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有昆蟲(chóng)Shaker通道和/或Hyperkinetic β 亞基，優(yōu)選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽產(chǎn)生；
[0140] h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO : 102和/或103中分別所述共有序列或者SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128中分別所述一個(gè)或更多個(gè)基序的 多肽；
[0141] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :88、89 ;90、91 ; 92、93 ;94、95 ;96、97 ;98、99和/或IOOUOl中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組 文庫(kù)得到；
[0142] 和
[0143] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針包 含（a)或（b)核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互補(bǔ)并編碼分別具有昆蟲(chóng)Shaker通道和/或HyperkineticP亞基，優(yōu)選H-kvP亞基A或 C亞型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。
[0144] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、 h) 、i)或j)項(xiàng)所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物的膜實(shí)現(xiàn)，由此核 酸分子包含Kozak序列（例如ACCATG)。
[0145] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、 i) 或j)項(xiàng)所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物的膜實(shí)現(xiàn)，由此核酸 分子包含編碼Shaker通道的400bp或500bp的5' -片段的序列，優(yōu)選包含Shaker ATG密 碼子，優(yōu)選加上適當(dāng)?shù)腒ozak,和/或Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β 亞基A或C亞型的1770bp片段。
[0146] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用選自SEQ ID NO :73、75、77、79、81和83的至 少一種多肽或其功能等同物或同源物和選自SEQ ID NO :85和87的多肽或其功能等同物或 同源物的任意組合的膜實(shí)現(xiàn)。
[0147] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自下列的核酸分子編碼的至少一種 多肽的膜實(shí)現(xiàn)：
[0148] a)編碼 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174 中所不多肽的核酸分子；
[0149] b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所 不核酸分子；
[0150] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO :130、134、138、 142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列；
[0151] d)與包含 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0152] e)核酸分子，編碼與（a)至（c)核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分別具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅的〇a2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的昆蟲(chóng) 酚乙醇胺受體活性的多肽；
[0153] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0154] g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct-0_2R 和Oct-β -3R的昆蟲(chóng)酚乙醇胺受體活性的多肽產(chǎn)生；
[0155] h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO : 177、178和/或179中分別所述共有序列或者 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、 210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 中分 別所述一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽；
[0156] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :131、132 ;135、 136 ;139、140 ;143、144 ;147、148 ;151、152 ;155、156、159、160 ;163、164 ;167、168 ;171、172 和/或175、176中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組文庫(kù)得到；
[0157] 和
[0158] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針包 含（a)或（b)核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互補(bǔ)并編碼具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅〇a2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的昆蟲(chóng)酚乙醇 胺受體活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。
[0159] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、 i)或j)項(xiàng)所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物和另外的標(biāo)記蛋白質(zhì) 如GFP的膜實(shí)現(xiàn)，由此其優(yōu)選地與本發(fā)明的多肽，例如由選自a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、 i)或j)項(xiàng)的核酸分子編碼的多肽連接。
[0160] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用包含由SEQ ID NO :173中所述核酸分子或其 同源物編碼的，SEQ ID NO :46中所示多肽的至少一種功能等同物或同源物的膜實(shí)現(xiàn)。
[0161] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、 h)、i)或j)項(xiàng)所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物和另外的"泛宿主 性" G-蛋白的膜實(shí)現(xiàn)，其G亞基使得G-蛋白與正常情況下與其它家族G-蛋白偶聯(lián)的GPCR 偶聯(lián)，由此"泛宿主性" G-蛋白優(yōu)選地與本發(fā)明的多肽，例如由選自a)、b)、c)、d)、e)、f)、 g) 、h)、i)或j)項(xiàng)的核酸分子編碼的多肽連接。
[0162] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、 h) 、i)或j)項(xiàng)所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物和另外的標(biāo)記蛋 白質(zhì)如GFP，和/或另外的"泛宿主性"G-蛋白的膜實(shí)現(xiàn)，由此標(biāo)記蛋白質(zhì)和/或"泛宿主 性"G-蛋白優(yōu)選地與本發(fā)明的多肽，例如由選自a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)或j)項(xiàng) 的核酸分子編碼的多肽連接。
[0163] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用包含由SEQ ID NO :173中所述核酸分子或其 同源物編碼的，SEQ ID NO :46中所示多肽至少一種功能等同物或同源物和另外的"泛宿主 性"G-蛋白的膜實(shí)現(xiàn)，由此蛋白質(zhì)優(yōu)選地與其連接。
[0164] 在一個(gè)實(shí)施方案中，"泛宿主性"G-蛋白是泛宿主性G-α -16-蛋白質(zhì)或其同源物。
[0165] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自下列的核酸分子編碼的至少一種 多肽的膜實(shí)現(xiàn)：
[0166] a)編碼SEQ ID NO :228、230、232中所示多肽的核酸分子；
[0167] b) SEQ ID NO : 227、229、231 中所示核酸分子；
[0168] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO :228、230、232 的多肽序列；
[0169] d)與包含SEQ ID NO :227、229、231所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具 有至少50 %同一'丨生的核酸分子；
[0170] e)核酸分子，編碼與（a)至（c)核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽；
[0171] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0172] g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽產(chǎn)生；
[0173] h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或選自SEQ ID NO :240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個(gè)或更多個(gè)基序的多 肽；
[0174] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :233、234、235、 236 ;和237、238中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組文庫(kù)得到；
[0175] 和
[0176] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針包 含（a)或（b)核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互補(bǔ)并編碼具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。
[0177] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、 i) 或j)項(xiàng)所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物的膜實(shí)現(xiàn)。
[0178] 術(shù)語(yǔ)如上所述多肽的"功能等同物"是基本上賦予如SEQ ID NO :2、6、10、14、18、 22、26和/或30中所述多肽活性的多肽，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為 SEQ ID N0:73、75、77、79、81、83、85和/或87，至于G蛋白偶聯(lián)受體為SEQIDN0:130、134、 138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :228、 230、232。
[0179] 術(shù)語(yǔ)如上所述核酸分子的"功能等同物"是基本上賦予如SEQ ID NO :1、5、 9、13、17、21、25和/或29中所述核酸分子活性的多核苷酸，至于shaker通道和/或 HyperkineticP 亞基為 SEQ ID N0:72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86,至于 G 蛋白偶聯(lián)受 體為 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 并且至于 SK-通道為 SEQ ID N0:227、229、231。
[0180] 根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)或多肽具有如SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30中所 述多肽的活性，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為SEQ ID NO :73、75、77、79、 81、83、85 和 / 或 87,至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、 158、162、166、170和/或174并且至于SK-通道為SEQIDN0 :228、230、232，如果其活性的 減少、阻抑、降低或抑制介導(dǎo)經(jīng)膜的鉀流降低的話。
[0181] 根據(jù)本發(fā)明，核酸分子或多核苷酸具有如SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或 29中所述核酸分子的活性，至于shaker通道和/或HyperkineticP亞基為SEQ ID NO :72、 74、76、78、80、82、84和/或86，至于G蛋白偶聯(lián)受體為SEQIDN0:129、133、137、141、145、 149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :227、229、231 如 果其表達(dá)的減少、阻抑、降低或抑制介導(dǎo)經(jīng)膜的鉀流降低的話。
[0182] 本發(fā)明多肽的同源物（=同源物），特別是由如SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25 和/或29中所示核酸分子編碼或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO :33和/或34 中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、 70和/或71的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源 物賦予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。
[0183] 至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，本發(fā)明多肽的同源物（=同源物）， 特別是由如SEQ ID勵(lì)：72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子編碼或者包含其 的多肽，或者包含含有SEQ ID NO : 102和/或103中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO : 104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、 122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽的多肽的 同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物賦予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能 等同物。
[0184] 至于G蛋白偶聯(lián)受體，本發(fā)明多肽的同源物（=同源物），特別是由如SEQ ID NO: 129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 中所示核酸分子編碼或者包 含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO :177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選 自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、 193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物賦予本文 所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。
[0185] 至于SK-通道，本發(fā)明多肽的同源物（=同源物），特別是由如SEQ ID N0:227、 229、231中所示核酸分子編碼或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO :239中所示共 有序列或選自 SEQ ID 勵(lì)：240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物賦予本 文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。
[0186] 此外，根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"同源物"涉及生物的、與所述生物的所有表達(dá)序列的本文 所述或所列序列具有優(yōu)選最1?或者基本最1?序列同源性的序列。
[0187] 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知如何發(fā)現(xiàn)、鑒定和證實(shí)假定的同源物具有本文所述的相同活 性。如果知道的話，生物中的生物學(xué)功能或活性基本上涉及或?qū)?yīng)于如對(duì)于SEQ ID NO: 1、5、9、13、17、21、25和/或29中所述基因所述的活性或功能，至于shaker通道和/或 HyperkineticP 亞基為 SEQ ID N0:72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86,至于 G 蛋白偶聯(lián)受 體為 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173,并且至于 SK-通道為 SEQ ID N0:227、229、231。
[0188] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，同源物或功能等同物包含由含有SEQ ID NO :1、5、9、13、 17、21、25和/或29中所指出序列的核酸分子編碼的多肽的序列或者在SEQ ID NO :2、6、10、 14、18、22、26和/或30中所述的多肽序列、如分別在SEQ ID NO :33和/或34中所示的共 有序列或分別選自 SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個(gè)或更多個(gè)基序，或者其是包含SEQ ID勵(lì)：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所指出 多核苷酸的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)物。
[0189] 至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，同源物 或功能等同物包含由含有SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86所指出序列的核酸 分子編碼的多肽序列或者在SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87中所述的多肽 序列、如分別在SEQ ID NO :102和/或103中所示的共有序列或分別選自SEQ ID NO :104、 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、 124和/或125和/或126、127和/或128的一個(gè)或更多個(gè)基序，或者其是包含SEQ ID NO : 73、75、77、79、81、83、85和/或87中所指出多核苷酸的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)物。
[0190] 至于G蛋白偶聯(lián)受體，因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，同源物或功能等同物包含由含有 SEQ ID NO : 129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 所指出序列的核 酸分子編碼的多肽序列或者在 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、 170和/或174中所述的多肽序列、如分別在SEQ ID NO :177、178和/或179中所示的共 有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、 和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、 225和/或226的一個(gè)或更多個(gè)基序，或者其是包含SEQ ID N0:130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170和/或174中所指出多核苷酸的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)物。
[0191] 至于SK-通道，因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，同源物或功能等同物包含由含有SEQ ID NO :227、229、231所指出序列的核酸分子編碼的多肽序列或者在SEQ ID NO :228、230、232 中所述的多肽序列、如在SEQ ID N0:239中所示的共有序列或選自SEQ ID N0:240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個(gè)或更多個(gè)基序，或者其是 包含SEQ ID N0:228、230、232中所指出多核苷酸的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)物。
[0192] 本文所公開(kāi)的關(guān)于序列、活性、共有序列、多肽基序和測(cè)試的信息將本領(lǐng)域技術(shù)人 員引向生物中的各個(gè)同源或功能等效表達(dá)產(chǎn)物。
[0193] 在一個(gè)實(shí)施方案中，任何一個(gè)本發(fā)明多肽的同源物衍生自昆蟲(chóng)并且具有至少50 % 的序列同一性并且優(yōu)選與昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和 /或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）分別具有基本相同或者相似的活性。
[0194] 在另一實(shí)施方案中，任何一個(gè)本發(fā)明多肽的同源物衍生自昆蟲(chóng)并且具有至少50% 的序列同一性并且優(yōu)選與Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β亞基A或 C亞型分別具有基本相同或者相似的活性。
[0195] 在另一實(shí)施方案中，任何一個(gè)本發(fā)明多肽的同源物衍生自昆蟲(chóng)并且具有至少50% 的序列同一'丨生并且優(yōu)選與選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅〇a2、Oamb、Oct-0 -2R和Oct-β -3R的酚 乙醇胺受體具有基本相同或者相似的活性。
[0196] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，任何一個(gè)本發(fā)明多肽的同源物衍生自昆蟲(chóng)并且具有至 少50%的序列同一性并且優(yōu)選與昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道具有基本相同或者相似的活 性。
[0197] 在一個(gè)實(shí)施方案中，任何一個(gè)本發(fā)明多肽的同源物衍生自昆蟲(chóng)，優(yōu)選來(lái)自選自有 翅亞綱、新翅目、半翅目、鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、同翅目、擬步行蟲(chóng)總科、擬步行蟲(chóng)科、擬步 行蟲(chóng)屬、Sternorrhyncha、Aphidina、Brachycera、果妮科、Drosophilinae 和果妮屬的昆蟲(chóng) 并且具有至少50%的序列同一性并且優(yōu)選與
[0198] i)昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助蛋 白KChIP (鉀通道相互作用蛋白），或
[0199] ii) Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選H_kv β亞基A或C亞型，或
[0200] ;1;[;0選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅032、(^11]113、〇(31：-0-21?和〇(31：-6-31?的酚乙醇胺受體， 或
[0201] iv)昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道
[0202] 分別具有基本相同或者相似的活性。
[0203] 在一個(gè)實(shí)施方案中，任何一個(gè)本發(fā)明多肽的同源物衍生自
[0204] i)黑腹果蠅、亞熱帶粘蟲(chóng)、擬谷盜屬、褐稻飛虱，或者
[0205] ii)黑腹果蠅、亞熱帶粘蟲(chóng)、擬谷盜屬、桃蚜、棉蚜和/或苜蓿蚜，或者
[0206] iii)黑腹果蠅、亞熱帶粘蟲(chóng)（Spodoptera eridania)、赤擬谷盜（Tribolium castaneum)、桃姆（Myzus persicae)和銀葉粉風(fēng)（Bemisia argentifolii)，或者
[0207] iv)昆蟲(chóng)，優(yōu)選來(lái)自選自有翅亞綱、新翅目、半翅目、鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、同翅 目、擬步行蟲(chóng)總科、擬步行蟲(chóng)科、擬步行蟲(chóng)屬、Sternorrhyncha、Aphidina、Brachycera、果蠅 科、Drosophilinae and果蠅屬的昆蟲(chóng)并且具有至少50 %的序列同一'丨生并且優(yōu)選與昆蟲(chóng)小 電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道具有基本相同或者相似的活性。
[0208] 本發(fā)明多肽的功能等同物或者同源物分別具有
[0209] i)昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助蛋 白KChIP (鉀通道相互作用蛋白），或
