專利名稱：一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術領域。
背景技術：
楊屬Populus L.在全世界約有100多種，廣泛分布于歐亞和北美洲。我國約有62種，是世界楊樹種質資源最多的國家。楊屬植物因其生長快、適應性強、用途廣泛，不僅在水土保持和維護生態(tài)平衡方面發(fā)揮重要作用，而且還具有廣泛的工業(yè)用途，是制漿造紙、膠合板、包裝材料等的重要原料。長期以來，楊樹的改良主要通過雜交育種的方式進行，但因其生長發(fā)育受光照、水分、溫度很多因素影響，與其它農作物和園藝植物比較，有許多特有的生物學特性，如較長的生長周期、復雜的生殖方式、高度雜合性等，使得傳統(tǒng)的楊樹育種方法己遠遠不能滿足現代育種的要求，所以，利用組織培養(yǎng)技術和基因工程方法來滿足實踐中對楊樹育種的要求具有重要的意義。進入二十世紀八十年代后，隨著分子生物學理論和技術的快速發(fā)展，以1983年首株轉基因煙草問世為標志，功能基因的克隆和轉基因技術己廣泛應用到植物抗性的研究領域。盡管以木本植物為實驗材料的林木基因工程因研究難度較大，進展相對滯后，但是由于楊樹生長速度快，易繁殖，核基因組(約420Mb)及染色體數目相對較小，易于通過農桿菌轉化，使得楊樹成為研究樹木分子生物學、林業(yè)生物技術及樹木基因組的模式植物。目前，在植物上應用的遺傳轉化方法主要有DNA直接轉移法和根癌農桿菌(Agrobactenium tumefaciens)介導法。其中后者最為常用，是目前應用最廣泛且結果較為理想、技術較為成熟的一種基因轉化方法。它具有操作簡便，外源基因插入一般為單拷貝或低拷貝，整合位點穩(wěn)定，轉移DNA片段明確，整合后外源基因結構變異小，可轉移大片段DNA，可直接用不同的植物組織進行基因轉移等優(yōu)點。已被應用于雙子葉植物的遺傳轉化研究，現有的轉基因植物如煙草擬南芥西紅柿玉米等，80%以上是通過這種方法獲得的。隨著對楊屬的遺傳轉化研究的逐漸深入，農桿菌侵染已經應用于胡楊、歐洲黑楊、毛果楊、小葉楊等樹種，但對白楊派及其雜種無性系的研究較為滯后，轉化效率較低；而白楊派樹種具有適應生境廣、抗逆性強、鄉(xiāng)土樹種多、種間雜交能力強、能在大陸半干旱帶和大陸濕潤帶等廣泛生境范圍內栽培并可發(fā)揮較大的生產作用等獨特優(yōu)勢，因此研究一種針對白楊派的高效轉基因方法對林木分子育種意義深遠。目前白楊派中農桿菌介導的轉基因的方法多局限于葉片和葉柄，而直接侵染這些外植體周期長轉化效率低，而且后期染菌嚴重，因此本研究以白楊雜種無性系717-1B4 (P.tremulaXP.alba)為實驗對象,建立了一種以愈傷組織為受體的雜交楊農桿菌轉化方法。注:本研究采用的農桿菌為C58/pMP90/pH7GWIWG2⑴，C58具有利福平抗性，輔助Ti質粒pMP90具有慶大霉素抗性；通過Gateway技術構建的表達載體pH7GWIWG2 (I)具有壯觀霉素抗性，其T-DNA上的潮霉素磷酸轉移酶基因作為轉基因楊樹的選擇標記基因，編碼蛋白具有潮霉素抗性。具有潮霉素抗性的再生苗用特異性引物進行全基因組PCR檢測，產物大小為456bp,驗證目的片段轉入白楊雜種無性系717-1B4 (P.tremulaXP.alba)中。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種以愈傷組織為外植體的農桿菌轉化白楊雜種無性系方法。本發(fā)明的技術方案概述如下:一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，包括下述步驟:(I)愈傷誘導:將白楊雜種無性系717-1B4 (P.tremulaXP.alba)的腋芽或頂芽置于基本培養(yǎng)基上繼代繁殖，培養(yǎng)4-6周獲得組培苗；切取所述組培苗0.8-1.5cm不帶腋芽的莖段，用刀片沿著莖段縱軸方向劃2-3次造成傷口或切取所述組培苗的帶有0.1-0.5cm2葉片的葉柄置于Ml’固體培養(yǎng)基中，于24-26°C黑暗條件下預培養(yǎng)12-15天；更換一次Ml’固體培養(yǎng)基，繼續(xù)在24-26°C黑暗條件下預培養(yǎng)12-15天，有愈傷組織生成；(2)愈傷組織預培養(yǎng):將步驟(I)獲得的愈傷組織切成0.4-0.6cm3的塊，置于Ml固體培養(yǎng)基預配養(yǎng)2_3天;(3)菌種活化與培養(yǎng):用移液槍槍頭挑取_80°C保存的農桿菌至含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上，27-29°C倒置暗培養(yǎng)20-28h ;挑取培養(yǎng)后的農桿菌在另一含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，27-29°C倒置暗培養(yǎng)36-48h ；挑取單菌落至2_4mL含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基的無菌試管中，150-200rpm27-29°C暗培養(yǎng)12_16h ;吸取0.1-1.0mL菌液放置于50_75mL含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，150-200rpm27-29°C暗培養(yǎng)至菌液OD6tltl=0.6-0.8 ；(4)侵染:將步驟(3)獲得的菌液在室溫、3500-4000rpm離心10_15min，棄去上清液，將沉淀用50-75mL