專利名稱：一種飼用復(fù)合小肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種飼用復(fù)合小肽的制備方法。
背景技術(shù)：
小肽(P印tides)是由兩個以上的氨基酸組成，有二肽到多肽之分。小肽作為蛋白質(zhì)的主要消化產(chǎn)物，在氨基酸消化、吸收以及動物營養(yǎng)代謝中起著重要的作用。研究表明，小肽和氨基酸的混合物在人體的吸收率和吸收速度都比單純氨基酸佳，不僅如此，小肽還能在腸道內(nèi)保護(hù)易被破壞的氨基酸。此外，單純的氨基酸在體內(nèi)根據(jù)需要新組成肽和蛋白質(zhì)，而小肽和氨基酸的混合物可省去一部分重新組合的過程，因此，它的生物效價更高。小肽可促進(jìn)動物對礦物元素的吸收利用，其促進(jìn)作用主要來源于酪蛋白肽的水解產(chǎn)物，由酶解酪多聚谷蛋白獲得的肽可結(jié)合和運(yùn)輸二價礦物離子。小肽的氨基酸殘基可與金屬離子螯合，可以避免腸腔中頡頏因子及其他影響因子對礦物元素的沉淀或吸附作用，直接到達(dá)小腸刷狀緣，并在吸收位點(diǎn)處發(fā)生水解，從而增加礦物質(zhì)元素的吸收。小肽具有生理調(diào)節(jié)作用。它可以通過誘導(dǎo)小腸中一些酶活性的提高，而使小腸消化功能發(fā)育提前，促進(jìn)動物體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而提高動物體的免疫機(jī)能和生產(chǎn)性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種飼用復(fù)合小肽的制備方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種飼用復(fù)合小肽的制備方法，包括如下步驟
1)將蛋白原料、碳源和水配制成培養(yǎng)液，滅菌；
2)將芽孢菌接種到滅菌后的培養(yǎng)液中，30 37°C下振蕩培養(yǎng)18 30h后，加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，繼續(xù)酶解6 12h，得到小肽發(fā)酵液；或者是往培養(yǎng)液中加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，酶解6 12h后，接種芽孢菌，30 37°C下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)18 30h，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液干燥，得到飼用復(fù)合小肽。蛋白原料為豆柏、大米蛋白粉、小麥蛋白粉、玉米蛋白粉、棉柏、花生柏、馬鈴薯蛋白、菜柏、大豆?jié)饪s蛋白中的至少一種或幾種組合。碳源為葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少一種。以上原料均可在原料市場購得。每IOOml培養(yǎng)液中，含有蛋白原料20 30g、碳源O. I lg。 芽孢菌為地衣芽孢桿菌QBaciIlus Iicheniformis)或/和枯草芽孢桿菌{BeilIus subtilis、或 I 和納豆芽抱桿菌Cfeci77w5· natto、。芽孢菌的接種濃度為5 X IO7 IOX 107cfu/ml培養(yǎng)液。蛋白酶為中性蛋白酶。
蛋白酶的加入量為400 700U/g蛋白原料。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明方法制備得到的復(fù)合小肽分子量主要集中在238 568Da，約2 5肽，小肽得率占蛋白質(zhì)含量的35%以上。復(fù)合小肽風(fēng)味獨(dú)特、口感好，可用作飼料添加劑，提高動物動物體的生產(chǎn)性能。


圖I是蛋白含量與吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖2是標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量和出峰時間曲線3是小肽發(fā)酵液凝膠G-15洗脫圖譜。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不僅限于此。以下實施例中所用到的菌液按以下方法制備
從斜面試管培養(yǎng)基中刮取一環(huán)地衣芽孢桿菌Iicheniformis)或枯草芽孢桿菌iBcillus或納豆芽孢桿菌{Bacillus菌種加入到液體培養(yǎng)基中,搖
瓶培養(yǎng)。搖瓶種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件為葡萄糖1%、酵母膏O. 5%、蛋白胨O. 5%、牛肉膏O. 5%、食鹽O. 05%、磷酸二氫鉀O. 1%，ρΗ=7. 0-7. 2、121°C滅菌18分鐘。于32°C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h，得到菌種液。以上三個菌種購自廣東省微生物菌種保藏中心，地衣芽孢桿菌(McilliisIi cheni formi s )和枯草芽抱桿菌 C5ci77w5· subtil is、的編號分別為 GIM1. 8=AS1. 518,GIM1. 19=AS1. 210。以下實施例中所用到的中性蛋白酶購自肇東市日成酶制劑有限公司，商品型號為AS. 1398，酶活力為 50000U/g。實施例I
小肽復(fù)合物的制備方法1，包括如下步驟
