專(zhuān)利名稱(chēng)：：植物耐低溫蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物耐低溫蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：低溫脅迫是水稻生產(chǎn)中常見(jiàn)的非生物脅迫。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界有1500萬(wàn)公頃以上的稻作受到低溫威脅，僅我國(guó)在災(zāi)年中平均每年將損失稻谷約50-100億公斤，給人們生產(chǎn)生活帶來(lái)嚴(yán)重危害。植物遭遇低溫脅迫和缺磷時(shí)，均會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，使分蘗分枝減少，生長(zhǎng)緩慢，植株矮小甚至死亡，嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育。因此在水稻中挖掘同時(shí)與耐低溫和響應(yīng)低磷脅迫相關(guān)的優(yōu)異基因，并把它們應(yīng)用于水稻育種生產(chǎn)中具有十分重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值，也是解決當(dāng)前水稻育種難題的一條行之有效的途徑。已有一些研究表明含有SPX(SYGl/Pho81/XPRl)結(jié)構(gòu)域的基因參與磷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)途徑。SPX是約180個(gè)氨基酸長(zhǎng)，存在于3種已知蛋白(SYGl、Pho81和XPR1)N末端的一個(gè)結(jié)構(gòu)域，其名稱(chēng)來(lái)源于這三種蛋白的首字母。早在1995年，Spain等人(Spain,B.H.,Koo,D.,Ramakrishnan,M.,Dzudzor，B.andColicelli，J.(1995)TruncatedformsofanovelyeastproteinsuppressthelethalityofaGproteinalphasubunitdeficiencybyinteractingwiththebetasubunit.JBiolChem,270,25435-25444)研究發(fā)現(xiàn)酵母SYGl的N末端可與G-蛋白結(jié)合從而抑制交配信息素(matingpheromone)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；在磷饑餓條件下，有報(bào)導(dǎo)CDK抑制子Pho81可抑制PHO80-PHO85及Pcl7-Pho85復(fù)合體的酶活性(Lee,M.,O'Regan，S.,Moreau,J丄.,Johnson,A.L.,Johnston,L.H.andGoding,C.R.(2000)RegulationofthePcl7-Pho85cyclin-cdkcomplexbyPho81.MolMicrobiol,38，411-422);Poleg等人(1996)(Poleg,Y"Aramayo,R.,Kang，S.,Hall,J.G.andMetzenberg，R丄.(1996)NUC-2,acomponentofthephosphate-regulatedsignaltransductionpathwayinNeurosporacrassa,isanankyrinrepeatprotein.MolGenGenet,252，709-716)在真菌7Vewms;poracmwa中發(fā)現(xiàn)，與PH081結(jié)構(gòu)相似的NUC-2蛋白可感知磷的存在并參與磷轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)途徑。2002年，Hamburger等人(Hamburger，D.，Rezzonico,E.，MacDonald國(guó)ComberPetetot，J.，Somerville,C.andPoirier,Y.(2002)IdentificationandcharacterizationoftheArabidopsisPHOlgeneinvolvedinphosphateloadingtothexylem.尸/朋fCe〃，14,889-902)在擬南芥中亦發(fā)現(xiàn)一類(lèi)SPX基因，艮卩PHOl(具有SPX結(jié)構(gòu)域和EXS結(jié)構(gòu)域)基因和PHOl類(lèi)似蛋白，它們可參與磷由根到莖的運(yùn)輸，并在根的微管束細(xì)胞中特異表達(dá)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種植物耐低溫蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的植物耐低溫蛋白，名稱(chēng)為OsSPXl，來(lái)源于稻屬水稻(Oryzasfl"VflL.)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列3的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列3的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐低溫功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列3所示的蛋白序列由295個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第1-169位氨基酸殘基為SPX蛋白結(jié)構(gòu)域。為了使(a)中的OsSPXl分泌到細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中或使其功能穩(wěn)定，可在由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端連接上信號(hào)肽序列，為了(a)中的OsSPXl便于純化，可在由序列表中序列3的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表l.