一種用于獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體組合物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體組合物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種用于獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)桿菌專用載體組合物，由獨(dú)立包裝的重組載體和pClean系列載體的pClean-Soup載體組成；所述重組載體為將目的基因插入pClean系列載體的pClean-Green載體T-DNA區(qū)中，且將標(biāo)記基因插入所述pClean-Green載體的另一個T-DNA區(qū)中，得到表達(dá)所述目的基因和標(biāo)記基因的重組載體。從上述可以看出，本發(fā)明利用標(biāo)記基因和目的基因在同一載體的不同T-DNA區(qū)的5TBTG154組合物，后代均可以獲得較高比例的無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明對轉(zhuǎn)基因植物研究，尤其是小麥無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的獲得和利用具有重要意義。
【專利說明】一種用于獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種用于獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體組合物及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是進(jìn)行基因功能研究和通過基因工程進(jìn)行植物遺傳改良的重要工具。自1996年首例轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植以來，目前世界各國已累計批準(zhǔn)23種轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，涉及13類目標(biāo)性狀，包括抗蟲、抗除草劑、抗病、育性改變、品質(zhì)改良等。以抗除草劑和抗蟲為主的大豆、玉米、棉花、油菜等轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)在全球22個國家和地區(qū)種植，2012年種植面積已達(dá)1.7億公頃。轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化已成為全球新的經(jīng)濟(jì)增長點(diǎn)，是增強(qiáng)農(nóng)業(yè)國際競爭力的重要保障。
[0003]目前植物遺傳轉(zhuǎn)化方法眾多，其中根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Agrobacterium-mediatedtransformation)和基因槍轟擊法(particle bombardment transformation)是植物遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法外源基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的轉(zhuǎn)化機(jī)理清楚、整合位點(diǎn)較穩(wěn)定、拷貝數(shù)低、整合后的外源基因結(jié)構(gòu)變異較小、遺傳穩(wěn)定性好，但存在受體基因型限制和骨架序列整合的缺點(diǎn)；基因槍轉(zhuǎn)化法基本不受材料基因型的限制，但卻存在轉(zhuǎn)基因植株中整合有載體骨架序列和抗生素標(biāo)記、目的基因的多拷貝、轉(zhuǎn)基因沉默以及轉(zhuǎn)基因后代遺傳穩(wěn)定性差等問題。
[0004]盡管多數(shù)國家對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的態(tài)度日趨積極，但轉(zhuǎn)基因作物的潛在安全風(fēng)險問題仍然受到公眾的普遍關(guān)注，特別在歐洲一些國家轉(zhuǎn)基因作物的爭議非常激烈。在轉(zhuǎn)基因作物中爭議最大的是抗除草劑和抗生素類選擇標(biāo)記可能帶來的潛在風(fēng)險。如在環(huán)境方面，由于花粉飄移可能形成超級雜草、增加靶標(biāo)生物抗性、對生物多樣性影響等。在食品安全方面，包括標(biāo)記基因所表達(dá)蛋白質(zhì)致敏性，以及對受體作物本身營養(yǎng)成分、天然毒素和抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)含量等方面的影響及其它可能的非預(yù)期效應(yīng)。另外標(biāo)記基因的存在也不利于基因的重復(fù)轉(zhuǎn)化。因此建立安全轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系和培育無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物已成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)的主要方向，也是各國在轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】進(jìn)行技術(shù)創(chuàng)新的熱點(diǎn)之一。