O培養(yǎng)液的制備將IOOkg粗蛋白含量為46%的豆柏，IOOkg粗蛋白含量為60%的大米蛋白粉，IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，4kg鹿糖,4kg葡萄糖,用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液pH值到6. 8，121°C滅菌18分鐘；
2)小肽發(fā)酵液制備將在32°C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h后的地衣芽孢桿菌菌種液接入上述滅菌后的1000L培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液中菌體濃度約為5X107cfu/ml，30°C培養(yǎng)24小時后，加入鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為7.0，加入3kg中性蛋白酶(500U/g蛋白原料)，45°C繼續(xù)酶解10h，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過40目篩，得飼用復(fù)合小肽。實施例2
小肽復(fù)合物的制備方法2，包括如下步驟
I)培養(yǎng)液的制備將IOOkg粗蛋白含量為46%的豆柏，IOOkg粗蛋白含量為60%的大米蛋白粉，IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，8kg蔗糖，用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液PH值到6. 8，121°C滅菌18分鐘；
2)小妝發(fā)酵液制備將在32C恒溫?fù)u床中，200r/min振湯培養(yǎng)24h后的枯早牙抱桿囷菌種液接入上述滅菌后的IOOOL培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液中菌體濃度約為5X 107cfu/ml，30°C培養(yǎng)24小時后，加入鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為6. 8，加入2. 4kg中性蛋白酶(400U/g蛋白原料)，43°C繼續(xù)酶解12h，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過60目篩，得飼用復(fù)合小肽。實施例3
小肽復(fù)合物的制備方法3，包括如下步驟
1)培養(yǎng)液的制備將IOOkg粗蛋白含量為46%的豆柏，IOOkg粗蛋白含量為60%的大米 蛋白粉，IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，6kg葡萄糖，用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液PH值到6. 8，121°C滅菌18分鐘；
2)小肽發(fā)酵液制備將在32°C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h后的納豆芽孢桿MiMcilliis aaiio)菌種液接入上述滅菌后的1000L培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液中菌體濃度約為5X107cfu/ml，32°C培養(yǎng)24小時后，加入鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為6. 8，加入
3.6kg中性蛋白酶(600U/g蛋白原料)，43°C繼續(xù)酶解12h，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過60目篩，得飼用復(fù)合小肽。實施例4
小肽復(fù)合物的制備方法4，包括如下步驟
I)培養(yǎng)液的制備將IOOkg粗蛋白含量為46%的豆柏，IOOkg粗蛋白含量為60%的大米蛋白粉，IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，4kg蔗糖，4g葡萄糖，用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液pH值到6. 8，121°C滅菌18分鐘；
2)小肽發(fā)酵液制備將在32°C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h后的地衣芽孢桿菌菌種液和枯草芽孢桿菌菌種液接入上述滅菌后的1000L培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液中地衣芽孢桿菌菌體濃度約為5X 107cfu/ml，枯草芽孢桿菌菌體濃度約為5X 107cfu/ml，32°C培養(yǎng)24小時后，加入鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為6. 8，然后加入4. 2kg中性蛋白酶(700U/g蛋白原料)，40°C繼續(xù)酶解12h，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過60目篩，得飼用復(fù)合小肽。實施例5
小肽復(fù)合物的制備方法5，包括如下步驟
1)培養(yǎng)液的制備50kg粗蛋白含量為46%的豆柏，20kg粗蛋白含量為50%的玉米蛋白粉，30kg粗蛋白含量為35%菜柏，20kg粗蛋白含量為48%的花生柏，60kg粗蛋白含量為60%的大米蛋白粉，20kg粗蛋白含量為80%的小麥蛋白粉，IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，4kg蔗糖，4g葡萄糖，用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液pH值到6. 8，121。。滅菌18分鐘;