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的OsSPXl可人工合成，也可先合成其編碼基因，再按照下述方法進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的OsSPXl的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1或序列2的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端連上信號(hào)肽的編碼序列，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述植物耐低溫蛋白的編碼基因(0^尸％/)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述植物耐低溫蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列2的DNA序列；2)編碼序列表中序列3所示蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。其中，序列表中序列2是由888個(gè)脫氧核苷酸組成，自序列表中序列2的5'端第1-888位核苷酸序列為編碼序列(0RF)，編碼具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。上述植物耐低溫蛋白的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列;2)編碼序列表中序列3所示蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。其中，序列表中序列1是由4031個(gè)脫氧核苷酸組成，自序列表中序列1的5'端第1-297位核苷酸序列為第一個(gè)外顯子，自序列表中序列1的5'端第399-531位核苷酸序列為第二個(gè)外顯子，自序列表中序列1的5'端第3574-4031位核苷酸序列為第三個(gè)外顯子；自序列表中序列1的5'端第298-398位核苷酸序列為第一個(gè)內(nèi)含子，自序列表中序列1的5'端第532-3573位核苷酸序列為第二個(gè)內(nèi)含子。上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。含有上述植物耐低溫蛋白的編碼基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還提供了上述植物耐低溫蛋白編碼基因在提高植物耐凍性中的應(yīng)用。所述提高植物耐凍性的方法是將上述的植物耐低溫蛋白編碼基因通過(guò)植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選得到耐凍性提高的植物。上述植物表達(dá)載體可為pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301或pCAMBIA130卜UbiN或其它衍生植物表達(dá)載體。所述植物宿主既可以是水稻、玉米、小麥等單子葉植物，也可以是番茄、擬南芥、煙草、棉花等雙子葉植物；優(yōu)選為水稻、煙草。使用OW尸Z7構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、泛生素基因Ubiquitin啟動(dòng)子(pUbi)等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必須與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。攜帶有本發(fā)明編碼提高煙草抗凍性的基因的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞或組織培育成植株。本發(fā)明的耐低溫蛋白的編碼基因可轉(zhuǎn)入植物中提高植物抗凍性。該基因?qū)τ谥参锬屠?凍)分子機(jī)制的研究，植物抗逆性品種的選育具有重要的理論及實(shí)際意義，并為改良作物的耐冷性提供了一條經(jīng)濟(jì)、快速、有效的途徑。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場(chǎng)前景。圖1為水稻OsSPXl基因在低溫處理?xiàng)l件下與正常條件下(對(duì)照)的表達(dá)量比較。圖2為水稻a"尸i7的植物表達(dá)載體(pCOUOsSPXl)的構(gòu)建圖(圖中A)和轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草的RT-PCR鑒定。圖3為轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草在不同溫度下的表型分析。圖4為轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草在不同溫度下的生理指標(biāo)(包括離子滲透、脯氨酸含量、蔗糖含量和磷含量)的變化。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用引物合成及測(cè)序工作均由北京奧科生物科技有限責(zé)任公司完成。實(shí)施例1、水稻S尸Z基因在低溫處理?xiàng)l件下的表達(dá)特征檢測(cè)通過(guò)芯片數(shù)據(jù)挖掘，在水稻基因組序列中發(fā)現(xiàn)一個(gè)預(yù)測(cè)的PHOl亞家族不同的另一類(lèi)只具有SPX結(jié)構(gòu)域而無(wú)EXS結(jié)構(gòu)域的SPX基因，定位于第六號(hào)染色體從23，874,765bp到23,878,795bp，其N(xiāo)CBI定位號(hào)為NP—001058013，NCBI基因號(hào)(GENEID)為Os06g0603600，TIGR號(hào)為L(zhǎng)OC_Os06g40120。利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法對(duì)上述預(yù)測(cè)的基因在冷處理?xiàng)l件下的表達(dá)譜進(jìn)行驗(yàn)證。依據(jù)NCBI的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的信息設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物，正向引物Os-s6F:5，-gtcgcggcgcttaggtctc-3';反向弓l物Os-s6R:5，-tgccggtcgtgtcatttg-3，。