生產(chǎn)表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因動物領(lǐng)域，具體而言，涉及生產(chǎn)表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法。其用熒光蛋白表達載體轉(zhuǎn)染五指山豬體細胞，生產(chǎn)表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬。由于五指山豬的基因序列與人類相近度在90%以上，其血型類似人類O型血，血液生理生化指標(biāo)、各組織臟器對藥物的代謝等特征均與人類相似，則其細胞、組織或器官的移植得到了推廣應(yīng)用，廣泛應(yīng)用于藥學(xué)、畜牧、獸醫(yī)學(xué)，尤其應(yīng)用于人類比較醫(yī)學(xué)的各種試驗中。尤其為人類器官移植的研究及各類動物模型培育、人源化豬器官移植開發(fā)應(yīng)用研究提供科學(xué)依據(jù)。
【專利說明】生產(chǎn)表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因動物領(lǐng)域，具體而言，涉及生產(chǎn)表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著細胞、組織和器官移植應(yīng)用的增多，能夠提供可供移植的細胞、組織和器官的動物和方法得到了廣泛的關(guān)注和研究。其中，利用遺傳工程獲得轉(zhuǎn)基因動物，尤其是能夠表達熒光的轉(zhuǎn)基因豬得到了廣泛的研究，近年來，帶有不同熒光基因的轉(zhuǎn)基因豬不斷被研制成功。
[0003]相關(guān)技術(shù)中，通過將熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入到豬體內(nèi)，使轉(zhuǎn)基因豬的全身表達熒光蛋白。使用該轉(zhuǎn)基因豬的能夠表達熒光的細胞、組織或器官進行移植時，可以根據(jù)熒光對移植后的細胞、組織或器官進行監(jiān)視和追蹤。
[0004]但是，相關(guān)技術(shù)中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的受體由于其基因序列與人類相近度低，因此，其細胞、組織或器官的移植應(yīng)用受到了一定的限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供生產(chǎn)表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法，以解決上述的問題。
[0006]在本發(fā)明的實施例中提供了生產(chǎn)表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法，用熒光蛋白表達載體轉(zhuǎn)染五指山豬體細胞，生產(chǎn)表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬。
[0007]本發(fā)明實施例提供的生產(chǎn)表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法，與現(xiàn)有技術(shù)中的轉(zhuǎn)基因豬相比，其選用五指山豬，通過將熒光蛋白基因?qū)氲狡潴w內(nèi)，生產(chǎn)全身能夠表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬。由于五指山豬的基因序列與人類相近度在90%以上，其血型類似人類O型血，血液生理生化指標(biāo)、各組織臟器對藥物的代謝等特征均與人類相似，則其細胞、組織或器官的移植得到了推廣應(yīng)用，廣泛應(yīng)用于藥學(xué)、畜牧、獸醫(yī)學(xué)，尤其應(yīng)用于人類比較醫(yī)學(xué)的各種試驗中。尤其為人類器官移植的研究及各類動物模型培育、人源化豬器官移植開發(fā)應(yīng)用研究提供了科學(xué)依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1示出了生產(chǎn)表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法流程；
[0009]圖2示出了經(jīng)G418篩選15d后得到的轉(zhuǎn)基因細胞穩(wěn)定表達的紅色熒光；
[0010]圖3示出了轉(zhuǎn)基因細胞的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；
[0011]圖4示出了重構(gòu)卵細胞體外培養(yǎng)時的卵裂情況和囊胚胎發(fā)育情況。
【具體實施方式】