[0210] ii)昆蟲(chóng)Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基,優(yōu)選H_kv β亞基A或C亞型， 或
[0211] iii)選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅〇82、0&11113、0(^1-21?和0(^-@-31?的昆蟲(chóng)酚乙醇胺 受體，或
[0212] iv)昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道
[0213] 的活性
[0214] 和與選自SEQ ID勵(lì)：2、6、10、14、18、22、26和/或30的序列所示多肽具有至少 55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%或63%、優(yōu)選至少64%、65%、66%、67%、 68%或69%、更優(yōu)選至少70%、71%、72%、73%、74%，75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81%、82%、83%、84%或85%、最優(yōu)選86%、87%、88%、89%或90%、特別優(yōu)選至少91%、 92%、93%，94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，至于shaker通道和 / 或 Hyperkinetic^ 亞基為 SEQ ID N0:73、75、77、79、81、83、85 和 /或87,至于G蛋白偶 聯(lián)受體為 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174,并且 至于 SK-通道為 SEQ ID N0:228、230、232。
[0215] "功能等同物"在本文上下文中描述在標(biāo)準(zhǔn)條件下與編碼具有下列生物學(xué)活性的 多肽的核酸序列雜交的核酸序列
[0216] i)昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助蛋 白KChIP (鉀通道相互作用蛋白），或
[0217] ii)昆蟲(chóng)Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基,優(yōu)選H_kv β亞基A或C亞型， 或
[0218] ;1;[;0選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅032、(^11]113、〇(31：-0-21?和〇(31：-6-31?的酚乙醇胺受體， 或
[0219] iv)昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道
[0220] 或上述核酸序列的部分，其能夠在細(xì)胞或生物內(nèi)引起具有下列生物學(xué)活性的多肽 的表達(dá)
[0221] i)昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助蛋 白KChIP (鉀通道相互作用蛋白），或
[0222] ii)昆蟲(chóng)Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選H_kv β亞基A或C亞型， 或
[0223] iii)選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅oa2、0amb、0ct_P-2R和Oct-β-3R的昆蟲(chóng)酚乙醇胺 受體，或
[0224] iv)昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道。
[0225] 為了開(kāi)展雜交，有利的是使用如保守區(qū)或其它區(qū)域長(zhǎng)度約10_50bp、優(yōu)選15_40bp 的短寡核苷酸，其可以以技術(shù)人員熟悉的方式通過(guò)與其它相關(guān)基因的比較確定。然而，本發(fā) 明核酸的長(zhǎng)度100_500bp的較長(zhǎng)片段或完整序列也可用于雜交。取決于所使用的核酸/寡 核苷酸、片段或完整序列的長(zhǎng)度或取決于什么類型核酸用于雜交，即DNA或RNA，這些標(biāo)準(zhǔn) 條件可變化。因此，例如，對(duì)于DNA: DNA雜合體的解鏈溫度比相同長(zhǎng)度DNA: RNA雜合體的解 鏈溫度低大約KTC。
[0226] 標(biāo)準(zhǔn)雜交條件應(yīng)理解為意思是指，取決于核酸，例如42和58°C之間的溫度，在水 性緩沖溶液中具有0. 1至5x之間的SSC濃度（IX SSC = O. 15M NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH7. 2) 或者另外在50%甲酰胺存在下，例如42°C，5x SSC，50%甲酰胺。對(duì)于DNA = DNA雜合體的雜 交條件有利的是〇. Ix SSC和約20°C和65°C之間的溫度，優(yōu)選約30°C和45°C之間的溫度。 以DNA: RNA雜合體為例，雜交條件有利的是0. Ix SSC和約30°C和65°C之間的溫度，優(yōu)選約 45°C和55°C之間的溫度。已經(jīng)描述的這些雜交溫度是解鏈溫度值，其已經(jīng)通過(guò)實(shí)例如在甲 酰胺缺乏下長(zhǎng)度約100個(gè)核苷酸和50%的G+C含量的核酸計(jì)算出。對(duì)于DNA雜交的實(shí)驗(yàn)條 件描述于遺傳學(xué)的專業(yè)教科書(shū)中，例如在Sambrook等，〃Molecular Cloning"，Cold Spring Harbor Laboratory, 1989中，并且可以使用技術(shù)人員熟悉的公式，例如作為核酸長(zhǎng)度、雜合 體類型或G+C含量的函數(shù)計(jì)算。技術(shù)人員將在下列教科書(shū)中找到關(guān)于雜交的進(jìn)一步的信 息：Ausubel 等（eds), 1985, Current 方案 s in Molecular Biology, John ffiley&Sons, New York ；Hames and Higgins(eds),1985, Nucleic Acids Hybridization ：A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press, Oxford ；Brown (ed),1991,Essential Molecular Biology ：A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。
[0227] 此外，功能等同物還理解為意思是指，尤其是由根據(jù)本發(fā)明的核酸序列所編碼蛋 白質(zhì)的各個(gè)核酸序列的天然或人工突變和來(lái)自其他生物的它們的同源物。
[0228] 因此，本發(fā)明還包括，例如，通過(guò)修飾SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29的 核酸序列得到的那些核苷酸序列，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86,至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO :129、133、137、 141、145、149、153、157、161、165、169和/或173，并且至于SK-通道為SEQIDN0 :227、229、 231。例如，此類修飾可以通過(guò)技術(shù)人員熟悉的技術(shù)，例如"定點(diǎn)誘變"、"易錯(cuò)PCR"、"DNA改 組"（Nature370,1994，PP. 389-391)或者"交錯(cuò)延伸方法"（Nature Biotechnol. 16,1998， pp. 258-261)產(chǎn)生。此種修飾的目的可以是，例如插入用于限制酶的更多的酶切位點(diǎn)、去除 DNA以便將序列截短、替代核苷酸以優(yōu)化密碼子或加入更多的序列。由所修飾核酸序列編碼 的蛋白質(zhì)必須保留預(yù)期的功能，盡管是有偏差的核酸序列，其是下列的生物學(xué)活性
[0229] i)昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助蛋 白KChIP (鉀通道相互作用蛋白），或
[0230] ii)昆蟲(chóng)Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選H_kv β亞基A或C亞型， 或
[0231] iii)選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅oa2、0amb、0ct_P-2R和Oct-β-3R的昆蟲(chóng)酚乙醇胺 受體，或
[0232] iv)昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道。
[0233] 因此功能等同物包括本文所述序列的天然存在變體和人工核酸序列，例如已經(jīng)通 過(guò)化學(xué)合成得到的那些和適應(yīng)密碼子選擇以及從它們衍生的氨基酸序列的那些。
[0234] 對(duì)應(yīng)于包含 SEQ ID 勵(lì)：2、6、10、14、18、22、26和/或30，至于81^1?51'通道和/或 Hyperkinetic^ 亞基為 SEQ ID N0:73、75、77、79、81、83、85 和 / 或87,至于 G 蛋白偶聯(lián)受 體為 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174,并且至于 SK-通道為SEQ ID NO :228、230、232中所示多核苷酸的核酸分子的天然變體同源物的核酸 分子，例如本發(fā)明的核酸分子和還可以是cDNA的核酸分子，可以基于它們與本文所公開(kāi)核 酸分子的同源性，使用SEQ ID勵(lì)：1、5、9、13、17、21、25和/或29，至于811&1?51'通道和/或 HyperkineticP 亞基為 SEQ ID N0:72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86,至于 G 蛋白偶聯(lián)受 體為 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173,并且至于 SK-通道為SEQ ID NO :227、229、231中所示核酸分子，如本發(fā)明的核酸分子或其片段作為 雜交探針，根據(jù)嚴(yán)格雜交條件下的標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)分離。
[0235] 有利地用于本發(fā)明方法的核酸分子可以基于它們與本文所公開(kāi)核酸分子的同源 性，使用序列或其部分作為雜交探針并在嚴(yán)格雜交條件下按照標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)分離。
[0236] 術(shù)語(yǔ)"同源性"意思是指，各個(gè)核酸分子或所編碼的蛋白質(zhì)是功能和/或結(jié)構(gòu)等效 的。與上述核酸分子同源和為所述核酸分子衍生物的核酸分子是，例如，核酸分子的變體， 所述變體呈現(xiàn)出具有相同的生物學(xué)功能，特別是編碼具有相同或者基本相同生物學(xué)功能的 蛋白質(zhì)的修飾。它們可以是天然存在的變體，例如來(lái)自其他植物品種或物種或突變的序列。 這些突變可天然發(fā)生或者可通過(guò)誘變技術(shù)得到。等位基因變體可以是天然存在的等位基因 變體以及合成產(chǎn)生的或遺傳工程產(chǎn)生的變體。結(jié)構(gòu)等同物可以通過(guò)例如測(cè)試所述多肽與抗 體的結(jié)合或者基于計(jì)算機(jī)的預(yù)測(cè)鑒定。結(jié)構(gòu)等同物具有相似的免疫學(xué)特性，例如包含相似 的表位。
[0237] "雜交"意思是指，核酸分子在常規(guī)雜交條件，優(yōu)選在嚴(yán)格雜交條件下，例如 Sambrook(Molecular Cloning ；A Laboratory Manual, 第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989))或Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N. Y. (1989)，6. 3. 1-6. 3. 6 中所述的條件下雜交。
[0238] 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明核酸的DNA以及RNA分子可以用作探針。此外，作為用于鑒定 功能同源物的模板，可以開(kāi)展Northern印跡分析以及Southern印跡分析。Northern印跡 分析有利地提供關(guān)于所表達(dá)基因產(chǎn)物的更多的信息：例如表達(dá)模式、加工步驟的出現(xiàn)，像剪 接和加帽等。Southern印跡分析提供關(guān)于編碼本發(fā)明核酸分子的基因的染色體定位和組織 的附加信息。
[0239] 嚴(yán)格Southern印跡雜交條件的優(yōu)選、非限定實(shí)例是，在6x氯化鈉/檸檬酸鈉 (=SSC)中于大約45°C下雜交，接著是在0. 2x SSC，0. 1%SDS中于50至65°C，例如在 50°C、55°C或60°C下開(kāi)展一次或更多次的洗滌步驟。技術(shù)人員已知，這些雜交條件因核酸 類型的不同而不同，并且例如當(dāng)存在有機(jī)溶劑時(shí)，關(guān)于溫度和緩沖液的濃度的雜交條件 因核酸類型的不同而不同。"標(biāo)準(zhǔn)雜交條件"下的溫度因核酸類型的不同而不同，例如在 具有0.11、0.51、11、21、31、41或5義55(：(?!17.2)濃度的水性緩沖液中在421：和581：之 間，優(yōu)選在45°C和50°C之間。如果在上述緩沖液中存在一種或多種有機(jī)溶劑，例如50% 甲酰胺，標(biāo)準(zhǔn)條件下的溫度約40°C、42°C或45°C。對(duì)于DNA = DNA雜合體的雜交條件優(yōu)選 的為例如 〇· lx SSC 和 20°C、25°C、30°C、35°C、40°C或 45°C，優(yōu)選在 30°C和 45°C之間。對(duì) 于DNA:RNA雜合體的雜交條件優(yōu)選的為例如0. Ix SSC和30°C、35°C、40°C、45°C、50°C或 55°C，優(yōu)選在45°C和55°C之間。對(duì)于例如在甲酰胺缺乏下長(zhǎng)度約100bp(=堿基對(duì)）和 50%的G+C含量的核酸確定了上述雜交溫度。技術(shù)人員知道借助于教科書(shū)確定所需要的 雜交條件，例如上面提到的教科書(shū)或者下列教科書(shū)：Sambrook等，"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 ；Hames 和 Higgins(Ed.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization ：A Practical Approach"， IRL Press at Oxford University Press, Oxford ;Brown (Ed. ) 1991, ''Essential Molecular Biology ：A Practical Approach"，IRL Press at Oxford University Press, Oxford。
[0240] -個(gè)此類嚴(yán)格雜交條件的其他實(shí)例是在4XSSC中于65°C下雜交，接著在0. IXSSC 中于65°C下洗滌一小時(shí)。備選地，示例性的嚴(yán)格雜交條件是在50 %甲酰胺，4XSSC中于42°C 下雜交。此外，洗滌步驟過(guò)程中的條件可以選自由低嚴(yán)格條件（約2X SSC中于50°C下）和 高嚴(yán)格條件（約〇. 2XSSC中于50°C下，優(yōu)選于65°C下）（20X SSC:0. 3M檸檬酸鈉，3M NaCl， PH7.0)所界定的條件范圍。此外，洗滌步驟過(guò)程中的溫度可以從室溫約22°C的低嚴(yán)格條件 升高約65°C的較高嚴(yán)格條件。
[0241] 鹽濃度和溫度參數(shù)兩者可同時(shí)變化，或者兩個(gè)參數(shù)之一可以保持恒定而僅另一個(gè) 變化。在雜交過(guò)程中還可以使用變性劑，例如甲酰胺或SDS。在50%甲酰胺存在下，雜交優(yōu) 選地在42°C下實(shí)現(xiàn)。相關(guān)因素如i)處理長(zhǎng)度、ii)鹽濃度、iii)去污劑條件、iv)競(jìng)爭(zhēng)DNA、 V)溫度和vi)探針選擇可以依情況組合以致于并非所有的可能性均在此提到。
[0242] 對(duì)于DNA雜交（Southern印跡分析）和洗漆步驟的條件的一些實(shí)例示于下面：
[0243] (1)可以從下列條件中選擇雜交條件：
[0244] a)4X SSC，65°C，
[0245] b)6X SSC，45°C，
[0246] c) 6X SSC，lOOmg/ml 變性的片段化的魚(yú)精 DNA，68°C，
[0247] d)6X SSC，0. 5% SDS，lOOmg/ml 變性的鮭精 DNA，68°C，
[0248] e)6X SSC，0. 5% SDS，lOOmg/ml 變性的片段化鮭精 DNA，50% 甲酰胺，42°C，
[0249] f)50% 甲酰胺，4X SSC，42°C，
[0250] g)50% (vol/vol)甲酰胺，0· 1%牛血清白蛋白，0· 1% Ficoll，0. 1%聚乙烯批咯 烷酮，50mM磷酸鈉緩沖液pH6. 5,750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉，42°C，
[0251] h) 2X 或 4X SSC，50°C (低嚴(yán)格條件），或
[0252] 丨）30至40%甲酰胺，2乂或4乂55(：，421：(低嚴(yán)格條件）。
[0253] (2)洗滌步驟可以從例如下列條件中選擇：
[0254] a) 0· 015M NaCl/0. 0015M 檸檬酸鈉 /0· 1 % SDS，50°C。
[0255] b)0. IX SSC，65°C。
[0256] c)0. IX SSC，0. 5% SDS，68°C。
[0257] d)0. IX SSC，0. 5% SDS，50% 甲酰胺，42°C。
[0258] e) 0· 2X SSC，0· I % SDS，42°C。
[0259] f)2X SSC，65°C (低嚴(yán)格條件）·
[0260] g)0,2XSSC，0, 1% S DS，60°C (中高嚴(yán)格條件），或
[0261] h)0, 1XSSC，0, 1% S DS，60°C (中高嚴(yán)格條件），或
[0262] i) 0, 2XSSC，0, 1 % S DS，65°C (高嚴(yán)格條件），或
[0263] h) 0, 1XSSC，0, 1 % S DS，65°C (高嚴(yán)格條件）。
[0264] 在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格條件下的雜交"旨在描述對(duì)于這樣的雜交和洗漆的 條件，在該條件下彼此至少30%、40%、50 (%或65(%同一性的核苷酸序列通常仍然彼此雜 交。優(yōu)選地，條件是這樣的，以致于彼此至少約70 %、更優(yōu)選至少約75 %或80 %并且甚至更 優(yōu)選至少約85%、90%或95%或更高同一性的序列通常仍然保持彼此雜交。
[0265] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :1、5、9、13、17、 21、25和/或29中所示序列，在shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基情況下SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86，在G蛋白偶聯(lián)受體情況下SEQIDN0:129、133、137、 141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173,并且在 SK-通道情況下 SEQ ID NO :227、 229、231中所示序列雜交，并且對(duì)應(yīng)于天然存在的核酸分子。如本文所使用，"天然存在"核 酸分子指具有自然出現(xiàn)的核苷酸序列的RNA或DNA分子（例如編碼天然蛋白質(zhì)）。
[0266] 除了在種群中存在的核酸或蛋白質(zhì)序列的天然存在變體之外，技術(shù)人員將進(jìn)一步 地認(rèn)識(shí)到，可通過(guò)向編碼多肽的核酸分子的核苷酸序列中引入突變而引入改變，由此導(dǎo)致 所編碼多肽氨基酸序列中的改變并且由此改變多肽的功能能力，這意味著優(yōu)選減少、降低 或缺失所述活性。例如，導(dǎo)致"必需"氨基酸殘基位置上氨基酸替代的核苷酸替代可以在本 發(fā)明方法中待減少的核酸分子序列中進(jìn)行，所述序列例如包含如SEQ ID NO :1、5、9、13、17、 21、25和/或29中所示對(duì)應(yīng)核酸分子，在shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基情況下 SEQIDN0:72、74、76、78、80、82、84和/或86，在G蛋白偶聯(lián)受體情況下SEQIDN0 :129、 133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173,并且在 SK-通道情況下 SEQ ID Ν0:227、229、231。"必需"氨基酸殘基是這樣的殘基，S卩如果來(lái)自一個(gè)多肽野生型序列的殘 基改變導(dǎo)致所述多肽活性改變，而"非必需"氨基酸殘基對(duì)于蛋白質(zhì)活性，例如對(duì)于作為酶 或通道的活性而言是不需要的。"必需"殘基的改變常常導(dǎo)致多肽活性減少、降低或缺失。 優(yōu)選地，多肽氨基酸以如此方式改變以致于活性被減少、降低或缺失，這意味著優(yōu)選地必 需氨基酸殘基和/或更多非必需殘基被改變并且由此在降低多肽的表達(dá)或活性之后活性 減少。然而，其它氨基酸殘基（例如在具有所述活性的結(jié)構(gòu)域中不保守的或僅半保守的那 些）對(duì)于活性而言不是必需的，并且因此可以被改變而不改變所述活性，這是較不優(yōu)選的。
[0267] 優(yōu)選地，由核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與SEQ ID勵(lì)：2、6、10、14、18、22、26和/或30 中所示序列或者與包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個(gè)或更多個(gè)基序的序 列至少約60%、70%或80%相同，更優(yōu)選與SEQIDN0:2、6、10、14、18、22、26和/或30所 示序列之一或者與包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個(gè)或更多個(gè)基序的序列 至少約85%同一，甚至更優(yōu)選與SEQ ID勵(lì)：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示序列或 者與包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一個(gè)或更多個(gè)基序的序列至少約90%、 91%、92%、93%、94%、95% 同源，并且最優(yōu)選與 SEQ ID 吣：2、6、10、14、18、22、26和/或30 中所示序列或者與包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個(gè)或更多個(gè)基序的序列 至少約 96%、97%、98%或 99% 同一。
[0268] 在shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基的情況下，優(yōu)選地，由核酸分子編碼的 蛋白質(zhì)與SEQIDN0:73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示序列或者與包含SEQIDN0 : 102和/或103中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO: 104、105、106、107、108、109、 110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126U27和/或128的一個(gè)或更多個(gè)基序的序列至少約60 %、70 %或80 %同一，更優(yōu)選與 SEQIDN0:73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示序列或者與包含SEQIDN0:102和/ 或103中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、 112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 /或128的一個(gè)或更多個(gè)基序的序列至少約85%同一，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO :73、75、77、 79、81、83、85和/或87中所示序列或者與包含SEQIDN0:102和/或103中分別所示共有 序列或分別選自 SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、112、113、114、115、116、 117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 / 或 128 的一個(gè)或更多 個(gè)基序的序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%同源，并且最優(yōu)選與SEQIDN0:73、 75、77、79、81、83、85和/或87中所示序列或者與包含SEQIDN0 :102和/或103中分別 所示共有序列或分別選自 SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、112、113、114、 115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 / 或 128 的一 個(gè)或更多個(gè)基序的序列至少約96%、97%、98%或99%同一。
[0269] 在G蛋白偶聯(lián)受體的情況下，優(yōu)選地，由核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO : 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 中所示序列或者與包含 SEQ IDN0:177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自SEQIDN0:180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、 200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或226的一個(gè)或更多個(gè)基序的序列至少 約 60%、70%或 80% 同一，更優(yōu)選與 SEQ ID NO : 130、134、138、142、146、150、154、158、162、 166、170和/或174中所示序列或者與包含SEQ ID NO : 177、178和/或179中分別所示共 有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、 和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、 225和/或226的一個(gè)或更多個(gè)基序的序列至少約85%同一，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO: 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 中所示序列或者與包含 SEQ IDN0:177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自SEQIDN0:180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、 200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 的一個(gè)或更多個(gè)基序的序列至 少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%同源，并且最優(yōu)選與SEQIDN0:130、134、138、142、 146、150、154、158、162、166、170和/或174中所示序列或者與包含SEQIDN0 :177、178和 /或179中分別所示共有序列或者分別選自SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、 187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、 203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、 219、220、221、222、223、224、225和/或226的一個(gè)或更多個(gè)基序的序列至少約96%、97%、 98%或 99% 同一。