2)小肽發(fā)酵液制備將于32°C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h的地衣芽孢桿菌菌種液接入上述滅菌后的1000L培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液中菌體濃度約為5X 107cfu/ml，35°C培養(yǎng)24小時后，加入鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為7. O，加入3kg中性蛋白酶(500U/g蛋白原料)，45°C繼續(xù)酶解10h，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過40目篩，得飼用復(fù)合小肽。實施例6
小肽復(fù)合物的制備方法6，包括如下步驟
1)培養(yǎng)液的制備50kg粗蛋白含量為46%的豆柏，20kg粗蛋白含量為50%的玉米蛋白粉、15kg粗蛋白含量為35%菜柏、20kg粗蛋白含量為48%的花生柏，95kg粗蛋白含量為60%的大米蛋白粉，IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，8kg淀粉，用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液pH值到6. 8,用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液pH值到6. 8,121°C 滅菌18分鐘；
2)小妝發(fā)酵液制備將在32C恒溫?fù)u床中，200r/min振湯培養(yǎng)24h后的枯早牙抱桿菌菌種液接入上述滅菌后的1000L培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液中菌體濃度約為5 10X107cfu/ml，37°C培養(yǎng)24小時后，加入鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為6. 8，加入2. 4kg中性蛋白酶(400U/g蛋白原料)，43°C繼續(xù)酶解12h，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過60目篩，得飼用復(fù)合小肽。實施例7
小肽復(fù)合物的制備方法7，包括如下步驟
1)培養(yǎng)液的制備50kg粗蛋白含量為46%的豆柏，20kg粗蛋白含量為50%的玉米蛋白粉，15kg粗蛋白含量為35%菜柏，20kg粗蛋白含量為48%的花生柏，95kg粗蛋白含量為60%的大米蛋白粉，IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，4kg鹿糖,4kg葡萄糖,用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液pH值到6. 8，121°C滅菌18分鐘；
2)小肽發(fā)酵液制備將在32°C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h后的納豆芽孢桿MiMcilliis aaiio)菌種液接入上述滅菌后的1000L培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液中菌體濃度約為5X107cfu/ml，32°C培養(yǎng)24小時后，加入鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為6. 8，加入2. 4kg中性蛋白酶(400U/g蛋白原料)，43°C繼續(xù)酶解12h，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過60目篩，得飼用復(fù)合小肽。實施例8
小肽復(fù)合物的制備方法8，包括如下步驟
40kg粗蛋白含量為46%的豆柏，15kg粗蛋白含量為50%的玉米蛋白粉，15kg粗蛋白含量為35%菜柏，20kg粗蛋白含量為48%的花生柏，95kg粗蛋白含量為60%的大米蛋白粉，IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，15kg粗蛋白含量42%的棉柏，6kg葡萄糖，用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液pH值到6. 8，121°C滅菌18分鐘；
2)小肽發(fā)酵液制備將在32°C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h后的地衣芽孢桿菌菌種液和枯草芽孢桿菌菌種液接入上述滅菌后的1000L培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液中地衣芽孢桿菌菌體濃度約為5X 107cfu/ml，枯草芽孢桿菌菌體濃度約為5X 107cfu/ml，32°C培養(yǎng)24小時后，加入鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為6. 8，然后加入4. 2kg中性蛋白酶(700U/g蛋白原料)，40°C繼續(xù)酶解12h，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過60目篩，得飼用復(fù)合小肽。實施例9