以日本晴為材料，按照下述方法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR:將發(fā)芽約1周，芽長(zhǎng)約5mm的日本晴幼苗置于4-5'C進(jìn)行低溫處理，處理時(shí)間為6h，12h，24h，48h后，利用TR1ZOL試劑提取RNA，以正常生長(zhǎng)條件下的幼苗為對(duì)照。以此RNA為模板，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此cDNA為模板，以O(shè)s-s6F和Os-s6R為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因選用水稻中的18srRNA基因，引物序列為18S-F:5'-GCTTTGGTGACTCTAGATAAC-3';18S-R:5'-GTCGGGAGTGGGTAATTTGC-3'。反應(yīng)體系為4plcDNA模板(2ng/nl)，4.5|ilSYBRGreenMasterMix，1|11特異引物，0.5plddH2O。擴(kuò)增程序如下(利用MJResearch公司生產(chǎn)的檢測(cè)系統(tǒng))95°C5min，1個(gè)循環(huán)，95。C30s，60°C30s，讀板(readplate)，85。CIs讀板(readplate)，共40個(gè)循環(huán)，72°C2min，65°C-95°C每隔0.2。C作溶解曲線。上述實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。結(jié)果如圖l所示，結(jié)果表明，水稻S尸JT基因在低溫處理6h，12h，24h和48h后，表達(dá)量持續(xù)增高，說(shuō)明此基因確實(shí)為冷誘導(dǎo)基因。圖1的縱坐標(biāo)表示的是低溫處理水稻S尸Z基因表達(dá)量與正常條件下水稻S尸I基因表達(dá)量的比。實(shí)施例2、水稻S尸義基因及其編碼蛋白的獲得及其功能驗(yàn)證一、水稻S/W基因及其編碼蛋白的獲得設(shè)計(jì)實(shí)施例1所述水稻S尸X基因的全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，并在引物兩端分別引入限制性內(nèi)切酶萬(wàn)g/II和i^"I識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基，引物序列如下CDS-PF:5，-CGGGGTACCCCGATGAAGTTTGGGAAGAGCCTGAG-3，(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶^"I識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基)；CDS-PR:5，-CGAGATCTCGTCATTTGGCGGCCTGCTCAATC-3，(帶下戈機(jī)堿基為限制性內(nèi)切酶^g/n識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基)。利用TRIZ0L試劑提取日本晴低溫處理12h(4°C)的芽期植株的RNA，以此RNA為模板，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此cDNA為模板，在引物CDS-PF和引物CDS-PR的引導(dǎo)下，用常規(guī)PCR法擴(kuò)增水稻S尸X基因的cDNA序列，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1X瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化得到888bp的DNA片段，將該片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增得到的片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，將其命名為0^尸^7。序列表中序列2的核苷酸序列是由888個(gè)脫氧核苷酸組成，自序列表中序列2的5'端第1-888位核苷酸序列為編碼序列(ORF)，編碼具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。將該蛋白命名為OsSPXl。序列表中序列3所示的蛋白序列共有295氨基酸，自氨基端(N端)第1-169位氨基酸殘基為SPX蛋白結(jié)構(gòu)域。通過(guò)序列比對(duì)，與TIGR水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，確認(rèn)其定位號(hào)為L(zhǎng)OC_Os06g40120，與實(shí)施例1中所預(yù)測(cè)的基因相一致，具有序列表中序列1的核苷酸序列，自序列表中序列1的5'端第1-297位核苷酸序列為第一個(gè)外顯子，自序列表中序列1的5'端第399-531位核苷酸序列為第二個(gè)外顯子,自序列表中序列1的5'端第3574-4031位核苷酸序列為第三個(gè)外顯子；自序列表中序列1的5'端第298-398位核苷酸序列為第一個(gè)內(nèi)含子，自序列表中序列1的5'端第532-3573位核苷酸序列為第二個(gè)內(nèi)含子。二、水稻S尸義基因及其編碼蛋白的耐低溫功能驗(yàn)證1、水稻的植物表達(dá)載體(pCOUOsSPXl)的構(gòu)建將步驟一PCR擴(kuò)增得到的片段具有序列表中序列2的核苷酸序列的a^PX/的cDNA片段，用Sg/II和A:p"I進(jìn)行雙酶切，回收純化后，將其插入到植物表達(dá)載體pCambial301-UbiN(GenBank號(hào)AF234296)多克隆位點(diǎn)的5g/II和《;"I酶切位點(diǎn)之間，得到重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，將鑒定表明含有序列表中序列2的核苷酸序列的重組表達(dá)載體命名為pCOUOsSPXl(其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖如圖2中A所示)。2、轉(zhuǎn)O^PJW煙草的獲得1)轉(zhuǎn)化煙草將步驟1構(gòu)建的水稻OM/lW的植物表達(dá)載體pCOUOsSPXl用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草(Mcotowflto6ao/wL.cv.Xanthinn)的外植體。