[0270] 在SK-通道的情況下，優(yōu)選地，由核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO :228、230、 232中所示序列或者與包含SEQ ID NO :239所示共有序列或者選自SEQ ID NO :240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個(gè)或更多個(gè)基序的序列至少 約60%、70%或80%同一，更優(yōu)選與SEQIDN0:228、230、232 中所示序列或者與包含SEQ ID N0:239 所示共有序列或者選自 SEQ ID N0:240、241、242、243、244、245、246、247、248、 249、250、251、252和253的一個(gè)或更多個(gè)基序的序列至少約85%同一，甚至更優(yōu)選與SEQ IDN0 :228、230、232 中所示序列或者與包含SEQIDN0:239 所示共有序列或者選自SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個(gè)或更多個(gè) 基序的序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%同源，并且最優(yōu)選與SEQIDN0:228、 230、232所示序列或者與包含SEQ ID N0:239所示共有序列或者選自SEQ ID N0:240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個(gè)或更多個(gè)基序的序列至少 約 96%、97%、98%或 99% 同一。
[0271] 為了確定兩個(gè)氨基酸序列或者兩個(gè)核酸分子的同源性（=同一性）百分?jǐn)?shù)，將一 個(gè)序列寫(xiě)在另一個(gè)序列的下方以便優(yōu)化比較。可以向蛋白質(zhì)或核酸分子序列中插入空位以 便產(chǎn)生與另一蛋白質(zhì)或者另一核酸的最佳比對(duì)。然后在兩個(gè)聚合物之間比較對(duì)應(yīng)氨基酸位 置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或者核苷酸。如果在一個(gè)序列中的一個(gè)位置被與另一序列 對(duì)應(yīng)位置上的相同的氨基酸殘基或相同的核苷酸占據(jù)，則在該位置上分子是相同的。氨基 酸或者核苷酸"同一性"，如在本文上下文中所使用，對(duì)應(yīng)于氨基酸或者核酸"同源性"。通 常，兩個(gè)序列之間的同源性百分?jǐn)?shù)是序列共享的相同位置數(shù)量的函數(shù)（即％同源性=相同 位置數(shù)量/總位置數(shù)量xlOO)。因此，術(shù)語(yǔ)"同源性"和"同一性"被認(rèn)為對(duì)于本說(shuō)明書(shū)是同 義詞。
[0272] 為了確定兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列或者兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸序列之間的同源性 (=同一性）百分?jǐn)?shù)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出數(shù)個(gè)計(jì)算機(jī)軟件程序。兩個(gè)或更多個(gè)序列的同源性可用 軟件fasta計(jì)算，其目前已經(jīng)有版本fasta3在使用（W. R. Pearson和D. J. Lipman (1988), Improved Tools for Biological Sequence Comparison. PNAS85:2444-2448 ； ff. R. Pearson(1990)Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, Methods in Enzymologyl83:63_98;W.R.Pearson 和 D.J. Lipman (1988) Improved Tools for Biological Sequence Comparison. PNAS85:2444-2448 ；ff.R.Pearson (1990)； Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA Methods in Enzymologyl83:63 - 98)。用于計(jì)算不同序列同源性的另一有用的程序是標(biāo)準(zhǔn)的blast程 序，其包含在Biomax pedant軟件之中（Biomax, Munich,德意志聯(lián)邦共和國(guó)）。不幸的是， 這有時(shí)產(chǎn)生亞最佳的結(jié)果，因?yàn)閎last不是經(jīng)常把目標(biāo)和查詢序列的全部包括在內(nèi)。雖然 該序列極其有效，其可以用于比較極大數(shù)量的序列。對(duì)于此類序列比較有代表性地使用下 列設(shè)置：-p程序名稱[字符串];-d數(shù)據(jù)庫(kù)[字符串];默認(rèn)=nr ;-i查詢文件[文件輸 入];默認(rèn)=stdin ;-e期望值（E) [Real];默認(rèn)=10. 0 ;-m比對(duì)觀察選項(xiàng)：0 =配對(duì)；1 =查 詢錨定的顯示同一性；2 =查詢錨定的無(wú)同一性；3 =平面查詢錨定的，顯示同一性；4 =平 面查詢錨定的，無(wú)同一性；5 =查詢錨定的無(wú)同一性和平端；6 =平面查詢錨定的，無(wú)同一性 和平端；7 = XML Blast輸出；8 =列表；9帶有注解行的列表[整數(shù)];默認(rèn)=0 ;-〇 BLAST 報(bào)告輸出文件[文件輸出]可選；默認(rèn)=stdout ;-F過(guò)濾查詢序列（DUST具有blastn， SEG具有其他）[字符串];默認(rèn)=T ;-G空位打開(kāi)代價(jià)（零調(diào)用默認(rèn)行為）[整數(shù)];默認(rèn) =0 ;-E空位延長(zhǎng)代價(jià)（零調(diào)用默認(rèn)行為）[整數(shù)];默認(rèn)=0 ;-X對(duì)于有空位比對(duì)的X減少 (in bits)(零調(diào)用默認(rèn)行為）；blastn30, megablast20，tblastxO,所有其他 15 [整數(shù)]; 默認(rèn)=〇;-1 Show GI's in deflines[T/F];默認(rèn)=F;_q 核苷酸錯(cuò)配罰分（僅 blastn) [整數(shù)];默認(rèn)=-3 ;-r核苷酸匹配獎(jiǎng)勵(lì)（僅blastn)[整數(shù)];默認(rèn)=I ;-v對(duì)于（V)顯示 一行描述的數(shù)據(jù)庫(kù)序列數(shù)量[整數(shù)];默認(rèn)=500 ;-b顯示對(duì)于（B)比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)序列數(shù) 量[整數(shù)];默認(rèn)=250 ;-f對(duì)于延長(zhǎng)命中的閾值，如果是零為默認(rèn)；blastpll，blastnO， blastxl2，tblastnl3 ;tblastxl3，megablast0[整數(shù)];默認(rèn)=0 ;_g執(zhí)行有缺口的比對(duì)（對(duì) 于tblastx不可用）[T/F];默認(rèn)=T ;-Q使用的查詢遺傳密碼子[整數(shù)];默認(rèn)=I ;-D DB 遺傳密碼子（僅對(duì)于tblast [nx])[整數(shù)];默認(rèn)=I ;_a使用的處理器數(shù)量[整數(shù)];默認(rèn) =1 ;-0 SeqAlign文件[文件輸出]可選；-J相信查詢defline[T/F];默認(rèn)=F ;-M矩陣 [字符串];默認(rèn)=BL0SUM62 ;-W字大小，如果是零為默認(rèn)（blastnll，megablast28,所有其 他3)[整數(shù)];默認(rèn)=0;-z數(shù)據(jù)庫(kù)的有效長(zhǎng)度（對(duì)應(yīng)真實(shí)大小使用零）[真];默認(rèn)=0;-K 來(lái)自待保留區(qū)域的最佳命中數(shù)（默認(rèn)為關(guān)，如果使用則數(shù)值100是推薦的）[整數(shù)];默認(rèn) =〇 ;-Ρ對(duì)于多次命中為〇,對(duì)于一次命中為1 [整數(shù)];默認(rèn)=〇 ;-Υ搜索空間的有效長(zhǎng)度 (對(duì)于真實(shí)大小使用零）[真];默認(rèn)=〇 ;_S針對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的查詢鏈（對(duì)于blast [nx]， 和tblastx) ;3是兩者，1是上面的，2是下面的[整數(shù)];默認(rèn)=3 ;-T產(chǎn)生HTML輸出[T/ F];默認(rèn)=F ;-1對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索限制于GI's列表[字符串]可選；-U使用小寫(xiě)過(guò)濾FASTA 序列[T/F]可選；默認(rèn)=F ;-y在命中中對(duì)于非空位延伸的X減少值（0.0調(diào)用默認(rèn)行為）； blastn20, megablastlO,所有其他7[真];默認(rèn)=0. 0 ;-Z在命中中對(duì)于最終缺口比對(duì)的 X減少值（〇·〇調(diào)用默認(rèn)行為）；blastn/megablast50, tblastxO,所有其他25 [整數(shù)];默 認(rèn)=0 ;-R PSI-TBLASTN檢查點(diǎn)文件[文件輸入]可選；-n MegaBlast搜索[T/F];默認(rèn)= F ;_L查詢序列上的位置[字符串]可選；-A多重命中窗口大小，如果是零為默認(rèn)（blastn/ megablastO,所有其他40 [整數(shù)];默認(rèn)=0;_w移碼罰分（對(duì)blastx為00F算法）[整數(shù)]; 默認(rèn)=0 ;_t用于連接HSPs的tblastn中允許的最大內(nèi)含子長(zhǎng)度（0不能連接）[整數(shù)]; 默認(rèn)=0。
[0273] 通過(guò)使用Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman算法達(dá)到高質(zhì)量的結(jié) 果。因此基于所述算法的程序是優(yōu)選的。有利的，序列比較可以用程序PileUp(J.Mol. Evolution.，25, 351-360,1987, Higgins 等，CABI0S，51989 :151 - 153)或優(yōu)選用程序 Gap 和 BestFit 進(jìn)行，它們分別基于 Needleman 和 Wunsch[J. Mol. Biol. 48 ;443-453(1970)] 以及 Smith 和 Waterman[Adv. Appl. Math. 2 ;482_489 (1981)]的算法。兩個(gè)程序是 GCG 軟件包的一部分[Genetics Computer Group, 575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711 (1991);Altschul 等（1997)Nucleic Acids Res.25:3389 以及下列等等]。因 此，優(yōu)選地使用Gap程序在序列的整個(gè)范圍上開(kāi)展計(jì)算以確定序列同源性百分?jǐn)?shù)。對(duì)于核 酸序列比較使用下列標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整：空位加權(quán)：50,長(zhǎng)度加權(quán)：3,平均匹配：10. 000,平均錯(cuò)配： 0. 000〇
[0274] 例如在核酸水平與SEQ ID NO. :1所示序列具有80%同源性的序列理解為意思 是指，當(dāng)通過(guò)上述Gap程序算法應(yīng)用上述參數(shù)設(shè)置與SEQ ID NO :1的序列比較時(shí)序列具有 80%同源性。
[0275] 兩個(gè)多肽之間的同源性理解為意思是指，通過(guò)借助于程序算法Gap (Wisconsin Package VersionlO. 0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison，USA)，設(shè)置以下參數(shù)：空位加權(quán)：8 ;長(zhǎng)度加權(quán)：2 ;平均匹配：2. 912 ;平均錯(cuò) 配：-2. 003經(jīng)比較計(jì)算的，每一情況下整個(gè)序列長(zhǎng)度上的氨基酸序列的同一性。
[0276] 例如在蛋白質(zhì)水平與SEQ ID NO :2的序列具有80%同源性的序列理解為意思是 指，當(dāng)通過(guò)上述Gap程序算法應(yīng)用上述參數(shù)設(shè)置與SEQ ID NO :2的序列比較時(shí)序列具有 80%同源性。
[0277] 根據(jù)本發(fā)明通過(guò)取代、插入或者缺失，從SEQ ID勵(lì)：2、6、10、14、18、22、26和/或 30所示多肽之一或者包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個(gè)或更多個(gè)基序的 序列之一衍生的功能等同物，與SEQIDN0:2、6、10、14、18、22、26和/或30所示多肽之一 或者包含SEQ ID NO : 33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO : 35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽之一具有至少 30%、35%、40%、45%或50%，優(yōu)選至少55%、60%、65%或70%，優(yōu)選至少80%，特別優(yōu)選 至少85%或90%、91%、92%、93%或94%，非常特別優(yōu)選至少95%、97%、98%或99%同源 性，并且通過(guò)與SEQ ID勵(lì)：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽具有基本相同的特 性相區(qū)別。
[0278] 根據(jù)本發(fā)明通過(guò)取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29 所示核酸序列衍生的功能等同物與SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示的根據(jù) 本發(fā)明的核酸具有至少30%、35%、40%、45%或50%，優(yōu)選至少55%、60%、65%或70%優(yōu) 選至少80 %，特別優(yōu)選至少85 %或90 %、91 %、92 %、93 %或94 %，非常特別優(yōu)選至少95 %、 97%、98%或99%同源性，并且編碼與SEQ ID勵(lì)：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示 多肽具有基本相同特性的多肽。
[0279] 以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，根據(jù)本發(fā)明通過(guò)取代、插入或者 缺失，從SEQ ID Ν0:73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽之一或者包含SEQ ID NO: 102和/或103中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO: 104、105、106、107、108、109、 110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127和/或128的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽之一衍生的功能等同物，與SEQ ID NO :73、 75、77、79、81、83、85和/或87中所示多肽之一或者包含SEQIDN0:102和/或103中分別 所示共有序列或分別選自 SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、112、113、114、 115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 / 或 128 的一 個(gè)或更多個(gè)基序的多肽之一具有至少30%、35%、40%、45%或50%，優(yōu)選至少55%、60%、 65%或70%，優(yōu)選至少80%，特別優(yōu)選至少85%或90%、91 %、92%、93%或94%，非常特別 優(yōu)選至少 95%、97%、98% 或 99% 同源性，并且通過(guò)與 SEQ ID N0:73、75、77、79、81、83、85 和/或87所示多肽具有基本相同的特性相區(qū)別。
[0280] 以shaker通道和/或HyperkineticP亞基為例，根據(jù)本發(fā)明通過(guò)取代、插入或者 缺失，從SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸序列衍生的功能等同物， 與根據(jù)本發(fā)明的SEQ ID勵(lì)：72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸之一具有至少 30%、35%、40%、45%或50%，優(yōu)選至少55%、60%、65%或70%，優(yōu)選至少80%，特別優(yōu)選 至少85%或90%、91%、92%、93%或94%，非常特別優(yōu)選至少95%、97%、98%或99%同源 性，并且編碼與SEQ ID N0:73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示多肽具有基本相同特 性的多肽。
[0281] 以G蛋白偶聯(lián)受體為例，根據(jù)本發(fā)明通過(guò)取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO :130、 134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 中所示多肽之一或者包含 SEQ ID NO : 177、178和/或179中分別所示共有序列或者分別選自SEQ ID NO : 180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、 200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽之 一衍生的功能等同物，與 SEQ ID NO : 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 /或174中所示多肽之一或者包含SEQ ID NO :177、178和/或179中分別所示共有序列 或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、 和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 /或226的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽之一具有至少30 %、35 %、40 %、45 %或50 %，優(yōu)選至 少55%、60%、65%或70%，優(yōu)選至少80%，特別優(yōu)選至少85%或90%、91%、92%、93%或 94%，非常特別優(yōu)選至少95%、97%、98%或99%同源性，并且通過(guò)與SEQ ID N0:130、134、 138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174所示多肽具有基本相同的特性相區(qū)別。
[0282] 以G蛋白偶聯(lián)受體為例，根據(jù)本發(fā)明通過(guò)取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO :129、 133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所示核酸序列衍生的功能等同 物，與根據(jù)本發(fā)明的 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173中所示核酸之一具有至少30%、35%、40%、45%或50%，優(yōu)選至少55%、60%、65%或 70 %，優(yōu)選至少80 %，特別優(yōu)選至少85 %或90 %、91 %、92 %、93 %或94%，非常特別優(yōu)選 至少 95%、97%、98% 或 99% 同源性，并且編碼與 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170和/或174中所示多肽具有基本相同特性的多肽。
[0283] 以SK-通道為例，根據(jù)本發(fā)明通過(guò)取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO :228、230、 232所示多肽之一或者包含SEQ ID NO :239中所示共有序列或選自SEQ ID NO :240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽之一 衍生的功能等同物，與SEQIDN0:228、230、232 中所示多肽之一或者包含SEQIDN0:239 所示共有序列或選自 SEQ ID N0:240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、 252和253的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽之一具有至少30 %、35 %、40 %、45 %或50 %，優(yōu)選至 少55%、60%、65%或70%，優(yōu)選至少80%，特別優(yōu)選至少85%或90%、91%、92%、93%或 94%，非常特別優(yōu)選至少95%、97%、98%或99%同源性，并且通過(guò)與SEQIDN0 :228、230、 232所示多肽具有基本相同的特性相區(qū)別。
[0284] 以SK-通道為例，根據(jù)本發(fā)明通過(guò)取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO :227、229、 231中所示核酸序列衍生的功能等同物，與根據(jù)本發(fā)明的SEQ ID N0:227、229、231中所示 核酸之一具有至少30%、35%、40%、45%或50%，優(yōu)選至少55%、60%、65%或70%，優(yōu)選 至少80 %，特別優(yōu)選至少85 %或90 %、91 %、92 %、93 %或94%，非常特別優(yōu)選至少95%、 97%、98%或99%同源性，并且編碼與SEQIDN0:228、230、232 中所示多肽具有基本相同 特性的多肽。
[0285] 在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)核酸序列或多肽序列之間的"同源性"或"同一性"通 過(guò)每一情況中核酸序列/多肽序列整個(gè)序列長(zhǎng)度上的同一性定義，同一性通過(guò)借助于設(shè) 置如下參數(shù)：空位加權(quán)：8 ;長(zhǎng)度加權(quán)：2 ;平均匹配：2, 912 ;平均錯(cuò)配：-2, 003以程序算法 GAP(Wisconsin Package VersionlO.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group(GCG)，Madison，USA)進(jìn)行的比對(duì)計(jì)算。
[0286] 在下文中，術(shù)語(yǔ)同一性也代替術(shù)語(yǔ)"同源的"或"同源性"同義地使用。
[0287] "突變"包括取代、添加、缺失、倒位或插入一個(gè)或更多個(gè)核苷酸殘基，這也可通過(guò) 取代、插入或者缺失一個(gè)或更多個(gè)氨基酸帶來(lái)靶標(biāo)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)氨基酸序列的改變。
[0288] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及選自下列的分離的核酸分子：
[0289] a)編碼SEQ ID N0:2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子；
[0290] b)SEQ ID N0:l、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29 中所示核酸分子；
[0291] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID N0:2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；
[0292] d)與包含SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29所示核酸分子的多核苷酸的 核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0293] e)核酸分子，編碼與（a)至（C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或 其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活性的多肽；
[0294] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0295] g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1 或Shaker樣）和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活性的多肽產(chǎn)生；
[0296] h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自 SEQIDN0:35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個(gè)或更多個(gè) 基序的多膚；
[0297] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :7、8 ;9、10 ;11、 12中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組文庫(kù)得到；
[0298] 和
[0299] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針包 含（a)或（b)核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互補(bǔ)并編碼分別具有電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助 蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、 50nt、100nt、200nt 或 500nt。
[0300] 以shaker通道和/或HyperkineticP亞基為例，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及 選自下列的分離的核酸分子：