M液重懸，得到侵染液，按30-50個/25mL的比例將經步驟(2)預培養(yǎng)的愈傷組織放入所述侵染液中，24-26°C條件下80-100rpm侵染10_20min ；(5)共培養(yǎng):取出侵染后的愈傷組織，吸干表面殘留的侵染液，放在Ml固體培養(yǎng)基上，24-26°C，暗條件下培養(yǎng)24-36小時；(6)延遲選擇:取出步驟(5)培養(yǎng)的愈傷組織，棄掉因侵染而褐變的愈傷組織，先用去離子水在180-220rpm下洗滌4_5min，洗滌2_3次，再用濃度為350_500mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液150-200rpm洗滌4_5min，洗滌2_3次，吸干表面水分并轉移至CM固體選擇培養(yǎng)基中，24-26°C于黑暗條件下培養(yǎng)3-5天，舍棄與CIM固體選擇培養(yǎng)基的接觸處可見白色農桿菌菌落的愈傷組織，將剩余愈傷組織轉移到新鮮的CIM固體選擇培養(yǎng)基中，500-800Lux弱光下培養(yǎng)5-8天；(7)誘導不定芽:
將步驟(6)獲得的愈傷組織轉移至SMa固體培養(yǎng)基中，22-26°C 1500-2000Lux,光照周期為光照/黑暗16h/8h的條件下進行培養(yǎng)，得到表面為白色或白色略帶褐化的愈傷組織，每14-21天更換一次SIMa固體培養(yǎng)基；待白色或白色略帶褐化的愈傷組織表面出現綠色的愈傷組織，用解剖刀剝離綠色的愈傷組織轉移至新鮮SIMa固體培養(yǎng)基中22-260C 1500-2000Lux光照條件下培養(yǎng)，待綠色愈傷組織表面開始長出玻璃化的不定芽；將帶有玻璃化不定芽的綠色愈傷組織轉移到含有SIMb固體培養(yǎng)基的組培瓶中，直到不定芽生長至l_2cm ；(8)伸長培養(yǎng):切取不定芽轉移至含有SEM固體培養(yǎng)基的組培瓶中24_26°C 1500_2000LuX光照條件下培養(yǎng)2-4周，獲得表型趨于正常的芽；(9)誘導生根及檢測:取步驟(8)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉入RM固體培養(yǎng)基中，24-260C 1500-2000Lux光照下誘導生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農桿菌基因轉化了的雜交楊樹?；九囵B(yǎng)基的組成為:MS鹽2.2g，蔗糖20_30g，瓊脂7-7.2g，定容至1L，ρΗ5.6-5.8 ；Ml’固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，生長素NAA1.86mg，細胞分裂素 2ipl.02mg,瓊脂 7-7.2g，定容至 1L，pH=5.6-5.8。Ml固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，生長素NAA1.86mg，細胞分裂素2ipl.02mg,乙酰丁香酮 19.86mg，瓊脂 7-7.2g，定容至 1L，pH=5.6-5.8。農桿菌為C58 (pMP90/pH7GWIWG2(I))；

含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基的組成為利福平25_50mg，慶大霉素20_30mg，壯觀霉素30-50mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化鈉5g，瓊脂15g，定容至1L，pH=7.0 ；含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基的組成為利福平25-50mg，慶大霉素20_30mg，壯觀霉素30-50mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化鈉5g，定容至1L，pH=7.0。M液的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20_30g，生長素NAA1.86mg，細胞分裂素2ipl.02mg,乙酰丁香酮 19.86mg,定容至 1L, pH=5.6-5.8。CM固體選擇培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，生長素NAA1.86mg，細胞分裂素 2ipl.02mg,頭孢霉素 350-500mg,瓊脂 7-7.2g，定容至 1L，pH=5.6-5.8。SMa固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20_30g，細胞分裂素TDZ0.05mg，頭孢霉素 350-500mg,潮霉素 BlOmg,瓊脂 7-7.2g，定容至 1L，pH=5.6-5.8 ；SIMb固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，細胞分裂素TDZ0.0022mg，頭孢霉素 350-500mg，潮霉素7-7.2g，定容至 1L，pH=5.6-5.8。SEM固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20_30g，細胞分裂素BAP0.05mg,頭孢霉素 350-500mg,潮霉素 BlOmg,瓊脂 7-7.2g，定容至 1L，pH=5.6-5.8。。RM固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽2.2g，蔗糖20-30g，頭孢霉素350-500mg，潮霉素BlOmg,瓊脂 7-7.2g，定容至 1L，pH=5.6-5.8。本方法明顯克服了因以楊樹莖段或葉柄為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法后期染菌而被迫不斷繼代的缺點，可以用少量愈傷組織外植體快速獲得的抗性轉基因楊樹，周期短、染菌率低、轉化效率高，為大規(guī)模的轉基因楊樹提供了一種技術手段。