[0005]雙元載體的發(fā)展和Gateway克隆技術(shù)的應(yīng)用大大促進(jìn)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在植物基因工程改良中的應(yīng)用，同時也使其成為獲得無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的重要工具。從1983年Hoekema等把根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的vir區(qū)和T-DNA區(qū)分離并置于兩個復(fù)制子中，提出雙元載體策略以來，雙元載體的發(fā)展已取得了突破性的進(jìn)展。雙元載體的種類從最早pBinl9和pBI121的構(gòu)建至今二十幾年間，已發(fā)展了二十多個系列幾十種載體,如:pCAMBIA, pMDC和pGreen雙元載體系列等。與此同時,雙元載體在以下幾個方面得到了大幅度的優(yōu)化:添加廣適的復(fù)起制點(diǎn)，使其在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中能夠自由復(fù)制；運(yùn)用高拷貝復(fù)制子，以提高質(zhì)粒的產(chǎn)量，便于體外亞克隆操作；降低載體質(zhì)粒的長度和增加T-DNA內(nèi)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，便于外源基因的亞克隆操作。在提高轉(zhuǎn)化效率和增強(qiáng)外源基因表達(dá)穩(wěn)定性方面，通過添加額外的vir基因、T-DNA轉(zhuǎn)移增強(qiáng)序列(overdrive)、基因沉默抑制子等方面的改良，提高植物遺傳轉(zhuǎn)化效率和外源基因的穩(wěn)定表達(dá)。雙元載體的發(fā)展，使農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物基因研究的各個領(lǐng)域，如RNA干擾、基因過表達(dá)、多基因傳遞、功能基因組和蛋白質(zhì)組研究等。然而通過傳統(tǒng)的酶切、連接方法構(gòu)建不同用途的載體，不僅耗時耗力，而且還受到酶切位點(diǎn)的限制，特別是對于高通量的功能基因組和蛋白質(zhì)組研究來說，載體構(gòu)建是一個最大的‘瓶頸’。Gateway技術(shù)的出現(xiàn),克服了傳統(tǒng)載體構(gòu)建中遇到的上述問題。
[0006]Gateway克隆技術(shù)是Invitrogen公司基于λ曬菌體介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性整合和刪除系統(tǒng)而開發(fā)的。位于特異性位點(diǎn)att間的DNA片段,在重組酶BP Clonase或LR ClonaseEnzyme Mix的作用下,通過一步反應(yīng)(attBXattP或attLXattR)便可將DNA片段轉(zhuǎn)移到含相應(yīng)重組位點(diǎn)的目的載體中，避免了載體構(gòu)建中的酶切、連接等繁瑣步驟。目前已報道了多種 Gateway兼容的雙元載體,如pW、pMDC、pEarleyGate系列載體，每種載體系列都含有多種不同用途的載體類型。如PW系列載體包括過表達(dá)和反義表達(dá)載體、用于啟動子分析含有LUC、GUS和GFP-GUS等基因的載體、用于基因融合的含GFP基因的載體和用于基因沉默的RNA干擾載體。
[0007]農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化標(biāo)記基因剔除法以其操作簡單、適用性廣，且易產(chǎn)生非連鎖位點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。共轉(zhuǎn)化法將目的基因和標(biāo)記基因分別置于兩個獨(dú)立的T-DNA中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化時，兩個獨(dú)立T-DNA可隨機(jī)整合到染色體的不同位點(diǎn)，產(chǎn)生連鎖或非連鎖的共整合植株，這些非連鎖的共整合植株通過自交和后代的分離便可獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)化植株。兩個獨(dú)立的T-DNA可位于同一質(zhì)粒上或各位于一個質(zhì)粒上，共存于同一農(nóng)桿菌中或各位于一個質(zhì)粒上，存在于不同的農(nóng)桿菌中。此外，其它形式結(jié)構(gòu)的載體如利用載體骨架上的篩選基因和雙RB邊界等方法，也可通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法獲得無標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。如Huang等把目的基因置于T-DNA內(nèi)，而將標(biāo)記基因置于T-DNA左邊界外的骨架序列上，將此載體轉(zhuǎn)化玉米，實(shí)驗結(jié)果表明，此法比利用多T-DNA法可獲得較高的無標(biāo)記植株；Lu等構(gòu)建了含雙R B和一個LB結(jié)構(gòu)的T-DNA的載體，將標(biāo)記基因置于兩個RB序列間，而目的基因位于LB和RB間，用此載體轉(zhuǎn)化水稻，有36-64%!；植株的后代發(fā)生了分離，并獲得了抗水稻齒葉矮縮病毒無標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株。