[0301] a)編碼包含SEQ ID勵(lì)：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核 酸分子；
[0302] b)包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子的核酸分 子；
[0303] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自包含根據(jù)SEQ ID NO :73、75、 77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；
[0304] d)與包含SEQ ID勵(lì)：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷 酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0305] e)核酸分子，編碼與（a)至（c)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β亞基A或 C亞型活性的多肽；
[0306] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0307] g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有Shaker通道和/或HyperkineticP亞基， 優(yōu)選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽產(chǎn)生；
[0308] h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO : 102和/或103中分別所示共有序列或分別選 白 SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽；
[0309] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :88、89 ;90、91 ; 92、93 ;94、95 ;96、97 ;98、99和/或IOOUOl中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組 文庫(kù)得到
[0310] 和
[0311] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針包 含（a)或（b)核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互補(bǔ)并編碼分別具有Shaker通道和/或HyperkineticP亞基，優(yōu)選H-kvP亞基A或C亞 型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。
[0312] 以G蛋白偶聯(lián)受體為例，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及選自下列的分離的核酸 分子：
[0313] a)編碼 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174 中所不多肽的核酸分子；
[0314] b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所 不核酸分子；
[0315] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自包含根據(jù)SEQ ID NO :130、134、 138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列的多肽；
[0316] d)與包含 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0317] e)核酸分子，編碼與（a)至（C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇 胺受體活性的多肽；
[0318] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0319] g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅的oa2、0amb、0ct-@-2R 和Oct-β -3R的酚乙醇胺受體活性的多肽產(chǎn)生；
[0320] h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO : 177、178和/或179中分別所示共有序列或分 別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、 192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽；
[0321] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :131、132 ;135、 136 ;139、140 ;143、144 ;147、148 ;151、152 ;155、156、159、160 ;163、164 ;167、168 ;171、172 和/或175、176中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組文庫(kù)得到
[0322] 和
[0323] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針包 含（a)或（b)核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互補(bǔ)并編碼具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅的〇a2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇胺 受體活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。
[0324] 以SK-通道為例，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及選自下列的分離的核酸分子：
[0325] a)編碼SEQ ID NO :230、232中所示多肽的核酸分子；
[0326] b)SEQ ID NO :229、231 中所示核酸分子；
[0327] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO :230、232的多 肽序列；
[0328] d)與包含SEQ ID NO :229、231所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至 少50%同一性的核酸分子；
[0329] e)核酸分子，編碼與（a)至（C)核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽；
[0330] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0331] g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽產(chǎn)生；
[0332] h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或選自SEQ ID NO :240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個(gè)或更多個(gè)基序的多 肽；
[0333] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :233、234、235、 236 ;和237、238中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組文庫(kù)得到
[0334] 和
[0335] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針包 含（a)或（b)核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互補(bǔ)并編碼具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。
[0336] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明分離的核酸分子的核酸構(gòu)建體。
[0337] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體或者分離的核酸分子的載 體。
[0338] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化方式包含本發(fā)明的載體、核酸構(gòu) 建體或者分離的核酸分子的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。
[0339] "分離的"多核苷酸或者核酸分子與存在于該核酸分子天然來(lái)源的其它多核苷酸 或者核酸分子分離。分離的核酸分子可以是數(shù)kb的染色體片段，或者優(yōu)選地僅包含基因編 碼區(qū)的分子。因此，分離的核酸分子可包含臨近5'和3'的染色體區(qū)或者進(jìn)一步臨近染色體 區(qū)，但是優(yōu)選地不包含如此的序列，即其天然位于在核酸分子所來(lái)源生物基因組或染色體 背景中核酸分子的側(cè)翼（例如臨近編碼核酸分子5' -和3' -UTR區(qū)的序列）。在多種實(shí)施 方案中，在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的分離的核酸分子可以例如包含小于約5kb、4kb、3kb、 2kb、lkb、0. 5kb或0. Ikb的核苷酸序列，這些核苷酸序列天然位于核酸分子所來(lái)源細(xì)胞基 因組DNA中核酸分子的側(cè)翼。
[0340] 在方法中使用的核酸分子或其部分可以使用分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和本文提供的 序列信息分離。同樣，例如在DNA或者氨基酸水平同源的序列或者同源、保守序列區(qū)可以借 助于比較算法鑒定。前者可以用作標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)（例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述的那些）下的雜交探針用于分離 在該方法中有用的更多的核酸序列。
[0341 ] 包含其活性待在本發(fā)明方法中降低的分子的整個(gè)序列或其部分的核酸分 子，可額外地通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、基于被使用的該序列或其部分的寡核苷酸引物分 離。例如，包含完整序列或其部分的核酸分子可以通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用已經(jīng)基于 該每一序列產(chǎn)生的寡核苷酸引物分離。例如，mRNA可以通過(guò)例如Chirgwin等（1979) Biochemistryl8:5294-5299的硫氰酸胍提取法從細(xì)胞分離，并且cDNA可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶 (例如Moloney MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，可從Gibco/BRL，Bethesda，MD得到，或AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，可從 Seikagaku America, Inc. , St. Petersburg, FL 得至丨J )產(chǎn)生。
[0342] 用于通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的合成的寡核苷酸引物可以基于本文所示序列產(chǎn) 生。此類引物可以用于從cDNA文庫(kù)或者從基因組文庫(kù)擴(kuò)增核酸序列和鑒定在本發(fā)明方法 中有用的核酸分子。
[0343] 此外，通過(guò)與根據(jù)本發(fā)明方法待減少的核酸分子所編碼蛋白質(zhì)，特別是SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示核酸分子，在81^1?51'通道和/或!^6濁丨1^^(^ 亞基情況下，SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86,在G蛋白偶聯(lián)受體情況下，SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173,并且在 SK-通道情況 下，SEQ ID勵(lì)：227、229、231所編碼的序列開(kāi)展蛋白質(zhì)序列比對(duì)，可以鑒定來(lái)自不同生物的 保守區(qū)，并且反過(guò)來(lái)從這些保守區(qū)可以衍生簡(jiǎn)并引物。
[0344] 保守區(qū)是在來(lái)自不同來(lái)源的數(shù)個(gè)同源物的一個(gè)特定位置中的氨基酸極少變異的 那些區(qū)。本文所示的共有序列和多肽基序衍生自所述比對(duì)。此外，通過(guò)與根據(jù)本發(fā)明方法 待減少的核酸分子所編碼蛋白質(zhì)，特別是由SEQ ID勵(lì)：2、6、10、14、18、22、26和/或30所 示多肽分子編碼的序列，至于shaker通道和/或HyperkineticP亞基為SEQ ID NO :73、 75、77、79、81、83、85 和 / 或 87,至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、 150、154、158、162、166、170 和 / 或 174,并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :228、230、232 開(kāi)展 蛋白質(zhì)序列比對(duì)，可以鑒定來(lái)自多種生物的保守區(qū)，并且反過(guò)來(lái)從這些保守區(qū)可以衍生簡(jiǎn) 并引物。
[0345] 保守區(qū)是在來(lái)自不同來(lái)源的數(shù)個(gè)同源物的一個(gè)特定位置中的氨基酸極少變異的 那些區(qū)。本文所示的共有序列和多肽基序衍生自所述比對(duì)。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，在 本發(fā)明方法中，包含SEQ ID NO :33和/或34,至于shaker通道和/或Hyperkineticii亞 基為SEQ ID N0:102和/或103,至于G蛋白偶聯(lián)受體為SEQ ID N0:177、178和/或179， 并且至于SK-通道為SEQ ID N0:239所示共有序列或者選自SEQ ID N0:35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基 為 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128,至于G蛋白偶聯(lián)受體為SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、 195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、 211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或226，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽或者由它們組成的多肽的活性被降低，并且在另一個(gè)實(shí)施方案 中，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO :33和/或34,至于shaker通道和/或Hyperkineticii亞 基為SEQ ID N0:102和/或103,至于G蛋白偶聯(lián)受體為SEQ ID N0:177、178和/或179， 并且至于SK-通道為SEQ ID N0:239所示共有序列或者選自SEQ ID N0:35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基 為 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128,至于G蛋白偶聯(lián)受體為SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、 195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、 211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或226，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽或者由它們組成的多肽，由此所指定的20或更少、優(yōu)選15或 10、優(yōu)選9、8、7或6、更優(yōu)選5或4、甚至更優(yōu)選3、甚至更優(yōu)選2、甚至更優(yōu)選1、最優(yōu)選0個(gè) 氨基酸位置被任意氨基酸代替。在一個(gè)實(shí)施方案中，由字母指定的不大于15%、優(yōu)選10%、 甚至更優(yōu)選5%、4%、3%或2%、最優(yōu)選1 %或0%的氨基酸位置被另一氨基酸代替。在一 個(gè)實(shí)施方案中，20或更少、優(yōu)選15或10、優(yōu)選9、8、7或6、更優(yōu)選5或4、甚至更優(yōu)選3、甚至 更優(yōu)選2、甚至更優(yōu)選1、最優(yōu)選0個(gè)氨基酸被插入至共有序列或蛋白質(zhì)基序中。
[0346] 共有序列衍生自如SEQ ID勵(lì):2、6、10、14、18、22、26和/或30，至于811&1?51'通道 和 / 或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID 勵(lì)73、75、77、79、81、83、85和/或87，至于6蛋白偶 聯(lián)受體為 SEQ ID Ν0130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174,并且至 于SK-通道為SEQ ID N0228、230、232所示序列的多重比對(duì)。字母表示單字母氨基酸密碼 子并且表明氨基酸在所有比對(duì)的蛋白質(zhì)中是保守的。字母X代表在所有序列中不保守的氨 基酸。
[0347] 保守結(jié)構(gòu)域從所有序列鑒定并且使用亞類標(biāo)準(zhǔn)PiOSite標(biāo)記法描述，例如模式 Υ-χ (21，23) - [FW]意思是指，保守酪氨酸被來(lái)自苯丙氨酸或色氨酸的最小21和最大23個(gè)氨 基酸殘基分隔開(kāi)。
[0348] 保守模式使用軟件工具M(jìn)EME版本3. 5. 1或者手工鑒定。MEME由Timothy L Bailey 和 Charles Elkan, Dept, of Computer Science and Engeneering，University of California，San Diego, USA 開(kāi)發(fā)并且由 Timothy L Bailey 和 Charles Elkan [Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, 1994] 描述。獨(dú)立程序的源代碼可以從San Diego Supercomputer center(http: //meme. sdsc. edu)公開(kāi)獲得。
[0349] 為了用軟件工具M(jìn)EME鑒定所有序列中的共同基序，使用下列設(shè)置：-maxsiZe5000 00, -nmotifsl5, -evtO. 001，_maxw60,-距離 le_3, -minsites 用于分析的序列數(shù)。對(duì)于MEME 的輸入序列是Fasta格式的非對(duì)齊的序列。其它參數(shù)在該軟件版本中使用默認(rèn)設(shè)置。
[0350] 對(duì)于保守結(jié)構(gòu)域的Prosite模式使用軟件工具Pratt版本2. 1或手工產(chǎn)生。 Pratt 由 Inge Jonassen, Dept, of Informatics, University of Bergen，Norway 開(kāi)發(fā) 并由 Jonassen 等· [I.Jonassen，J. F. Collins and D.G. Higgins, Finding flexible patterns in unaligned protein sequences, Protein Science4 (1995)，pp. 1587-1595 ; 1. Jonassenj Efficient discovery of conserved patterns using a pattern graph，Submitted to CABIOS Febr. 1997]描述。對(duì)于獨(dú)立程序的源代碼（ANSI C)在例如 建立的生物信息中心像EBI (European Bioinformatics Institute)中公開(kāi)得到。
[0351] 為了使用軟件工具Pratt產(chǎn)生模式，使用下列設(shè)置：PL(max Pattern Length): 100,PN(max Nr of Pattern Symbols) ：100,PX(max Nr of consecutive x s) ：30,FN(max Nr of flexible spacers) ：5, FL(max Flexibility) ：30, FP(max Flex.Product) :10， ON(max number patterns) :50。對(duì)于Pratt的輸入序列是如從軟件工具M(jìn)EME所鑒定的表 現(xiàn)出高相似性的蛋白質(zhì)序列的不同區(qū)。不得不匹配所產(chǎn)生模式的序列的最低數(shù)量（CM，min Ni* of Seqs to Match)被設(shè)置成是所提供序列的至少80%。本文未提到的參數(shù)使用它們 的默認(rèn)設(shè)置。
[0352] 保守結(jié)構(gòu)域的Prosite模式可以用于搜尋匹配該模式的蛋白質(zhì)序列。多個(gè)建立的 生物信息中心提供公開(kāi)的英特網(wǎng)入口用于在數(shù)據(jù)庫(kù)搜索中使用那些模式（例如PIR[蛋白 質(zhì)信息資源，位于 Georgetown University Medical Center]或 ExPASy [Expert Protein Analysis System])。備選地，可利用獨(dú)立軟件，像程序Fuzzpro,它是EMBOSS軟件包的部 分。例如，程序Fuzzpro不但允許搜索精確的模式-蛋白質(zhì)匹配，而且還允許在開(kāi)展的搜索 中設(shè)置不同的模糊。
[0353] 比對(duì)使用軟件ClustalW(版本L 83)開(kāi)展并描述于Thompson等.[Thompson， J. D. , Higgins, D. G. and Gibson, T. J. (1994) CLUSTAL W ：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Research, 22:4673-4680]。對(duì)立程序的源代碼從 European Molecular Biology Laboratory ;Heidelberg，Germany 公開(kāi)獲得。分析使用 ClustalW vl. 83 默認(rèn)參數(shù)（空位 開(kāi)口罰分：1〇· 0 ;空位延長(zhǎng)罰分：〇· 2 ;蛋白質(zhì)矩陣：Gonnet ;pprotein/DNA endgap :_1 ;蛋 白質(zhì)/DNA gapdist :4)開(kāi)展。
[0354] 然后，如上述設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物可被PCR采用用于擴(kuò)增編碼具有上述活性的蛋白質(zhì) 的新編碼區(qū)片段。
[0355] 然后，這些片段可用作雜交探針用于分離完整的基因序列。備選地，缺失的5'和 3'序列可以通過(guò)RACE-PCR手段分離。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以使用cDNA，備選地使用 基因組DNA作為模板和適宜寡核苷酸引物，按照標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增。因此，擴(kuò)增的核酸 分子可以被克隆入適宜的載體中并通過(guò)DNA序列分析的方式表征。對(duì)應(yīng)于用于本發(fā)明方法 的核酸分子之一的寡核苷酸可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成方法，例如使用自動(dòng)DNA合成儀產(chǎn)生。
[0356] 有利地用于根據(jù)本發(fā)明方法的核酸分子可以基于它們與本文所公開(kāi)核酸分子的 同源性，使用序列或其部分作為雜交探針并且按照嚴(yán)格雜交條件下的標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)分離。
[0357] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽：
[0358] a)編碼SEQ ID N0:2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子；
[0359] b)SEQ ID N0:l、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29 中所示核酸分子；
[0360] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID N0:2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；
[0361] d)與包含SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29所示核酸分子的多核苷酸的 核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0362] e)核酸分子，編碼與（a)至（C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或 其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活性的多肽；
[0363] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0364] g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1 或Shaker樣）和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活性的多肽產(chǎn)生；
[0365] h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自 SEQIDN0:35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個(gè)或更多個(gè) 基序的多膚；
[0366] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :7、8 ;9、10 ;11、 12中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組文庫(kù)得到
[0367] 和
[0368] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針包 含（a)或（b)核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互補(bǔ)并編碼分別具有電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助 蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白）活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、 50nt、100nt、200nt 或 500nt。
