一種應用mlana基因的snp鑒定五指山小型豬近交系的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種應用MLANA基因的SNP鑒定五指山小型豬近交系的方法。本發(fā)明提供了一種輔助鑒定待測豬群體是否為五指山小型豬近交系群體的方法，包括如下步驟：從待測豬群體中隨機抽樣得到待測樣本，然后檢測待測樣本基于MLANA基因上的ALGA0007899SNP位點的基因型，如果所有待測樣本均為雜合型、待測豬群體為候選的五指山小型豬近交系群體，如果所有待測樣本中存在一個以上純合型、待測豬群體為候選的非五指山小型豬近交系群體。本發(fā)明對于五指山小型豬近交系的種質(zhì)資源鑒定具有重大價值。
【專利說明】—種應用MLANA基因的SNP鑒定五指山小型豬近交系的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種應用MLANA基因的SNP鑒定五指山小型豬近交系的方法。
【背景技術】
[0002]1989年-2003年期間，“五指山近交系培育、種質(zhì)特性及開發(fā)利用”在農(nóng)業(yè)部“七五、八五、九五”行業(yè)攻關項目，以及科技部“863”、國家自然基金委重點、重大項目有關等7個課題的資助下，研究工作取得突破性進展，即:以I公I母五指山豬(又稱五指山小型豬)為系祖，連續(xù)采用“仔配母”、“全同胞”交配等綜合措施，逐步克服近交繁育導致繁殖成活率極低、不足20%不良影響，組建F17近交系群體和系譜，并進行了利用分子遺傳手段DNA指紋圖相似系數(shù)、微衛(wèi)星等多種先進的技術手段監(jiān)測了該近交系品種F7-F16近交系培育研究過程，初步揭示五指山小型豬近交系的遺傳規(guī)律和特點，驗證了該近交系培育過程的真實性、科學性。并進行了大量的開發(fā)利用研究，顯示出作為人類理想動物模型研究的無比優(yōu)越型，取得一定的經(jīng)濟效益和較大的社會效益。其研究內(nèi)容分別于1995年和2005年《五指山小型豬種質(zhì)特性及開發(fā)利用研究》(農(nóng)科果鑒定【95】第075號)、《五指山小型豬實驗用近交系培育與分子遺傳基礎研究》兩項成果通過農(nóng)業(yè)部技術成果鑒定，其中1999年獲得農(nóng)業(yè)部科技進步三等獎。
[0003]小型豬近交培育初步研發(fā)成果，在國內(nèi)外產(chǎn)生了較大的影響，如，美國、意大利、日本、西德、韓國等紛紛要求引種或合作研究，尤其美國1996年提出500萬美元購買當時的50頭種豬；韓國不同意引種后2000年提議出資500萬元在中國合資辦廠等等。其主要原因在于近交系動物是特殊動 物遺傳資源，它能向化學分析純試劑和物理學上的精密儀器一樣，能為生命科學研究迅速得出、靈敏、準確的科學數(shù)據(jù)，具有很高的使用價值和研究意義，所以目前國際上已培育出360多種近交系系(小鼠、大鼠、雞等)。小型哺乳動物近交系做為動物模型，已廣泛應用于解決人類疑難病癥、攻克生命科學和醫(yī)學、藥學難題等研究領域。由于種間生理等多方差異，近交系豬培育十分困難，經(jīng)查新證實(2013.11)至今國際上未見成功報道。但豬和鼠類相比與人類有更大的相似性，在解決人類疑難病癥、攻克生命科學和醫(yī)學、藥學難題等研究中將發(fā)揮不可代替的、獨特的作用。近交系豬是國際上珍稀的、寶貴的大型動物基因遺傳資源。此前，遠在上世紀六十年代美歐一些發(fā)達國家多單位、就出巨資開展了近交系豬培育研究，但未能成功、近交系數(shù)最高的僅能達到0.75。而我國通過15年培育研究，利用我國特殊的小型豬資源已獲得F17、近交系數(shù)已達0.965，更可喜的是已克服、跨越近交繁殖所導致仔豬死亡的高發(fā)階段。因此，近交系豬培育成功很有可能在我國首次實現(xiàn)。經(jīng)過近年的進一步工作，現(xiàn)在已獲得五指山小型豬近交系F17至F22。
[0004]由于近交系豬國際尚未有培育成功報道，更無近交系建系標準和鑒定方法。因此，必須借鑒、嚴格遵循近交系小鼠、大鼠的培育方法進行，即同一世祖2頭豬近親繁育20代以上并建立完整系譜，檢測其遺傳穩(wěn)定性，建立鑒定方法，建立品系標準尤其是與現(xiàn)海南五指山豬種間區(qū)別，才能向世人提供科學、可信證據(jù)，才能完成前無古人后暫無來者的遺傳資源創(chuàng)新工程、造福人類。