圖1為轉化了的楊樹全基因組PCR檢測結果。
具體實施例方式本發(fā)明的實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發(fā)明，并不對本發(fā)明作任何限制。實施例1一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，包括下述步驟:(I)愈傷誘導:將白楊雜種無性系717-1B4 (P.tremulaXP.alba)的腋芽置于基本培養(yǎng)基上繼代繁殖，培養(yǎng)5周獲得組培苗；切取所述組培苗0.8-1.5cm不帶腋芽的莖段，用刀片沿著莖段縱軸方向劃2次造成傷口置于Ml’固體培養(yǎng)基中，于25°C黑暗條件下預培養(yǎng)14天；更換一次Ml’固體培養(yǎng)基，繼續(xù)在25°C黑暗條件下預培養(yǎng)14天，有愈傷組織生成；( 2 )愈傷組織預培養(yǎng):將步驟(I)獲得的愈傷組織切成0.4-0.6cm3的塊，置于Ml固體培養(yǎng)基預配養(yǎng)2天;(3)菌種活化與培養(yǎng): 用移液槍槍頭挑取_80°C保存的農桿菌至含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上，28°C倒置暗培養(yǎng)24h ;挑取培養(yǎng)后的農桿菌在另一含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，28°C倒置暗培養(yǎng)42h ；挑取單菌落至3mL含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基的無菌試管中，180rpm28°C暗培養(yǎng)14h ;吸取0.5mL菌液放置于60mL含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，180rpm28°C暗培養(yǎng)至菌液OD6qq=0.6-0.8 ；(4)侵染:將步驟(3)獲得的菌液在室溫、3800rpm離心12min，棄去上清液，將沉淀用60mL M液重懸，得到侵染液，按40個/25mL的比例將經步驟(2)預培養(yǎng)的愈傷組織放入所述侵染液中，25°C條件下90rpm侵染15min ；(5)共培養(yǎng):取出侵染后的愈傷組織，用無菌濾紙吸干表面殘留的侵染液，放在Ml固體培養(yǎng)基上，25°C，暗條件下培養(yǎng)30小時；(6)延遲選擇:取出步驟(5)培養(yǎng)的愈傷組織，棄掉因侵染而褐變的愈傷組織，先用去離子水在200rpm下洗漆4min,洗漆2次,再用濃度為400mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液180rpm洗滌4min，洗滌2次，吸干表面水分并轉移至CIM固體選擇培養(yǎng)基中，25°C于黑暗條件下培養(yǎng)4天，舍棄與CIM固體選擇培養(yǎng)基的接觸處可見白色農桿菌菌落的愈傷組織，將剩余愈傷組織轉移到新鮮的CIM固體選擇培養(yǎng)基中，700LuX弱光下培養(yǎng)6天；(7)誘導不定芽:將步驟(6)獲得的愈傷組織轉移至SIMa固體培養(yǎng)基中，24°C 1800Lux，光照周期為光照/黑暗16h/8h的條件下進行培養(yǎng)，得到表面為白色或白色略帶褐化的愈傷組織，每18天更換一次SIMa固體培養(yǎng)基；待白色或白色略帶褐化的愈傷組織表面出現綠色的愈傷組織，用解剖刀剝離綠色的愈傷組織轉移至新鮮SIMa固體培養(yǎng)基中24°C ISOOLux光照條件下培養(yǎng)，待綠色愈傷組織表面開始長出玻璃化的不定芽；將帶有玻璃化不定芽的綠色愈傷組織轉移到含有SIMb固體培養(yǎng)基的組培瓶中，直到不定芽生長至l-2cm ；(8)伸長培養(yǎng):切取不定芽轉移至含有SEM固體培養(yǎng)基的組培瓶中25°C 1800Lux光照條件下培養(yǎng)3周，獲得表型趨于正常的芽；(9)誘導生根及檢測:取步驟(8)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉入RM固體培養(yǎng)基中，25°C 1800Lux光照下誘導生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農桿菌基因轉化了的雜交楊樹。 基本培養(yǎng)基的組成為:MS鹽2.2g，蔗糖25g，瓊脂7.2g，定容至1L，pH=5.6。Ml’固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖25g，生長素NAA1.86mg，細胞分裂素2ipl.02mg,瓊脂 7.2g，定容至 1L，pH=5.6。Ml固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g,鹿糖25g,生長素NAA1.86mg,細胞分裂素2ipl.02mg，乙酰丁香酮 19.86mg，瓊脂 7.2g，定容至 1L，ρΗ=5.6。