[0369] 以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及 由選自下列的核酸分子編碼的多肽：
[0370] a)編碼SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示多肽的核酸分子；
[0371] b)SEQ ID N0:72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86 所示核酸分子；
[0372] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO :73、75、77、79、 81、83、85和/或87的多肽序列；
[0373] d)與包含SEQ ID勵(lì)：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷 酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0374] e)核酸分子，編碼與（a)至（C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β亞基A或 C亞型活性的多肽；
[0375] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0376] g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有Shaker通道和/或HyperkineticP亞基， 優(yōu)選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽產(chǎn)生；
[0377] h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO : 102和/或103中分別所示共有序列或分別選 白 SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽；
[0378] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :88、89 ;90、91 ; 92、93 ;94、95 ;96、97 ;98、99和/或IOOUOl中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組 文庫(kù)得到
[0379] 和
[0380] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針 包含（a)或（b)核酸分子的互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子 序列互補(bǔ)并編碼分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β亞基A或 C亞型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。
[0381] 以G蛋白偶聯(lián)受體為例，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由選自下列的核酸分子 編碼的多肽：
[0382] a)編碼 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174 中所不多肽的核酸分子；
[0383] b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所 不核酸分子；
[0384] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO :130、134、138、 142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列；
[0385] d)與包含 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0386] e)核酸分子，編碼與核酸分子（a)至（C)所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一'I"生并且具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅的〇a2、Oamb、Oct-β -2R和Oct-β -3R的酚乙醇胺 受體活性的多肽；
[0387] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0388] g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct-0_2R 和Oct-β -3R的酚乙醇胺受體活性的多肽產(chǎn)生；
[0389] h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO : 177、178和/或179中分別所示共有序列或分 別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、 192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、 222、223、224、225 和 / 或 226的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽；
[0390] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :131、132 ;135、 136 ;139、140 ;143、144 ;147、148 ;151、152 ;155、156、159、160 ;163、164 ;167、168 ;171、172 和/或175、176中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組文庫(kù)得到
[0391] 和
[0392] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針包 含（a)或（b)核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互補(bǔ)并編碼具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅的〇a2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇胺 受體活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。
[0393] 以SK-通道為例，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由選自下列的核酸分子編碼的 多肽：
[0394] a)編碼SEQ ID NO :230、232中所示多肽的核酸分子；
[0395] b)SEQ ID NO :229、231 中所示核酸分子；
[0396] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO :230、232的多 肽序列；
[0397] d)與包含SEQ ID NO :229、231所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至 少50%同一性的核酸分子；
[0398] e)核酸分子，編碼與（a)至（C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽；
[0399] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0400] g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽產(chǎn)生；
[0401] h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或選自SEQ ID NO :240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個(gè)或更多個(gè)基序的多 肽；
[0402] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :233、234、235、 236 ;和237、238中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組文庫(kù)得到
[0403] 和
[0404] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針包 含（a)或（b)核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互補(bǔ)并編碼具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。
[0405] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明多肽的膜，由此膜不具有本發(fā)明多肽 的內(nèi)源活性。
[0406] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞，由此宿主的膜不顯 示本發(fā)明多肽的內(nèi)源活性。
[0407] 措辭"膜不具有本發(fā)明多肽的最初活性"意思是指，本發(fā)明的多肽不是天然存在膜 的部分，但是其被裝配入根據(jù)本發(fā)明方法的膜中。
[0408] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括編碼分別具有下列活性的多肽的基因的表達(dá)
[0409] i)在宿主膜中的昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和 /或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白），或
[0410] ii)在宿主膜中的昆蟲(chóng)Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β亞 基A或C亞型，或
[0411] iii)在宿主膜中的選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅的oa2、0amb、0ctm^P0ct-@-3R 的昆蟲(chóng)酚乙醇胺受體，或
[0412] iv)在宿主膜中的昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道。
[0413] 在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0414] 在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是在其天然狀態(tài)下具有低或者無(wú)興趣的電活性的細(xì) 胞。與此相比，表達(dá)本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞顯示選自2-20?5、3-20?5、4-15?5、5-12?5和 5-10pS間隔的電導(dǎo)。
[0415] 在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自CHO細(xì)胞、HEK293、COS、HeLa、NIH3T3、BAK21、 Jurkat、CV-1、!fepC-2-、爪蟾卵母細(xì)胞；Sf9、S2、Sf21、Hi5、Pcl2、U20S。
[0416] 為了產(chǎn)生包含具有下列活性的本發(fā)明多肽的本發(fā)明宿主細(xì)胞
[0417] i)離子通道和/或其輔助蛋白，編碼多肽的核苷酸序列，或
[0418] ii)離子通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β亞基A或C亞型，編碼多 肽的核苷酸序列，或
[0419] iii)酚乙醇胺受體和優(yōu)選額外的標(biāo)記蛋白質(zhì)，如GFP，和/或額外的"泛宿主 性" G-蛋白，編碼多肽的至少一個(gè)核苷酸序列，或
[0420] iv)離子通道，編碼多肽的核苷酸序列被引入其被重組產(chǎn)生的宿主細(xì)胞中。
[0421] 在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是微生物，其中編碼具有下列活性的多肽的核苷酸 序列被根據(jù)描述于例如 T. Maniatis，E. F. Fritsch 和 J. Sambrook，"Molecular Cloning :A Laboratory Manual"， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989) 的一般克隆技術(shù)引入以增殖所述核苷酸序列
[0422] i)本發(fā)明的鉀離子通道和/或其輔助蛋白，或
[0423] ii)本發(fā)明的鉀離子通道和/或HyperkineticP亞基，優(yōu)選H-kvP亞基A或C亞 型，或
[0424] iii)本發(fā)明的酚乙醇胺受體和優(yōu)選額外標(biāo)記蛋白質(zhì)，如GFP，和/或額外的"泛宿 主性"G-蛋白，或
[0425] iv)本發(fā)明的通道。
[0426] 上述核酸分子可以與更多的基因一起被克隆入根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或者載 體中，或者不同的基因通過(guò)將數(shù)個(gè)核酸構(gòu)建體或載體（包括質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞中而引 入。
[0427] 因此，本發(fā)明還涉及包含功能性連接至一個(gè)或更多個(gè)調(diào)節(jié)元件或信號(hào)的用于本發(fā) 明方法中的一個(gè)或多個(gè)核酸分子或其片段的核酸構(gòu)建體，優(yōu)選表達(dá)構(gòu)建體。此外，本發(fā)明 還涉及用于產(chǎn)生同源重組事件的包含用于本發(fā)明方法的核酸分子或其部分的核酸構(gòu)建體。
[0428] 核酸構(gòu)建體還可以包含待引入宿主細(xì)胞內(nèi)的更多的基因。
[0429] 如本文所述，調(diào)節(jié)序列或因子可對(duì)優(yōu)選引入的構(gòu)建體的表達(dá)具有正作用，因此增 加構(gòu)建體的表達(dá)。因此，通過(guò)使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(hào)例如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子可有利地在轉(zhuǎn)錄水 平發(fā)生調(diào)節(jié)元件的增強(qiáng)。此外，然而，轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)也可通過(guò)例如增加 RNA穩(wěn)定性實(shí)現(xiàn)。
[0430] 因此，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以用作表達(dá)盒并且因此可以用于直接引入至宿主細(xì) 胞中，或者它們可以被引入至載體中。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體是包含微生物 啟動(dòng)子或微生物終止子或者兩者的表達(dá)盒。在另一實(shí)施方案中，表達(dá)盒包含真核啟動(dòng)子或 者真核終止子或者兩者。
[0431] 如果預(yù)期以數(shù)個(gè)構(gòu)建體或者載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，則上述轉(zhuǎn)化的標(biāo)記必須去除或者 在后續(xù)轉(zhuǎn)化中采用另外的標(biāo)記?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員的方法如現(xiàn)有技術(shù)中所述將標(biāo)記 從宿主細(xì)胞中去除。
[0432] 在一個(gè)實(shí)施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明方法的核酸序列可有利的有效連接至一個(gè)或 更多個(gè)調(diào)節(jié)信號(hào)以便增加基因表達(dá)。
[0433] 這些調(diào)節(jié)序列旨在使核酸分子，例如用于本發(fā)明方法的基因或基因片段或基因產(chǎn) 物或核酸的特異表達(dá)成為可能。取決于宿主生物，例如真核細(xì)胞或微生物，這將意味著例如 基因或基因構(gòu)建體僅在誘導(dǎo)后表達(dá)和/或過(guò)表達(dá)，或其組成型表達(dá)和/或過(guò)表達(dá)。這些調(diào) 節(jié)序列為例如誘導(dǎo)子或阻抑物結(jié)合并因此調(diào)節(jié)核酸表達(dá)的序列。此外，基因構(gòu)建體還可有 利的包含一個(gè)或更多個(gè)與啟動(dòng)子有效連接的稱作增強(qiáng)子序列的序列，并且它們使核酸序列 增強(qiáng)表達(dá)。同樣，可以在DNA序列3'端插入另外有利的序列，例如其他的調(diào)節(jié)元件或終止 子。
[0434] 術(shù)語(yǔ)"增加的表達(dá)"或"過(guò)表達(dá)"，如本文所使用，意思是指原始野生型表達(dá)水平之 外的任何形式的表達(dá)。
[0435] 用于增加基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法在本領(lǐng)域中廣泛記錄并且包括例如由適當(dāng) 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過(guò)表達(dá)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子的使用。充當(dāng)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件的分離 的核酸可以引入至非異源形式多核苷酸的適當(dāng)位置中（通常是上游），以致于上調(diào)編碼目 的多肽的核酸的表達(dá)。
[0436] 以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中使 用Kozak序列。
[0437] 編碼根據(jù)本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸分子和編碼另外的多肽的核酸分子可以存在于一 個(gè)核酸構(gòu)建體或載體中或者存在于數(shù)個(gè)核酸構(gòu)建體或載體中。在一個(gè)實(shí)施方案中，僅用于 本發(fā)明方法的核酸分子或其編碼基因的一個(gè)拷貝存在于核酸構(gòu)建體或載體中。數(shù)個(gè)載體或 核酸構(gòu)建體或載體可以在宿主生物中一起表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或核酸構(gòu)建體可以 插入在載體中并以自由形式存在于細(xì)胞中。如果優(yōu)選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，則使用超過(guò)數(shù)個(gè)世代穩(wěn)定 復(fù)制或者它們或它們的部分被插入至基因組中的載體。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可以發(fā)生向 細(xì)胞核基因組中的整合。為了向宿主基因組中插入一個(gè)以上的構(gòu)建體，待表達(dá)的構(gòu)建體將 一起存在于一個(gè)載體中，例如在攜帶多個(gè)構(gòu)建體的上述載體中。
[0438] 通常，用于構(gòu)建體表達(dá)率的調(diào)節(jié)序列位于與待調(diào)節(jié)核酸分子序列相對(duì)而言的上游 (5'）、當(dāng)中和/或下游（3'）。它們特別是控制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯和/或轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性。表達(dá)水 平依賴于更多細(xì)胞調(diào)節(jié)系統(tǒng)，例如細(xì)胞的蛋白質(zhì)生物合成和降解系統(tǒng)的結(jié)合。
[0439] 調(diào)節(jié)序列包括轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列或信號(hào)，例如尤其與轉(zhuǎn)錄或翻譯起始調(diào)節(jié)有關(guān) 的位于上游（5'）的序列，如啟動(dòng)子或起始密碼子，和尤其與轉(zhuǎn)錄或翻譯終止和轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定 性有關(guān)的位于下游（3'）的序列，如多腺苷化信號(hào)或終止密碼子。
[0440] 特別有利的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子、組織或區(qū)室特異啟動(dòng)子和可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。通 常，"啟動(dòng)子"在本文上下文中被理解為意思是指核酸分子中的介導(dǎo)核酸分子的編碼序列片 段表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。原則上，可以使用天然啟動(dòng)子和它們的調(diào)節(jié)序列。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞 的一些啟動(dòng)子是例如CMV、SV40、ΤΚ、β -肌動(dòng)蛋白。
[0441] 核酸構(gòu)建體有利地如此構(gòu)建，以致于啟動(dòng)子之后是用于插入待表達(dá)核酸的適宜切 割位點(diǎn)，有利地在多接頭中，如果合適，之后是位于多接頭后面的終止子。如果合適，該次序 被重復(fù)數(shù)次以致于數(shù)個(gè)基因被組合在一個(gè)構(gòu)建體中，并且因此可以被引入至轉(zhuǎn)基因植物中 以便被表達(dá)。序列被重復(fù)如直至三次。為了表達(dá)，核酸序列通過(guò)適宜的切割位點(diǎn)插入在例 如啟動(dòng)子后面的多接頭中。對(duì)于每一核酸序列，有利的是具有其自身的啟動(dòng)子，并且，如果 合適，具有其自身的終止子，如上面所提到。然而，還可以在啟動(dòng)子后面并且如果合適在終 止子之前插入數(shù)個(gè)核酸序列，特別是當(dāng)在宿主或靶細(xì)胞中多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄可能時(shí)。在該上下 文中，插入位點(diǎn)或者插入至核酸構(gòu)建體中的核酸分子序列不是決定性的，也就是說(shuō)核酸分 子可以插入至盒的第一個(gè)或最后一個(gè)位置而對(duì)表達(dá)沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的影響。然而，還可以在構(gòu) 建體中僅使用一個(gè)啟動(dòng)子類型。
[0442] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案還涉及產(chǎn)生載體的方法，包括將本文表征的核酸分子、根 據(jù)本發(fā)明的核酸分子或根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒插入至載體中。載體可以例如引入至細(xì)胞，如 微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，如本文對(duì)于核酸構(gòu)建體或下面轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所述或?qū)嵤├尽?宿主或靶細(xì)胞可以瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，然而，優(yōu)選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
[0443] 根據(jù)本發(fā)明的載體優(yōu)選是適宜在細(xì)胞中、優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)根據(jù)本發(fā)明多 肽的載體。因此，方法還包括用于將調(diào)節(jié)信號(hào)，特別是介導(dǎo)在生物如微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞 中表達(dá)的信號(hào)整合入載體的一個(gè)或更多個(gè)步驟。
[0444] 因此，本發(fā)明還涉及包含本文所表征核酸分子作為適于根據(jù)本發(fā)明核酸分子的植 物表達(dá)的核酸構(gòu)建體部分的載體。
[0445] 用于本發(fā)明方法的有利的載體，如本發(fā)明的載體包含編碼用于本發(fā)明方法的核酸 分子的核酸分子，或適用于在細(xì)胞中表達(dá)的包含如上所述適用于本發(fā)明方法的核酸分子的 核酸構(gòu)建體，或者單獨(dú)或者與更多的基因如標(biāo)記或者選擇基因一起。
[0446] 因此，有利的用于本發(fā)明方法的重組表達(dá)載體包含用于本發(fā)明方法的核酸分子或 者根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，其為這樣的形式，即適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)包含SEQ ID Ν02、 6、10、14、18、22、26和/或30，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亞基為SEQIDN073、 75、77、79、81、83、85 和 / 或 87,至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID N0130、134、138、142、146、 150、154、158、162、166、170 和 / 或 174,并且至于 SK-通道為 SEQ ID N0228、230、232 中所 示多核苷酸的核酸分子或其同源物和/或同時(shí)表達(dá)與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子伴隨的或本 文所述的另外的基因。因此，重組表達(dá)載體包含與待表達(dá)核酸序列有效連接的、基于待用于 表達(dá)的宿主細(xì)胞選擇的一個(gè)或更多個(gè)調(diào)節(jié)信號(hào)。
[0447] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"載體"指能夠運(yùn)輸與其連接的另一核酸的核酸分子。一種類型 的載體是"質(zhì)粒"，其意思是指可以向其中連接另外的DNA片段的環(huán)形雙鏈DNA環(huán)。更多類 型的載體是病毒載體，其可以將額外的DNA片段連接入病毒基因組中。某些載體能夠在它 們所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制（例如具有細(xì)菌復(fù)制起始點(diǎn)的細(xì)菌載體）。其它優(yōu)選的載 體當(dāng)它們被引入至宿主細(xì)胞中時(shí)有利地全部或部分整合入宿主細(xì)胞的基因組中，并因此與 宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠控制與它們有效連接的基因的表達(dá)。在本文上 下文中，這些載體被稱為"表達(dá)載體"。如上面所提到，它們能夠自主復(fù)制或者可以部分或全 部整合入宿主基因組中。適用于DNA重組技術(shù)的表達(dá)載體通常采用質(zhì)粒形式。在本說(shuō)明書(shū) 中，"質(zhì)粒"和"載體"可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最頻繁使用形式的載體。然而，本發(fā)明還旨在 包括發(fā)揮相似功能的其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體。此外，術(shù)語(yǔ)載體還包括技術(shù)人員 已知的其他載體，例如噬菌體、病毒例如SV40、CMV、TMV、轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘 粒和線性或環(huán)狀DNA。
