專利名稱：防治煙草土傳真菌病害的木霉固體顆粒劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥，更具體地說，本發(fā)明涉及一種防治煙草土傳真 菌病害的生物制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
煙草土傳病害(soil borne tobacco diseases)是煙草病害中危害較為嚴(yán)重的 一大類病害，這類病害病原能在植煙土壤中存活、繁殖，并侵染根、根脛部， 或通過根、根脛部侵染，引起根、根脛部病變，或全株性病變，其發(fā)生特點(diǎn) 是積年流行、逐年加重。這些土傳病害中真菌性土傳病害發(fā)生較多，危害較 重，有些成為煙草農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟(jì)病害。這類真菌性病害有煙草黑脛 病(尸/zj^op/^/zora/ aros7Y/ca var. "/co"'a"ae)、 猝〈到病(尸;^/z/m附spp.)、 立才古病 (朋/zoctomV^o/flm〕等。其中，苗期為害較重的土傳病害是猝倒病，其病原主 要為瓜果腐霉(i^/z/wm a/ /za"/(i^wa^w )等腐霉屬真菌；大田期較為重要 的病害有煙草黑脛病。這兩種病害的病原已高度適應(yīng)了煙株根部環(huán)境，致使
煙株整個(gè)大田期均可感病。 一般感病越早，病害損失越大?，F(xiàn)有技術(shù)采用抗 病品種及輪作為主的綜防措施控制'，但效果并不理想。
煙草主要土傳真菌病害的生物防治已引起國內(nèi)外的高度重視。當(dāng)前進(jìn)展 最快的是以木霉(7Hcto^mzaspp.)研制的生防制劑用于煙草黑脛病、立枯 病、猝倒病的生物防治。
木霉菌是一類理想的生防菌，在植物病害生物防治上占有非常重要的地 位。目前在國內(nèi)外注冊(cè)的商品生防制劑已達(dá)十幾種。近十幾年來，木霉生防 制劑的生產(chǎn)工藝日臻完善，菌劑專利技術(shù)明顯上升。釆用液體深層發(fā)酵得到 的芽生孢子壽命短且生活力弱；固體培養(yǎng)可得到貯存期相對(duì)較長(zhǎng)的分生孢 子，但生產(chǎn)周期長(zhǎng)、菌劑含孢量低。最近幾年，液固兩相法制備木霉菌高孢 粉技術(shù)的成熟大大增強(qiáng)了木霉菌的實(shí)用性進(jìn)程。但液固兩相法菌劑生產(chǎn)中， 固體培養(yǎng)的質(zhì)量不容易控制，阻礙了木霉菌劑的規(guī)?；a(chǎn)。因此，木霉制 劑的工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化、商品化生產(chǎn)問題還有待進(jìn)一步探索。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種有效、無毒、 安全、無殘留、使用簡(jiǎn)便的防治煙草土傳真菌病害的木霉固體顆粒劑。同 時(shí)，本發(fā)明還提供該木霉固體顆粒劑的制備方法。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
*除非另有說明，本發(fā)明中所釆用的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。 本發(fā)明提供了一種防治煙草土傳真菌病害的木霉固體顆粒劑。
本發(fā)明的生防菌株其分類命名為哈茨木霉(7Hc/zocfem^ /wra'a"wm) TR13,保藏編號(hào)為CGMCCNo.2849。
本發(fā)明的生產(chǎn)菌株哈茨木霉(7Hc/7o&rwa /wCa"Mw) TR13 ，分離自 云南昆明根際土壤，經(jīng)培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)測(cè)定，該生防真菌為哈茨木霉 (7h'c/zod^wa/za/^am^)的一個(gè)新菌株TR13。該菌株具有以下特征①菌 落在PDA平板上生長(zhǎng)速度在1.5mm/h以上，成同心圓生長(zhǎng)，絨毛狀，初生 菌絲白色，老熟時(shí)暗綠色。②光學(xué)顯微觀察，孢子梗常常2 3個(gè)一組，環(huán) 狀排列，直角伸出，呈樹狀。孢子梗短，基部變細(xì)，中間膨大，長(zhǎng)3.0~4.3pm ， 中間寬6.5~8.0|am ，基部寬2.0 3.2pm。瓶梗2.0-2.8 jumx3.5~5.5pm,分生 孢子球形，短倒卵形，基部平截，孢子大小2.5 3.5 pmx2.5 3.0 pm。③抑 菌能力強(qiáng)，可產(chǎn)生(3-l，3葡聚糖酶、纖維素酶，對(duì)黑脛病(戶/^c^/^ora ; ara57'ft'ca var. m'cof/a"ae )、立枯病(A/ /zoctow'a so/am')、猝倒病(尸jKf/^"m spp.，其中以/y/n^m op/ww'^fermWww為主)等煙草土傳真菌病原有顯著的 抑制作用，主要表現(xiàn)為重寄生。④定殖能力強(qiáng)，可在煙草的根際、根內(nèi)定 殖，促進(jìn)煙草幼苗生長(zhǎng)。