小肽復(fù)合物的制備方法9，包括如下步驟 I)培養(yǎng)液的制備將IOOkg粗蛋白含量為46%的豆柏，IOOkg粗蛋白含量為60%的大米蛋白粉、IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，8kg蔗糖，用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液PH值到6. 8，121°C滅菌18分鐘；
2)小肽發(fā)酵液制備滅菌結(jié)束，溫度降到45 °C后，加入4. 2kg中性蛋白酶(700U/g蛋白原料)，45°C酶解12h，得到小肽酶解液；將在32°C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h后的地衣芽孢桿菌菌種液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢桿菌菌體濃度約為5 10X107cfu/ml，35°C培養(yǎng)24小時后，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過40目篩，得飼用復(fù)合小肽。實施例10
小肽復(fù)合物的制備方法10，包括如下步驟
1)培養(yǎng)液的制備將IOOkg粗蛋白含量為46%的豆柏，IOOkg粗蛋白含量為60%的大米蛋白粉，IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，4kg蔗糖，4g葡萄糖，用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液pH值到6. 8，121°C滅菌18分鐘；
2)小肽發(fā)酵液制備滅菌結(jié)束，培養(yǎng)液溫度降到45°C后，加入4.2kg中性蛋白酶(700U/g蛋白原料)，45°C酶解12h，得到小肽酶解液；將在32 °C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h后的枯草芽孢桿菌菌種液接入小肽酶解液中，枯草芽孢桿菌菌體濃度約為5X 107cfu/ml，32°C培養(yǎng)24小時后得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過60目篩，得飼用復(fù)合小肽。實施例11
小肽復(fù)合物的制備方法11，包括如下步驟
1)培養(yǎng)液的制備將IOOkg粗蛋白含量為46%的豆柏，IOOkg粗蛋白含量為60%的大米蛋白粉，IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，4kg蔗糖，4g葡萄糖，用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液pH值到6. 8，121°C滅菌18分鐘；
2)小肽發(fā)酵液制備滅菌結(jié)束，培養(yǎng)液溫度降到45°C后，加入4.2kg中性蛋白酶(700U/g蛋白原料)，45°C酶解12h，得到小肽酶解液；將在32°C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h后的納豆芽孢桿菌菌種液接入小肽酶解液中，使酶解中納豆芽孢桿菌菌體濃度約為5X 107cfu/ml，32°C培養(yǎng)24小時后，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過60目篩，得飼用復(fù)合小肽。實施例12
小肽復(fù)合物的制備方法12，包括如下步驟
I)培養(yǎng)液的制備將IOOkg粗蛋白含量為46%的豆柏，IOOkg粗蛋白含量為60%的大米蛋白粉，IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，4kg蔗糖，4g葡萄糖，用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液PH值到6. 8，121°C滅菌18分鐘；
2)小肽發(fā)酵液制備滅菌結(jié)束，培養(yǎng)液溫度降到45°C后，加入2.4kg中性蛋白酶(400U/g蛋白原料)，45°C酶解12h，得到小肽酶解液；將在32 °C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h后的地衣芽孢桿菌菌種液和枯草芽孢桿菌菌種液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢桿菌菌體濃度約為5X 107cfu/ml，枯草芽孢桿菌菌體濃度約為5X 107cfu/ml，32°C培養(yǎng)24小時后，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過60目篩，得飼用復(fù)合小肽。實施例13
小肽復(fù)合物的制備方法13，包括如下步驟
1)培養(yǎng)液的制備50kg粗蛋白含量為46%的豆柏，25kg粗蛋白含量為50%的玉米蛋白粉、15kg粗蛋白含量為35%菜柏、20kg粗蛋白含量為48%的花生柏、65kg粗蛋白含量為60%的大米蛋白粉，25kg粗蛋白含量72%的馬鈴薯蛋白粉，IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，4kg蔗糖，4g葡萄糖，用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液pH值到6. 8，121。。滅菌18分鐘；
2)小肽發(fā)酵液制備滅菌結(jié)束，培養(yǎng)液溫度降到45°C后，加入4.2kg中性蛋白酶(700U/g蛋白原料)，45 °C酶解12h，得到小肽酶解液；將在32 °C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h的地衣芽孢桿菌菌種液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢桿菌菌體濃度約為5X 107cfu/ml，枯草芽孢桿菌菌體濃度約為5X 107cfu/ml，32°C培養(yǎng)24小時后，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過40目篩，得飼用復(fù)合小肽。實施例14