[0448] 在重組表達(dá)載體中，"有效連接"意思是指目的核酸分子以基因表達(dá)成為可能的 方式連接至調(diào)節(jié)信號(hào)：它們彼此如此連接以致于兩個(gè)序列實(shí)現(xiàn)對(duì)于序列所指定的預(yù)期功能 (例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或在宿主細(xì)胞中，如果載體被引入宿主細(xì)胞中的話）。
[0449] 術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)序列"旨在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件（例如多腺苷化 信號(hào)）。這些調(diào)節(jié)序列描述于例如 Goeddel :Gene Expression Technology :Methods in Enzymologyl85，Academic Press，San Diego，CA(1990)，或參見(jiàn)：Gruber 和 Crosby，in : Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida,Ed. :Glick和Thompson,第7章，89-108中，包括它們當(dāng)中所引用的文獻(xiàn)。調(diào)節(jié)序 列包括控制核苷酸序列在許多類型宿主細(xì)胞中組成型表達(dá)的那些，和控制核苷酸序列僅在 特定細(xì)胞中和在特定條件下直接表達(dá)的那些。技術(shù)人員知道，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)將取決于多 種因素如待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇、蛋白質(zhì)量減少的程度等等。對(duì)調(diào)節(jié)序列的優(yōu)選選擇描述 于上面，例如啟動(dòng)子、終止子、增強(qiáng)子等等。術(shù)語(yǔ)調(diào)節(jié)序列被認(rèn)為包含在術(shù)語(yǔ)調(diào)節(jié)信號(hào)之內(nèi)。 數(shù)個(gè)有利的調(diào)節(jié)序列，尤其是啟動(dòng)子和終止子在上面描述。通常，作為適宜表達(dá)的有利核酸 構(gòu)建體描述的調(diào)節(jié)序列也適用于載體。
[0450] 備選地，核酸序列可以使用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)?？捎糜?在所培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞（例如Sf9細(xì)胞）中表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括pAc系列 (Smith 等（1983)Mol. Cell Biol. 3:2156-2165)和 pVL 系列（Lucklow 和 Summers(1989) Virologyl70:31-39)。上面提到的載體僅是可能的適宜載體的小的概述。更多的質(zhì)粒 是技術(shù)人員已知的并且描述于例如Cloning Vectors(Ed.Pouwels，P.H.等，Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN0444904018)。用于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的更多 的適宜表達(dá)系統(tǒng)見(jiàn) Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E. F.和 Maniatis，T.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989 中的第 16 和 17 章。
[0451] 因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及包含用于根據(jù)本發(fā)明方法中的核酸分子或用于 本發(fā)明方法中的核酸構(gòu)建體，例如本發(fā)明的核酸分子或核酸構(gòu)建體的載體。所述載體可用 于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以便提供根據(jù)本發(fā)明多肽的表達(dá)。有利地，所述核酸分子與用于在 原核或真核宿主中或者在原核和真核宿主中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列有效連接。此外，適宜同源重 組的載體也處于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
[0452] 因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及已經(jīng)用適宜本發(fā)明方法的載體，特別是用根據(jù) 本發(fā)明的載體或根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的宿 主細(xì)胞，由此宿主的膜不內(nèi)源顯示本發(fā)明多肽的活性。
[0453] 本發(fā)明的更多實(shí)施方案還涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，例如真核或原核宿主或宿主 細(xì)胞，優(yōu)選轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，包括向宿主細(xì)胞中引入根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體、 根據(jù)本發(fā)明的載體或根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，由此宿主的膜不內(nèi)源顯示本發(fā)明多肽的活 性。
[0454] 載體DNA可以通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)引入至原核或真核細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn) 化"和"轉(zhuǎn)染"包括接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且如在本文上下文中所使用，旨在包括用于將外來(lái)核 酸分子（例如DNA)引入宿主細(xì)胞內(nèi)的多種多樣的現(xiàn)有技術(shù)方法，包括磷酸鈣共沉淀或 氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、PEG-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、天然感受態(tài)、化學(xué) 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、電穿孔或粒子轟擊。用于宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的適宜方法可 以在 Sambrook 等(Molecular Cloning ：A Laboratory Manual.,2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 1989)和其它實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)如Methods in Molecular Biology，1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols，Ed. :Gartland and Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey 中找到。
[0455] 為了選擇核酸分子、載體或核酸構(gòu)建體向宿主生物內(nèi)的成功轉(zhuǎn)移，有利的是使用 已經(jīng)在上面詳細(xì)描述的標(biāo)記基因。對(duì)于核酸向植物細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定或瞬時(shí)整合，已知僅少數(shù) 細(xì)胞攝入外來(lái)DNA并且如果預(yù)期的話，將其整合入其基因組中，這取決于所使用的表達(dá)載 體和所使用的轉(zhuǎn)染技術(shù)。為了鑒定和選擇這些整合體，通常將編碼可選擇標(biāo)記的基因（如 上所述，例如對(duì)抗生素的抗性）與目的基因一起引入到宿主細(xì)胞內(nèi)。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記是 例如編碼參與抗性的基因的標(biāo)記，優(yōu)選抗生素抗性基因或者如糖或氨基酸生物合成途徑 中的基因，例如β-半乳糖苷酶、ura3或ilv2。編碼基因如螢光素酶、gfp或其他熒光基因 的標(biāo)記同樣適用。這些標(biāo)記和上述標(biāo)記可以用于突變體中，在所述突變體中這些基因不具 有功能，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)通過(guò)常規(guī)方法被缺失。此外，編碼可選擇標(biāo)記的核酸分子可以與編碼 本方法所用核苷酸分子在同一載體上引入至宿主細(xì)胞中，或者在分開(kāi)的載體上引入至宿主 細(xì)胞中。已經(jīng)以所引入核酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以通過(guò)例如選擇來(lái)鑒定（例如，已經(jīng)整 合入可選擇標(biāo)記的細(xì)胞存活而其它細(xì)胞死亡）。
[0456] "報(bào)告基因"編碼容易定量的蛋白質(zhì)，如上述標(biāo)記基因一樣。轉(zhuǎn)化效率或表達(dá)位 點(diǎn)或時(shí)限可通過(guò)這些基因經(jīng)生長(zhǎng)測(cè)定、熒光測(cè)定、化學(xué)發(fā)光測(cè)定、生物發(fā)光測(cè)定或抗性測(cè) 定或光度測(cè)量（內(nèi)在顏色）或酶活性評(píng)價(jià)。在該上下文中，極其特別優(yōu)選的是報(bào)告蛋白 質(zhì)（Schenborn E，Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999 ; 13(1) :29-44)例如"綠色突光蛋 白"（GFP)(Gerdes HH 和 Kaether C，F(xiàn)EBS Lett. 1996 ;389(1):44-47 ;Chui WL 等，Curr Biol 1996,6:325-330 ;Leffel SM 等，Biotechniques· 23 (5): 912-8,1997)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn) 移酶、螢光素酶（Giacomin，Plant Scil996,116:59-72 ;Scikantha，J Bactl996,178:121 ; Millar等，Plant Mol Biol R印199210:324-414)和一般的螢光素酶基因、β-半乳糖苷酶 或 β-葡糖醛酸糖苷酶（Jefferson等，EMBO J. 1987,6, 3901-3907)或 Ura3基因。
[0457] "選擇標(biāo)記"賦予對(duì)抗生素或其他毒性化合物的抗性：在該上下文中可以提到 的實(shí)例是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其賦予對(duì)氨基葡糖苷抗生素新霉素（G418)、卡那霉 素、巴龍霉素的抗性（Deshayes A等，EMBO J. 4(1985)2731-2737)，編碼突變的二氫蝶 酸合酶的 sul 基因 （Guerineau F 等，Plant Mol Biol. 1990; 15(1): 127-136)，潮霉素 B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 （Gen Bank登錄號(hào)：K01193)和she ble抗性基因，其賦予對(duì)博來(lái)霉 素抗生素如zeocin的抗性。選擇標(biāo)記基因的更多實(shí)例是賦予對(duì)2-脫氧葡萄糖-6-磷 酸（W098/45456)或膦絲菌素等等抗性的基因，或賦予對(duì)抗代謝物抗性的那些基因，例 如 dhfr 基因（Reiss，Plant Physiol. (Life Sci. Adv. ) 13(1994) 142-149)。其他適宜 的基因?qū)嵗?trpB 或 hisD (Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sci U S A. 85(1988)8047-8051)。另一適宜基因是甘露糖磷酸異構(gòu)酶基因（W094/20627)，ODC(鳥(niǎo)氨 酸脫羧酶）基因（McConlogue，1987in :Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory，Ed.)或土曲霉脫氨酶（Tamura K等，Biosci Biotechnol Biochem. 59(1995)2336-2338)。
[0458] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體或核酸構(gòu)建體包括編碼親和標(biāo)記的核酸序列。 "親和標(biāo)記":指肽或多肽，其編碼核酸序列可使用慣?？寺〖夹g(shù)直接或通過(guò)連接體方式與 編碼本發(fā)明多肽的核酸序列融合。親和標(biāo)記用于通過(guò)親和層析從總細(xì)胞提取物中分離、濃 縮和/或特異純化重組靶蛋白質(zhì)。上述連接體可有利的包含蛋白酶切割位點(diǎn)（例如凝血酶 或因子X(jué)a的切割位點(diǎn)），由此當(dāng)需要時(shí)可從靶蛋白質(zhì)上將親和標(biāo)記切割下來(lái)。常用的親和 標(biāo)記的實(shí)例為來(lái)自Quiagen的"His標(biāo)記"、Hilden、"Strep標(biāo)記"、"Myc標(biāo)記"(Invitrogen， Carlsberg)、來(lái)自New England Biolabs的由殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和內(nèi)含肽組成的標(biāo)記、來(lái) 自New England Biolabs的麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)（pMal)和來(lái)自Novagen的稱作CBD的標(biāo)記。 在該上下文中，親和標(biāo)記可以連接至編碼靶蛋白質(zhì)的編碼核酸序列的5'或3'端。
[0459] 本發(fā)明的核酸分子可以用于產(chǎn)生雜交探針，通過(guò)雜交探針可以分離根據(jù)本發(fā)明的 核酸序列的功能等同物。這些探針的產(chǎn)生和實(shí)驗(yàn)步驟是已知的。例如，這涉及通過(guò)PCR特 異性產(chǎn)生放射性或非放射性探針和適宜標(biāo)記的寡核苷酸的使用和之后的雜交實(shí)驗(yàn)。對(duì)于此 目的所需要的技術(shù)在例如 T. Maniatis，E. F. Fritsch 和 J. Sambrook，Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989) 中提到。此外，所討論的探針可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)（Lit. SDM或隨機(jī)誘變）以如此方式修飾， 以致于它們能夠用于更多目的，例如用作與mRNA和相應(yīng)編碼序列特異性雜交的探針以便 分析其它生物中的相應(yīng)序列。探針可以用于例如篩選所述昆蟲(chóng)的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù) 或者在電子數(shù)據(jù)庫(kù)中計(jì)算機(jī)搜索類似序列。
[0460] "遺傳控制序列":術(shù)語(yǔ)"遺傳控制序列"被認(rèn)為與術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)序列"等同，并且描述 對(duì)根據(jù)本發(fā)明的核酸在原核或真核生物中的轉(zhuǎn)錄并且如果合適對(duì)翻譯具有影響的序列。實(shí) 例是啟動(dòng)子、終止子或稱作"增強(qiáng)子"的序列。除了這些控制序列外或者代替這些序列，這些 序列的天然調(diào)節(jié)可仍存在于實(shí)際結(jié)構(gòu)基因之前，并且如果合適，會(huì)以如此方式進(jìn)行遺傳修 飾以致于關(guān)閉天然調(diào)節(jié)并且靶標(biāo)基因的表達(dá)已經(jīng)被修飾，也就是說(shuō)增加了或者減少了?？?制序列的選擇取決于宿主生物或起始生物。此外，遺傳控制序列還包括基因的5' -非翻譯 區(qū)、內(nèi)含子或非編碼3'區(qū)。此外，控制序列理解為意思是指允許向宿主生物基因組中進(jìn)行 同源重組或插入的那些或者允許從基因組去除的那些。
[0461] "敲除轉(zhuǎn)化體"指在其中特定基因已經(jīng)通過(guò)轉(zhuǎn)化手段以定向方式被分別失活，特定 基因的活性已經(jīng)被降低、下調(diào)、減少或缺失的個(gè)體轉(zhuǎn)基因生物。
[0462] "天然遺傳環(huán)境"指原來(lái)生物中的天然染色體基因座。以基因組文庫(kù)為例，核酸序 列的天然遺傳環(huán)境優(yōu)選地至少部分保留。該環(huán)境至少在核酸序列5'或3'側(cè)面，并且具有 至少50bp、優(yōu)選至少100bp、特別優(yōu)選至少500bp、非常特別優(yōu)選至少I(mǎi)OOObp和最優(yōu)選至少 5000bp的序列長(zhǎng)度。
[0463] "反應(yīng)時(shí)間"指開(kāi)展活性測(cè)定直至得到關(guān)于活性的重要發(fā)現(xiàn)所需要的時(shí)間；它取決 于在測(cè)定法中所采用蛋白質(zhì)的比活性和所使用方法以及所用設(shè)備的靈敏度。技術(shù)人員熟悉 反應(yīng)時(shí)間的確定。以基于光度鑒定殺真菌活性化合物的方法為例，反應(yīng)時(shí)間通常在>0和 360分鐘之間。
[0464] "重組DNA"描述可通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的DNA序列的組合。
[0465] "重組DNA技術(shù)":是用于融合DNA序列的通常已知的技術(shù)（例如描述于Sambrook 等，1989, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press 中）。
[0466] "復(fù)制起點(diǎn)"保證了根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒或載體在微生物和酵母中的繁殖，例 如大腸桿菌（E. coli)中的 pBR322ori、ColEl 或 P15A ori (Sambrook 等· ：Molecular Cloning. A Laboratory Manual,2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY，1989)和酵母中的 ARSlori (Nucleic Acids Research，2000,28(10): 2060-2068)。
[0467] "靶標(biāo)/靶標(biāo)蛋白質(zhì)":具有下列活性的本發(fā)明的多肽、蛋白質(zhì)
[0468] i)鉀離子通道和/或其輔助蛋白，或
[0469] ii)鉀離子通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β亞基A或C亞型，或
[0470] iii)具有酚乙醇胺受體活性的蛋白質(zhì)，或
[0471] iv)鉀離子通道。
[0472] 所有的靶標(biāo)或作用位點(diǎn)共有特征，即靶標(biāo)蛋白質(zhì)功能的存在是昆蟲(chóng)存活所必須 的。
[0473] "轉(zhuǎn)化"描述向原核或真核細(xì)胞內(nèi)引入異源性DNA的過(guò)程。所轉(zhuǎn)化細(xì)胞不僅描述了 轉(zhuǎn)化過(guò)程本身的產(chǎn)物，還描述了通過(guò)轉(zhuǎn)過(guò)過(guò)程所產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物的所有轉(zhuǎn)基因后代。
[0474] "轉(zhuǎn)基因的":指包含根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的核酸序列、表達(dá)盒或載體或者以根 據(jù)本發(fā)明的核酸序列、表達(dá)盒或載體轉(zhuǎn)化的生物，術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)基因描述已經(jīng)通過(guò)遺傳工程方法 產(chǎn)生的所有那些構(gòu)建體，其中靶標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列，或者有效連接至靶標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸 序列的遺傳控制序列，或者上述可能性的組合不在它們的天然遺傳環(huán)境中或者已經(jīng)通過(guò)重 組方法修飾。在該上下文中，修飾可以通過(guò)例如將所述核酸序列的一個(gè)或更多個(gè)核苷酸殘 基突變實(shí)現(xiàn)。
[0475] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽、膜或宿主細(xì)胞用作殺蟲(chóng)靶標(biāo)的用 途。
[0476] 編碼黑腹果蠅昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣） 和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白）的基因的缺失，或電壓門(mén)控性鉀通道 Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活 性的抑制對(duì)黑腹果蠅而言是致死性的。
[0477] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽：
[0478] a)編碼SEQ ID N0:2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子；
[0479] b)SEQ ID N0:l、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29 中所示核酸分子；
[0480] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID N0:2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；
[0481] d)與包含SEQ ID N0:2、6、10、14、18、22、26和/或30所示核酸分子的多核苷酸 的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0482] e)核酸分子，編碼與（a)至（C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或 其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活性的多肽；
[0483] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0484] g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1 或Shaker樣）和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活性的多肽產(chǎn)生；
[0485] h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自 SEQIDN0:35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個(gè)或更多個(gè) 基序的多膚；
[0486] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :7、8 ;9、10 ;11、 12中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組文庫(kù)得到；
[0487] 和
[0488] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，探針包含 (a)或（b)的核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子序列互 補(bǔ)并編碼分別具有電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助 蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白）活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、 50nt、100nt、200nt 或 500nt,
[0489] 或其同源物用作殺蟲(chóng)靶標(biāo)的用途。
[0490] 以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，黑腹果蠅中編碼昆蟲(chóng)Shaker通 道和/或HyperkineticP亞基，優(yōu)選H-kvP亞基A或C亞型的基因的缺失，或Shaker通 道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選H-kvi3亞基A或C亞型活性的抑制對(duì)黑腹果蠅而言 是致命性的。
[0491] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽：
[0492] a)編碼包含SEQ ID勵(lì)：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核 酸分子；
[0493] b)包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子的核酸分 子；
[0494] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自包含根據(jù)SEQ ID NO :73、75、 77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；
[0495] d)與包含SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87所示核酸分子的多核苷 酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0496] e)核酸分子，編碼與（a)至（C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β亞基A或 C亞型活性的多肽；
[0497] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0498] g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有Shaker通道和/或HyperkineticP亞基， 優(yōu)選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽產(chǎn)生；
[0499] h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO : 102和/或103中分別所示共有序列或分別選 白 SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一個(gè)或更多個(gè)基序的多 肽；