[0005]一旦小型豬近交系培育成功，我國將擁有自主知識產(chǎn)權，具有國際領先水平的創(chuàng)新的豬遺傳種質(zhì)資源，將填補該研究領域內(nèi)世界研究空白，豐富大型動物近交系培育理論與實踐；作為人類理想的“替難者”，是生物技術研究取得進展的重要基石和創(chuàng)新基礎，將會大大促進我國生命科學、人類醫(yī)學、藥學等方面的協(xié)同發(fā)展和創(chuàng)新，為解決人類疑難病癥、延長生命而造福人類做出不可替代地位和作用。因此，具有重要的現(xiàn)實意義和理論意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種應用MLANA基因的SNP鑒定五指山小型豬近交系的方法。
[0007]本發(fā)明提供了一種輔助鑒定待測豬群體是否為五指山小型豬近交系群體的方法，包括如下步驟:從待測豬群體 中隨機抽樣得到待測樣本，然后檢測待測樣本基于MLANA基因上的ALGA0007899SNP位點的基因型，如果所有待測樣本均為雜合型、待測豬群體為候選的五指山小型豬近交系群體，如果所有待測樣本中存在一個以上純合型、待測豬群體為候選的非五指山小型豬近交系群體。
[0008]所述方法中，從待測豬群體中隨機抽樣得到有統(tǒng)計學意義的待測樣本。
[0009]所述方法中，從待測豬群體中隨機抽樣得到16頭以上待測樣本。
[0010]所述待測豬具體可為五指山小型豬近交系或海南五指山豬。
[0011]所述五指山小型豬近交系具體屬于F17至F22中的任一世代。
[0012]所述“檢測待測樣本基于MLANA基因上的ALGA0007899SNP位點的基因型”的方法具體可為:以待測樣本的基因組DNA為模板，采用特異引物對進行PCR擴增，然后將PCR擴增產(chǎn)物進行測序。所述特異引物對由序列表的序列2所示的單鏈DNA分子和序列表的序列3所示的單鏈DNA分子組成。
[0013]本發(fā)明還保護一種輔助鑒定待測豬是否為五指山小型豬近交系的方法，包括如下步驟:檢測待測豬基于MLANA基因上的ALGA0007899SNP位點的基因型，如果為雜合型、待測豬為候選的五指山小型豬近交系，如果為純合型、待測豬為候選的非五指山小型豬近交系。
[0014]所述待測豬具體可為五指山小型豬近交系或海南五指山豬。
[0015]所述五指山小型豬近交系具體屬于F17至F22中的任一世代。
[0016]所述“檢測待測豬基于MLANA基因上的ALGA0007899SNP位點的基因型”的方法具體可為:以待測豬的基因組DNA為模板，采用特異引物對進行PCR擴增，然后將PCR擴增產(chǎn)物進行測序。所述特異引物對由序列表的序列2所示的單鏈DNA分子和序列表的序列3所示的單鏈DNA分子組成。
[0017]本發(fā)明還保護一種特異引物對；所述特異引物對由序列表的序列2所示的單鏈DNA分子和序列表的序列3所不的單鏈DNA分子組成。
[0018]以上任一所述ALGA0007899SNP位點具體可為序列表的序列I自5’末端第206位
核苷酸。
[0019]以上任一所述ALGA0007899SNP位點具體可為以待測豬的基因組DNA為模板，采用所述特異引物對進行PCR擴增得到的PCR擴增產(chǎn)物的自5’末端第206位核苷酸。
[0020]本發(fā)明對于五指山小型豬近交系的種質(zhì)資源鑒定具有重大價值?！揪唧w實施方式】
[0021]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0022]五指山小型豬近交系:
[0023]李凱、馮書堂、牟玉蓮，楊述林，韓建林，劉歲，員新旭，郭勇，五指山小型豬3個近交家系微衛(wèi)星等位基因遺傳變化，中國農(nóng)業(yè)科學，2012，42 (5):1751-1760
[0024]海南五指山豬:
[0025]侯冠或，王東勁，管松，榮光，黃顯洲，五指山豬小群體遺傳學檢測，家畜生態(tài)學，2007,28 (6):44-47
[0026]實施例1、“永不純合”基因的遺傳規(guī)律的發(fā)現(xiàn)
[0027]利 用Illumina豬高密度SNP芯片(6萬個SNPs)，對五指山小型豬近交系中的F17至F22共6個世代、以及海南五指山豬共計112個樣品的基因型進行了系統(tǒng)測定。
[0028]1、純合度分析