本發(fā)明通過哈茨木霉(7Hc/2ocfer附a /2jz/a"wm) TR13菌株的菌種復(fù)壯， 菌種制備，液體發(fā)酵培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng)，制備木霉固體顆粒劑，將其運(yùn) 用于煙草上，測(cè)定其對(duì)煙草土傳真菌病的防治效果。
本發(fā)明提供了一種木霉固體顆粒劑的制備方法，該方法釆用以下步驟
l.菌種復(fù)壯
由于木霉菌株是一種兼性寄生的生防菌株，人工培養(yǎng)的過程往往是營養(yǎng) 類似腐生的一種生活方式，而且生產(chǎn)菌株傳代代數(shù)一般較多，使木霉菌株的 寄生能力下降，制劑對(duì)病害的防治能力減弱。為保持制劑的防效穩(wěn)定性，必須對(duì)生產(chǎn)的菌種進(jìn)行復(fù)壯。 具體操作如下
1) 菌種的活化
挑取TR13菌種上少量的孢子粉，點(diǎn)接于新制備、表面無明顯冷凝水的
PDA平板上，27.5土rC光照培養(yǎng)2 3天。待長(zhǎng)出菌落后，切取生長(zhǎng)較快的 菌絲塊(盡可能將多余的培養(yǎng)基塊削去)，再轉(zhuǎn)接于PDA平板，27.5 土rC光 照培養(yǎng)2 3天，剔除污染的平板，選擇菌絲生長(zhǎng)較快的平板繼續(xù)培養(yǎng)，每曰 定時(shí)觀察菌絲的生長(zhǎng)與產(chǎn)孢狀況，選擇生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)孢量大的平板培養(yǎng)物 作為復(fù)壯的出發(fā)菌株。
2) 平板對(duì)峙培養(yǎng)
挑取新鮮的復(fù)壯出發(fā)菌株孢子粉點(diǎn)接于PDA平板的一側(cè)，距離3 4cm 的另 一側(cè)接種(J)4mm新鮮的立枯絲核菌(i /2/zoctom'a w/am')( —種生長(zhǎng)速 度較快的土傳真菌病害病原)菌絲塊。接種后的平板27.5土rC光照培養(yǎng)5 7 天，直至復(fù)壯的出發(fā)菌株的菌絲越過立枯絲核菌菌絲，并在其上產(chǎn)孢為止。 3)菌種的分離、純化
挑取對(duì)峙培養(yǎng)中的復(fù)壯出發(fā)菌株在立枯絲核菌菌落上產(chǎn)生的孢子于 PDA平板上劃線分離、純化，選擇生長(zhǎng)快的單菌落轉(zhuǎn)接于PDA平板進(jìn)行純 培養(yǎng)，再在這些純培養(yǎng)物中挑選產(chǎn)孢快、產(chǎn)孢量大的培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接PDA斜 面，產(chǎn)孢后的菌種即為復(fù)壯的菌種。 2.菌種的制備
菌種的好壞直接影響到發(fā)酵的各個(gè)工序，有質(zhì)和量的要求。質(zhì)的要求包 括①菌種無雜菌污染。顯微觀察為菌體形態(tài)正常，形體較一致；②菌種 應(yīng)處于相同的生理狀態(tài)，以期菌種能充分地生長(zhǎng)和繁殖，進(jìn)行同步生長(zhǎng)。供 生產(chǎn)用的斜面菌種在冰箱內(nèi)保存最多不超過7天。量的要求包括①菌種 的含菌量。菌種的種子液含孢子量不低于106個(gè)/1111。②菌種的接種量。需 通過試驗(yàn)來確定，要考慮盡量縮短發(fā)酵周期、控制繁殖代數(shù)。將種子液的體 積與發(fā)酵液的體積之比控制在一定的范圍內(nèi)。
菌種的制備首先從保存的菌種(如密封斜面試管)轉(zhuǎn)接PDA平板進(jìn)行 活化2次，再轉(zhuǎn)接搖瓶，然后以一定的比例接種種子罐，最后移種至發(fā)酵生 產(chǎn)罐。具體步驟如下(1) 平板菌種的培養(yǎng)
按無菌操作從活化的平板菌種中，挑取2 4mmx2 4mm的菌絲塊，3~5 點(diǎn)點(diǎn)接于PDA平板上，置27.5土rC、光照培養(yǎng)5 7天。在接種后培養(yǎng)的過 程中注意每天定時(shí)檢查平板，如有污染或生長(zhǎng)異常的培養(yǎng)物應(yīng)及時(shí)淘除。平 板菌種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為無雜菌污染，產(chǎn)孢快、產(chǎn)孢量大，顏色深綠，孢子大 小較一致，輪廓清晰，混有少量菌絲。 .