農桿菌為C58 (pMP90/pH7GWIWG2(I))；含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基的組成為利福平35mg，慶大霉素25mg，壯觀霉素40mg,蛋白胨IOg,酵母浸出物5g,氯化鈉5g,瓊脂15g，定容至1L, pH=7.0 ；含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基的組成為利福平35mg，慶大霉素25mg，壯觀霉素40mg,蛋白胨IOg,酵母浸出物5g,氯化鈉5g,定容至1L, pH=7.0。M液的組成為:MS鹽4.4g,鹿糖25g,生長素NAA1.86mg,細胞分裂素2ipl.02mg,乙酰丁香酮 19.86mg,定容至 1L, pH=5.6。CIM固體選擇培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖25g，生長素NAAL 86mg，細胞分裂素 2ipl.02mg,頭抱霉素(Cefotaxime Sodium) 400mg，瓊月旨 7.2g，定容至 1L, pH=5.6。SIMa固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖25g，細胞分裂素TDZ0.05mg，頭孢霉素 400mg，潮霉素7.2g，定容至 1L，pH=5.6。SIMb固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖25g，細胞分裂素TDZ0.0022mg，頭孢霉素 400mg，潮霉素7.2g，定容至 1L，pH=5.6。SEM固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖25g，細胞分裂素BAP0.05mg,頭孢霉素400mg，潮霉素7.2g，定容至 1L，pH=5.6。RM固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽2.2g，蔗糖25g，頭孢霉素400mg，潮霉素BlOmg，瓊脂 7.2g，定容至 lL，pH=5.6。實施例2一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，包括下述步驟:(I)愈傷誘導:將白楊雜種無性系717-1B4 (P.tremulaXP.alba)的腋芽置于基本培養(yǎng)基上繼代繁殖，培養(yǎng)4周獲得組培苗；切取所述組培苗0.8-1.5cm不帶腋芽的莖段，用刀片沿著莖段縱軸方向劃3次造成傷口置于Ml’固體培養(yǎng)基中，于24°C黑暗條件下預培養(yǎng)15天；更換一次Ml’固體培養(yǎng)基，繼續(xù)在24°C黑暗條件下預培養(yǎng)15天，有愈傷組織生成；( 2 )愈傷組織預培養(yǎng):將步驟(1)獲得的愈傷組織切成0.4-0.6cm3的塊，置于Ml固體培養(yǎng)基預配養(yǎng)3天;(3)菌種活化與培養(yǎng):用移液槍槍頭挑取_80°C保存的農桿菌至含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上，27°C倒置暗培養(yǎng)28h ;挑取培養(yǎng)后的農桿菌在另一含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，27°C倒置暗培養(yǎng)48h ；挑取單菌落至2mL含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基的無菌試管中，150rpm27°C暗培養(yǎng)16h ;吸取0.1mL菌液放置于50mL含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，150rpm27°C暗培養(yǎng)至菌液OD6qq=0.6-0.8 ；(4)侵染:將步驟(3)獲得的菌液在室溫、3500rpm離心15min，棄去上清液，將沉淀用50mL M液重懸，得到侵染液，按30個/25mL的比例將經步驟(2)預培養(yǎng)的愈傷組織放入所述侵染液中，24°C條件下80rpm侵染20min ；(5)共培養(yǎng):取出侵染后的愈傷組織，用無菌濾紙吸干表面殘留的侵染液，放在Ml固體培養(yǎng)基上，24°C，暗條件下培養(yǎng)36小時；(6)延遲選擇:取出步驟(5)培養(yǎng)的愈傷組織，棄掉因侵染而褐變的愈傷組織，先用去離子水在180rpm下洗漆5min,洗漆3次,再用濃度為350mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液150rpm洗滌5min，洗滌3次，吸干表面水分并轉移至CIM固體選擇培養(yǎng)基中，24°C于黑暗條件下培養(yǎng)5天，舍棄與CIM固體選擇培養(yǎng)基的接觸處可見白色農桿菌菌落的愈傷組織，將剩余愈傷組織轉移到新鮮的CIM固體選擇培養(yǎng)基中，500LuX弱光下培養(yǎng)8天；(7)誘導不定芽:將步驟(6)獲得的愈傷組織轉移至SIMa固體培養(yǎng)基中，22°C 1500Lux，光照周期為光照/黑暗16h/8h的條件下進行培養(yǎng)，得到表面為白色或白色略帶褐化的愈傷組織，每21天更換一次SIMa固體培養(yǎng)基；待白色或白色略帶褐化的愈傷組織表面出現綠色的愈傷組織，用解剖刀剝離綠色的愈傷組織轉移至新鮮SIMa固體培養(yǎng)基中22°C 1500Lux光照條件下培養(yǎng)，待綠色愈傷組織表面開始長出玻璃化的不定芽；將帶有玻璃化不定芽的綠色愈傷組織轉移到含有SIMb固體培養(yǎng)基的組培瓶中，直到不定芽生長至l-2cm ；(8)伸長培養(yǎng):切取不定芽轉移至含有SEM固體培養(yǎng)基的組培瓶中24°C 1500Lux光照條件下培養(yǎng)4周，獲得表型趨于正常的芽；(9)誘導生根及檢測:取步驟(8)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉入RM固體培養(yǎng)基中，24°C 1500Lux光照下誘導生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農桿菌基因轉化了的雜交楊樹?