[0012]下面通過具體的實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細描述。[0013]本發(fā)明實施例提供的生產(chǎn)表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法，可以采用如下步驟進行操作:
[0014]步驟一，獲得可轉(zhuǎn)染的五指山豬體細胞。
[0015]五指山豬，主產(chǎn)于海南省五指山區(qū)，是中國著名的小型豬種之一。具有體型小、性成熟早、遺傳穩(wěn)定、適應(yīng)性強等諸多特性，是一種非常適合進行實驗的動物模型。
[0016]而且五指山豬的基因序列與人類相近在90%以上，其血型類似人類O型血，血液生理生化指標(biāo)、各組織臟器對藥物的代謝等特征均與人類相似。上述特性決定了五指山豬非常適合于人類細胞、組織或器官移植的研究，為人源化豬器官移植開發(fā)應(yīng)用研究提供了資源。
[0017]本發(fā)明實施例提供的生產(chǎn)表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法，其中，可轉(zhuǎn)染的五指山豬細胞可以選用五指山豬的耳皮細胞為體細胞，相對于胎兒細胞獲得更加容易。
[0018]由于五指山豬耳成纖維細胞取材方便，操作簡單，本發(fā)明實施例中，優(yōu)選五指山豬的耳成纖維細胞。
[0019]參見圖1，步驟二，用抗性熒光蛋白表達載體轉(zhuǎn)染上述五指山豬體細胞。
[0020]熒光蛋白可以用來標(biāo)記細胞，利用熒光蛋白標(biāo)記細胞這種方法在監(jiān)視移植細胞和組織上非常有效。用熒光蛋白標(biāo)記的細胞進行移植后，可以對其進行監(jiān)視和追蹤，從而可以實時觀察細胞的生長、轉(zhuǎn)移、血管生成及藥物療效等。例如熒光蛋白標(biāo)記的細胞在研究和治療癌癥中的應(yīng)用。
[0021]按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法，制備熒光蛋白的表達載體，并將抗性基因插入到上述熒光蛋白的表達載體中，形成抗性熒光蛋白表達載體，有利于后續(xù)在選擇性培養(yǎng)基中進行陽性克隆的轉(zhuǎn)基因體細胞的篩選操作。
[0022]用抗性熒光蛋白表達載體轉(zhuǎn)染上述得到的五指山豬體細胞。轉(zhuǎn)染操作之前，對可轉(zhuǎn)染的五指山豬體細胞進行培養(yǎng)。
[0023]使用培養(yǎng)中的五指山豬體細胞進行轉(zhuǎn)染實驗，由于正在生長繁殖中的五指山豬體細胞處于活躍的狀態(tài)，因此，其代謝活性強，進行轉(zhuǎn)染時，載體進入細胞的速度以及與載體的結(jié)合速度等都比較快，有助于轉(zhuǎn)染的進行。同時，在培養(yǎng)過程中，控制細胞生長的匯合度為75%~85%時，將其用PBS清洗I次后更換無血清培養(yǎng)基待用，從而進一步提高轉(zhuǎn)染的速度以及成功的轉(zhuǎn)染率。
[0024]本發(fā)明實施例中，轉(zhuǎn)染的方法選自:FuGENE HD試劑轉(zhuǎn)染，Lipofectamine TM2000試劑轉(zhuǎn)染或Nucleofector TM轉(zhuǎn)染。
[0025]其中，F(xiàn)uGENE HD試劑轉(zhuǎn)染法可以具體按照如下步驟進行操作:按照FuGENE HD試劑轉(zhuǎn)染說明書進行，首先用opt1-MEM清洗細胞2次，在培養(yǎng)細胞用的6孔培養(yǎng)板中的每孔加1.5mL opt1-MEM于待轉(zhuǎn)染細胞中，放入培養(yǎng)箱中備用。取6個滅菌L 5mL Eppendorf管，分別加入100 μ L opt1-MEM和2.Ομ g pCX-mRFPl手指彈勻，再分別添加3、4、5、6、7、8 μ LFuGENE HD試劑漩渦混合充分，室溫放置40min后形成FuGENE HD與DNA復(fù)合物，加入到準(zhǔn)備好細胞板中，38.5°C培養(yǎng)，6~8 h后換為10%FBS+90%DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48h后評價轉(zhuǎn)染效率。
[0026]LipofectamineTM2000試劑轉(zhuǎn)染可以具體按照如下步驟進行操作:按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書進行，取12個1.5mL Eppendorf管加250 μ L Opt1-MEM培養(yǎng)液，前6個分別加4μ g pCX-mRFPl，后 6 個分別加入 4、6、8、10、12 和 14 μ L LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體，靜置5min，兩組液體輕輕混勻后室溫放置30min，然后加至準(zhǔn)備好WMP培養(yǎng)液中，38.5°C培養(yǎng)，6-8 h后換為10%FBS+90%DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48h后評價轉(zhuǎn)染效率。