(2) 液體菌種的制備
按無菌操作從制備的平板菌種中，挑取6 8塊2 4mmx 2~4mm的菌 絲塊，加到裝有滅菌PD液的三角瓶(裝液量容積比為30%~50%)中，27.5 土1。C、光照、150r/m培養(yǎng)2天。液體菌種的標(biāo)準(zhǔn)為無雜菌，菌體處于旺 盛生長(zhǎng)期，菌絲體濃稠。
3. 液體發(fā)酵培養(yǎng)
將液體菌種以2%~5%的體積比接入盛有液體發(fā)酵培養(yǎng)基SDIS (配 方為大豆蛋白胨10g、蔗糖10g、酵母粉2g、磷酸二氫鉀lg、硫酸 鎂0.3g、自來水1000ml、花生油0.1%、消泡劑0.01%、 pH自然。) 的發(fā)酵罐中，28土rC，以培養(yǎng)基:空氣為1:1.6-2.2的體積比通氣，轉(zhuǎn)速 120轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，培養(yǎng)36 42小時(shí)。以液體菌絲乳白色、粘稠，菌絲體 干重5mg/mL以上為合格發(fā)酵液。
4. 固體發(fā)酵培養(yǎng)
(1) 接種
將合格的發(fā)酵液按20%~30%的質(zhì)量比接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基RS[配方 為稻殼卯％, 1 3mm的粗麥麩10%,用礦質(zhì)無機(jī)鹽(硫酸氨2g,磷酸二 氫鉀0.5g， 磷酸二氫鈉0.5，硫酸鎂lg，氯化鉤0.5g, 1000ml自來水) 溶液濕潤(rùn)，使其含水量為25%~30%。]中。接種時(shí)，邊加發(fā)酵液邊攪拌，至 固體物料含水量50%~60%。
(2) 裝盤
用底部裝有l(wèi)-2mm的篩網(wǎng)、深4 6cm的不銹鋼淺盤盛裝，再將淺盤置 于培養(yǎng)架上。
(3) 培養(yǎng)
黑暗培養(yǎng)淺盤中的物料在28士rC、相對(duì)濕度90%~95%的黑暗條件下培養(yǎng)2 3天，檢查物料，發(fā)現(xiàn)物料內(nèi)外布滿白色菌絲為合格。
光照培養(yǎng)在每層培養(yǎng)架的頂部加光，24小時(shí)光照，在溫度為35土rC、 相對(duì)濕度50% 60%、對(duì)流通風(fēng)的條件下培養(yǎng)2 3天，每12小時(shí)翻盤1次， 檢查顆粒狀物料布滿綠色分生孢子，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)每克干物料分生孢子含 量在109個(gè)以上的為合格。
5.制劑化
合格固體培養(yǎng)物45± rC干燥12-24小時(shí)，加質(zhì)量比10%~15%的硅藻 土 (保護(hù)劑)、質(zhì)量比0.1°/。~0.2%的敵克松原粉(增效劑)，混勻，粉碎 成粒徑為0.1 0.2mm的顆粒，裝袋。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)
1. 釆用改良的液固兩相一步法進(jìn)行生產(chǎn) ' 生產(chǎn)菌株在液體發(fā)酵中生長(zhǎng)菌絲，在固體載體中產(chǎn)孢，實(shí)現(xiàn)液固兩相一
步法生產(chǎn)，克服以往固體培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、容易污染的缺點(diǎn)，液固培養(yǎng)時(shí)間縮短 3~5天。
培養(yǎng)過程分為2個(gè)階段第一階段為液體發(fā)酵階段，主要生產(chǎn)適合固體 培養(yǎng)的菌漿；第二階段為固體培養(yǎng)階段，主要是使菌漿附著在載體的表面， 并在合適的條件下產(chǎn)孢，菌絲生長(zhǎng)的營養(yǎng)主要來自液體培養(yǎng)殘存的營養(yǎng)成 分。
2. 生產(chǎn)流程可操作性強(qiáng)、重現(xiàn)率高、成功率高
菌種培養(yǎng)時(shí)，接種量大，能使生產(chǎn)的菌種迅速占領(lǐng)基質(zhì)，形成絕對(duì)優(yōu)勢(shì) 的微生物群體。液體培養(yǎng)時(shí)，由于本法采用的接種體為處于同一生理水平的 旺盛生長(zhǎng)期菌絲體，種子罐可實(shí)現(xiàn)同步生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)基本上呈現(xiàn)出旺盛生長(zhǎng)。 固體培養(yǎng)時(shí)，菌絲不利用固體物料中的營養(yǎng)，可阻斷污染。