；九囵B(yǎng)基的組成為:MS鹽2.2g，蔗糖20g，瓊脂7.lg，定容至1L，pH=5.8。
Ml’固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20g，生長素NAA1.86mg，細胞分裂素2ipl.02mg,瓊脂 7.1g,定容至 1L，ρΗ=5.8。Ml固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20g，生長素NAA1.86mg，細胞分裂素2ipl.02mg,乙酰丁香酮 19.86mg,瓊脂 7.1g,定容至 1L, pH=5.8。農桿菌為C58 (pMP90/pH7GWIWG2(I))；含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基的組成為利福平25mg，慶大霉素20mg，壯觀霉素30mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化鈉5g，瓊脂15g，定容至1L, pH=7.0 ；含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基的組成為利福平25mg，慶大霉素20mg，壯觀霉素30mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化鈉5g，定容至1L，pH=7.0。M液的組成為:MS鹽4.4g,鹿糖20g,生長素NAA1.86mg,細胞分裂素2ipl.02mg,乙酰丁香酮 19.86mg,定容至 1L, pH=5.8。CIM固體選擇培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20g，生長素NAA1.86mg，細胞分裂素 2ipl.02mg,頭孢霉素 350mg,瓊脂 7.1g,定容至 1L，pH=5.8。SIMa固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20g，細胞分裂素TDZ0.05mg，頭孢霉素350mg，潮霉素BlOmg，瓊脂7.lg，定容至1L，ρΗ=5.8。SIMb固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20g，細胞分裂素TDZ0.0022mg，頭孢霉素350mg，潮霉素BlOmg，瓊脂7.lg，定容至1L，ρΗ=5.8。SEM固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20g，細胞分裂素BAP0.05mg，頭孢霉素350mg，潮霉素 BlOmg，瓊脂 7.lg，定容至 1L，ρΗ=5.8。RM固體培養(yǎng)基的 組成為:MS鹽2.2g，蔗糖20g，頭孢霉素350mg，潮霉素BlOmg，瓊脂7.lg，定容至 lL，pH=5.8。實施例3一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，包括下述步驟:(I)愈傷誘導:將白楊雜種無性系717-1B4 (P.tremulaXP.alba)的頂芽置于基本培養(yǎng)基上繼代繁殖，培養(yǎng)6周獲得組培苗；切取所述組培苗0.8-1.5cm不帶腋芽的莖段，用刀片切取所述組培苗的帶有0.1-0.5cm2葉片的葉柄置于Ml’固體培養(yǎng)基中，于26°C黑暗條件下預培養(yǎng)12天；更換一次Ml’固體培養(yǎng)基，繼續(xù)在26°C黑暗條件下預培養(yǎng)12天，有愈傷組織生成；(2)愈傷組織預培養(yǎng):將步驟(I)獲得的愈傷組織切成0.4-0.6cm3的塊，置于Ml固體培養(yǎng)基預配養(yǎng)3天;(3)菌種活化與培養(yǎng):用移液槍槍頭挑取_80°C保存的農桿菌至含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上，29°C倒置暗培養(yǎng)20h ;挑取培養(yǎng)后的農桿菌在另一含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，29°C倒置暗培養(yǎng)36h ；挑取單菌落至4mL含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基的無菌試管中，200rpm29°C暗培養(yǎng)12h ;吸取1.0mL菌液放置于75mL含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，200rpm29°C暗培養(yǎng)至菌液OD6qq=0.6-0.8 ；(4)侵染:
將步驟(3)獲得的菌液在室溫、4000rpm離心lOmin，棄去上清液，將沉淀用75mL M液重懸，得到侵染液，按50個/25mL的比例將經步驟(2)預培養(yǎng)的愈傷組織放入所述侵染液中，26°C條件下IOOrpm侵染IOmin ；(5)共培養(yǎng):取出侵染后的愈傷組織，用無菌濾紙吸干表面殘留的侵染液，放在Ml固體培養(yǎng)基上，26°C，暗條件下培養(yǎng)24小時；(6)延遲選擇:取出步驟(5)培養(yǎng)的愈傷組織，棄掉因侵染而褐變的愈傷組織，先用去離子水在220rpm下洗漆4min,洗漆2次,再用濃度為500mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液200rpm洗滌4min，洗滌2次，吸干表面水分并轉移至CIM固體選擇培養(yǎng)基中，26°C于黑暗條件下培養(yǎng)3天，舍棄與CIM固體選擇培養(yǎng)基的接觸處可見白色農桿菌菌落的愈傷組織，將剩余愈傷組織轉移到新鮮的CIM固體選擇培養(yǎng)基中，800LuX弱光下培養(yǎng)5天；(7)誘導不定芽:將步驟(6)獲得的愈傷組織轉移至SMa固體培養(yǎng)基中，26°C 2000Lux，光照周期為光照/黑暗16h/8h的條件下進行培養(yǎng)，得到表面為白色或白色略帶褐化的愈傷組織，每14天更換一次SIMa固體培養(yǎng)基；待白色或白色略帶褐化的愈傷組織表面出現綠色的愈傷組織，用解剖刀剝離綠色的愈傷組織轉移至新鮮SMa固體培養(yǎng)基中26°C 2000LUX光照條件下培養(yǎng)，待綠色愈傷組織表面開始長出玻璃化的不定芽；將帶有玻璃化不定芽的綠色愈傷組織轉移到含有SIMb固體培養(yǎng)基的組培瓶中，直到不定芽生長至l-2cm ；(8)伸長培 養(yǎng):切取不定芽轉移至含有SEM固體培養(yǎng)基的組培瓶中26°C 2000Lux光照條件下培養(yǎng)2周，獲得表型趨于正常的芽；(9)誘導生根及檢測:取步驟(8)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉入RM固體培養(yǎng)基中，26°C 2000Lux光照下誘導生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農桿菌基因轉化了的雜交楊樹?；九囵B(yǎng)基的組成為:MS鹽2.2g，蔗糖30g，瓊脂7.0g，定容至1L，pH=5.7。Ml’培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖30g，生長素NAA1.86mg，細胞分裂素2ipl.02mg,瓊脂 7.0g,定容至 1L，pH=5.7。Ml固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖30g，生長素NAA1.86mg，細胞分裂素2ipl.02mg,乙酰丁香酮 19.86mg,瓊脂 7.0g,定容至 1L, pH=5.7。農桿菌為C58 (pMP90/pH7GWIWG2(I))；含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基的組成為利福平50mg，慶大霉素30mg，壯觀霉素50mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化鈉5g，瓊脂15g，定容至1L，pH=7.0 ；含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基的組成為利福平50mg，慶大霉素30mg，壯觀霉素50mg,蛋白胨IOg,酵母浸出物5g,氯化鈉5g，定容至1L, pH=7.0。M液的組成為:MS鹽4.4g,鹿糖30g,生長素NAA1.86mg,細胞分裂素2ipl.02mg,乙酰丁香酮 19.86mg，定容至 1L，pH=5.7。CIM固體選擇培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖30g，生長素NAA1.86mg，細胞分裂素 2ipl.02mg,頭孢霉素 500mg,瓊脂 7.0g,定容至 1L，pH=5.7。SMa固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖30g，細胞分裂素TDZ0.05mg，頭孢霉素500mg,潮霉素BlOmg,瓊脂7.0g,定容至1L，pH=5.7。SIMb固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖30g，細胞分裂素TDZ0.0022mg，頭孢霉素500mg,潮霉素BlOmg,瓊脂7.0g,定容至1L，pH=5.7。SEM固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖30g，細胞分裂素BAP0.05mg，頭孢霉素500mg，潮霉素 BlOmg，瓊脂 7.0g，定容至 1L，pH=5.7。RM固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽2.2g，蔗糖30g，頭孢霉素500mg，潮霉素BlOmgJlC脂 7.0g，定容至 lL，pH=5.7。上面各實施例所涉及的MS鹽(Duchefa Biochemie B.V.公司)。實施例4:不同外植體類型對白楊雜種無性系717-1B4 (P.tremulaXP.alba)產生陽性抗性芽及其染菌率的影響本實驗用白楊雜種無性系717-1B4 (P.tremulaXP.alba)不帶腋芽的莖段，帶有