[0027]Nucleofector TM轉(zhuǎn)染可以具體按照如下步驟進行操作:使用AmaxaTM BasicNucleofector TM Kit Primary Fibroblasts試劑盒，按照說明書加入電轉(zhuǎn)液及2 μ g pCX-mRFPI質(zhì)粒，混合后移入Amaxa電轉(zhuǎn)杯，將小杯放入Nucleofector TM轉(zhuǎn)染儀中，選擇成纖維細胞轉(zhuǎn)染程序A-024、T-016、U-012、U-023、V-013電轉(zhuǎn)，取出小杯用500 μ L10%FBS+90%DMEM培養(yǎng)基沖洗后移入6孔板一孔中培養(yǎng)，48h后評價轉(zhuǎn)染效率。
[0028]上述三種轉(zhuǎn)染方法，技術(shù)成熟，轉(zhuǎn)染效率高，是本領(lǐng)域的常用轉(zhuǎn)染方法。
[0029]轉(zhuǎn)染操作之后，對其轉(zhuǎn)染效率進行評價，其中，轉(zhuǎn)染效率的評價可以按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法進行操作。本發(fā)明實施例中，轉(zhuǎn)染效率可以采用如下方法進行評價:
[0030]將轉(zhuǎn)染細胞放在激發(fā)波長為520_550nm熒光顯微鏡下觀察紅色熒光的表達，以放大200倍顯微鏡視野為標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)染4次，統(tǒng)計5個顯微鏡視野表達紅色熒光細胞數(shù)，計算其占轉(zhuǎn)染細胞數(shù)的比率，以此比率來評價轉(zhuǎn)染效率。
[0031]根據(jù)上述轉(zhuǎn)染效率的評價方法，轉(zhuǎn)染48h后評價轉(zhuǎn)染效率，選擇轉(zhuǎn)染效率最高的細胞作為篩選能夠穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因體細胞。
[0032]本發(fā)明實施例中，優(yōu)選Nucleofector TM轉(zhuǎn)染法，且其條件為:2X106，紅色熒光蛋白表達載體的添加量為:2ug，轉(zhuǎn)染程序為:U-023電轉(zhuǎn)。在該優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件下，轉(zhuǎn)染效率可達到83.33%。而采用LFuGENE HD試劑轉(zhuǎn)染和LipofectamineTM2000試劑轉(zhuǎn)染法時，轉(zhuǎn)染效率最高可達65%和9.70%。因此，本發(fā)明實施例中優(yōu)選使用Nucleofector TM轉(zhuǎn)染法，將在上述轉(zhuǎn)染條件下進行轉(zhuǎn)染獲得的細胞作為篩選能夠穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因體細胞，進行后續(xù)的能夠穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因體細胞的篩選操作。
[0033]步驟三，篩選能夠穩(wěn)定表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因體細胞。
[0034]使用選擇性培養(yǎng)基篩選陽性克隆細胞。為了能夠選擇能夠穩(wěn)定表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因體細胞，本發(fā)明實施例中，用選擇性培養(yǎng)基連續(xù)篩選15d。篩選時間短，可能不能獲得能穩(wěn)定表達熒光蛋白的五指山豬轉(zhuǎn)基因體細胞，本發(fā)明實施例中，選擇連續(xù)篩選15d，足以獲得純的、能穩(wěn)定表達熒光蛋白的五指山豬轉(zhuǎn)基因體細胞。
[0035]步驟四，用上述轉(zhuǎn)基因體細胞作為供體，培養(yǎng)成熟的去核的豬卵母細胞作為受體，采用體細胞核移植的方法獲得轉(zhuǎn)基因五指山豬重構(gòu)卵細胞。
[0036]經(jīng)過卵母細胞體外成熟培養(yǎng)并去核操作之后，采用轉(zhuǎn)基因體細胞核移植方法，將轉(zhuǎn)基因體細胞移植到培養(yǎng)成熟的去核的五指山豬卵母細胞中，并對其進行融合與激活，獲得轉(zhuǎn)基因五指山豬重構(gòu)胚胎。
[0037]選擇培養(yǎng)成熟的去核的五指山豬卵母細胞作為受體，與供體結(jié)合后，能夠形成重構(gòu)胚胎，從而重構(gòu)胚胎發(fā)育后，可以獲得全身的細胞、組織和器官都能表達紅色熒光的轉(zhuǎn)基因五指山豬，從而其任何的細胞、組織和器官都能夠用于移植應(yīng)用。