對(duì)設(shè)計(jì)出的液固兩相一步法生產(chǎn)流程，進(jìn)行了多次試驗(yàn)，證明了液固兩 相一步法生產(chǎn)流程可操作性強(qiáng)、重現(xiàn)率高、成功率高(可達(dá)100%),在加強(qiáng) 在線檢測(cè)的前提下可完全杜絕污染，因此，此流程對(duì)于木霉菌固體顆粒劑的 工廠化生產(chǎn)來說是切實(shí)可行的。
3. 液體培養(yǎng)采用富營養(yǎng)化培養(yǎng)基
生產(chǎn)菌株在該培養(yǎng)基(SDIS培養(yǎng)基)生長(zhǎng)較快，不會(huì)形成對(duì)菌絲不利 的高滲液體，且菌絲處于旺盛生長(zhǎng)期時(shí)培養(yǎng)液還含有殘余的營養(yǎng)，可滿足固體載體上菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢的營養(yǎng)需求。
4. 固體培養(yǎng)基通透性強(qiáng)
固體培養(yǎng)基的主要原料為谷殼，能大大增強(qiáng)固體培養(yǎng)基的通透性，利于 滅菌，也有利于培養(yǎng)好氣的木霉菌絲，還有利于翻盤、光照產(chǎn)孢。
5. 固體培養(yǎng)分菌絲生長(zhǎng)、強(qiáng)制產(chǎn)孢2個(gè)階段
黑暗培養(yǎng)適溫、高濕、黑暗，有利于菌絲在固體基質(zhì)中附著、生長(zhǎng)；光 照培養(yǎng)高溫、低濕、通風(fēng)、透光，為木霉菌絲產(chǎn)孢創(chuàng)造了良好的條件。
保藏生物材料的說明 本發(fā)明的生防菌株其分類命名為哈茨木霉 (7Wc/206few^ /wn/a"^w)
TR13,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址
北京巿朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏曰期2009年01月
06日；保藏登記入冊(cè)的編號(hào)CGMCCNo.2849。


圖1是本發(fā)明菌種生產(chǎn)的流程示意圖2是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)室小試的工藝流程示意圖3是本發(fā)明車間中試的工藝流程示意圖。
具體實(shí)施例方式
通過下面給出的具體實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，可以進(jìn)一步清楚地了解本發(fā) 明。但它們不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。 實(shí)施例1 一一實(shí)驗(yàn)室小試
工藝流程圖中從斜面菌種至搖瓶菌漿為實(shí)驗(yàn)室液體菌漿制備階段，菌漿 接入固體后為作坊式生產(chǎn)過程。具體如下 l.平板菌種的培養(yǎng)
按無菌操作從活化的平板菌種中，挑取已經(jīng)大量產(chǎn)孢的菌絲，3~5點(diǎn)點(diǎn) 接于平板上，置27.5士rC、光照培養(yǎng)5 7天。在接種后培養(yǎng)的過程中注意每 天定時(shí)檢查平板，如有污染或生長(zhǎng)異常的培養(yǎng)物應(yīng)及時(shí)淘除。為避免由于光
10照不均而導(dǎo)致產(chǎn)孢不一致的培養(yǎng)物出現(xiàn)，可減少堆放層數(shù)，如2~3層培養(yǎng)皿， 如條件容許可擺放一層。
2. 液體菌種的制備
將燒紅的接種刀冷卻，按無菌操作從制備的平板菌種中，挑取6 8塊 2~4mm x 2~4mm的菌絲塊，加到裝有300ml滅菌PD液的500ml三角瓶中， 27.5土rC光照、150r/m培養(yǎng)2天。'通常情況下，搖瓶用菌種盡可能按時(shí)分批制備。
3. 液體發(fā)酵培養(yǎng)
將液體菌種以2% 5%的體積比接入盛有液體發(fā)酵培養(yǎng)基SDIS (配 方為大豆蛋白胨10g、蔗糖10g、酵母粉2g、磷酸二氫鉀lg、硫酸 鎂0.3g、自來水1000ml、花生油0.1%、消泡劑0.01%、 pH自然。) 的三角瓶中，28土1。C， 150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)36 42小時(shí)。