[0029]分布于五指山小型豬近交系的18對常染色體上的61，565個有效SNPs中，F(xiàn)2tlSNPs已被固定的比例高達80.0%以上，隨著世代的推進，幾乎在所有的染色體上都有一些區(qū)域有規(guī)律的被慢慢固定，雜合度由大到小直至為0，而且這些區(qū)域隨世代推進呈現(xiàn)變大趨勢，這些現(xiàn)象都符合近交系動物特有的遺傳規(guī)律。海南五指山豬群體幾乎所有染色體區(qū)域均表現(xiàn)高度雜合，61565個有效SNPs呈彌漫性、均勻性、無規(guī)律的分布在18個染色體上。證實由海南五指山豬培育出的五指山小型豬近交系是一種新的遺傳種質(zhì)資源。
[0030]2、雜合度分析，揭示了近交系“永不純合”基因遺傳規(guī)律
[0031]雜合度分析發(fā)現(xiàn):雖然五指山小型豬近交系群體SNPs雜合數(shù)由F17的15368個逐步降低至F22的9630個；但平均基因組的雜合度在F17 (0.3540±0.1735)至F22(0.4502±0.1551)世代還呈現(xiàn)出緩慢的上升趨勢；各對染色體之間的雜合度卻又不盡相同(0.2775-0.4364)，是各染色體所攜帶基因之功能的異同所致；還發(fā)現(xiàn)各對染色體內(nèi)有一定數(shù)量、長度不等的基因組區(qū)域相對獨立地被固定下來，世代之間有許多相同的被固定區(qū)域。分析結果表明:五指山小型豬近交系群體嚴格地遵循了閉鎖繁育的方式，而這種被固定的區(qū)域隨近交世代的遞增，在數(shù)量或長度上也有規(guī)律的、一定程度的增加，而海南五指山豬群體幾乎所有染色體區(qū)域均仍然呈現(xiàn)無規(guī)律、彌漫性高雜合度分布。進一步分析發(fā)現(xiàn):這些被固定區(qū)域分布在各染色體之間又呈現(xiàn)較大差別，雖在近交過程有一定的減少，但絕大多數(shù)同源染色體區(qū)域在世代之間卻仍然維持明顯波動的雜合狀態(tài)；經(jīng)過與豬基因組對比發(fā)現(xiàn)，這些仍處于雜合狀態(tài)的基因組區(qū)域，與其正常繁殖性狀和生長發(fā)育存在高度關聯(lián)。
[0032]以上結果不僅驗證了五指山小型豬近交系等位基因變化規(guī)律和“永不純合”基因的存在，而且表明處于雜合狀態(tài)的基因組區(qū)域所攜帶的“永不純合”的關鍵基因，應該具有特殊的“抗近交”衰退的生物學功能，而挖掘并利用這些“抗近交”基因，將為深入探討該近交系的基因?qū)W結構變化規(guī)律及特征、種系延續(xù)等遺傳學理論，增添新的材料和內(nèi)容、提供了新的研究視角，也為進一步定向培育這一新的遺傳種質(zhì)資源奠定理論基礎。[0033]實施例2、雜合度為I位點的分析，進一步驗證“永不純合”基因
[0034]分析發(fā)現(xiàn)，7646個SNP位點在第F2tl以上仍保持雜合，這些SNP位點能夠映射到2238個基因上。分析結果表明80%以上的基因涉及代謝過程(metabolic process，共750個基因，占45%)和細胞過程(cellular process，共643個基因，占38.6%)，這些基因是維持生命活動必須的，與全基因組測序取得一致性結果。再次揭示了沒被近交過程所純合的原因。
[0035]進一步分析保持雜合的SNP位點，發(fā)現(xiàn)該近交系出現(xiàn)了雜合度為I的位點，而在對應的海南五指山豬位點上沒觀察到，并且這種現(xiàn)象在該近交系各近交世代中仍呈不規(guī)律的、馬賽克狀變化趨勢，即=F17有21個雜合度為I的位點，能夠映射到7個基因上#8有24個雜合度為I的SNP位點，仍然涉及以上7個基因疋19有35個雜合度為I的位點；^有25個位點保持雜合度為I ;^有21個，仍然映射到最初的7個基因上，出現(xiàn)新的8個基因高雜合度、又都表現(xiàn)小于I ;F22有29個位點表現(xiàn)出雜合度為1，但有18個位點幾乎在各個世代中雜合度均為I。這些基因涉及的功能大致為細胞免疫、細胞增殖、可能糖代謝、ATP結合及能量代謝、脂肪沉積、聽力等。這一發(fā)現(xiàn)再次證實:該近交系豬存有少量、部分永不純合的等位基因，并且呈現(xiàn)馬賽克狀不規(guī)律的變化，是高度近交繁育的結果，也是近交系豬維持生命所必需的。[0036]上述研究結果，不僅證明五指山小型豬近交系培育成功，驗證了發(fā)明人前期研究發(fā)現(xiàn)近交系豬等位基因遺傳變化規(guī)律模式“生命基因”的存在，也從該近交系SNP雜合度分析中，證實該近交系與現(xiàn)海南五指山豬具有本質(zhì)區(qū)別，尤其是雜合度為I的位點、永不純合基因的發(fā)現(xiàn)，為該近交系存在“生命基因”的論斷假說提供了科學依據(jù)。該結果豐富了大型哺乳動物近交系遺傳學理論與實踐，為認識近交衰退、雜交優(yōu)勢利用等重大基礎生物學問題提供了全新的視角。