具體方法為(1)將pCOUOsSPXl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌得到含有pCOUOsSPXl的農(nóng)桿菌，將含有pCOUOsSPXl的農(nóng)桿菌接種于YEB液體培養(yǎng)液(100jig/mlKan，75jig/mlRif)中，28°C振蕩培養(yǎng)至OD6oo為0.6-0.8;以10,000rpm室溫離心lmin，用MS鹽溶液(pH7.0)重新懸浮菌體，使用時(shí)采用MS鹽溶液稀釋至原體積的20-50倍得到含有pCOUOsSPXl的農(nóng)桿菌菌液。(2)無(wú)菌的煙草(Mcori朋atokcw/nL.cv.Xanthinn)葉片切去邊緣和主要葉脈，切成0.4x0.6cm2大小，得到外植體；(3)將步驟(2)得到的外植體在步驟(1)得到的含有pCOUOsSPXl的農(nóng)桿菌菌液中浸泡10min;(4)用無(wú)菌濾紙吸干外植體材料表面的菌液，轉(zhuǎn)入上鋪一層濾紙的MS基本培養(yǎng)基，28。C暗培養(yǎng)；3天后，將材料轉(zhuǎn)到含有相應(yīng)抗生素的MS分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；待抗性芽生長(zhǎng)至2-3cm高時(shí)，切下小芽轉(zhuǎn)入MS生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，分化得到轉(zhuǎn)基因植株。2)轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定提取步驟l)得到的轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA并以此為模板，在引物l:5'-ATGAAGTTTGGGAAGAGCCTGAG-3'和引物2:5'陽(yáng)TCATTTGGCGGCCTGCTCAATC-3'的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件為先94°C5min;然后94°C30s，58°C45s，72°Clmin，共35個(gè)循環(huán)；最后72°ClOmin。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2中B所示，陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株可擴(kuò)增出約888bp的條帶。結(jié)果得到6株P(guān)CR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草T0代植株。圖2中B的泳道WT為野生型煙草對(duì)照，其他的泳道為轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草PCR鑒定結(jié)果，圖2中B中的actin表示微絲中的肌動(dòng)蛋白，在這里作為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的對(duì)照。3、轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草的耐低溫功能驗(yàn)證將步驟2的步驟2)PCT鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草和野生型煙草(WT,Mcorta"fltoZwcMwL.cv.Xanthinn)正常(25°C，16小時(shí)晝/8小時(shí)夜周期)生長(zhǎng)4周，然后分別置于0'C，培養(yǎng)24小時(shí)，然后再在-2"C冷凍處理3小時(shí)，然后再置于正常(25°C)條件進(jìn)行恢復(fù)生長(zhǎng)2天，此過(guò)程中，觀察轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草和野生型煙草的生長(zhǎng)狀況，同時(shí)檢測(cè)了它們的離子滲透、脯氨酸含量、蔗糖含量和葉片磷含量。生長(zhǎng)狀況結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，正常培養(yǎng)4周的時(shí)間內(nèi)，轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草和野生型煙草的生長(zhǎng)情況無(wú)明顯差異(圖3中A)，當(dāng)將它們置于0°C24小時(shí)后，野生型植株較轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草植株明顯萎蔫(圖3中B);當(dāng)將它們?cè)僭?2。C冷凍處理3小時(shí)后，雖然野生型和轉(zhuǎn)基因植株都表現(xiàn)出冷凍傷害，但野生型煙草植株要更加明顯，所有植株幾乎完全萎蔫(圖3中C);再經(jīng)過(guò)兩天正常條件下的恢復(fù)生長(zhǎng)，部分轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出生長(zhǎng)恢復(fù)跡象，而絕大部分野生型植株無(wú)法恢復(fù)(圖3中D)。圖3中A、B、C、D中的盯均表示上述野生型煙草，..a^尸"均表示轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草。與抗冷性相關(guān)的一些生理生化指標(biāo)(離子滲透、脯氨酸含量、蔗糖含量、磷含量)檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明轉(zhuǎn)OsS戶Z/基因煙草較野生型煙草具有更強(qiáng)的抗凍性(圖4)。同時(shí)，葉片磷含量的測(cè)定表明在低溫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草的植株中磷含量的下降程度要大于野生型煙草(圖4)，圖4中A為轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草的電導(dǎo)率檢測(cè)結(jié)果；圖4中B為轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草的脯氨酸含量檢測(cè)結(jié)果；圖4中C為轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草的蔗糖含量檢測(cè)結(jié)果；圖4中D為轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草的磷含量檢測(cè)結(jié)果。