0.1-0.5cm2葉片的葉柄，l-2cm2的葉片以及實施例1步驟(I)獲得的0.5cm3的塊狀愈傷組織四種不同的組織作為農桿菌侵染的外植體材料。實驗步驟和條件均參照實施例1的步驟和條件，結果見表1，結果表明，在其它轉化條件相同的情況下，不同的外植體材料產生的抗潮霉素陽性再生芽的頻率不同，其中愈傷組織的轉化效率最高，莖段次之，差異極其顯著，而由葉片產生的再生芽的頻率最低，幾乎沒有再生芽產生；不同外植體材料染菌率不同，愈傷組織染菌率最低，葉片、葉柄、莖段的染菌率都超過百分之五十，轉化效率高，為大規(guī)模的轉基因楊樹提供了一種技術手段。表I不同受體材料對白楊雜種無性系717-1B4 (P.tremulaXP.alba)產生抗性不
定芽的影響
權利要求
1.一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，其特征包括下述步驟: (O愈傷誘導: 將717楊樹的腋芽或頂芽置于基本培養(yǎng)基上繼代繁殖，培養(yǎng)4-6周獲得組培苗；切取所述組培苗0.8-1.5cm不帶腋芽的莖段，用刀片沿著莖段縱軸方向劃2-3次造成傷口或切取所述組培苗的帶有0.1-0.5cm2葉片的葉柄置于Ml’固體培養(yǎng)基中，于24-26°C黑暗條件下預培養(yǎng)12-15天；更換一次Ml’固體培養(yǎng)基，繼續(xù)在24-26°C黑暗條件下預培養(yǎng)12-15天，有愈傷組織生成； (2)愈傷組織預培養(yǎng): 將步驟(I)獲得的愈傷組織切成0.4-0.6cm3的塊，置于Ml固體培養(yǎng)基預配養(yǎng)2_3天； (3)菌種活化與培養(yǎng): 用移液槍槍頭挑取 _80°C保存的農桿菌至含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上，27-29°C倒置暗培養(yǎng)20-28h ;挑取培養(yǎng)后的農桿菌在另一含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，27-29°C倒置暗培養(yǎng)36-48h ； 挑取單菌落至2-4mL含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基的無菌試管中，150-200rpm27-29°C暗培養(yǎng)12-16h ;吸取0.1-1.0mL菌液放置于50_75mL含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，150-200rpm27-29°C暗培養(yǎng)至菌液 0D_=0.6-0.8 ； (4)侵染: 將步驟(3)獲得的菌液在室溫、3500-4000rpm離心10_15min，棄去上清液，將沉淀用50-75mL M液重懸，得到侵染液，按30-50個/25mL的比例將經步驟(2)預培養(yǎng)的愈傷組織放入所述侵染液中，24-26°C條件下80-100rpm侵染10_20min ； (5)共培養(yǎng): 取出侵染后的愈傷組織，吸干表面殘留的侵染液，放在Ml固體培養(yǎng)基上，24-26°C，暗條件下培養(yǎng)24-36小時； (6)延遲選擇: 取出步驟(5)培養(yǎng)的愈傷組織，棄掉因侵染而褐變的愈傷組織，先用去離子水在180-220rpm下洗滌4_5min，洗滌2_3次，再用濃度為350_500mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液150-200rpm洗滌4_5min，洗滌2_3次，吸干表面水分并轉移至CM固體選擇培養(yǎng)基中，24-26°C于黑暗條件下培養(yǎng)3-5天，舍棄與CIM固體選擇培養(yǎng)基的接觸處可見白色農桿菌菌落的愈傷組織，將剩余愈傷組織轉移到新鮮的CIM固體選擇培養(yǎng)基中，500-800Lux弱光下培養(yǎng)5-8天； (7)誘導不定芽: 將步驟(6)獲得的愈傷組織轉移至SMa固體培養(yǎng)基中，22-26°C 1500_2000Lux，光照周期為光照/黑暗16h/8h的條件下進行培養(yǎng)，得到表面為白色或白色略帶褐化的愈傷組織，每14-21天更換一次SIMa固體培養(yǎng)基；待白色或白色略帶褐化的愈傷組織表面出現綠色的愈傷組織，用解剖刀剝離綠色的愈傷組織轉移至新鮮SIMa固體培養(yǎng)基中22-260C 1500-2000Lux光照條件下培養(yǎng)，待綠色愈傷組織表面開始長出玻璃化的不定芽；將帶有玻璃化不定芽的綠色愈傷組織轉移到含有SIMb固體培養(yǎng)基的組培瓶中，直到不定芽生長至l_2cm ； (8)伸長培養(yǎng):切取不定芽轉移至含有SEM固體培養(yǎng)基的組培瓶中24-26°C 1500_2000Lux光照條件下培養(yǎng)2-4周，獲得表型趨于正常的芽； (9)誘導生根及檢測: 取步驟(8)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉入RM固體培養(yǎng)基中，24-260C 1500-2000Lux光照下誘導生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農桿菌基因轉化了的雜交楊樹。