[0008]Hellens等基于pBluescript載體構(gòu)建了 pGreen/pSoup雙元載體。其具有以下特點(diǎn):減少了質(zhì)粒長度，提高了在E.coli中拷貝數(shù)，便于體外操作和克??；pGreen質(zhì)粒只含有pSa-ori基因，只有在輔助質(zhì)粒pSoup中pSa-RepA的存在下,才能夠在農(nóng)桿菌中復(fù)制,這樣pGreen在非選擇性條件下是不穩(wěn)定的，在一定程度上增強(qiáng)了質(zhì)粒的生物安全性；適應(yīng)性廣，可適合于單雙子葉植物的轉(zhuǎn)化；便于載體的改良和構(gòu)建不同用途的載體，如可在pSoup質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)附加額外的vir基因，從而提高大片段基因的轉(zhuǎn)化和提高谷類作物的轉(zhuǎn)化效率。通過將pSoup上連接一個T-DNA，使得pGreen和pSoup載體中均含有獨(dú)立的T-DNA，從而產(chǎn)生marker-free轉(zhuǎn)基因植株。
[0009]目前，pGreen載體已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于多種植物的轉(zhuǎn)化，如擬南芥、煙草、豌豆、番爺?shù)?。此外，一些改良的新型pGreen/pSoup載體也已成功地應(yīng)用于谷類作物如小麥、水稻的轉(zhuǎn)化，用于提高轉(zhuǎn)化效率或用于產(chǎn)生marker-free轉(zhuǎn)基因植株的研究。如Wu等利用含Komari片段(包含VirB、VirC和VirG基因)pSoup載體,作為輔助質(zhì)粒同pGreen載體轉(zhuǎn)化四倍體小麥，結(jié)果表明，與pSoup載體(轉(zhuǎn)化效率O)相比,含有Komari片段的改良載體可顯著提高四倍體小麥Ofanto的轉(zhuǎn)化效率(平均轉(zhuǎn)化效率3.0%，最高可達(dá)9.7%)。用此改良載體在另一四倍體小麥Steward的轉(zhuǎn)化中，也獲得了一個較高的轉(zhuǎn)化效率(平均轉(zhuǎn)化效率
4.7%，最高可達(dá)12.3%)。Afolabi等通過在pSoup質(zhì)粒中引入T-DNA，使之成為T載體，期望與pGreen載體中獨(dú)立T-DNA的共轉(zhuǎn)化,可獲得marker-free的植株。在水稻轉(zhuǎn)化實(shí)驗中，成功分離獲得了無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因水稻植株，并發(fā)現(xiàn)在Ttl陽性植株中，有50%的植株中標(biāo)記基因和目的基因位于非連鎖位點(diǎn)。
[0010]Thole等通過對pGreen載體改良，構(gòu)建了 pClean系列載體。pClean系列雙元載體，包括pClean-Green和pClean-Soup兩種質(zhì)粒。與pGreen載體相比,pClean系列載體具有如下特點(diǎn):進(jìn)一步減少了 T-DNA中的非必需序列(全長102nt，包括52nt的多克隆位點(diǎn)，而pGreen T-DNA結(jié)構(gòu)全長777nt，包含728nt的多克隆位點(diǎn));降低了 pClean-G與pSoup載體的同源性，增加了質(zhì)粒的穩(wěn)定性，pClean-G/pClean-S可與pGreen/pSoup匹配使用；優(yōu)化了部分載體的LB序列，使其與胭脂型和章魚堿型T-DNA的LB序列一致，擴(kuò)大了宿主范圍；部分質(zhì)粒的RB外添加了額外VirGwt基因以提高轉(zhuǎn)化效率；pClean-S質(zhì)粒上添加了獨(dú)立的T-DNA,可用于多基因的傳遞或marker-free植株的產(chǎn)生；pClean_G質(zhì)粒LB外的骨架序列上含有多個單酶切位點(diǎn)，便于backnone的利用，如通過在backnone上插入選擇標(biāo)記基因，可獲得maker-free植株的載體；部分載體含有雙LB序列，以降低T-DNA的通讀頻率,減少骨架序列的整合。
[0011]綜上所述，上述研究只采用了一種載體構(gòu)建策略并應(yīng)用于個別植物的遺傳轉(zhuǎn)化，目前在小麥和其它作物中的應(yīng)用尚未見報道。此外，大部分載體的構(gòu)建是為了驗證農(nóng)桿菌傳遞2獨(dú)立T-DNA，產(chǎn)生mark-free植株的可行性，因此很多載體只在模式植物如煙草等中進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，并未在重要農(nóng)作物如小麥中應(yīng)用。另外，目前報道的用于產(chǎn)生marker-free植株的載體，多數(shù)是通過傳 統(tǒng)酶切連接構(gòu)建的，很多載體是以gus基因為目的基因的，因為受酶切位點(diǎn)的限制，有些載體不便于用于目的基因的替換。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的一個目的是提供一種用于獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)桿菌專用載體組合物。