[0500] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :88、89 ;90、91 ; 92、93 ;94、95 ;96、97 ;98、99和/或IOOUOl中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組 文庫(kù)得到；
[0501] 和
[0502] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，探針包含 (a)或（b)核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子序列互補(bǔ) 并編碼分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β亞基A或C亞型活 性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt,
[0503] 或其同源物用作殺蟲(chóng)靶標(biāo)的用途。
[0504] 以G蛋白偶聯(lián)受體為例，黑腹果蠅或其他昆蟲(chóng)中編碼選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅的 oa2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的昆蟲(chóng)酚乙醇胺受體的基因的缺失，或選自優(yōu)選來(lái)自黑 腹果蠅〇a2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇胺受體活性的抑制對(duì)黑腹果蠅或其它 昆蟲(chóng)而言是致命性的。
[0505] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽：
[0506] a)編碼 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174 中所不多肽的核酸分子；
[0507] b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所 不核酸分子；
[0508] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自包含根據(jù)SEQ ID NO :130、134、 138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列的多肽；
[0509] d)與包含 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0510] e)核酸分子，編碼與（a)至（c)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇 胺受體活性的多肽；
[0511] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0512] g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct-0_2R 和Oct-β -3R的酚乙醇胺受體活性的多肽產(chǎn)生；
[0513] h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO : 177、178和/或179中分別所示共有序列或分 別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、 192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽；
[0514] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :131、132 ;135、 136 ;139、140 ;143、144 ;147、148 ;151、152 ;155、156、159、160 ;163、164 ;167、168 ;171、172 和/或175、176中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組文庫(kù)得到；
[0515] 和
[0516] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針包 含（a)或（b)核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互補(bǔ)并編碼具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅〇a2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇胺受 體活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt,
[0517] 或其同源物用作殺蟲(chóng)靶標(biāo)的用途。
[0518] 以SK-通道為例，黑腹果蠅中編碼昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道基因的缺失，或昆 蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的抑制對(duì)黑腹果蠅而言是致命性的。
[0519] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽：
[0520] a)編碼SEQ ID NO :228、230、232中所示多肽的核酸分子；
[0521] b) SEQ ID NO : 227、229、231 中所示核酸分子；
[0522] c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO :228、230、232 的多肽序列；
[0523] d)與包含SEQ ID NO :228、230、232所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具 有至少50 %同一'丨生的核酸分子；
[0524] e)核酸分子，其編碼與（a)至（c)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽；
[0525] f)在嚴(yán)格雜交條件下與（a)至（C)的核酸分子雜交的核酸分子；
[0526] g)核酸分子，其編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針 對(duì)（a)至（e)之一的核酸分子所編碼并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽產(chǎn)生；
[0527] h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或選自SEQ ID NO :240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個(gè)或更多個(gè)基序的多 肽；
[0528] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :233、234、235、 236 ;和237、238中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組文庫(kù)得到；
[0529] 和
[0530] j)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針包 含（a)或（b)核酸分子的互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a)至（e)中所表征核酸分子序 列互補(bǔ)并編碼具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt，
[0531] 或其同源物用作殺蟲(chóng)靶標(biāo)的用途。
[0532] 本發(fā)明此外涉及包含下列的核酸構(gòu)建體或表達(dá)盒
[0533] a)與包含下列的核酸序列有效連接的遺傳控制序列
[0534] i)具有 SEQ ID N01、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29,至于 shaker 通道和 / 或 HyperkineticP 亞基為 SEQ ID N072,74, 76, 78,80,82,84和 / 或86,至于G 蛋白偶聯(lián)受體 為 SEQ ID N0129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173,并且至于 SK-通 道為SEQ ID N0227、229、231中所示核酸序列的核酸序列；或
[0535] ii)基于遺傳密碼子簡(jiǎn)并性，可以通過(guò)回譯從SEQ ID N02、6、10、14、18、22、26和 / 或 30,至于 shaker 通道和 / 或 HyperkineticP 亞基為 SEQ ID N073、75、77、79、81、83、 85 和 / 或 87,至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID N0130、134、138、142、146、150、154、158、162、 166、170和/或174，并且至于SK-通道為SEQIDN0228、230、232 所示氨基酸序列衍生的 核酸序列；或
[0536] iii)核酸序列 SEQ ID N01、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29,至于 shaker 通道和 / 或 HyperkineticP 亞基為 SEQ ID N072,74,76,78,80,82,84 和 / 或86,至于G 蛋白偶聯(lián)受體 為 SEQ ID N0129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和/ 或 173,并且至于 SK-通 道為SEQ ID N0227、229、231的功能等同物；
[0537] 和
[0538] b)額外的功能元件；或
[0539] c)a)和b)的組合
[0540] 并且涉及包含下列的核酸構(gòu)建體或表達(dá)盒
[0541] a)與根據(jù)本發(fā)明的核酸序列有效連接的遺傳控制序列；
[0542] b)額外的功能元件；或
[0543] c)a)和b)的組合
[0544] 在"體外"或"體內(nèi)"測(cè)定系統(tǒng)中的用途。
[0545] 本發(fā)明此外涉及核酸構(gòu)建體或表達(dá)盒的上述實(shí)施方案用于在體外或體內(nèi)測(cè)定系 統(tǒng)中表達(dá)本發(fā)明多肽的用途。
[0546] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽、膜或宿主細(xì)胞用于鑒定具有殺蟲(chóng) 活性的化合物的用途。
[0547] 本發(fā)明此外涉及本發(fā)明的多肽在用于鑒定殺蟲(chóng)化合物的方法中的用途。
[0548] 根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案包括下列步驟：
[0549] i.將本發(fā)明的多肽在允許一種或更多種測(cè)試化合物與本發(fā)明多肽結(jié)合的條件下 與一種或更多種測(cè)試化合物接觸，
[0550] ii.檢測(cè)測(cè)試化合物是否結(jié)合在i)中所述本發(fā)明的多肽；或
[0551] iii.檢測(cè)測(cè)試化合物是否減少或抑制或封閉在i)中所述本發(fā)明多肽的活性；或
[0552] iv.檢測(cè)測(cè)試化合物是否減少或抑制或封閉具有下列活性的多肽的轉(zhuǎn)錄、翻譯或 表達(dá)
[0553] 1.在i)中所述電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其 輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白），或
[0554] 2.在i)中所述Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選H_kv β亞基A或 C亞型，或
[0555] 3.在i)中所述選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚 乙醇胺受體，或
[0556] 4.在i)中所述昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道。
[0557] 按照上述方法步驟ii或iii對(duì)本發(fā)明多肽活性的檢測(cè)，可以使用多種體外和體內(nèi) 測(cè)定法評(píng)價(jià)，例如測(cè)量電流、測(cè)量膜電位、測(cè)量離子流如鉀或銣、測(cè)量鉀濃度、測(cè)量第二信使 和轉(zhuǎn)錄水平、使用鉀依賴性酵母生長(zhǎng)測(cè)定法和使用如電壓敏感染料、放射性示蹤劑和膜片 鉗電生理學(xué)。
[0558] 以G蛋白偶聯(lián)受體為例，按照上述方法步驟ii或iii對(duì)本發(fā)明多肽活性的檢測(cè)， 可以使用多種體外和體內(nèi)測(cè)定法評(píng)價(jià)，例如測(cè)量電流、測(cè)量膜電位、測(cè)量離子流如鈣、優(yōu)選 測(cè)量鈣濃度、測(cè)量第二信使和轉(zhuǎn)錄水平、使用鉀依賴性酵母生長(zhǎng)測(cè)定法和使用如鈣濃度敏 感染料或放射性示蹤劑。
[0559] 按照上述方法步驟ii或iii的檢測(cè)可使用鑒定蛋白質(zhì)和配體之間相互作用的 技術(shù)實(shí)現(xiàn)。在該上下文中，測(cè)試化合物或者多肽可包含可檢測(cè)標(biāo)記例如熒光標(biāo)記、放射性 同位素、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或膜或電位標(biāo)記。標(biāo)記的實(shí)例選自來(lái)自Molecular Devices的 藍(lán)色膜電位染料、ANEP (氨基萘基乙烯基吡啶?。┤玖舷馾i-4-ANEPPS、di-8-ANEPPS、 di-2-ANEPEQ+、di-8-ANEPPQ、di-12-ANEPPQ;RH 染料（最初由 Rina Hildesheim 合 成），包括來(lái)自Molecular Probes的一系列的二烷基氨基苯基多烯基吡啶，鋪染料像 RH414(T-llll)、RH795(R-649)和 RH237(S-1109)。RH421(S-1108)或來(lái)自 Molecular Probes的基于羰花青和氧雜菁的其它染料，如在1999年出版的第七版Molecular Probes' Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 中所述。
[0560] 以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中， 檢測(cè)測(cè)試化合物是否減少、抑制或封閉本發(fā)明多肽活性的方法包括以優(yōu)選選自SEQ ID NO: 72,74,76,78,80,82,84 和 / 或 86 的昆蟲(chóng) Shaker 通道和 / 或 HyperkineticP 亞基，優(yōu) 選H-kv β亞基A或C亞型穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞經(jīng)受加載至少一種上述染料，優(yōu)選來(lái)自 Molecular Devices的藍(lán)色膜電位染料，達(dá)0. 1-3小時(shí)、優(yōu)選0. 5-1小時(shí)、優(yōu)選0. 45小時(shí)，
[0561] 通過(guò)以l-120mM、優(yōu)選10-60mM、更優(yōu)選50mM KCl的EC50值濃度增加 KCl的細(xì)胞 外水平活化Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β亞基A或C亞型，
[0562] 優(yōu)選以ΙμΜ-lOOmM、10-10000 μΜ、優(yōu)選100-1000 μΜ的濃度加入懷疑具有抑制 通道活性能力的化合物，
[0563] 測(cè)量發(fā)光、突光，
[0564] 與對(duì)照比較染料的發(fā)光/熒光數(shù)據(jù)
[0565] 和確定所測(cè)試化合物是否具有抑制通道活性的能力。
[0566] 以G蛋白偶聯(lián)受體為例，按照上述方法步驟ii或iii的檢測(cè)可使用鑒定蛋白質(zhì)和 配體之間相互作用的技術(shù)實(shí)現(xiàn)。在該上下文中，測(cè)試化合物或者多肽可包含可檢測(cè)標(biāo)記例 如熒光標(biāo)記、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或膜或電位標(biāo)記。標(biāo)記的實(shí)例可以選自鈣濃度 敏感性染料，例如 Fluo_4Calcium Crimson?、Calcium Green?、Calcium Orange?、Calcium Yellow?、Fura Red?、0regonGreen?、Rhod-3、X-rhod-5F、Fura-2、bis-fura-2、flu〇-5F、 flu〇-5N> fura dextran、fura_4F、fura_5F、fura_6F、fura-FF、fura-FF、quin-2、rhod dextran、rhod-2、rhod_5N 或 rhod-FF 或來(lái)自 Molecular Probes 的基于撰花青和氧雜菁 的其它染料，如在1999年出版的第七版Molecular Probes'Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 中所述。
[0567] 以SK-通道為例，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中檢測(cè)測(cè)試化合物是否減少、抑制或 封閉本發(fā)明多肽活性的方法包括以優(yōu)選選自SEQ ID N0:227、229、231的昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+ 激活鉀通道穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞經(jīng)受
[0568] 加載至少一種上述染料，優(yōu)選來(lái)自Molecular Devices的藍(lán)色膜電位染料，達(dá)2-6 小時(shí)、優(yōu)選_5小時(shí)、優(yōu)選4小時(shí)，
[0569] 以100-500nM、更優(yōu)選200nM的EC50值濃度的離子載體，優(yōu)選離子霉素活化小電導(dǎo) Ca2+激活鉀通道，意思是指以1-5 μ M的濃度溫育細(xì)胞，
[0570] 以5-50 μ Μ、5-20 μ Μ、優(yōu)選10 μ M的濃度加入懷疑具有抑制通道活性能力的化合 物
[0571] 測(cè)量發(fā)光、突光
[0572] 與對(duì)照比較染料的發(fā)光/熒光數(shù)據(jù)
[0573] 和確定所測(cè)試化合物是否具有抑制通道活性的能力。
[0574] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中檢測(cè)測(cè)試化合物是否減少、抑制或封閉本發(fā)明多肽活 性的方法包括以優(yōu)選選自SEQ ID NO : 1、5、9、13、17、21、25和/或29的昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性鉀通 道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白） 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞經(jīng)受，
[0575] 加載至少一種上述染料，優(yōu)選來(lái)自Molecular Devices的藍(lán)色膜電位染料，達(dá) 0. 5-3小時(shí)、優(yōu)選1. 5小時(shí)、優(yōu)選2-2. 5小時(shí)，
[0576] 通過(guò)以10-120mM、優(yōu)選10-60mM、更優(yōu)選30mM EC50值的KCl濃度增加 KCl的細(xì) 胞外水平活化電壓門(mén)控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助蛋白 KChIP (鉀通道相互作用蛋白），
[0577] 以1-200 μ Μ、5-100 μ M、優(yōu)選25-30 μ M的濃度加入懷疑具有抑制通道活性能力的 化合物，
[0578] 測(cè)量發(fā)光、突光
[0579] 與對(duì)照比較染料的發(fā)光/熒光數(shù)據(jù)
[0580] 和確定所測(cè)試化合物是否具有抑制通道活性的能力。
[0581] 懷疑具有抑制本發(fā)明多肽活性的化合物直接加入至槽溶液中。
[0582] 備選地，按照上述方法步驟ii或iii的檢測(cè)可使用膜片鉗技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
[0583] 可使用基本技術(shù)的一些變型選自內(nèi)部-外、外部-外、細(xì)胞連接的、雙切割膜片、全 細(xì)胞膜片和穿孔膜片技術(shù)。
[0584] 隨后的測(cè)定取決于標(biāo)記并且是技術(shù)人員已知的。
[0585] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)測(cè)試化合物是否減少、抑制或封閉本發(fā)明多肽 活性的方法包括以優(yōu)選選自SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30的昆蟲(chóng)電壓門(mén)控性 鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣）和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋 白）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在室溫（22-25°C )下經(jīng)受全細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膜片鉗技術(shù)，使用當(dāng)充滿 吸管溶液時(shí)具有2-3M0hm電阻的硼硅玻璃毛細(xì)管并且在槽溶液中測(cè)量，優(yōu)選補(bǔ)償槽和吸管 溶液之間的液體接頭電位，在全細(xì)胞鉗下測(cè)量膜電流，以2kHz取樣并以IkHz過(guò)濾，將細(xì)胞 保持在-70mV下并以每2秒IOmV的增量應(yīng)用從-100至+130mV的一系列400ms測(cè)試電 壓脈沖，測(cè)量波幅，如測(cè)量電流-電壓相互關(guān)系一樣，并且定義為在給定去極化電位下的最 大外向電流。
[0586] 以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中， 檢測(cè)測(cè)試化合物是否減少、抑制或封閉本發(fā)明多肽活性的方法包括以優(yōu)選選自SEQ ID NO: 73、75、77、79、81、83、85 和 / 或 87 的昆蟲(chóng) Shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基，優(yōu)選 H-kvi3亞基A或C亞型穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在室溫（22-25°C)下經(jīng)受全細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膜片鉗 技術(shù)。本發(fā)明的全細(xì)胞電壓鉗方法包括使用EPClO數(shù)字控制的放大器與PATCHMASTER軟件 (HEKA Electronics, Lambrect，Germany)組合進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和進(jìn)一步的分析。EPClO通過(guò) 前脈沖手段提供電容和泄漏電流的自動(dòng)扣除。數(shù)據(jù)以66. 7KHz過(guò)濾（-3dB，8-pole Bessel 低通濾波器）并以每個(gè)點(diǎn)5μ s數(shù)字化。膜片吸管的輸入電阻是2.0-4. 0ΜΩ并且細(xì)胞的電 容是15·3±2· lpF(n = 45);殘留系列電阻（在直到80%補(bǔ)償之后）是4·2±0·4ΜΩ。常規(guī) 應(yīng)用對(duì)液體接頭電位的修正。膜電位固定在-IOOmV并且電流通過(guò)從-60mV至+IOOmV(或 +60mV)的50ms去極化脈沖（0. IHz)引出。
[0587] 懷疑具有抑制本發(fā)明多肽活性的化合物直接加入至槽溶液中。
[0588] 在一個(gè)實(shí)施方案中，剩余電容和泄漏電流的扣除使用pClamp的在線P/4方案開(kāi) 展。
[0589] 以G蛋白偶聯(lián)受體為例，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)測(cè)試化合物是否減少、 抑制或封閉本發(fā)明多肽活性的方法包括使穩(wěn)定表達(dá)G- α -16泛宿主性G蛋白質(zhì)和穩(wěn)定或瞬 時(shí)表達(dá)優(yōu)選選自 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173 的選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅〇a2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇胺受體的CHO細(xì)胞 進(jìn)行
[0590] 加載至少一種上述染料，優(yōu)選Fluo-4,達(dá)0. 1-3小時(shí)、優(yōu)選0. 5-2小時(shí)、優(yōu)選1小 時(shí)，
[0591] 置于FLIPR中并使用兩次添加方案運(yùn)行，由此測(cè)試化合物，懷疑具有封閉或活化 酚乙醇胺受體能力的化合物在第一次添加中加入并溫育3分鐘，
[0592] 然后激活劑酚乙醇胺在第二次添加中以EC80濃度引入并且讀取熒光2分鐘。對(duì) 于兩次添加均運(yùn)行對(duì)照。在第一次添加中高于基線的熒光增加將表明是可能的激活劑并且 在第二次添加中反應(yīng)降低或者沒(méi)有增加可表明是可能的抑制劑。
[0593] 隨后的檢測(cè)依賴于標(biāo)記并且是技術(shù)人員已知的。
[0594] 以SK-通道為例，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)測(cè)試化合物是否減少、抑制或 封閉本發(fā)明多肽活性的方法包括以優(yōu)選選自SEQ ID N0:228、230、232的昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+ 激活鉀通道穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在室溫（22-25°C)下經(jīng)受全細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膜片鉗技術(shù)，使用 當(dāng)充滿電極溶液時(shí)具有2-3M0hm抗性的硼硅玻璃毛細(xì)管并且在槽溶液中測(cè)量，優(yōu)選補(bǔ)償槽 和電極溶液之間的液體接頭電位，在全細(xì)胞鉗下測(cè)量膜電流，以2kHz取樣并以IkHz過(guò)濾， 將細(xì)胞保持在-70mV下并以每2秒IOmV的增量應(yīng)用從-100至+130mV的一系列400ms 測(cè)試電壓脈沖，測(cè)量波幅，如測(cè)量電流-電壓相互關(guān)系，并且定義為在給定去極化電位下的 最大外向電流。
[0595] 在根據(jù)本發(fā)明的方法中，還可以采用多個(gè)測(cè)試化合物。如果一組測(cè)試化合物影響 靶標(biāo)，則可直接分離各個(gè)測(cè)試化合物或者可以將測(cè)試化合物組分成許多亞組，例如當(dāng)其由 數(shù)個(gè)不同成分組成時(shí)，以便減少根據(jù)本發(fā)明的方法中的不同測(cè)試化合物的數(shù)量。然后，根據(jù) 本發(fā)明的方法以各個(gè)測(cè)試化合物重復(fù)或者相關(guān)亞組的測(cè)試化合物重復(fù)。取決于樣品的復(fù)雜 性，上述步驟可以重復(fù)開(kāi)展，優(yōu)選地直到依照根據(jù)本發(fā)明方法鑒定的亞組僅包含小數(shù)量的 測(cè)試化合物或者實(shí)際上僅一種測(cè)試化合物。