[0038]步驟五，將上述重構(gòu)胚胎進行體外培養(yǎng)后，移植到代孕的五指山豬體內(nèi)，上述豬分娩后，得到表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬。
[0039]上述得到的克隆仔豬，通過一系列分子生物學(xué)檢測，選出帶有紅色熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)基因豬并將其擴繁，生產(chǎn)紅色熒光蛋白的五指山豬。[0040]利用上述紅色熒光的五指山豬，與普通的非轉(zhuǎn)基因五指山豬雜交，得到雜合的五指山豬，其中有一些為紅色熒光陽性。
[0041]上述結(jié)果說明采用本發(fā)明實施例提供的方法能夠生產(chǎn)能夠穩(wěn)定遺傳的紅色熒光五指山豬。
[0042]利用本發(fā)明實施例提供的生產(chǎn)表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因五指山豬，在自然光下全身發(fā)紅，在紫外燈下表現(xiàn)強烈的紅色熒光；解剖后各臟器在紫外燈下都表現(xiàn)強烈的紅色熒光。
[0043]因此，上述紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬為追蹤豬組織、細胞和器官在受者體內(nèi)存活和機能狀況提供了重要標(biāo)識，其將成為異種移植研發(fā)的理想動物模型，并將為人類器官移植的研究及各類動物模型培育、人源化豬器官移植開發(fā)應(yīng)用研究提供科學(xué)依據(jù)。
[0044]實施例:生廣表達紅色突光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法
[0045]本發(fā)明提供的生產(chǎn)表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法，可以用于生產(chǎn)表達紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或藍色熒光蛋白等多種熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬。本發(fā)明實施例中采用生產(chǎn)表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法。
[0046]步驟一，獲得可轉(zhuǎn)染的五指山豬的耳成纖維細胞，具體可以按照如下方法進行操作:
[0047]通過無菌操作取供體豬的耳部組織，采用常規(guī)組織塊接種培養(yǎng)，獲得五指山豬的耳成纖維細胞。
[0048]用眼科剪剪掉豬耳部周圍的皮毛，用75%的酒精充分清洗消毒，無菌條件下剪取耳部皮膚，置于含有雙抗的PBS中，用鑷子將豬多于耳毛拔掉，并用手術(shù)刀片背面將耳部多于脂肪刮掉，反復(fù)漂洗3-5次，直到漂洗液清亮透明為止，移至培養(yǎng)皿中，用眼科剪將其剪成0.5-lmm3大小的組織塊，放于DMEM培養(yǎng)基(Gibco)包含0.25%胰蛋白酶中，在38.5°C的C02培養(yǎng)箱中消化4分鐘，取出后加入含血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用吸管將組織塊轉(zhuǎn)移至15ml離心管內(nèi)，1500rmp離心10分鐘，離心后去掉上清液，加入新鮮DMEM培養(yǎng)基(Gibco)添加20%胎牛血清(FBS，Gibco)重懸，移入38.5°C預(yù)溫的新鮮DMEM培養(yǎng)基添加20%胎牛血清約3ml，用無菌吸管將組織塊轉(zhuǎn)移至處理過的專用培養(yǎng)皿中，并均勻鋪開在培養(yǎng)皿中，每小塊間距5mm左右，將培養(yǎng)皿置于在38.5°C, C02培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，每日在觀察細胞形態(tài)和生長情況，當(dāng)細胞長出后，將其轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。細胞在體外經(jīng)3-5次傳代后用于細胞轉(zhuǎn)染實驗。
[0049]步驟二,抗性單體紅色突光蛋白表達載體pCX-mRFPl-pgk-neo的構(gòu)建
[0050]本發(fā)明實施例中，優(yōu)選紅色熒光蛋白表達載體。
[0051]紅色熒光蛋白簡稱RFP，其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在紫外波長范圍的光線激發(fā)下，會發(fā)出現(xiàn)紅色熒光。由于具有自發(fā)熒光等特征，在分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。RFP作為為一種報告分子，在檢測蛋白表達、蛋白和細胞熒光示蹤、研究蛋白質(zhì)之間相互作用和構(gòu)象變化中，起到了重要作用。
