專利名稱：一種鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)方法，屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛，為蘭科多年生附生草本植物。生于海拔達(dá)1600米的山地半陰濕的巖石上，喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環(huán)境，不耐寒。一般均能耐一 5°C的低溫。石斛可分為黃草、金釵、馬鞭等數(shù)十種，鐵皮石斛和金釵石斛為石斛之極品，鐵皮石斛因表皮呈鐵綠色而得名。鐵皮石斛具有獨特的藥用價值，以其莖入藥，中藥名石斛，屬補(bǔ)益藥中的補(bǔ)陰藥，《中國藥典》益胃生津，滋陰清熱。鐵皮石斛等少數(shù)品種之嫩莖，扭成螺旋狀或彈簧狀，曬干，商品稱為耳環(huán)石斛，又名楓斗。多年以來，商品石斛主要依靠野生藥用石斛資源，隨著藥用石斛開發(fā)利用的不斷深入和國內(nèi)外需求量的逐年增加，我國野生藥用石斛資源遭到了嚴(yán)重破壞，有些地區(qū)甚至面臨枯竭。為了保護(hù)野生蘭科植物資源，各國都出臺了許多禁止采挖或銷售野生蘭科植物的法規(guī)和條例，如1975年生效的《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)，把所有蘭科植物全部列入附錄I和II中；于1987年國務(wù)院出臺的《野生藥材資源保護(hù)管理條例》中，環(huán)草石斛、黃草石斛、金釵石斛、馬鞭石斛和鐵皮石斛被列為國家三級珍稀瀕危保護(hù)植物。這些政策措施對野生藥用石斛資源的妥善保護(hù)起到了重要作用。傳統(tǒng)鐵皮石斛組織培養(yǎng)小植株主要依靠培養(yǎng)基中的糖作為碳源，極易引起微生物的污染。為了減少微生物的污染，必須使用封閉的、小的培養(yǎng)容器。培養(yǎng)容器小，并且由于培養(yǎng)基中糖的存在，導(dǎo)致葉片表層結(jié)構(gòu)發(fā)育差，氣孔開閉功能不強(qiáng)，葉片小，葉綠素含量低，最終抑制和降低了小植株的光合作用能力。與植株自然生長差異懸殊的容器內(nèi)環(huán)境，還導(dǎo)致植株生理、形態(tài)上的一定紊亂，難以適應(yīng)的會生長發(fā)育延緩或死亡，有的會出現(xiàn)植株生長細(xì)弱，葉片舒展度差，生根不良，引起馴化階段植株較高的死亡率，為此必須使用植物生長調(diào)節(jié)劑，但是植物生長調(diào)節(jié)劑的使用又會導(dǎo)致畸形和變異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)方法，可解決傳統(tǒng)組培過程中污染率高、生根率低、品質(zhì)差的問題，可提高鐵皮石斛組培苗的質(zhì)量和產(chǎn)苗率，縮短培養(yǎng)周期，并且降低組培苗生產(chǎn)成本。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的
本發(fā)明的鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)方法包括以下步驟
(1)外植體準(zhǔn)備選擇典型性狀健康的鐵皮石斛種苗的莖，以莖芽為中心上下各留O. 5cm剪下莖段作為體皮石斛無糖組織培養(yǎng)的外植體，將外植體浸泡在酒精體積百分含量70%的燒杯中2分鐘進(jìn)行滅菌，然后用無菌水沖洗I次；
(2)初代無糖組織培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)處理的外植體接種至鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)初代培養(yǎng)基中，置于不銹鋼外殼植物生長箱進(jìn)行初代培養(yǎng)；
(3)無根苗篩選將經(jīng)過步驟(2)培養(yǎng)的無根苗進(jìn)行篩選， 選擇大小達(dá)3- 4cm的無根苗并用無菌水沖洗，將沖洗干凈的無根苗切割為單苗；
(4)繼代無糖組織培養(yǎng)將經(jīng)步驟(3)處理的單苗接種至鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基中，置于不銹鋼外殼植物生長箱進(jìn)行繼代培養(yǎng)。在步驟(2)所述鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)初代培養(yǎng)基中，a-萘乙酸的含量為O. Ι-Ο. 5mg/L, 6-芐氨基腺嘌呤的含量為I一3mg/L，香蕉汁的含量為80— 120g/L，活性炭的含量為200— 300mg / L ,0. 25毫米的沙粒的含量為8 — 10g/L，PH為5. 6。在步驟(2)所述的初代無糖組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)周期20— 40天，CCU農(nóng)度650±50 μ L/L，培養(yǎng)溫度20°C—26°C，光照強(qiáng)度1800—2100Lx，光照時間16—20小時/天。