[0013]本發(fā)明提供的專用載體組合物(5TBTG154)，由獨(dú)立包裝的重組載體和pClean系列載體的pClean-Soup載體組成；
[0014]所述重組載體(pG1854-UG)為將目的基因和標(biāo)記基因插入pClean系列載體的pClean-Green載體2個不同的T-DNA區(qū)中，得到表達(dá)所述目的基因和標(biāo)記基因的重組載體。
[0015]上述的載體組合物中，
[0016]所述目的基因通過通過gatway重組到pClean系列載體的pClean-Green載體的T-DNA 區(qū)；
[0017]所述標(biāo)記基因以兩端分別融合2LB和RB的DNA分子的形式插入pClean系列載體的酶切位點(diǎn)間，形成另一個含有標(biāo)記基因的T-DNA區(qū)。
[0018]上述的載體組合物中，
[0019]所述pClean-Green 載體為 pCG181 或 pCG185 ；所述 pClean-Green 載體具體為pCG185 ；
[0020]所述pClean-Soup 載體為 pALl54。
[0021]上述的載體組合物中，
[0022]所述目的基因為⑶S基因，所述標(biāo)記基因為bar基因。 [0023]上述的載體組合物中，
[0024]所述gus基因以gus表達(dá)盒的形式插入所述pClean-Green載體中；所述gus表達(dá)盒包括啟動子Ub1、gus基因和終止子Nos ；
[0025]所述兩端分別融合2LB和RB的DNA分子包括LB、第二個LB、啟動子ub1、bar基因、終止子Nos和RB。
[0026]上述的載體組合物中，所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第1-3149位所示的核苷酸；序列I自5’末端第10-34位核苷酸為LB序列，35-60為間隔序列，61-85為LB序列，第1009-3004位核苷酸為ubi，第421-972位核苷酸為bar，第147-406位核苷酸為nos，第3079-3103位核苷酸為RB。
[0027]所述gus表達(dá)盒的核苷酸序列為序列表中序列2所示的核苷酸。
[0028]序列2所示的ub1:gus:nos表達(dá)盒，自5’末端第1-2034位核苷酸為ub1、自5’末端第2044-4059位核苷酸為gus、自5’末端第4069-4377位核苷酸為nos。
[0029]所述重組載體按照如下方法制備:
[0030]I)將 DNA 片段 attRl-cmR-ccdB_attR2 插入所述 pClean-Green 載體,得到中間載體A ;
[0031]2)將所述以兩端分別融合2LB和RB的DNA分子的形式插入所述中間載體A酶切位點(diǎn)間，，形成另一個含有標(biāo)記基因的T-DNA區(qū)，得到中間載體B ；
[0032]3)將所述目的基因與入門載體進(jìn)行TOPO反應(yīng)得到入門重組載體，再將所述入門重組載體與所述中間載體B進(jìn)行LR反應(yīng)，使所述目的基因插入所述中間載體B的另一T-DNA區(qū)，得到重組載體。
[0033]所述DNA片段attRl-CmK-CCdB-attR2的核苷酸序列為序列表中的序列3。
[0034]上述的載體組合物在鑒定或培育無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物中的而應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述培養(yǎng)為利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染植物進(jìn)行；
[0035]所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；
[0036]所述單子葉植物具體為小麥。
[0037]本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0038]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:
[0039]I)將上述的載體組合物中的重組載體和pClean-Soup載體共轉(zhuǎn)染到植物外植體中，得到TO代轉(zhuǎn)基因植物；
[0040]2)從TO代轉(zhuǎn)基因植物中選取目的基因和標(biāo)記基因共表達(dá)的TO代轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)行播種，收獲Tl代轉(zhuǎn)基因植物；
[0041]3)選取所述Tl代轉(zhuǎn)基因植物中無標(biāo)記基因且有目的基因的植株，得到無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株。
[0042]上述選取所述Tl代轉(zhuǎn)基因植物中無標(biāo)記基因且有目的基因的植株的方法如下:
[0043]鑒定無標(biāo)記基因bar的方法為PCR檢測或BAR氨鹽檢測；[0044]鑒定有目的基因gus的方法為PCR檢測或⑶S染色。
