一種茄子黃萎病的接種方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種茄子黃萎病的接種方法，將茄子種子浸種處理后進行培養(yǎng)催芽得到幼苗，再經(jīng)自然傷根或人工傷根后接種于孢子懸浮液中浸泡，然后移栽至丹麥品氏泥炭土基質(zhì)中，用雙層遮陰網(wǎng)覆蓋，從第2天開始正常管理，7天后即可觀察到植株開始發(fā)病。本發(fā)明簡便、快速、安全、準(zhǔn)確，是茄子黃萎病較理想的接種方法，能廣泛用于植物黃萎病的抗性鑒定研究，能有效縮短黃萎病的潛伏期和接種試驗周期，且能提高發(fā)病率，最終準(zhǔn)確、快速地獲得病原菌致病性測定結(jié)果。
【專利說明】一種茄子黃萎病的接種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種茄子黃萎病的接種方法，屬于植物病理學(xué)研究【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]爺子黃萎病(EggplantVerticillium Wilt)是由大麗輪枝菌(K<9_riici77itt?dahliae Kleb.)和黑白輪枝菌(K<9_riici77i應(yīng) alboatrum Reinke et Berth.)引起的一種植物維管束土傳病害，是威脅茄子生產(chǎn)的主要病害之一。
[0003]目前，研究人員一般通過人工接種鑒定對茄子黃萎病開展抗病性研究。已有研究主要采用實驗室人工接種鑒定，一般需在光照培養(yǎng)箱或人工氣候箱內(nèi)進行，該方法存在試驗條件要求高的問題，且由于循環(huán)利用導(dǎo)致廢棄物不易收集、處理；此外，存在接種方法較單一、接種周期長，一般15~20天才能觀察到發(fā)病情況,30~60天才能調(diào)查病情指數(shù),不能及時有效對爺子黃萎病進行抗病性研究，難于防控黃萎病對爺子生產(chǎn)的危害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決現(xiàn)有技術(shù)在對茄子黃萎病開展抗病性研究時，存在接種茄子黃萎病周期長、成本高，難于有效防控黃萎病對茄子生產(chǎn)危害等問題，本發(fā)明提供一種茄子黃萎病的接種方法。
[0005]本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實現(xiàn):一種茄子黃萎病的接種方法，其特征在于經(jīng)過下列各步驟:
(O將茄子種子置于40目的尼龍種子袋中，用質(zhì)量濃度為2%的次氯酸鈉溶液消毒10~15min,再用無菌水沖洗3次,然后在50~60°C的溫水中浸種30min,再用濃度為1000mg/L 的 GA3 (Gibberellin A3，赤霉素)溶液浸種 36h ；
(2)將步驟(1)處理后的種子置于溫度為25~30°C、濕度為70~75%的條件下進行培養(yǎng)催芽，每天用清水沖洗種子I~2次，待出芽后播入已滅菌的丹麥品氏泥炭土基質(zhì)中，直至長出3~4片真葉，得到幼苗；
(3)將黃萎病病菌的菌落用無菌水沖洗干凈，再經(jīng)過濾后調(diào)整為2XIO7 CFU/mL (CFU,Colony FormingUnits ;CFU/mL指每毫升樣品中含有的細菌群落總數(shù))的孢子懸浮液；
(4)將步驟(2)的幼苗拔出，并在拔出過程中完成自然傷根，或者在拔出后進行人工傷根，之后接種于步驟(3)所得孢子懸浮液中浸泡30min后，移栽至丹麥品氏泥炭土基質(zhì)中，并向每株幼苗施加50mL孢子懸浮液，再用雙層遮陰網(wǎng)覆蓋，接種后第I天不澆水，使幼苗根部與孢子懸浮液充分接觸，從第2天開始正常管理，7天后即可觀察到植株開始發(fā)病，以對茄子黃萎病的抗性進行鑒定研究。
[0006]發(fā)病率計算公式為:(染病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))X 100%。
[0007]病情指數(shù)計算公式為:病情指數(shù)=[Σ各級病株數(shù)/ (總株數(shù)X最高病級)]χιοο)。