4. 固體發(fā)酵培養(yǎng) 4.1接種
將合格的發(fā)酵液按20%~30%的質(zhì)量比接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基RS[配方 為稻殼90%， l~3mm的粗麥麩10%,用礦質(zhì)無機(jī)鹽(硫酸氨2g,磷酸二 氫鉀0.5g, 磷酸二氫鈉0.5，硫酸鎂lg，氯化鉤0.5g， 1000ml自來水) 溶液濕潤(rùn)，使其含水量為25%~30%。]中。接種時(shí)，邊加發(fā)酵液邊人工攪拌， 至手抓物料用力捏，指頭縫剛出水滴出為止(含水量50%~60%)。
4.2裝盤
用底部裝有l(wèi) 2mm的篩網(wǎng)、深4 6cm的不銹鋼淺盤盛裝，再將淺盤置 于培養(yǎng)架上。 4.3培養(yǎng)
黑暗培養(yǎng)淺盤中的物料在28土rC、相對(duì)濕度90% 95%的黑暗條件下 培養(yǎng)2 3天。為保持濕度、避免交叉污染，可用消毒的塑料密封培養(yǎng)架。
光照培養(yǎng)在每層培養(yǎng)架的頂部加光，加掛40W日光燈管，24小時(shí)光 照，在溫度為35士rC、相對(duì)濕度50%~60% (調(diào)節(jié)通風(fēng)口大小實(shí)現(xiàn))、對(duì)流 通風(fēng)的條件下培養(yǎng)2 3天，每12小時(shí)翻盤1次。
5. 制劑化
合格固體培養(yǎng)物45士rC恒溫烘箱干燥12~24小時(shí)，加質(zhì)量比10%~15%的硅藻土 (保護(hù)劑)、質(zhì)量比0.1%~0.2%的敵克松原粉(增效劑)，混勻，
粉碎成粒徑為0.1 0.2mm的顆粒，質(zhì)檢，裝袋。即得本發(fā)明的固體顆粒劑。 實(shí)施例2 --車間中試
車間中試工藝是在實(shí)驗(yàn)室小試基礎(chǔ)上改進(jìn)而成的，其工藝步驟如下 ①平板菌種的培養(yǎng)、②液體菌種的制備同實(shí)施例1。
③ 液體發(fā)酵培養(yǎng)
將液體菌種以2%~5%的體積比接入盛有液體發(fā)酵培養(yǎng)基SDIS的發(fā) 酵罐中，28土rC，以培養(yǎng)基:空氣為1:1.6~2.2的體積比通氣，轉(zhuǎn)速120 轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，培養(yǎng)36 42小時(shí)。
④ 固體發(fā)酵培養(yǎng)
接種將合格的發(fā)酵液按20y。 30。/。的質(zhì)量比接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基RS 中。接種時(shí)，用經(jīng)過蒸汽滅菌的攪拌機(jī)，邊加發(fā)酵液邊攪拌，至手抓物料用 力捏，指頭縫剛出水滴出為止(含水量50% 60%)。
裝盤用底部裝有1 2mm的篩網(wǎng)、深4~6cm的不銹鋼淺盤盛裝，再將 淺盤置于培養(yǎng)架上。
黑暗培養(yǎng)淺盤中的物料在28士rC、相對(duì)濕度90% 95%的黑暗條件下 培養(yǎng)2 3天。為保持濕度，可使用加濕器。
光照培養(yǎng)在每層培養(yǎng)架的頂部加光，加掛40W日光燈管，24小時(shí)光 照，在溫度為35士rC、相對(duì)濕度50% 60%(加濕器、除濕機(jī)、強(qiáng)制通風(fēng)等 共同實(shí)現(xiàn))、對(duì)流通風(fēng)的條件下培養(yǎng)2 3天，每12小時(shí)翻盤1次。
制劑化
合格固體培養(yǎng)物45士rC振動(dòng)流化床干燥4 6小時(shí)，加質(zhì)量比10°/。~15% 的硅藻土 (保護(hù)劑)、質(zhì)量比0.1%~0.2%的敵克松原粉(增效劑)，混句， 粉碎成粒徑為0.b0.2mm的顆粒，質(zhì)檢，裝袋。即得本發(fā)明的固體顆粒劑。
應(yīng)用實(shí)施例l
一一苗期防治煙草猝倒病的效果試驗(yàn) 1.材料與方法 1.1材料
試驗(yàn)藥劑本發(fā)明固體顆粒劑、50%多菌靈。試驗(yàn)煙草品種K326