[0045]上述方法中，所述植物外植體為胚；
[0046]所述目的基因為gus基因，所述標(biāo)記基因為bar基因。
[0047]上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；
[0048]所述單子葉植物具體為小麥。
[0049]本發(fā)明利用pClean雙元載體系列中的pClean_G181、pClean_G185和pClean-S167作為基礎(chǔ)載體，對其T-DNA和載體骨架進(jìn)行了一系列改良，如在pClean_G181、pClean_G185、pClean-S167T_DNA內(nèi)引入Gateway系統(tǒng)，便于載體的快速構(gòu)建；pClean-S167T-DNA內(nèi)分別引入Ubiqutin啟動子驅(qū)動的bar選擇標(biāo)記基因，可直接用于單子葉轉(zhuǎn)化中的篩選標(biāo)記；在pClean_G181和pClean_G185載體的backnone上插入了帶不同T-DNA邊界結(jié)構(gòu)的bar表達(dá)盒,如含多個左邊界或獨(dú)立T-DNA等。構(gòu)建了系列Gateway兼容的新型pClean安全高效雙元載體,并用此轉(zhuǎn)化小麥，成功獲得了 marker-free轉(zhuǎn)化植株。
[0050]本發(fā)明的實(shí)驗證明，本發(fā)明通過gateway重組技術(shù)直接把目的基因或表達(dá)盒定向引入目的載體的T-DNA內(nèi)，而另一 T-DNA內(nèi)含有選擇標(biāo)記基因bar。利用此系統(tǒng)，通過把目的基因和選擇基因分別置于同一質(zhì)粒的兩T-DNA內(nèi)或2質(zhì)粒的T-DNA內(nèi)或把標(biāo)記基因置于載體骨架上，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，可獲得無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小麥。所述獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因小麥的方法是，通過2個獨(dú)立的T-DNA或載體骨架與T-DNA共轉(zhuǎn)化小麥未成熟胚，經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株，整合到 染色體不同位點(diǎn)的非連鎖的T-DNA植株，經(jīng)自交和后代分離，通過PCR檢測，便可獲得無標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小麥植株。利用本發(fā)明可進(jìn)行植物尤其是小麥、玉米和水稻表達(dá)載體的高通量構(gòu)建和培育無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小麥、玉米和水稻。
[0051]從上述可以看出，本發(fā)明利用2種組合載體可以獲得高的篩選無bar基因而只含有g(shù)us的無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株效率，其中利用標(biāo)記基因和目的基因在不同載體的T-DNA區(qū)5G7B組合物和利用標(biāo)記基因和目的基因在同一載體的兩個不同T-DNA區(qū)5TBTG154組合物，均可以獲得高轉(zhuǎn)化效率(分別為2.8±0.8%和4.0±2.1%)。結(jié)合后代獲得無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株比例(分別為23.4%和19.7%)，我們認(rèn)為，這兩個載體組合更適合于獲得無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1為pClean雙元載體
[0053]圖2為Gateway兼容的pClean雙元載體酶切鑒定
[0054]圖3 為 pENTR/D-T0P0_ub1:bar:nos 載體構(gòu)建及驗證
[0055]A:ub1: bar: nos 表達(dá)盒的擴(kuò)增；B:pENTR/D-T0P0_ub1: bar: nos 菌液 PCR 檢測；C:SspI酶切鑒定；D:載體結(jié)構(gòu)。
[0056]圖4為中間載體pG185_ub1:bar:nos載體
[0057]A:Pme1-PacI酶切驗證；B:載體結(jié)構(gòu)
[0058]圖5 為 pCG1852、pCG1853 和 pCG1854 載體的構(gòu)建
[0059]圖6為pCS1671-UB載體的構(gòu)建
[0060]A:菌液PCR檢測結(jié)果；B:載體結(jié)構(gòu)
[0061]圖7 為 T0P0_ub1: gus:nos 載體構(gòu)建[0062]圖8為LR重組在各載體中引入gus cassette
[0063]圖9為用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的5個載體組合
[0064]圖10為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的不同載體組合轉(zhuǎn)化小麥過程
[0065]圖11為轉(zhuǎn)5G7B載體部分植株的PCR檢測
[0066]M =Marker DL2000 ；CK:非轉(zhuǎn)基因植株;1_15:轉(zhuǎn)基因植株。其中株系1、2、4、6、9、