[0008]病情分級標(biāo)準(zhǔn)為:O級，無病癥；
I級， 僅第一片真葉萎蔫或出現(xiàn)壞死；
2級，3片真葉萎蔫；
3級，僅心葉正常，老葉壞死，并有落葉；
4級，老葉全部落葉，僅剩新葉；
5級，植株死亡。
[0009]所述步驟(4)的人工傷根是:將植株主根的根尖部分切去0.5~1cm，切去3~5個側(cè)根的根尖I~2 cm。
[0010]所述步驟(4)的接種是在日、夜平均氣溫分別為25°C和15°C、空氣相對濕度為50~90%時進行。
[0011]本發(fā)明簡便、快速、安全、準(zhǔn)確，20天后即可統(tǒng)計發(fā)病率達100%，病情指數(shù)高達80以上。是茄子黃萎病較理想的接種方法，能廣泛用于植物黃萎病的抗性鑒定研究。通過本發(fā)明在黃萎病病菌生理小種以及茄子品種抗病性鑒定中的應(yīng)用，有助于篩選出抗性較好的優(yōu)良品種，解決目前生產(chǎn)上黃萎病抗性品種缺乏的問題，對茄子抗黃萎病育種研究具有重要的推動作用。本發(fā)明操作簡便，節(jié)約成本和空間，且操作、處理過程中產(chǎn)生的廢棄物易于收集，從而避免造成污染；此外，本發(fā)明將自然傷根、人工傷根、菌液浸根和菌液灌根結(jié)合應(yīng)用，能有效縮短黃萎病的潛伏期和接種試驗周期，且能提高發(fā)病率，最終準(zhǔn)確、快速地獲得病原菌致病性測定結(jié)果。
【具體實施方式】
[0012]下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0013]實施例1
(1)將茄子種子置于40目15XIOcm的尼龍種子袋中，用質(zhì)量濃度為2%的次氯酸鈉溶液消毒15min，再用無菌水沖洗3次，然后在55°C的溫水中浸種30min，再用濃度為1000mg/L的GA3 (Gibberellin A3，赤霉素)溶液浸種36h ；
(2)將步驟(1)處理后的種子置于溫度為30°C、濕度為70%的條件下進行培養(yǎng)催芽，每天用清水沖洗種子2次，待出芽后播入已滅菌的丹麥品氏泥炭土基質(zhì)中，直至長出3片真葉，得到幼苗；
(3)將PDA培養(yǎng)基上的黃萎病病菌的菌落用無菌水沖洗干凈，再經(jīng)孔徑為25μ m雙層紗布過濾后用16X25的血球計數(shù)板調(diào)整為2X IO7 CFU/mL (CFU, Colony FormingUnits ；CFU/mL指每毫升樣品中含有的細菌群落總數(shù))的孢子懸浮液；
(4)將步驟(2)的幼苗拔出，并在拔出過程中完成自然傷根，然后在日夜平均氣溫分別為25°C和15°C、空氣相對濕度為90%時接種于步驟(3)所得孢子懸浮液中浸泡30min，然后移栽至裝有丹麥品氏泥炭土基質(zhì)的塑料杯(底部帶有3個直徑為0.5cm的圓洞)中，并向每株幼苗施加50mL孢子懸浮液，再用雙層遮陰網(wǎng)覆蓋，接種后第I天不澆水，使幼苗根部與孢子懸浮液充分接觸，從第2天開始正常管理，7天后即可觀察到植株開始發(fā)病。20天后統(tǒng)計發(fā)病率可達100%，病情指數(shù)高達80以上。有助于篩選出抗性較好的優(yōu)良品種。
[0014]實施例2
(I)將茄子種子置于40目15X IOcm的尼龍種子袋中，用質(zhì)量濃度為2%的次氯酸鈉溶液浸種12min，再用無菌水沖洗3次，然后在50°C的溫水中浸種30min，再用濃度為1000mg/L的GA3 (Gibberellin A3，赤霉素)溶液浸種36h ；
(2)將步驟(1)處理后的種子置于溫度為25°C、濕度為72%的條件下進行培養(yǎng)催芽，每天用清水沖洗種子I次，待出芽后播入已滅菌的丹麥品氏泥炭土基質(zhì)中，直至長出4片真葉，得到幼苗；
(3)將PDA培養(yǎng)基上的黃萎病病菌的菌落用無菌水沖洗干凈，再經(jīng)孔徑為25μ m雙層紗布過濾后用16X25的血球計數(shù)板調(diào)整為2X107 CFU/mL (CFU, Colony FormingUnits ；CFU/mL指每毫升樣品中含有的細菌群落總數(shù))的孢子懸浮液；
(4)將步驟(2)的幼苗拔出，并在拔出后進行人工傷根，即植株主根的根尖部分切去