[0052]本發(fā)明實施例中的紅色熒光蛋白優(yōu)選采用單體紅色熒光蛋白(mRFPl)。該單體紅色熒光蛋白能夠快速成熟，且其激發(fā)與發(fā)射波長長。克服了紅色熒光蛋白(DsRed)成熟緩慢，在體內(nèi)形成四聚體，組織分布不均等缺點。
[0053]本發(fā)明實施例中，更優(yōu)選具有抗性基因的單體紅色熒光蛋白表達載體。該載體中增加了抗性基因，有利于后續(xù)在選擇性培養(yǎng)基中進行陽性克隆的轉(zhuǎn)基因體細胞的篩選操作。
[0054]本發(fā)明實施例中，具有抗性基因的單體紅色熒光蛋白表達載體pCX-mRFPl-pgk-neo的構(gòu)建具體可以按照如下方法進行制備:
[0055]從市售的模板質(zhì)粒PGKneotpAlox2中擴增磷酸激酶啟動子的新霉素抗性基因(pgk-neoR)片段(1321bp)，然后將該抗性基因片段從SalI位點插入到單體紅色熒光蛋白的表達載體PCX-mRFPl (該載體由吳曉輝博士提供，發(fā)育生物學(xué)和分子醫(yī)學(xué)研究所，復(fù)旦大學(xué)，中國上海)中，得到具有抗性的能夠表達單體紅色熒光蛋白的載體pCX-mRFPl-pgk-neo。如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的，得到pCX-mRFPl-pgk-neo載體后,采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段進行酶切鑒定，并對目的條帶進行擴繁用于后續(xù)的五指山豬體細胞的轉(zhuǎn)染。
[0056]步驟三，對可轉(zhuǎn)染的五指山豬耳成纖維細胞進行處理，具體按照如下方法進行:將將I~2X IO5個五指山豬耳成纖維細胞接種到6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細胞長到75%~85%匯合度時，將其用PBS清洗I次后更換無血清培養(yǎng)基待用。
[0057]步驟四，用pCX-mRFPl-pgk-neo轉(zhuǎn)染上述步驟三種得到的五指山豬耳成纖維細胞，可以按照如下方法進行操作:
[0058]本發(fā)明實施例中，為了能夠篩選出陽性克隆細胞，向細胞培養(yǎng)基中加入G418，形成選擇性培養(yǎng)基。由于本發(fā)明實施例中，能夠表達單體紅色熒光蛋白的載體pCX-mRFPl-pgk-neo中具有抗性基因，因此，凡是陽性克隆都能在上述選擇性培養(yǎng)基中生長。
[0059]為了能夠選擇能夠穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因體細胞，本發(fā)明實施例中，分別用濃度為100、150、200、250、300和400 μ g.mL_1的G418連續(xù)篩選15d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G418的濃度為200μ g.ml/1，篩選15d時，可以獲得純的、能穩(wěn)定表達單體紅色熒光蛋白的豬耳成纖維細胞，如圖2所示，其中，A表示在普通光學(xué)顯微鏡下的成像結(jié)果(放大倍數(shù)為100)；B表示在熒光顯微鏡下的成像結(jié)果(放大倍數(shù)為100)。從圖中可以看出，采用上述方法，獲得了純的、能穩(wěn)定表達單體紅色熒光蛋白的豬耳成纖維細胞。
[0060]實驗結(jié)果顯示,濃度為200 μ g.ml/1的G418對轉(zhuǎn)基因細胞的毒性最小。
[0061]利用QIAGEN公司提供的試劑盒對上述轉(zhuǎn)基因細胞進行PCR擴大培養(yǎng)，并提取擴大培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)基因細胞總基因組DNA，對其進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖3所示。其中，P表示質(zhì)粒pCX-mRFPl,作為陽性對照；N表示陰性對照；M表示Mark ;胃表示轉(zhuǎn)基因細胞,大小為711bp。從圖中可以看出:采用上述方法，成功得到了 PCR擴增培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)基因細胞。
[0062]其中，PCR擴大培養(yǎng)條件為:
[0063]上游引物:5'ATTCTCGAGATGGCCTCCTCCA3'；
[0064]下游引物:5'AATGGATCCTTAGGCGCCGGTG3'；
[0065]預(yù)計擴增產(chǎn)物大小為71 Ibp ；
[0066]PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 4min，98°C變性 10s, 56°C退火 30s, 72°C延伸 lmin，30循環(huán)，72 °C再延伸5min。 [0067]步驟五，獲得體外成熟培養(yǎng)的普通豬卵母細胞:
[0068]取初情期前青年母豬卵巢，用吸卵泵抽吸卵巢上直徑為3~8mm卵泡。挑選卵丘包裹3層以上、致密且胞質(zhì)均勻卵丘細胞-卵母細胞復(fù)合體(CumuLus-oocyte-complexes, COCs),用TALP液洗漆3遍,放在卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液(IVM液)中，在38.5°C、5%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)38h后，移入含0.1 %透明質(zhì)酸酶中，用直徑為170~180μ m的剝卵針，反復(fù)吹吸卵母細胞脫去卵丘細胞，挑選卵周隙明顯，卵細胞完整，且排出第一極體的卵母細胞備用。[0069]其中，IVM培養(yǎng)液成分為:TCM-199添加10%豬卵泡液(pFF)、0.6mmol.L^1L-半胱氨酸、IOIU.mL—1人絨毛膜促性腺激素(hCG)、10IU.mL—1孕馬血清促性腺激素(PMSG)和IOng.mL—1表皮生長因子(EGF)。22h后更換無激素IVM液。
[0070]步驟六，轉(zhuǎn)基因體細胞核移植:
[0071]按照已經(jīng)報道的去核方法(HyunS，Lee G, Kim D, et al.Production of nucleartransfer-derived piglets using porcine fetal fibroblasts transfected with theenhanced green fluorescent protein [J].Biol.Reprod.2003, 69, 1060-1068.),選取上述受體卵母細胞在含有0.4ug.ml/1的秋水酰胺(Demecolcine)和0.05mol.L-1的鹿糖培養(yǎng)液中處理Ih后，移入含5mg *mL_1的細胞松弛素b (CB)和0.4mg *mL_1的Demecolcine操作液中。在顯微操作系統(tǒng)(1X71，Olympus, Japan)下,利用去核針先去除卵母細胞第一極體及突起處的細胞核，然后在注核液中用注入針將體細胞從去核切口放入卵黃間隙，得到重構(gòu)卵細胞。
[0072]步驟七，重構(gòu)胚胎的融合與激活:
[0073]將重構(gòu)卵在融合液(0.28mmol.L-1甘露醇+0.1m mo I.T1MgCl2)中平衡后，放入鋪滿融合液的融合槽內(nèi)，用玻璃針使供體細胞-受體卵細胞膜接觸面與電極平行，再用融合儀(LF301)，施加I次2kV.cm^\20y s直流電脈沖進行融合。融合后重構(gòu)卵在含有0.4mg.mL 1的demecolcine培養(yǎng)液中培養(yǎng)Ih后，在激活液(0.28mmol.L 1甘露醇+0.1mmo1.L-1MgCV0.1mmol.1^Ca2—)中給予一次1.5kV.CnT1UOOy s直流電脈沖進行激活，然后在含有2mmol.L—1的6-DMAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)4h，得到融合的重構(gòu)胚胎。
[0074]步驟八，重構(gòu)胚胎的體外培養(yǎng):
[0075]將融合的重構(gòu)胚胎于NCSU-37培養(yǎng)液中，38°C，5%飽和濕度的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以重構(gòu)卵細胞構(gòu)建當(dāng)天為第O天，對重構(gòu)卵細胞培養(yǎng)7~8d后，在第38小時和第7天時分別觀察卵裂情況和囊胚胎發(fā)育情況并記錄，結(jié)果如圖4所示，其中，A為光學(xué)顯微鏡下卵裂圖；B為熒光顯微鏡下卵裂圖；C為光學(xué)顯微鏡下囊胚發(fā)育圖；D為熒光顯微鏡下囊胚發(fā)育圖。從圖中可以看出:重構(gòu)胚胎的卵裂和囊胚胎發(fā)育情況均良好。
[0076]步驟九，胚胎移植:
[0077]以發(fā)情周期正常生殖器官無疾病的大白豬作為受體，注射1000IU孕馬血清促性腺激素(PMSG) 72h后，對肌肉注射1000IU人絨毛膜促性腺激素(hCG)進行誘導(dǎo)發(fā)情，在注射hCG后48h，用手術(shù)法將培養(yǎng)I~3d卵裂正常的I~8細胞期的胚胎移植到代孕母豬輸卵管內(nèi)。胚胎移植一個月以后，用超聲波診斷儀檢測代孕母體是否妊娠，妊娠個體分離飼養(yǎng)管理，誘導(dǎo)分娩，得到4頭表達紅色熒光蛋白的五指山克隆仔豬。
[0078]上述克隆仔豬，通過一系列分子生物學(xué)檢測，選出2頭帶有紅色熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)基因豬并將其擴繁，生產(chǎn)紅色熒光蛋白的五指山豬。