圖4中A、B、C、D中的壞T均表示上述野生型煙草，OsS/lW均表示轉(zhuǎn)pCOUOsSPXl煙草。圖4中的FW表示鮮重，DW表示干重。序列表<160〉3〈210〉1<211〉4031<212〉DNA〈213>稻屬水稻(Oiyzas^/vaL.)<400>13tg犯gtttgggaagagcctgagta_gccagatcgtgg卿cgctcccggeigtggcgggac60aagttcttgtcgtacaaggatctcaagaagcggctcaagctgattggtgggggtgggggt120ggggsgg卿ggc鄉(xiāng)cg犯gcgggcacgcgttgcagcggatggcggcgaggaggaggcc180gccgccgcggcgatgacgcccgaggaggcgggcttcatgcggctcctggaggccgagctc240gacaagttcaactccttcttCgtCg3g肌gg鄉(xiāng)agg朋tacatcatccgccagaaggtg300cggcggtgatcgatcgccatttgtgcttcggttcgaatcttcttcttcttctcgagtttc360ttggttctgatttgggaaatcgacgctgtgtgtgtcaggagctgc鄉(xiāng)sc420gggcggcgggg鄉(xiāng)gagtcgeLagg郷agctgatgcgggtgcgcaaggagatcgtcgact480tccatggcgagstggtgctgctcgag犯ctacagcgccctca_3ctsca_ccggtg3gtgtC540ccagtccacgcacttccccacccgccgcatCgC朋C3CCCgtagttttcagttttcacat600gtctttcactaattatattaUgc朋3gggttcgttagctgttgcttatgttgtttgtta660actcttcttggaatgttctgtgaattggggaggtagt83taagagaggttggaaaaa_ctg720gttaacatagt8gtttsgt3tccttattagaattttttttgattgggga_ggt6lgt3,g780a犯ttggtt3atatagtagtttattagtgttctcageiaaggt33ttt3gC8403Cgcatcat3g恥t朋tgg3agtttcctgaacataggtcaagaaataggc900gax:ttattgtggttgtgggcagctatggtttcgcatgtccgctacgcagcactcgtgtcg960ctgtcaaggagaatggatccttgtatggcaattcagtgcgcacacgtttttgctctctat1020tgatgaatggatacttgaggttgggctcagcagctaatgttgggggcactgtatataaac1080agtttgttttctcgtgcgagac犯gcaattta_t3gt3tggccacatgagtgctaacattg1140tttatggtggagcactctgttcctttctgctgcaMttg3aatggtaacagtgtgtcatg1200catccttctatcgtgaacagattttcctttgactcgctataagaaggtactccctccatc1260ccaagatat3agtatttctagctstg犯tttgg3C犯Ctgtgtccagattcatagccaaa1320agttgctatattttgggtxggaggtagtatataacaattgtaaacaaataggtcaaaagiei1380tttatccttttcaacaggctgteiEitacagttcgtcaccaaccaaatggtgcatagaagtt1440tctacaagaaatatttgactaataattgacttggtatcagatattatcttggcaata/ttt1500ttcactaaaaatacagtctgattcagggttC3ceitg3tg3tgcagtagtgtgteigtateig1560ta/tagtgaccttgccctctactgcagtgttccatggtagtctggtagattatctgcttcc1620ttacctgtcc3CtggC3gC3tatgcagtgcata_tgca^a_gt肪tgatgt3caetctgtact1680gctttgctatttttcggttggcctttgttatgccttaatgctgagtggttgattttcctc1740tttatc犯tgtg卿ttgtgagtggcttct犯tatctgg3aattttcattcctagcctgg180010gggtt3C3ggttaatcatacaactcaatta肌tct3ggtcggtttctgttggcagttggg1860acgaaaattactcacttga3tatgatgttagagcatcatttctatcataagctccatagt1920tgttttagaaateittgatttagt肌gcagggcagcgtatgcctcccctcaccaaatccaa1980aattaaattcactatgcatcatttcaaagattgcctgaaattccgtagatgcattaataa2040acaeitttgca^^卿ttgggtgtacagtcatctgcagttagatsaa^taaa2100ttaacttgttctaaattccccax:gcctgaaatactgt3gtagacaagttt2160gcaggct犯tttttgcaatatgttataaactatttc犯3gacatttatagtttttatttt2220tagtacggcg8tttggt^3cgggggcacatgcttcattgccaaatattt2280ttcatcagttgacg3gtcttctgattaaaagtcatgcctaacgaaaLcaagetaeigtgcaat2340tcatgttacgtttgtgatttgcgttccagcaaaagaaattagttttgcat2400atcatctaaagatatggtattgctcaacagaaatttgtgtagctaatttcatgatcttca2460ttagttgactcttttatgctt3gctgagatgtgattgatggtcctaactttgC3tgCt3t2520tcgtcatcctagtgcttcttctttttaaagtcagttttttgctagctgca2580atgaacttgaggct犯tgagtaccttggttactgtgttattatgtgcttgtgg3C組gg2640tttcggtggacgtactgtgaaccagtgacctgtgaccactctttgtatcagcatcttgct2700tttttctgtttttcctttgcttgatggtgtcacagacctatatggctata2760ttgggccaggct犯tttggggagtcgacttttcgaatgtgaaca_cattct2820肌卿tgaggatgtcac3c3ttgttgttttgC3tC8tgC3agcttagtat2880gttttgctcaa^cc犯c3g犯cagaatgcaagttgcatgcttcttatatgcctgaagccct2940g肪ctgg3atgtgttactgttaataaccatcattggtgctttgcaactgc3000tctgctgccattttgctcatatcatgctggtctatttcgtatgcttatgcgaateiagaaia3060ctatattagtgttgtacaactgtctgaaagttttctggttatcatttgcaatatgeiEiatg3120ttatcctatctcaaccaaattgactagcatctcctttagtggcaatgtggtaccctttac3180acatcactacCETtgCtagC"tttcctgata/tgaaaattta_ctggaccatgcctcacgagaa3240ttcaggttcattagctaggg3tgtgscaagtt3C3肌tggttttggtgcctcagacagac3300gcctgtaagccatacaagggcgtattttctgitttccatcagtttgggcag3360atatcaxxtaaactaaaatgtttagtctgattgaaccactagcaatagctcatgtcagtt3420atccctgtttattctcttgagggaaaactctttaagaaaagttgtgatattggaagtgga3480ttggatgctatttg犯atttgg肌gatgtaactcttgtactttgttttagattttcacca3540gttgata^cttacgttccatgttgctgtttaC3ggsttagttaagattctcaagaagtatg3600acaagaggactggggctctgatccgtctgcctttcatccaga33gtgctacagcagcctt3660tcttcaccactgacctcctgtac犯gcttgtgaaacagtgtgaggccatgctggaccagc3720ttctaccatcaaacgaactgtctgtatcgagtgaagatgggagaggcgatagcactaacg37803gg3C朋gCCttcgaatcccagttcatccttggttaatggtggcactattCC3g3gtt6lg3840eitg￡igatcga_gtacatggaaagcatgtatatgaagggcacggtcgcggcgcttaggtctc3900tgaagg卿tccgaagcggaagctctactgttagtgcattctcattaccacctctccagg3960gcgacagttcgCC,gg3gcagcaggaactgtgg肌t犯ga_ttccggtgattgagcagg4020ccgccaaatg4031〈210〉2〈211〉888〈212〉DNA<213>稻屬水稻(Oryzasaf/wL.)<400>2atgaagtttggg3卿gCCtgagtagccag3tCgtgg卿cgctcccggagtggcgggac60aagttcttgtcgtacaaggatctcaag38gcggctcaagctg3ttggtgggggtgggggt120gggg鄉(xiāng),ggcaggcgaagcgggcacgcgttgca_gcggatggcggcgagg鄉(xiāng)aggcc180gccgccgcggcgatgacgccCg3gg3ggCgggcttcatgcggctcctggaggccgagctc240g3ca^gttcsactccttcttcgtcgag肌ggagg3gga3tacatcatccgccagaaggag300ctgcaggacagggtggCg3gggcggcggggagggagtcgaaggaggsgctgatgcgggtg360cgcaaggagatcgtcgacttccatggcgagatggtgctgctcgagaactacagcgccctc420aactacaccggattagttaag3ttctcaa_gagaggactggggctctgatc■cgtctgcctttcatccagaaEigtgctacagcagcctttcttcaccactgacctcctgtac540aagcttgtgaaacagtgtgaggccatgctggaccagcttctaccatcaaacgaactgtct600gtatcgagtga柳tgggagaggcgatagcact犯cgaggacaagccttcgaatcccagt660tC3tCCttggtt城ggtggcactattccag3gtt卿tgagatcgagtacatggei3agc720atgtatatgaagggcacggtcgcggcgcttaggtctctgaaggagatccgaagcggaagc780tctactgttagtgcattctcattaccacctctccagggcgacagttcgccagaggagcag840c站gaactgtggaataagattccggtgattgagcaggccgccaaatga888<210>3<211>295〈212〉PRT〈213>稻屬水稻(Oryzas^/vaL.)