小肽復(fù)合物的制備方法14，包括如下步驟
1)培養(yǎng)液的制備50kg粗蛋白含量為46%的豆柏，20kg粗蛋白含量為50%的玉米蛋白粉，15kg粗蛋白含量為35%菜柏，20kg粗蛋白含量為48%的花生柏，95kg粗蛋白含量為60%的大米蛋白粉，IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，4kg鹿糖，4g葡萄糖,用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液pH值到6. 8，121°C滅菌18分鐘；
2)小肽發(fā)酵液制備滅菌結(jié)束，培養(yǎng)液溫度降到45°C后，加入4.2kg中性蛋白酶(700U/g蛋白原料)，45°C酶解12h，得到小肽酶解液；將在32°C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h后的枯草芽孢桿菌菌種液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢桿菌菌體濃度約為5X 107cfu/ml，枯草芽孢桿菌菌體濃度約為5X 107cfu/ml，32°C培養(yǎng)24小時后，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過60目篩，得飼用復(fù)合小肽。實施例15
小肽復(fù)合物的制備方法15，包括如下步驟
I)培養(yǎng)液的制備50kg粗蛋白含量為46%的豆柏，20kg粗蛋白含量為50%的玉米蛋白粉，15kg粗蛋白含量為35%菜柏，20kg粗蛋白含量為48%的花生柏，95kg粗蛋白含量為60%的大米蛋白粉，IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，4kg鹿糖，4g葡萄糖,用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液pH值到6. 8，121°C滅菌18分鐘；
2)小肽發(fā)酵液制備滅菌結(jié)束，溫度降到45°C后，加入4.2kg中性蛋白酶(700U/g蛋白原料)，45°C酶解12h，得到小肽酶解液；將在32°C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h后的納豆芽孢桿菌菌種液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢桿菌菌體濃度約為5 X IO7Cfu/ml，枯草芽孢桿菌菌體濃度約為5X 107cfu/ml，36°C培養(yǎng)24小時后，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過60目篩，得飼用復(fù)合小肽。實施例16
小肽復(fù)合物的制備方法16，包括如下步驟
1)培養(yǎng)液的制備50kg粗蛋白含量為46%的豆柏，20kg粗蛋白含量為50%的玉米蛋白粉、15kg粗蛋白含量為35%菜柏、20kg粗蛋白含量為48%的花生柏、95kg粗蛋白含量為60%的大米蛋白粉，IOOkg粗蛋白含量為65%的大豆?jié)饪s蛋白，4kg鹿糖，4g葡萄糖,用水定容到1000L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整反應(yīng)液pH值到6. 8，121°C滅菌18分鐘；
2)小肽發(fā)酵液制備.人BaciIIusIicheniformis):滅菌結(jié)束,溫度降到45°C后,加入2. 4kg中性蛋白酶(400U/g蛋白原料)，45°C酶解12h，得到小肽酶解液；將在32°C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h的地衣芽孢桿菌菌種液和枯草芽孢桿菌菌種液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢桿菌菌體濃度約為5X 107cfu/ml，枯草芽孢桿菌菌體濃度約為5X 107cfu/ml，33°C培養(yǎng)24小時后，得到小肽發(fā)酵液；
3)將小肽發(fā)酵液置于80°C烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，過60目篩，得飼用復(fù)合小肽。一、飼用復(fù)合小肽樣品的水解度測定
I原理蛋白質(zhì)的水解度(Degree of hydrolysis, Z)//)的基本定義代表蛋白質(zhì)在水解過程中，肽鍵被裂解的程度或百分比，j//=(被水解的肽鍵數(shù)/原料中的總肽鍵數(shù))X 100%。假設(shè)蛋白飼料中蛋白質(zhì)分子未被水解時肽鏈長度(即肽中的氨基酸平均數(shù)目)為PCL0，則肽鍵總數(shù)目PCL0-1，當(dāng)被蛋白酶切斷η-i個肽鍵而水解成η個肽時，則蛋白質(zhì)的水解度DH與肽鍵總數(shù)PCL0-1和切開肽鍵數(shù)(η-i)關(guān)系表示如以下公式DH=(n — I)/(PCLO 一 1)X100%因為=PCLO = ηXPCL (水解后小肽平均鏈長度)DH= (PCLO/ PCL — I)/ (PCL0 — 1)X100%=(I/ PCL - I/ PCLO)/ (1-1/ PCL0)X100%。由于豆柏、玉米蛋白粉、麩皮中蛋白質(zhì)分子量都較大，水解程度較高，這時可以認(rèn)為PCLO C ，那么，水解度繼轉(zhuǎn)化為:/^=1/PCLX 100%小肽的平均鏈長即肽鏈的平均氨基酸殘基數(shù)。根據(jù)李培駿等(2006)研究總結(jié)，小肽的平均鏈長 I/DH X 100%