[0079]利用上述2頭紅色熒光的五指山豬，與普通的非轉(zhuǎn)基因五指山豬雜交，生下11頭雜合的五指山小型豬，3頭為紅色熒光陽性。[0080]上述結(jié)果說明采用本發(fā)明實施例提供的方法能夠生產(chǎn)能夠穩(wěn)定遺傳的紅色熒光五指山豬。
[0081]利用本發(fā)明實施例提供的生產(chǎn)表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因五指山豬，在自然光下全身發(fā)紅，在紫外燈下表現(xiàn)強烈的紅色熒光；解剖后各臟器在紫外燈下都表現(xiàn)強烈的紅色熒光。
[0082]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均 應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.生產(chǎn)表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬的方法，其特征在于，用熒光蛋白表達載體轉(zhuǎn)染五指山豬體細胞，生產(chǎn)表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括: 獲得可轉(zhuǎn)染的五指山豬體細胞； 用抗性熒光蛋白表達載體轉(zhuǎn)染上述五指山豬體細胞； 篩選能夠穩(wěn)定表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因體細胞； 用上述轉(zhuǎn)基因體細胞作為供體，去核的體外培養(yǎng)成熟的豬卵母細胞作為受體，采用體細胞核移植的方法獲得轉(zhuǎn)基因五指山豬重構(gòu)胚胎； 將上述重構(gòu)胚胎進行體外培養(yǎng)后，移植到代孕的大白豬體內(nèi)，上述豬分娩后，得到表達突光蛋白的轉(zhuǎn)基因五指山豬。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述熒光蛋白表達載體為紅色熒光蛋白表達載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述紅色熒光蛋白表達載體為單體紅色熒光蛋白表達載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述單體紅色熒光蛋白表達載體包含有磷酸激酶啟動子的新霉素抗性基因片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,所述轉(zhuǎn)染的方法為NucleofectorTM轉(zhuǎn)染法，其條件為:所述五指山豬體細胞的個數(shù)為:2X106，紅色熒光蛋白表達載體的添加量為:2ug，轉(zhuǎn)染程序為:U-023電轉(zhuǎn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染之后，所述篩選能夠穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因體細胞之前，還包括下列步驟: 對轉(zhuǎn)染的效率進行評價； 所述篩選能夠穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因體細胞的步驟具體為:選擇轉(zhuǎn)染效率最高的五指山豬體細胞篩選能夠穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因體細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述對轉(zhuǎn)染的效率進行評價的方法具體為:將轉(zhuǎn)染細胞放在激發(fā)波長為520~550nm熒光顯微鏡下觀察紅色熒光的表達，以放大200倍顯微鏡視野為標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)染4次，統(tǒng)計5個顯微鏡視野表達紅色熒光細胞數(shù)，計算其占轉(zhuǎn)染細胞數(shù)的比率，以此比率評價轉(zhuǎn)染的效率。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述五指山豬體細胞為五指山豬的耳成纖維細胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述篩選能夠穩(wěn)定表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因體細胞為用選擇性培養(yǎng)基連續(xù)篩選15d。
【文檔編號】A01K67/027GK103642837SQ201310631272
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】尹熙俊, 康錦丹, 李所, 崔成哲, 王曉明, 李秀元 申請人:尹熙俊