試驗(yàn)地點(diǎn)云南省煙草科學(xué)研究所大棚溫室漂浮育苗池。 1.2試驗(yàn)方法
種子包衣分別按種子包衣劑1%的比例加入本發(fā)明固體顆粒劑、50% 多菌靈，對(duì)煙草品種K326的裸種進(jìn)行包衣，以不加防治猝倒病藥劑的包衣 種子作空白對(duì)照，共形成3種類型的包衣種子。
帶病育苗基質(zhì)的制備瓜果腐霉(煙草猝倒病的主要病原)用l~3mm 的麥麩固體培養(yǎng)基28士1。C培養(yǎng)10 15天，倒出，搗碎，自然晾干，以2% 的質(zhì)量比與消毒的育苗基質(zhì)混勻，即可制備得到帶猝倒病菌的育苗基質(zhì)。
試驗(yàn)處理將制備得到帶猝倒病菌的育苗基質(zhì)裝入漂浮育苗盤，再分別 播種3種類型的包衣種子，播種的每種類型包衣種子形成l個(gè)試驗(yàn)處理，共 3個(gè)處理。每處理播種1盤(約280粒包衣種子)，3次重復(fù)，盤在同一育苗 池隨機(jī)排列。
病情調(diào)查播種完畢，按正常漂浮育苗措施育苗，至大十字期調(diào)查，主 要調(diào)查發(fā)病率，計(jì)算相對(duì)防治效果。 2.結(jié)果與分析
苗期防治煙草猝倒病試驗(yàn)效果見表1，從表1可看出本發(fā)明菌劑對(duì)煙草 猝倒病的防治效果達(dá)75.36%,略次于50%多菌靈78.58%的防治效果，但相 差不明顯。因此，本發(fā)明固體顆粒劑可以作為煙草猝倒病的防治藥劑使用。
應(yīng)用實(shí)施例2
一一大田期防治煙草黑脛病的效果試驗(yàn) 1.材料與方法 1.1材料
試驗(yàn)藥劑本發(fā)明固體顆粒劑、48%甲霜靈錳鋅。 試驗(yàn)煙草品種紅花大金元
表l.苗期防治煙草猝倒病試驗(yàn)效果
調(diào)査株數(shù)發(fā)病株數(shù)發(fā)病率(％) 相對(duì)防治效果(％)
本發(fā)明固體顆粒劑 50%多菌靈 空白對(duì)照試驗(yàn)地點(diǎn)云南省煙草科學(xué)研究所研和試驗(yàn)基地。
1.2試驗(yàn)方法
有機(jī)藥肥的制備本發(fā)明固體顆粒劑與腐熟的有機(jī)肥(不含人工制造的 化學(xué)肥料)以質(zhì)量1:10的比例混勻，48%甲霜靈錳鋅與同樣腐熟的有機(jī)肥以 lg/kg的比例混勻，分別形成2種有機(jī)藥肥。
黑脛病菌谷的制備按煙草品種抗病性鑒定YC/T41-1996行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中 所述的方法制備黑脛病菌谷。
試驗(yàn)處理將制備得到的2種有機(jī)藥肥，在煙苗移栽澆定根水時(shí)，按40g/ 株施于移栽煙苗的四周，松土培墑。以同樣腐熟的有機(jī)肥作空白對(duì)照，共形 成3個(gè)處理，每處理植煙50 80株。株行距設(shè)置、施肥、管理與當(dāng)?shù)責(zé)煵萆?產(chǎn)推廣要求相同。各處理形成的小區(qū)隨機(jī)排列，3次重復(fù)。
接種菌谷有機(jī)藥肥施用后20天，按煙草品種抗病性鑒定YC/T41-1996 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中所述的方法接種黑脛病菌谷。接種后，灌半溝水保濕2 3天。
病情調(diào)查接種黑脛病菌谷當(dāng)天按煙草病害調(diào)查的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 39-1996進(jìn)行一次病情基數(shù)調(diào)查，40天再調(diào)查一次病情，計(jì)算病情指數(shù)、 防效。
2.結(jié)果與分析
大田期防治煙草黑脛病試驗(yàn)效果見表2，從表2可看出本發(fā)明菌劑對(duì)煙 草黑脛病的防治效果達(dá)78.91%，略次于48%甲霜靈錳鋅82.50%的防治效 果，但相差不明顯。因此，本發(fā)明固體顆粒劑可以作為煙草黑脛病的防治藥 劑使用。
表2.大田期防治煙草黑脛病試驗(yàn)效果
病情基數(shù) 40天的病指增加的病指
相對(duì)防治效果(％)
本發(fā)明固體顆粒劑 0 48%甲霜靈錳鋅 0 空白對(duì)照 0
1權(quán)利要求