2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
2. I完全水解蛋白液的制備取菜籽蛋白100 mg，放入特制的反應(yīng)瓶，加入100 ml 6mo I鹽酸，擰緊瓶蓋，放入130°C烘箱中水解24 h，冷卻，過濾，濾液真空濃縮至O. 5 ml左右，加蒸餾水90 ml，用I molNaOH中和至中性(pH6)，定容至100 ml (參考郭興鳳，蛋白質(zhì)水解度的測定)。2. 2吸光度值測定取完全水解液0. I πιΓ . O ml于25 ml比色管中，蒸餾水稀釋至 4. O ml，加 pH=8 的 PBS 緩沖溶液(O. 2 M Na2HPO4,94. 7 ml 與 O. 2M NaH2PO4, 5. 3ml 合并，混勻)1. O ml,卻三酮溶液I. O ml,混勻,沸水浴加熱15 min,冷卻，蒸懼水稀釋至25 ml,570 nm測光密度(水作參比)。另取100 mg蛋白，加水100 mL，振蕩均勻后過濾，取相應(yīng)體積的濾液，按上述方法測光密度值。相同體積樣品的光密度之差與蛋白質(zhì)量做工作曲線，取線性部分做標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得已水解的蛋白質(zhì)的質(zhì)量(X，mg)對所測溶液的吸光度值(yi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表I和圖I )，求得回歸方程Y1=O. 0003x+0. 0048，R2=O. 9990 ;蛋白質(zhì)水解度(DH)=已水解的蛋白質(zhì)的質(zhì)量/總蛋白質(zhì)量X 100% ;小肽的平均鏈長 I/DHX 100%。
權(quán)利要求
1.一種飼用復(fù)合小肽的制備方法，包括如下步驟 1)將蛋白原料、碳源和水配制成培養(yǎng)液，滅菌； 2)將芽孢菌接種到滅菌后的培養(yǎng)液中，30 37°C下振蕩培養(yǎng)18 30h后，加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，繼續(xù)酶解6 12h，得到小肽發(fā)酵液；或者是往培養(yǎng)液中加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，酶解6 12h后，接種芽孢菌，30 37°C下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)18 30h，得到小肽發(fā)酵液； 3)將小肽發(fā)酵液干燥，得到飼用復(fù)合小肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的飼用復(fù)合小肽的制備方法，其特征在于所述蛋白原料為豆柏、大米蛋白粉、小麥蛋白粉、玉米蛋白粉、棉柏、花生柏、馬鈴薯蛋白、菜柏、大豆?jié)饪s蛋白中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的飼用復(fù)合小肽的制備方法，其特征在于所述碳源為葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的飼用復(fù)合小肽的制備方法，其特征在于每IOOml培養(yǎng)液中，含有蛋白原料20 30g、碳源O. I lg。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的飼用復(fù)合小肽的制備方法，其特征在于所述芽孢菌為地衣芽抱桿菌(Baci I Ius Iicheniformi S、或/和枯草芽抱桿菌iBcillus subtil is)或/和納豆芽抱桿菌natto)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的飼用復(fù)合小肽的制備方法，其特征在于所述芽孢菌的接種濃度為5 X IO7 IOX 107cfu/ml培養(yǎng)液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的飼用復(fù)合小肽的制備方法，其特征在于所述蛋白酶為中性蛋白酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或7所述的飼用復(fù)合小肽的制備方法，其特征在于所述蛋白酶的加入量為400 700U/g蛋白原料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種飼用復(fù)合小肽的制備方法，包括如下步驟1)將蛋白原料、碳源和水配制成培養(yǎng)液，滅菌；2)將芽孢菌和蛋白酶接到滅菌后的培養(yǎng)液中，酶解發(fā)酵或發(fā)酵酶解，得到小肽發(fā)酵液；3)將小肽發(fā)酵液干燥，得到飼用復(fù)合小肽。本發(fā)明方法制備得到的復(fù)合小肽分子量主要集中在238～568Da，約2～5肽。小肽得率占蛋白質(zhì)含量的35%以上。復(fù)合小肽風(fēng)味獨(dú)特、口感好，可用作飼料添加劑，提高動物動物體的生產(chǎn)性能。
文檔編號A23K1/16GK102823731SQ20121027294
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月2日
發(fā)明者潘軍, 張偉強(qiáng), 王瑞平, 蘇全, 馬春平 申請人:廣州市博善生物飼料有限公司