[0596] 根據(jù)本發(fā)明的方法可有利的作為HTS步驟開(kāi)展。
[0597] HTS使得同時(shí)測(cè)試大量不同化合物成為可能。
[0598] 1?通量篩選的質(zhì)量由兩種因素確定，即測(cè)定窗口的相對(duì)大小和該測(cè)定窗口在從對(duì) 照實(shí)驗(yàn)到對(duì)照實(shí)驗(yàn)間的穩(wěn)定性（即?20個(gè)測(cè)定篩選板對(duì)照中的測(cè)定信號(hào)穩(wěn)定性）。這表示 為篩選的z'因子并且等式為：
[0599] Z，= 1- ((3 〇 max+3 σ min) / (I μ - μ minI))。
[0600] 以SK-通道外例，高通量篩選的質(zhì)量由兩種因素確定，即測(cè)定窗口的相對(duì)大小，在 該例中來(lái)自完全活化通道的信號(hào)減去來(lái)自非活化通道的信號(hào)（通常表示成任意單位）。第 二個(gè)因素是該測(cè)定窗口在從對(duì)照實(shí)驗(yàn)到對(duì)照實(shí)驗(yàn)間的穩(wěn)定性（即?20個(gè)測(cè)定篩選板對(duì)照 中的測(cè)定信號(hào)穩(wěn)定性）。這表示為篩選的z'因子并且等式為：
[0601] Z，= 1_[3*( 0 max+σ min)/Abs (Ave (MAX)-Ave (MIN))]。
[0602] 所計(jì)算的Z' >0. 5被認(rèn)為是極佳的測(cè)定。
[0603] 以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，備選地為了計(jì)算Z'因子使用下 列公式：
[0604] 3* (ST. DEV 激動(dòng)劑 +ST. DEV Tyrode
[0605] Ζ，=1_(------------------------------------------------------------- _)
[0606] MEAN 激動(dòng)劑-MEAN Tyrode
[0607] 在該上下文中，也適用于與本發(fā)明相結(jié)合的高通量篩選方法（HTS)的優(yōu)選實(shí)施方 案必須提到，尤其是：
[0608] 1.依照優(yōu)選的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明方法的步驟ii的檢測(cè)（并且以SK-通道 為例，變體3)包括下列步驟：熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)基于適宜條件下兩個(gè)空間鄰近的 熒光分子之間的無(wú)輻射的能量轉(zhuǎn)移。前提是供體分子的發(fā)射光譜與受體分子的激發(fā)光譜 重疊。使用熒光標(biāo)記的UGP和測(cè)試化合物，通過(guò)FRET手段可以測(cè)量結(jié)合（Cyt 〇metry34， 1998，pp. 159-179)。備選地，根據(jù)本發(fā)明的方法也可采用在1下面描述的"置換測(cè)定"形式。 FRET技術(shù)的特別適合的實(shí)施方案是可以從Packard BioScience得到的"均一時(shí)間解析突 光"（HTRF)。以該方式鑒定的化合物可適宜用作抑制劑。
[0609] 2.依照優(yōu)選的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明方法的步驟ii的檢測(cè)（并且以SK-通道為 例，變體3)包括下列步驟：表面等離振子共振的測(cè)量基于當(dāng)化學(xué)化合物結(jié)合至已固定至 表面的蛋白質(zhì)時(shí)在所述表面上的折光指數(shù)。由于折光指數(shù)的變化與幾乎所有蛋白質(zhì)和多 肽在表面上質(zhì)量濃度的確定變化相同，所以該方法原則上可應(yīng)用于任何蛋白質(zhì)（Lindberg 等.Sensor Actuators4(1983)299_304;Malmquist Nature361(1993) 186_187)。測(cè)量可以 使用例如從Biacore(Freiburg)可得到的基于表面等離振子共振的自動(dòng)分析儀以當(dāng)前每 天高達(dá)384個(gè)樣品的通量開(kāi)展。根據(jù)本發(fā)明的方法可以設(shè)計(jì)成直接測(cè)量測(cè)試化合物與UGP 的結(jié)合。備選地，根據(jù)本發(fā)明的方法也可采用在1下面描述的"置換測(cè)定"形式。以該方式 鑒定的化合物可適宜用作抑制劑。
[0610] 3.依照優(yōu)選的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明方法的步驟ii的檢測(cè)包括來(lái)自Molecular Devices的FLIPR膜電位測(cè)定試劑盒的使用，如在實(shí)施例中所公開(kāi)。該方法基于電壓敏感性 染料在FLIPR熒光測(cè)量成像平板讀取儀系統(tǒng)上的應(yīng)用，顯示與手工膜片鉗數(shù)據(jù)良好相關(guān)。
[0611] 4.依照優(yōu)選的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明方法的步驟ii的檢測(cè)包括BIOMOL化合物篩 選或BioFocus化合物篩選的應(yīng)用，使用兩次流體添加方法以允許在單次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)激活 劑和拮抗劑，或隨后的BIOMOL和BioFocus驗(yàn)證篩選，如在實(shí)施例中所公開(kāi)。
[0612] 以shaker通道和/或HyperkineticP亞基為例，本發(fā)明方法提供對(duì)黑腹果蠅 Shaker通道的基于功能細(xì)胞的測(cè)定法，優(yōu)選在CH0-K1細(xì)胞中通過(guò)穩(wěn)定純克隆的選擇和用 膜電位敏感性染料在FLIPR上，優(yōu)選FLIPR384和/或FLIPRTETRA或者兩個(gè)實(shí)驗(yàn)上和電生 理學(xué)技術(shù)進(jìn)行功能表征而開(kāi)發(fā)。
[0613] 所產(chǎn)生的測(cè)定法完全符合HTS需要，顯示出極高的信號(hào)質(zhì)量和再現(xiàn)性。
[0614] 為了高通量篩選的目的，下列參數(shù)應(yīng)該提到：
[0615] ?激活劑KCl濃度：在活化緩沖液中50mM(?EC80)
[0616] ?參照 Z' ：0.60
[0617] ?對(duì)于單一測(cè)定板的最低可接受Z' ：0. 45
[0618] ?對(duì)于命中的％抑制閾值：40%
[0619] 通過(guò)上述方法鑒定的所有物質(zhì)可以隨后在根據(jù)本發(fā)明方法的另一實(shí)施方案中檢 查它們的殺蟲(chóng)作用。
[0620] 此外，通過(guò)使用通過(guò)X射線結(jié)構(gòu)分析闡明本發(fā)明多肽的三維結(jié)構(gòu)的分子建模，存 在檢測(cè)用于殺蟲(chóng)活性成分的更多候選物的可能性。對(duì)于X射線結(jié)構(gòu)分析所必需的蛋白質(zhì)晶 體的制備、和相關(guān)測(cè)量和這些測(cè)量的隨后評(píng)價(jià)、蛋白質(zhì)中結(jié)合位點(diǎn)的檢測(cè)和潛在抑制劑結(jié) 構(gòu)的預(yù)測(cè)是技術(shù)人員已知的。原則上，通過(guò)分子建模也可以對(duì)通過(guò)上述方法鑒定的活性化 合物進(jìn)行優(yōu)化。
[0621] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與測(cè)試化合物溫育的本發(fā)明多肽的活性與野生型細(xì)胞對(duì)照的 活性或者在步驟iii中不與測(cè)試化合物溫育的本發(fā)明多肽的活性相比較。
[0622] 在該上下文中，在步驟（iii)中選擇化合物，其導(dǎo)致實(shí)現(xiàn)本發(fā)明多肽活性顯著降 低，至少10%減少，有利的至少20%、25%、29%、優(yōu)選至少30%、特別優(yōu)選至少50%和非 常特別優(yōu)選至少 70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%減少（抑制）。
[0623] 本發(fā)明此外涉及通過(guò)根據(jù)本發(fā)明方法鑒定的化合物。這些化合物在下文被稱為 "選擇的化合物"。它們具有小于l〇〇〇g/mol、有利的小于500g/mol、優(yōu)選的小于400g/mol、 特別優(yōu)選小于300g/mol的分子量。殺蟲(chóng)活性化合物具有小于1 μ Μ、優(yōu)選小于1 μ Μ、特別優(yōu) 選小于0. 1 μ Μ、非常特別優(yōu)選小于0. Ol μ M的Ki值。
[0624] 通過(guò)上述方法鑒定和/或在實(shí)施例中所示的物質(zhì)描述于表I中：
[0625]
【權(quán)利要求】
1. 鑒定殺蟲(chóng)活性化合物的方法，所述殺蟲(chóng)活性化合物降低： -G -蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)的活性，所述G-蛋白偶聯(lián)受體具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果 蠅、桃姆、赤擬谷盜的〇a2、Oamb、Oct-0 -2R和Oct-0 -3R的酚乙醇胺受體的活性，或 一昆蟲(chóng)Shaker通道和/或HyperkineticP亞基，優(yōu)選H_kv0亞基A或C亞型的活性 或 一昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道的活性， 所述方法包括： a_l)在膜中裝配具有G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)活性的多肽，所述G-蛋白偶聯(lián)受體 具有最初不存在于所述膜中的、具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅、桃蚜、赤擬谷盜的〇a2、Oamb、 Oct- P -2R和Oct- P -3R的酚乙醇胺受體活性， a_2)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、分別具有昆蟲(chóng)Shaker通道和/或 HyperkineticP亞基，優(yōu)選H-kvP亞基A或C亞型活性的多肽， a_3)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、具有昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的 多肽， b) 在一側(cè)膜上應(yīng)用懷疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化 合物， c) 檢測(cè)所述多肽的活性，和 d) 鑒定在（b)中應(yīng)用的降低所述多肽活性的化合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中編碼 一G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)，所述G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果 蠅、桃姆、赤擬谷盜的〇a2、Oamb、Oct- 0 -2R和Oct- 0 -3R的酚乙醇胺受體活性， 一昆蟲(chóng)Shaker通道和/或Hyperkinetic 0亞基，優(yōu)選H_kv 0亞基A或C亞型或 一昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道 的基因表達(dá)于宿主細(xì)胞的膜中。
3. 權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)的方法，其中膜包含由選自下列的核酸分子編碼的至少 一種多肽： a_l)編碼 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174中 所不多肽的核酸分子； b-l)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所示 核酸分子； c-1)核酸分子，其因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID N0:130、134、138、142、 146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列； (1-1)與包含3￡0 1〇勵(lì)：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173 所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子； e_l)核酸分子，其編碼與（a-1)至（c-1)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至 少50%同一性并且具有G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)的活性的多肽，所述G-蛋白偶聯(lián)受體具 有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅、桃姆、赤擬谷盜的〇a2、Oamb、Oct-0 -2R和Oct-0 -3R的酚乙醇 胺受體的活性； f-1)在嚴(yán)格雜交條件下與（a_l)至（c-1)的核酸分子雜交的核酸分子； g-1)核酸分子，其編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a-1)至（e-1)之一的核酸分子所編碼并且具有G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)的活性的多肽 產(chǎn)生，所述G-蛋白偶聯(lián)受體具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅、桃蚜、赤擬谷盜的oa2、0amb、 Oct- P -2R和Oct- P -3R的酚乙醇胺受體的活性； h_l)核酸分子，其編碼包含SEQ ID NO : 177、178和/或179中分別所示共有序列或分 別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、 192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽； i_l)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID N0:131、132;135、 136 ;139、140 ;143、144 ;147、148 ;151、152 ;155、156 ;159、160 ;163、164 ;167、168 ;171、172 和/或175、176中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組文庫(kù)得到； 和 j-1)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針包含 (a-1)或（b-1)核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a-1)至（e-1)中所表征核酸分子 序列互補(bǔ)并編碼具有G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)的活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選 20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，所述G -蛋白偶聯(lián)受體具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果 蠅、桃姆、赤擬谷盜的〇a2、Oamb、Oct-0 -2R和Oct-0 -3R的酚乙醇胺受體活性，或 a-2)編碼包含SEQ ID勵(lì)：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核酸 分子； b_2)包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的核酸分子； c-2)核酸分子，其因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性可以衍生自包含根據(jù)SEQ ID N0:73、75、77、79、 81、83、85和/或87的多肽序列的多肽； d_2)與包含SEQ ID勵(lì)：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷酸 的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子； e_2)核酸分子，其編碼與（a-2)至（c-2)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至 少50%同一性并且分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic 0亞基，優(yōu)選H_kv 0亞基A 或C亞型活性的多肽； f-2)在嚴(yán)格雜交條件下與（a_2)至（c-2)的核酸分子雜交的核酸分子； g_2)核酸分子，其編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a-2)至（e-2)之一的核酸分子所編碼并且分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic 3 亞基，優(yōu)選H-kv P亞基A或C亞型活性的多肽產(chǎn)生； h_2)核酸分子，其編碼包含SEQ ID NO : 102和/或103中分別所示共有序列或分別選 白 SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽； i_2)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID NO :88、89 ;90、91 ;92、 93 ;94、95 ;96、97 ;98、99和/或IOOUOl中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組文庫(kù) 得到； 和 j-2)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針包含 (a-2)或（b-2)核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a-2)至（e-2)中所表征核酸分子 序列互補(bǔ)并編碼分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic 0亞基，優(yōu)選H_kv 0亞基A或 〇亞型活性的多肽的核酸分子的至少15]11:、優(yōu)選2〇111:、3〇111:、5〇111:、10〇111:、20〇111:或50〇111:，或 a-3)編碼SEQ ID NO :228、230、232中所示多肽的核酸分子； b-3)SEQ ID NO :227、229、231 中所示核酸分子； c-3)核酸分子，其因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID N0:228、230、232的多 肽序列； d-3)與包含SEQ ID N0:227、229、231所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有 至少50 %同一'丨生的核酸分子； e_3)核酸分子，編碼與（a-3)至（c-3)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽； f-3)在嚴(yán)格雜交條件下與（a_3)至（c-3)的核酸分子雜交的核酸分子； g_3)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(duì) (a-3)至（e-3)之一的核酸分子所編碼并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽產(chǎn)生； h_3)核酸分子，編碼包含SEQ ID N0:239中所述共有序列或選自SEQ ID N0:240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個(gè)或更多個(gè)基序的多肽； i_3)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過(guò)使用SEQ ID N0:233、234;235、 236 ;237、238中分別所示的引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)或者基因組文庫(kù)得到； 和 j-3)通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫(kù)得到的核酸分子，所述探針包含 (a-3)或（b-3)核酸分子互補(bǔ)序列或具有其片段，具有與（a-3)至（e-3)中所表征核酸分 子序列互補(bǔ)并編碼具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選 20nt、30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述多肽的活性通過(guò)熒光測(cè)定法測(cè)定。
5. 權(quán)利要求2的方法，其中所述多肽的活性使用鈣濃度敏感染料測(cè)定。
6. 權(quán)利要求2的方法，其中編碼具有所述多肽活性的多肽的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表 達(dá)。
7. 權(quán)利要求2的方法，其中編碼具有所述多肽活性的多肽的基因在選自CHO細(xì)胞、 HEK293的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。
8. 權(quán)利要求1的方法，包括： a) 向昆蟲(chóng)害蟲(chóng)、昆蟲(chóng)害蟲(chóng)群體或所在場(chǎng)所應(yīng)用，其中所述昆蟲(chóng)害蟲(chóng)以昆蟲(chóng)控制量的根 據(jù)權(quán)利要求Id)項(xiàng)鑒定的化合物控制，和 b) 檢測(cè)所處理昆蟲(chóng)害蟲(chóng)或昆蟲(chóng)害蟲(chóng)群體或所述場(chǎng)所上的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)群體和未處理昆蟲(chóng)、 昆蟲(chóng)群體或場(chǎng)所的生長(zhǎng)或生存力和 c) 選擇在應(yīng)用步驟e)的化合物后降低所處理昆蟲(chóng)害蟲(chóng)或昆蟲(chóng)害蟲(chóng)群體或所述場(chǎng)作上 昆蟲(chóng)害蟲(chóng)群體生長(zhǎng)或生存力的化合物。
9. 用于鑒定降低 -G -蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)的活性，所述G-蛋白偶聯(lián)受體具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果 蠅、桃姆、赤擬谷盜的〇a2、Oamb、Oct-0-2R和Oct-0-3R的酚乙醇胺受體的活性，或 一昆蟲(chóng)Shaker通道和/或HyperkineticP亞基，優(yōu)選H_kv0亞基A或C亞型的活性 或 一昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道的活性的殺蟲(chóng)活性化合物的測(cè)定系統(tǒng)，包含宿主生物、 組織、細(xì)胞或其細(xì)胞消化物或膜，其已經(jīng)包埋入、裝配入、插入或整合入選自如權(quán)利要求3a) 至3j)項(xiàng)中所述核酸分子的核酸分子并且基于該核酸分子的表達(dá)，具有 -G -蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)，所述G -蛋白偶聯(lián)受體具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅、桃蚜、 赤擬谷盜的〇a2、Oamb、Oct- P -2R和Oct- P -3R的酚乙醇胺受體的活性，或 一昆蟲(chóng)Shaker通道和/或Hyperkinetic 0亞基，優(yōu)選H_kv 0亞基A或C亞型或 一昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道的生物學(xué)活性的多肽。
10. 權(quán)利要求9的測(cè)定系統(tǒng)，其中宿主生物是表達(dá)選自權(quán)利要求3a)至3j)項(xiàng)中所述核 酸分子的核酸分子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
11. 權(quán)利要求10的測(cè)定系統(tǒng)，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自：CHO細(xì)胞、HEK293、COS、HeLa、 NIH3T3、BAK21、Jurkat、CV-I、IfepC-2-、爪蟾卵母細(xì)胞、Sf9、S2、Sf 21、Hi5、Pc 12、U20S。
12. 殺死昆蟲(chóng)害蟲(chóng)或者抑制昆蟲(chóng)害蟲(chóng)生長(zhǎng)或生存力的方法，包括向昆蟲(chóng)害蟲(chóng)應(yīng)用根據(jù) 權(quán)利要求1的方法鑒定的化合物。
13. 核酸分子，其選自權(quán)利要求3a)到3j)中描述的核酸分子。
14. 包含根據(jù)權(quán)利要求13的核酸分子的核酸構(gòu)建體。
15. 包含根據(jù)權(quán)利要求14的核酸構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求13的核酸分子的載體。
16. 包含根據(jù)權(quán)利要求15的載體、根據(jù)權(quán)利要求14的核酸構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求13 的核酸分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
17. 根據(jù)權(quán)利要求13的核酸分子編碼的多肽。
18. 具有 -G -蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)，所述G -蛋白偶聯(lián)受體具有選自優(yōu)選來(lái)自黑腹果蠅、桃蚜、 赤擬谷盜的〇a2、Oamb、Oct- P -2R和Oct- P -3R的酚乙醇胺受體的活性，或 一昆蟲(chóng)Shaker通道和/或Hyperkinetic 0亞基，優(yōu)選H_kv 0亞基A或C亞型或 一昆蟲(chóng)小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道 的活性的多肽用作殺蟲(chóng)靶標(biāo)的用途。
19. 由選自權(quán)利要求3a)至3j)項(xiàng)所述核酸分子的核酸分子編碼的多肽用作殺蟲(chóng)靶標(biāo) 的用途。
20. 米安色林和/或賽庚啶用作殺蟲(chóng)活性成分的用途。
【文檔編號(hào)】A01N43/40GK104316693SQ201410319978
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2009年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2008年11月6日
【發(fā)明者】P·貝爾納斯科尼, J·多施, L·斯塔姆, S·齊特科, N·B·蘭克爾, M·格里斯沃爾德, F-J·布勞恩, G·魯, R·D·柯克敦, B·韋德?tīng)? J·迪克豪特, S·格羅斯, A·霍夫海因, J·青克, F·馬隆, D·豪茨, R·坎德薩米, D·倫敦, T·M·格加納斯 申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司