1.一種防治煙草土傳真菌病害的木霉固體顆粒劑，其特征在于該菌劑的生產(chǎn)菌株為哈茨木霉(Trichoderma harzianum)TR13，保藏號(hào)CGMCC No.2849。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的木霉固體顆粒劑，其特征在于(1) 所述菌株的培養(yǎng)基配方如下①試管斜面培養(yǎng)基PDA配方為新鮮馬鈴 薯200g(煮汁，過濾去殘?jiān)魹V液)，蔗糖20g,瓊脂I7 20g，蒸餾 水1000ml, pH自然；②液體發(fā)酵培養(yǎng)基SDIS配方為大豆蛋白胨10g、 蔗糖10g、酵母粉2g、磷酸二氫鉀lg、硫酸鎂0.3 g、自來水1000ml、 花生油0.1%、消泡劑0.01%、 pH自然；③固體發(fā)酵培養(yǎng)基.RS配方為 稻殼90%， 1 3mni的粗麥麩10%，用礦質(zhì)無機(jī)鹽(硫酸氨2g， 磷酸二 氫鉀0.5g, 磷酸二氫鈉0.5，硫酸鎂lg,氯化鈣0.5g, 1000ml自來水) 溶液濕潤(rùn)，使其含水量為25%~30%; (2)其菌劑生產(chǎn)釆用液固兩相一 步法進(jìn)行，即液體上生產(chǎn)菌絲、載體上產(chǎn)孢。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的木霉固體顆粒劑的制備方法，其特征 在于包括以下步驟(1) 菌種復(fù)壯；(2)菌種的制備；(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)；(4)固體發(fā)酵 培養(yǎng)；(5)制劑化。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的木霉固體顆粒劑的制備方法，其特征在于， 所述的菌種復(fù)壯是采用以下步驟(1)菌種的活化挑取TR13菌種上少量的孢子粉，點(diǎn)接于新制備、表面無明顯冷凝水的 PDA平板上，27.5士rC光照培養(yǎng)2 3天；待長(zhǎng)出菌落后，切取生長(zhǎng)較快的 菌絲塊(盡可能將多余的培養(yǎng)基塊削去)，再轉(zhuǎn)接于PDA平板，27.5 土rC光 照培養(yǎng)2 3天，剔除污染的平板，選擇菌絲生長(zhǎng)較快的平板繼續(xù)培養(yǎng)，每日 定時(shí)觀察菌絲的生長(zhǎng)與產(chǎn)孢狀況，選擇生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)孢量大的平板培養(yǎng)物 作為復(fù)壯的出發(fā)菌株；(2) 平板對(duì)峙培養(yǎng)挑取新鮮的復(fù)壯出發(fā)菌株孢子粉點(diǎn)接于PDA平板的一側(cè)，距離3 4cm 的另 一側(cè)接種04mm新鮮的立枯絲核菌菌絲塊；接種后的平板27.5 ± 1 。C光照培養(yǎng)5 7天，直至復(fù)壯的出發(fā)菌株的菌絲越過立枯絲核菌的菌絲，并在其上產(chǎn)孢為止；(3)菌種的分離、純化挑取對(duì)峙培養(yǎng)中的復(fù)壯出發(fā)菌株在立枯絲核菌菌落上產(chǎn)生的孢子于PDA平板上劃線分離、純化，選擇生長(zhǎng)快的單菌落轉(zhuǎn)接于PDA平板進(jìn)行純 培養(yǎng)，再在這些純培養(yǎng)物中挑選產(chǎn)孢快、產(chǎn)孢量大的培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接PDA斜 面，產(chǎn)孢后的菌種即為復(fù)壯的菌種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的木霉固體顆粒劑的制備方法，其特征在于，所述的菌種的制備是采用以下步驟(1) 平板菌種的培養(yǎng)按無菌操作從活化的平板菌種中，挑取2 4mmx2 4mm的菌絲塊，3~5 點(diǎn)點(diǎn)接于平板上，置27.5土rC、光照培養(yǎng)5 7天。在接種后培養(yǎng)的過程中 注意每天定時(shí)檢查平板，如有污染或生長(zhǎng)異常的培養(yǎng)物應(yīng)及時(shí)淘除；平板菌 種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為無雜菌污染，產(chǎn)孢快、產(chǎn)孢量大，顏色深綠，孢子大小較 一致，輪廓清晰，混有少量菌絲；(2) 液體菌種的制備按無菌操作從制備的平板菌種中，挑取6 8塊2 4mmx 2~4mm的菌 絲塊，加到裝有滅菌PD液的三角瓶中，裝液量容積比為30% 50%， 27.5± 1°C、光照、150r/m培養(yǎng)2天；液體菌種的標(biāo)準(zhǔn)為無雜菌，菌體處于旺盛 生長(zhǎng)期，菌絲體濃稠。