在步驟(4)所述鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基中，6-芐氨基腺嘌呤的含量為I一3mg/L，香蕉汁的含量為80— 120g/L，活性炭的含量為300—600mg / L，O. 25毫米的沙粒的含量為8 — 10g/L，PH為5. 6。在步驟(4)所述的繼代無糖組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)周期30— 60天，CCU農(nóng)度650±50 μ L/L，培養(yǎng)溫度20°C—26°C，光照強(qiáng)度1800—2100Lx，光照時間16—20小時/天。本發(fā)明的這種鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)方法與傳統(tǒng)鐵皮石斛組織培養(yǎng)方法區(qū)別在于
(I)碳源的改變在傳統(tǒng)的植物組培快繁技術(shù)中，小植株以糖(如蔗糖、白砂糖、果糖等)作為主要碳源進(jìn)行異養(yǎng)或兼養(yǎng)生長，糖被看作是 植物組織培養(yǎng)中必不可少的物質(zhì)。而本發(fā)明中則用CO2替代糖作為小植株生長的唯一碳源，通過強(qiáng)制性換氣系統(tǒng)供給小植株生長所需CO2，使其在人工光照下，吸收CO2進(jìn)行完全的自養(yǎng)生長，在一定程度上避免了微生物的污染。(2)培養(yǎng)基質(zhì)的改變在傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)中，通常使用瓊脂作為培養(yǎng)基質(zhì)，它的透氣性差，不利于水分、氣體和營養(yǎng)物質(zhì)的移動和吸收。本發(fā)明使用沙粒作為培養(yǎng)基質(zhì)，此基質(zhì)具有良好的透氣性，可以極大地提高小植株的生根率和生根質(zhì)量，而且與瓊脂相比，此無機(jī)基質(zhì)價格相對低廉，節(jié)約了培養(yǎng)成本。(3 )培養(yǎng)容器的改變在傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)中，由于培養(yǎng)基中糖的存在,為了防止污染，只能使用小的培養(yǎng)容器。本發(fā)明在培養(yǎng)過程中不使用糖及各類有機(jī)物質(zhì)，極大地避免了污染的發(fā)生，因此選用不銹鋼外殼植物生長箱作為培養(yǎng)容器，既可以人工控制CO2濃度又可以人工控制光照強(qiáng)度。
具體實施例方式本發(fā)面詳細(xì)實施方式如下
(1)外植體準(zhǔn)備選擇典型性狀健康的鐵皮石斛種苗的莖，以莖芽為中心上下各留O. 5cm剪下莖段作為體皮石斛無糖組織培養(yǎng)的外植體，將外植體浸泡在酒精體積百分含量70%的燒杯中2分鐘進(jìn)行滅菌，然后用無菌水沖洗I次；
(2)初代無糖組織培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)處理的外植體接種至鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)初代培養(yǎng)基中，置于不銹鋼外殼植物生長箱進(jìn)行初代培養(yǎng)，培養(yǎng)周期20— 40天，CO2濃度(650±50) yL/L，培養(yǎng)溫度20°C—26°C，光照強(qiáng)度1800— 2100Lx，光照時間16 — 20小時/天；所述鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)初代培養(yǎng)基包含以下成分MS培養(yǎng)基，a-萘乙酸的含量為O. l-ο. 5mg/L, 6-芐氨基腺嘌呤的含量為I一3mg/L，香蕉汁的含量為80— 120g/L，活性炭的含量為200— 300mg / L ,0. 25毫米的沙粒的含量為8 — 10g/L，PH為5. 6 ;
(3)無根苗篩選將經(jīng)過步驟(2)培養(yǎng)的無根苗進(jìn)行篩選，選擇大小達(dá)3- 4cm的無根苗并用無菌水沖洗，將沖洗干凈的無根苗切割為單苗；
(4)繼代無糖組織培養(yǎng)將經(jīng)步驟(3)處理的單苗接種至鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基中，置于不銹鋼外殼植物生長箱進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)周期30— 60天，CO2濃度(650±50) yL/L，培養(yǎng)溫度20°C—26°C，光照強(qiáng)度1800— 2100Lx，光照時間16 — 20小時/天；所述鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基包含以下成分MS培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤的含量為I一3mg/L，香蕉汁的含量為80— 120g/L，活性炭的含量為300—600mg / L，O. 25毫米的沙粒的含量為8 — 10g/L，PH為5. 6。