11、12、13為bar、gus共整合植株;3、5、7、8、10、14、15為只含bar的植株。
[0067]圖12為TO代轉(zhuǎn)5G7B小麥的Southern雜交
[0068]左圖為Southern雜交圖；右圖為pG1851_UG載體結(jié)構(gòu)圖
[0069]圖13為Ttl代轉(zhuǎn)5G7B小麥獨(dú)立株系后代個體在Tl代的分離分析
[0070]圖14為Ttl代轉(zhuǎn)5G7B小麥獨(dú)立株系后代個體的遺傳分離分析
[0071 ] A:bar和gus基因的PCR檢測。bar和gus PCR產(chǎn)物混合跑樣；B:⑶S染色驗證；C:bar表達(dá)驗證;圖A、B、C中1-15相對應(yīng)。
[0072]圖15為邊界整合檢測各引物位置示意圖
[0073]圖16為5G7B株系 邊界整合PCR檢測結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0074]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0075]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0076]質(zhì)粒pGreenll-UB 記載在如下文獻(xiàn)中:Hellens RP, Edwards EA, LeylandNR，Bean Sj Mullineaux PM.2000.pGreen: a versatile and flexible binary Tivector for Agrobacterium-mediated plant transformation.Plant MolecularBiology42, 819 - 832，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。
[0077]質(zhì)粒pClean 系列包括:pClean_G181 (pCG181)、pClean_G185 (pCG185)、pClean_S167 (pCS167)，上述質(zhì)粒均記載在如下文獻(xiàn)中:Tholej V.，Worland B.，SnapeJW.，Vain P.2007.The pCLEAN dual binary vector system for Agrobacterium-mediatedplant transformation.Plant Physiologyl45:1211-1219.公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。
[0078]質(zhì)粒PAL156 均記載在如下文獻(xiàn)中:He，Y.，Jones, HD.，Chen, XM.，Chen,Wang,DW.，Li，KX.，XiajLQ.2010.Agrobacterium-mediated transformation ofdurum wheat(Triticum turgidum L.var.durum cv Stewart)with improvedefficiency.61:1567-1581.公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。
[0079]質(zhì)粒PAL154 記載在如下文獻(xiàn)中:He，Y.，Jones, HD.，Chen, XM.，Chen, Wang, DW.，Li,KX., Xiaj LQ.2010.Agrobacterium-mediated transformation of durum wheat (Triticumturgidum L.var.durum cv Stewart)with improved efficiency.61:1567-1581.公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。
[0080]PrimerStar平末端高保真聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTP購自大連寶生物工程有限公司。減性憐酸酶 SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase)、Klenow Fragment 和 T4DNA聚合酶購自Ferments公司。各種限制性內(nèi)切酶購自NEB公司。pENTR? DirectionalTOPO Cloning Kits、Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdBSurvival2TICompenent Cells購自 Invitrogen公司。DH5 α 感受態(tài)、克隆載體pEASY-Blunt購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自天根生化科技有限公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。
[0081]實(shí)施例1、用于獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)桿菌專用載體組合物
[0082]一、Gateway 兼容的 pCG1811、pCG1851、p C S1671 通用雙元載體的構(gòu)建