2.根據權利要求1所述的一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，其特征是步驟(I)所述基本培養(yǎng)基的組成為:MS鹽2.2g，蔗糖20-30g，瓊脂7_7.2g，定容至1L，ρΗ5.6-5.8 ;所述肌’固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20_30g，生長素NAA1.86mg，細胞分裂素 2ipl.02mg,瓊脂 7-7.2g，定容至 1L，pH=5.6-5.8。
3.根據權利要求1所述的一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，其特征在于步驟(2)所述Ml固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，生長素NAA1.86mg，細胞分裂素 2ipl.02mg,乙酰丁香酮 19.86mg，瓊脂 7-7.2g，定容至 1L，pH=5.6-5.8。
4.根據權利要求1所述的一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，其特征在于步驟(3)所述農 桿菌為C58 (pMP90/pH7GWIWG2(I));所述含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基的組成為利福平25-50mg，慶大霉素20-30mg，壯觀霉素30_50mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化鈉5g，瓊脂15g，定容至1L，pH=7.0 ;所述含有抗生素的YEB液體培養(yǎng)基的組成為利福平25-50mg，慶大霉素20-30mg，壯觀霉素30_50mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化鈉5g，定容至 1L，pH=7.0。
5.根據權利要求1所述的一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，其特征在于步驟(4)中所述M液的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，生長素NAA1.86mg,細胞分裂素 2ipl.02mg,乙酰丁香酮 19.86mg,定容至 1L, pH=5.6-5.8。
6.根據權利要求1所述的一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，其特征在于步驟(6)中所述CM固體選擇培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，生長素NAA1.86mg,細胞分裂素2ipl.02mg,頭孢霉素350-500mg,瓊脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8ο
7.根據權利要求1所述的一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，其特征在于步驟(7)中所述SMa固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20_30g，細胞分裂素TDZ0.05mg,頭孢霉素 350-500mg，潮霉素 BlOmg，瓊脂 7-7.2g，定容至 1L，pH=5.6-5.8 ;所述SIMb固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，細胞分裂素TDZ0.0022mg，頭孢霉素350-500mg，潮霉素7-7.2g，定容至 1L，pH=5.6-5.8。
8.根據權利要求1所述的一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，其特征在于步驟(8)中所述SEM固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，細胞分裂素BAP0.05mg，頭孢霉素 350_500mg，潮霉素 BlOmg，瓊脂 7-7.2g，定容至 1L，pH=5.6-5.8。
9.根據權利要求1所述的一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，其特征在于在步驟(9)中所述RM固體培養(yǎng)基的組成為:MS鹽2.2g，蔗糖20-30g，頭孢霉素350-500mg，潮霉素7-7.2g，定容至 1L，pH=5.6-5.8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以愈傷組織為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法，包括下述步驟(1)愈傷誘導；(2)愈傷組織預培養(yǎng)；(3)菌種活化與培養(yǎng)；(4)侵染；(5)共培養(yǎng)；(6)延遲選擇；(7)誘導不定芽；(8)伸長培養(yǎng)；(9)誘導生根及檢測，驗證農桿菌基因轉化了的雜交楊樹。本發(fā)明的方法克服了現有技術因以楊樹莖段或葉柄為外植體的雜交楊農桿菌轉化方法后期染菌而被迫不斷繼代的缺點，可以用少量愈傷組織外植體快速獲得的抗性轉基因楊樹，周期短、染菌率低、轉化效率高，為大規(guī)模的轉基因楊樹提供了一種技術手段。
文檔編號A01H5/00GK103194486SQ20131013590
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月18日 優(yōu)先權日2013年4月18日
發(fā)明者王潔華, 昝艷君, 籍燕, 魏志蓉 申請人:天津大學