實施例選擇產(chǎn)于福建優(yōu)質(zhì)鐵皮石斛種苗的莖，經(jīng)步驟(I)處理，接種至鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)初代培養(yǎng)基中，置于不銹鋼外殼植物生長箱進(jìn)行初代培養(yǎng)，培養(yǎng)按照培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件分8組進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟(1)外植體準(zhǔn)備選擇典型性狀健康的鐵皮石斛種苗的莖，以莖芽為中心上下各留O.5cm剪下莖段作為體皮石斛無糖組織培養(yǎng)的外植體，將外植體浸泡在酒精體積百分含量 70%的燒杯中2分鐘進(jìn)行滅菌，然后用無菌水沖洗I次；(2)初代無糖組織培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)處理的外植體接種至鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)初代培養(yǎng)基中，置于不銹鋼外殼植物生長箱進(jìn)行初代培養(yǎng)；(3)無根苗篩選將經(jīng)過步驟(2)培養(yǎng)的無根苗進(jìn)行篩選，選擇大小達(dá)3- 4cm的無根苗并用無菌水沖洗，將沖洗干凈的無根苗切割為單苗；(4)繼代無糖組織培養(yǎng)將經(jīng)步驟(3)處理的單苗接種至鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基中，置于不銹鋼外殼植物生長箱進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利I所述的鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)方法，其特征在于在步驟(2)所述鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)初代培養(yǎng)基中，a-萘乙酸的含量為O. 1—0. 5mg/L, 6-芐氨基腺嘌呤的含量為I一3mg/L，香蕉汁的含量為80— 120g/L，活性炭的含量為200— 300mg / L，0. 25毫米的沙粒的含量為8 — 10g/L，PH為5. 6。
3.根據(jù)權(quán)利I所述的鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)方法，其特征在于在步驟(2)所述的初代無糖組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)周期20— 40天，CO2濃度650±50 μ L/L，培養(yǎng)溫度20°C—26°C，光照強(qiáng)度1800— 2100Lx，光照時間16—20小時/天。
4.根據(jù)權(quán)利I所述的鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)方法，其特征在于在步驟(4)所述鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基中，6-芐氨基腺嘌呤的含量為I一3mg/L，香蕉汁的含量為80— 120g/L，活性炭的含量為300— 600mg / L，O. 25毫米的沙粒的含量為8 — 10g/L，PH為5.6o
5.根據(jù)權(quán)利I所述的鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)方法，其特征在于在步驟(4)所述的繼代無糖組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)周期30— 60天，CO2濃度650±50 μ L/L，培養(yǎng)溫度20°C—26°C，光照強(qiáng)度1800— 2100Lx，光照時間16—20小時/天。
全文摘要
本發(fā)明提供一種鐵皮石斛無糖組織培養(yǎng)方法，是將鐵皮石斛小段組織接種于石斛無糖組織培養(yǎng)初代培養(yǎng)基置于不銹鋼外殼植物生長箱進(jìn)行培養(yǎng)，再將初代培養(yǎng)的無根苗切割為單苗接種于石斛無糖組織培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基置于不銹鋼外殼植物生長箱進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明可解決傳統(tǒng)組培過程中污染率高、生根率低、品質(zhì)差的問題，提高鐵皮石斛組培苗的質(zhì)量和產(chǎn)苗率，縮短培養(yǎng)周期，并且降低組培苗生產(chǎn)成本。
文檔編號A01H4/00GK103039368SQ201310029289
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月27日
發(fā)明者蔣娉, 張國武, 張國忠, 張華明, 張銀生 申請人:云南天泉生物科技股份有限公司