[0037]實施例3、應用永不純合MLANA基因鑒定五指山小型豬近交系與非五指山小型豬近交系
[0038]MLANA基因的功能:參與細胞免疫。MLANA基因位于I號染色體，本發(fā)明中涉及的SNP位I號染色體中的241959813 (Sscrofal0.2)位點(序列表的序列I自5，末端第206位核苷酸)，為A/G突變。
[0039]待測樣本為五指山小型豬近交系中的F17至F22共6個世代的96頭(每個世代16頭)，以及34頭海南五指山豬。各個待測樣本分別進行如下操作:
[0040]1、取血樣，從血樣中提取基因組DNA。
[0041]2、以步驟I提取的基因組DNA為模板，以Fl和Rl組成的引物對進行PCR擴增(退火溫度為55°C )，獲得長度為525bp的PCR擴增產(chǎn)物。
[0042]Fl (序列表的序列 2):5’ -GCGTACCCTTGCTGTTAGGT-3’ ；
[0043]Rl (序列表的序列 3):5’ -ACCTTCACCCTGGAGTCAGT-3’。
[0044]3、將步驟2得到的PCR擴增產(chǎn)物進行測序。
[0045]測序結果表明，各個待測樣本得到的PCR擴增產(chǎn)物的差異僅在于序列表的序列I自5，末端第206位核苷酸(該SNP位點又稱為ALGA0007899SNP位點)?；贏LGA0007899SNP位點，五指山小型豬近交系的96頭豬的基因型均為AG，即雜合型?；贏LGA0007899SNP位點，34頭海南五指山豬中5頭豬的基因型為AG，剩余的豬的基因型均為AA或GG，即雜合率(雜合體所占總測定 個體數(shù)的百分比)為14.7%。
【權利要求】
1.一種輔助鑒定待測豬群體是否為五指山小型豬近交系群體的方法，包括如下步驟:從待測豬群體中隨機抽樣得到待測樣本，然后檢測待測樣本基于MLANA基因上的ALGA0007899SNP位點的基因型，如果所有待測樣本均為雜合型、待測豬群體為候選的五指山小型豬近交系群體，如果所有待測樣本中存在一個以上純合型、待測豬群體為候選的非五指山小型豬近交系群體。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法中，從待測豬群體中隨機抽樣得到有統(tǒng)計學意義的待測樣本。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法中，從待測豬群體中隨機抽樣得到16頭以上待測樣本。
4.如權利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述待測豬為五指山小型豬近交系或海南五指山豬。
5.如權利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述五指山小型豬近交系屬于F17至F22中的任一世代。
6.一種輔助鑒定待測豬是否為五指山小型豬近交系的方法，包括如下步驟:檢測待測豬基于MLANA基因上的ALGA0007899SNP位點的基因型，如果為雜合型、待測豬為候選的五指山小型豬近交系，如果為純合型、待測豬為候選的非五指山小型豬近交系。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于:所述待測豬為五指山小型豬近交系或海南五指山豬。
8.如權利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述五指山小型豬近交系屬于F17至F22中的任一世代。
9.一種特異引 物對，由序列表的序列2所不的單鏈DNA分子和序列表的序列3所不的單鏈DNA分子組成。
【文檔編號】C12N15/11GK103923994SQ201410152868
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權日:2014年4月16日
【發(fā)明者】馮書堂, 牟玉蓮, 李奎, 吳添文, 劉嵐, 黃雷 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所