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的木霉固體顆粒劑的制備方法，其特征在于， 所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)是釆用以下步驟(1 )將液體菌種以2%~5%的體積比接入盛有液體發(fā)酵培養(yǎng)基SDIS 的發(fā)酵罐中；(2)在28土rC下，以培養(yǎng)基:空氣為1:1.6 2.2的體積比 通氣，轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，培養(yǎng)36 42小時(shí)；以液體菌絲乳白色、粘 稠，菌絲體干重5mg/mL以上為合格發(fā)酵液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的木霉固體顆粒劑的制備方法，其特征在于， 所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)是釆用以下步驟(1)接種將合格的發(fā)酵液按20%~30%的質(zhì)量比接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基RS[配方為稻殼90%, l~3mm的粗麥麩10%,用礦質(zhì)無機(jī)鹽(硫酸氨2g，磷酸二 氫鉀0.5g, 磷酸二氫鈉0.5,硫酸鎂lg,氯化鈣0.5g, 1000ml自來水) 溶液濕潤(rùn)，使其含水量為25% 30%。]中。接種時(shí)，邊加發(fā)酵液邊攪拌，至 固體物料含水量50%~60%; (2)裝盤用底部裝有1 2mm的篩網(wǎng)、深4 6cm的不銹鋼淺盤盛裝，再將淺盤置于培養(yǎng)架上； (3 )培養(yǎng)黑暗培養(yǎng)淺盤中的物料在28土1。C、相對(duì)濕度90% 95%的黑暗條件下 培養(yǎng)2 3天，檢查物料，發(fā)現(xiàn)物料內(nèi)外布滿白色菌絲為合格；光照培養(yǎng)..在每層培養(yǎng)架的頂部加光，24小時(shí)光照，在溫度為35士rC、 相對(duì)濕度50%~60%、對(duì)流通風(fēng)的條件下培養(yǎng)2~3天，每12小時(shí)翻盤1次， 檢查顆粒狀物料布滿綠色分生孢子，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)每克干物料分生孢子含 量在109個(gè)以上的為合格。
8.根'據(jù)權(quán)利要求3所述的木霉固體顆粒劑的制備方法，其特征在于，所 述的制劑化是釆用以下步驟'.(1 )合格固體培養(yǎng)物45 ± rC干燥12 24小時(shí)， 加質(zhì)量比10% 15%的硅藻土作保護(hù)劑；質(zhì)量比0.1%~0.2%的敵克松原粉作 增效劑；(2)混勻，粉碎成粒徑為0.1 0.2mm的顆粒，裝袋。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治煙草土傳真菌病害的木霉固體顆粒劑及其制備方法。旨在提供一種有效、無毒、安全、無殘留、使用簡(jiǎn)便的生防菌劑。該菌劑的生產(chǎn)菌株為哈茨木霉(Trichoderma harzianum)TR13，保藏號(hào)CGMCC No.2849。其制備方法包括(1)菌種復(fù)壯；(2)菌種的制備；(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)；(4)固體發(fā)酵培養(yǎng)；(5)制劑化。
文檔編號(hào)A01N25/12GK101558766SQ20091009428
公開日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2009年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月1日
發(fā)明者孔光輝, 力 方, 方敦煌, 革 王, 馬永凱 申請(qǐng)人:云南省煙草科學(xué)研究所