<400〉3MetLysPheGlyLysSerLeuSerSerGinlie1510GluTrpArgAspLysPheLeuSerTyrLysAsp2025LysLeulieGlyGlyGlyGlyGlyGlyGluGlu3540AlaArgValAlaAlaAspGlyGlyGluGluGlu5055ValGluThrUuPro15LeuLysLysArgLeu30ArgGinAlaLysArg45AlaAlaAlaAlaAla60ThrProGluGluAlaGlyPheMetArgLeuLeuGluAlaGlu70PhePheValGluMet65AspLysPheAsnSer85LeuLeu75GluGluGluTyrGinArgGinLysGlu100SerLysGluGluLeuMet115MetValLeuLeuGlyGlu130ValLyslieLeuILeu145ArgLeuProPheAspArgGlu135LysArgVal120AsnLys90AlaArgAlaAlaVal105ArgLysGlulielie95ArgLeu80lieGluGly110AspPheHisTyrAspLysLys150GinLysValLeuTyrSerAlaAsplie165LysLeuValLysArg155GinLeu140ThrProVal125AsnTyrThrGlyAspLeuLeuTyr180SerAsnGluLeuGin170CysGluAlaMetGlyAlaLeuPhePheLeuLeuPro195ThrAsnGluAspGin185ValSerSerGluThr175Asplie160ThrGinAspSer210GlyGlyThrlieSer200ProSerAsnProLeu190GlyArgGlyAsn225MetTyrMetLysLys215GluLeuAspGluAsp205SerSerLeuValPro230ThrValAlaAlaSer220GluTyrMetGluArgSerGlyGlyGly245SerThrValSerlie235ArgSerLeuLysValAsplie290Ser260SerProGluGluLeu250PheSerLeuProSer275GluGinAlaAlaGin280Ala265GinGluLeuTrpGlu255LeuSer240lieGinAsn285Pro270LyslieProLys29權(quán)利要求1、一種植物耐低溫蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQID№.3的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID№.3氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐低溫蛋白活性的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述的植物耐低溫蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述植物耐低溫蛋白的cDNA基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDW2:2的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQIDW:3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDW:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述植物耐低溫蛋白的基因組基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDW:1的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQIDJV2:3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDJV2:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。5、含有權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)所述的植物耐低溫蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體。6、含有權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)所述的植物耐低溫蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。7、含有權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)所述的物耐低溫蛋白編碼基因的宿主菌。8、權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)所述的植物耐低溫蛋白編碼基因在提高植物耐凍性中的應(yīng)用。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述提高植物耐凍性的方法是權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)所述的植物耐低溫蛋白編碼基因通過(guò)植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選得到耐凍性提高的植物。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物表達(dá)載體為pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301或pCAMBIA1301-UbiN;所述植物為農(nóng)作物，優(yōu)選為水稻、煙草。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種植物耐低溫蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQID№.3的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID№.3氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐低溫蛋白活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的耐低溫蛋白的編碼基因可轉(zhuǎn)入植物中提高植物抗凍性。該基因?qū)τ谥参锬屠?凍)分子機(jī)制的研究，植物抗逆性品種的選育具有重要的理論及實(shí)際意義，并為改良作物的耐冷性提供了一條經(jīng)濟(jì)、快速、有效的途徑。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場(chǎng)前景。文檔編號(hào)A01H1/00GK101289503SQ20081011517公開(kāi)日2008年10月22日申請(qǐng)日期2008年6月18日優(yōu)先權(quán)日2008年6月18日發(fā)明者于靜娟,劉鳳霞,周少霞,徐文英,震蘇,趙琳娜申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)