0.5cm，選取3個側(cè)根切去2cm，然后在日夜平均氣溫分別為25°C和15°C、空氣相對濕度為70%時接種于步驟(3)所得孢子懸浮液中浸泡30min，然后移栽至裝有丹麥品氏泥炭土基質(zhì)的塑料杯(底部帶有3個直徑為0.5cm的圓洞)中，并向每株幼苗施加50mL孢子懸浮液，再用雙層遮陰網(wǎng)覆蓋，接種后第I天不澆水，使幼苗根部與孢子懸浮液充分接觸，從第2天開始正常管理，7天后即可觀察到植株開始發(fā)病。20天后統(tǒng)計發(fā)病率可達100%，病情指數(shù)高達80以上。有助于篩選出抗性較好的優(yōu)良品種。
[0015]實施例3
(1)將茄子種子置于40目15XIOcm的尼龍種子袋中，用質(zhì)量濃度為2%的次氯酸鈉溶液浸種lOmin，再用無菌水沖洗3次，然后在60°C的溫水中浸種30min，再用濃度為1000mg/L的GA3 (Gibberellin A3，赤霉素)溶液浸種36h ；
(2)將步驟(1)處理后的種子置于溫度為26°C、濕度為75%的條件下進行培養(yǎng)催芽，每天用清水沖洗種子2次，待出芽后播入已滅菌的丹麥品氏泥炭土基質(zhì)中，直至長出4片真葉，得到幼苗；
(3)將PDA培養(yǎng)基上的黃萎病病菌的菌落用無菌水沖洗干凈，再經(jīng)孔徑為25μ m雙層紗布過濾后用16X25的血球計數(shù)板調(diào)整為2X107 CFU/mL (CFU, Colony FormingUnits ；CFU/mL指每毫升樣品中含有的細菌群落總數(shù))的孢子懸浮液；
(4)將步驟(2)的幼苗拔出，并在拔出過程中完成自然傷根，然后在日夜平均氣溫分別為25°C和15°C、空氣相對濕度為50%時接種于步驟(3)所得孢子懸浮液中浸泡30min，然后移栽至裝有丹麥品氏泥炭土基質(zhì)的塑料杯(底部帶有3個直徑為0.5cm的圓洞)中，并向每株幼苗施加50mL孢子懸浮液，再用雙層遮陰網(wǎng)覆蓋，接種后第I天不澆水，使幼苗根部與孢子懸浮液充分接觸，從第2天開始正常管理，7天后即可觀察到植株開始發(fā)病。20天后統(tǒng)計發(fā)病率可達100%，病情指數(shù)高達80以上。有助于篩選出抗性較好的優(yōu)良品種。
【權(quán)利要求】
1.一種茄子黃萎病的接種方法，其特征在于經(jīng)過下列各步驟: (1）將茄子種子置于40目的尼龍種子袋中，用質(zhì)量濃度為2%的次氯酸鈉溶液消毒10~15min,再用無菌水沖洗3次,然后在50~60°C的溫水中浸種30min,再用濃度為1000mg/L的GA3溶液浸種36h ； (2)將步驟(1)處理后的種子置于溫度為25~30°C、濕度為70~75%的條件下進行培養(yǎng)催芽，每天用清水沖洗種子I~2次，待出芽后播入已滅菌的丹麥品氏泥炭土基質(zhì)中，直至長出3~4片真葉，得到幼苗； (3)將黃萎病病菌的菌落用無菌水沖洗干凈，再經(jīng)過濾后調(diào)整為2XIO7 CFU/mL的孢子懸浮液； (4)將步驟(2)的幼苗拔出，并在拔出過程中完成自然傷根，或者在拔出后進行人工傷根，之后接種于步驟(3)所得孢子懸浮液中浸泡30min后，移栽至丹麥品氏泥炭土基質(zhì)中，并向每株幼苗施加50mL孢子懸浮液，再用雙層遮陰網(wǎng)覆蓋，接種后第I天不澆水，從第2天開始正常管理，7天后即可觀察到植株開始發(fā)病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茄子黃萎病的接種方法，其特征在于所述步驟(4)的人工傷根是:將植株主根的根尖部分切去0.5~1cm，切去3~5個側(cè)根的根尖I~2cm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的茄子黃萎病的接種方法，其特征在于所述步驟(4)的接種是在日、夜平均氣溫分別為25°C和15°C、空氣相對濕度為50~90%時進行。
【文檔編號】A01G7/06GK103931432SQ201410159891
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】吳麗艷, 龔亞菊, 黎志彬, 鮑銳, 孔令明, 鐘利 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所