[0083]pCG181、pCG185、pCS167載體的結(jié)構(gòu)如圖1，分別在其T-DNA內(nèi)插入ccdB讀碼框的DNA片段attRl-CmK-CCdB-attR2 (該DNA片段的核苷酸序列為序列表中的序列3，購自Invitrogen公司),得到雙元載體pCG1811、pCG1851、p C S1671 ;具體過程如下:
[0084]l、pCG1811載體的構(gòu)建
[0085]I)去P的平末端載體骨架的獲得
[0086]將pCG181載體用Not I酶切，回收2718bp的酶切產(chǎn)物；再將上述回收的酶切產(chǎn)物依次經(jīng)Klenow片段補(bǔ)平突出末端、純化、去P反應(yīng)，得到去P的平末端pCG181載體骨架，具體步驟和體系如下:
[0087]將上述回收的酶切產(chǎn)物經(jīng)Klenow片段補(bǔ)平突出末端，得到補(bǔ)平產(chǎn)物；
[0088]反應(yīng)體系如表1所示:
[0089]表1為補(bǔ)平突出末端反應(yīng)體系
【權(quán)利要求】
1.一種用于獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)桿菌專用載體組合物，由獨(dú)立包裝的重組載體和pClean系列載體的pClean-Soup載體組成； 所述重組載體為將目的基因和標(biāo)記基因插入pClean系列載體的pClean-Green載體2個不同的T-DNA區(qū)中，得到表達(dá)所述目的基因和標(biāo)記基因的重組載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體組合物，其特征在于: 所述目的基因通過通過gatway重組到pClean系列載體的pClean-Green載體的T-DNA區(qū)； 所述標(biāo)記基因以兩端分別融合2LB和RB的DNA分子的形式插入pClean系列載體的pClean-Green載體的酶切位點(diǎn)間，形成另一個含有標(biāo)記基因的T-DNA區(qū)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的載體組合物，其特征在于: 所述 pClean-Green 載體為 pCG181 或 pCG185 ;所述 pClean-Green 載體具體為 pCG185 ； 所述 pClean-Soup 載體為 pAL154。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體組合物，其特征在于: 所述目的基因為GUS基因，所述標(biāo)記基因為bar基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體組合物，其特征在于: 所述gus基因以gus表達(dá)盒的形式插入所述pClean-Green載體中；所述gus表達(dá)盒包括啟動子ub1、gus基因和終止子Nos ； 所述兩端分別融合2LB和RB的DNA分子包括LB、第二個LB、啟動子ub1、bar基因、終止子Nos和RB。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的載體組合物，其特征在于: 所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第1-3149位所示的核苷酸； 所述gus表達(dá)盒的核苷酸序列為序列表中序列2所示的核苷酸。
7.權(quán)利要求1-6中任一所述的載體組合物在鑒定或培育無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物中的而應(yīng)用； 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物； 所述單子葉植物具體為小麥。
8.一種用于獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟: 1)將權(quán)利要求1-6中任一所述的載體組合物中的重組載體和pClean-Soup載體共轉(zhuǎn)染到植物外植體中，得到TO代轉(zhuǎn)基因植物； 2)從TO代轉(zhuǎn)基因植物中選取目的基因和標(biāo)記基因共表達(dá)的TO代轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)行播種，收獲Tl代轉(zhuǎn)基因植物； 3)選取所述Tl代轉(zhuǎn)基 因植物中無標(biāo)記基因表達(dá)且有目的基因表達(dá)的植株，得到無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述植物外植體為胚； 所述目的基因為gus基因，所述標(biāo)記基因為bar基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于: 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物； 所述單子葉植物具體為小麥。
【文檔編號】A01H5/00GK103966257SQ201410160278
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】夏蘭琴, 王根平, 杜文明, 孫永偉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所