專利名稱：：一種植物耐低溫蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物耐低溫蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術(shù)：
：低溫脅迫是水稻生產(chǎn)中常見的非生物脅迫。據(jù)統(tǒng)計，全世界有1500萬公頃以上的稻作受到低溫威脅，僅我國在災年中平均每年將損失稻谷約50-100億公斤，給人們生產(chǎn)生活帶來嚴重危害。植物遭遇低溫脅迫和缺磷時，均會影響細胞的生長和分裂，使分蘗分枝減少，生長緩慢，植株矮小甚至死亡，嚴重影響植物生長和發(fā)育。因此在水稻中挖掘同時與耐低溫和響應低磷脅迫相關(guān)的優(yōu)異基因，并把它們應用于水稻育種生產(chǎn)中具有十分重要的理論意義和實踐價值，也是解決當前水稻育種難題的一條行之有效的途徑。已有一些研究表明含有SPX(SYGl/Pho81/XPRl)結(jié)構(gòu)域的基因參與磷的信號轉(zhuǎn)導和調(diào)節(jié)途徑。SPX是約180個氨基酸長，存在于3種已知蛋白(SYGl、Pho81和XPR1)N末端的一個結(jié)構(gòu)域，其名稱來源于這三種蛋白的首字母。早在1995年，Spain等人(Spain,B.H.,Koo，D.,Ramakrishnan,M.,Dzudzor,B.andColicelli,J.(1995)TruncatedformsofanovelyeastproteinsuppressthelethalityofaGproteinalphasubunitdeficiencybyinteractingwkhthebetasubunit.JBiolChem,270,25435-25444)研究發(fā)現(xiàn)酵母SYGl的N末端可與G-蛋白結(jié)合從而抑制交配信息素(matingpheromone)的信號轉(zhuǎn)導；在磷饑餓條件下，有報導CDK抑制子Pho81可抑制PHO80-PHO85及Pcl7-Pho85復合體的酶活性(Lee，M.,O'Regan,S.，Moreau,J丄.,Johnson,A.L.,Johnston,L.H.andGoding，C.R.(2000)RegulationofthePcl7-Pho85cyclin曙cdkcomplexbyPho81.MolMicrobiol,38,411-422);Poleg等人(1996)(Poleg,Y.,Aramayo,R"Kang,S.,Hall,J.G.andMetzenberg,R丄.(1996)NUC-2,acomponentofthephosphate-regulatedsignaltransductionpathwayinNeurosporacrassa,isanankyrinrepeatprotein.MolGenGenet,252，709-716)在真菌Neurosporacrassa中發(fā)現(xiàn)，與PH081結(jié)構(gòu)相似的NUC-2蛋白可感知磷的存在并參與磷轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)途徑。2002年，Hamburger等人(Hamburger,D.,Rezzonico,E.,MacDonald-ComberPetetot,J.,Somerville,C.andPoirier,Y.(2002)IdentificationandcharacterizationoftheArabidopsisPHOlgeneinvolvedinphosphateloadingtothexylem.PlantCell,14,889-902)在擬南芥中亦發(fā)現(xiàn)一類SPX基因，艮口PHOl(具有SPX結(jié)構(gòu)域和EXS結(jié)構(gòu)域)基因和PHOl類似蛋白，它們可參與磷由根到莖的運輸，并在根的微管束細胞中特異表達。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種植物耐低溫蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的植物耐低溫蛋白，名稱為OsSPX3，來源于稻屬水稻(Oryzas^/vflL.)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列3的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐低溫功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列3所示的蛋白序列由277個氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第1-159位氨基酸殘基為SPX蛋白結(jié)構(gòu)域。為了使(a)中的OsSPX3分泌到細胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中或使其功能穩(wěn)定，可在由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端連接上信號肽序列，為了(a)中的OsSPX3便于純化，可在由序列表中序列3的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標簽。<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的OsSPX3可人工合成，也可先合成其編碼基因，再按照下述方法進行生物表達得到。上述(b)中的OsSPX3的編碼基因可通過將序列表中序列l(wèi)或序列2的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端連上信號肽的編碼序列，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。上述植物耐低溫蛋白的編碼基因(OW尸X)也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述植物耐低溫蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列2的DNA序列；2)編碼序列表中序列3所示蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中序列2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。其中，序列表中序列2是由834個脫氧核苷酸組成，自序列表中序列2的5'端第1-834位核苷酸序列為編碼序列(0RF),編碼具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。上述植物耐低溫蛋白的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)編碼序列表中序列3所示蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中序列2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。其中，序列表中序列l(wèi)是由1993個脫氧核苷酸組成，自序列表中序列1的5'端第1-237位核苷酸序列為第一個外顯子，自序列表中序列1的5'端第328-478位核苷酸序列為第二個外顯子，自序列表中序列1的5'端第1548-1993位核苷酸序列為第三個外顯子；自序列表中序列1的5'端第238-327位核苷酸序列為第一個內(nèi)含子，自序列表中序列1的5'端第479-1547位核苷酸序列為第二個內(nèi)含子。上述高嚴謹條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。含有上述植物耐低溫蛋白的編碼基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還提供了上述植物耐低溫蛋白編碼基因在提高植物耐凍性中的應用。所述提高植物耐凍性的方法是將上述的植物耐低溫蛋白編碼基因通過植物表達載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選得到耐凍性提高的植物。上述植物表達載體可為pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301或pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達載體。所述植物宿主既可以是水稻、玉米、小麥等單子葉植物，也可以是番茄、擬南芥、煙草、棉花等雙子葉植物；優(yōu)選為水稻、煙草。使用構(gòu)建植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、泛生素基因Ubiquitin啟動子(pUbi)等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必須與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。攜帶有本發(fā)明編碼提高煙草抗凍性的基因OM/IO的植物表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉(zhuǎn)化水稻細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的水稻細胞或組織培育成植株。本發(fā)明的耐低溫蛋白的編碼基因可轉(zhuǎn)入植物中提高植物抗凍性。該基因?qū)τ谥参锬屠?凍)分子機制的研究，植物抗逆性品種的選育具有重要的理論及實際意義，并為改良作物的耐冷性提供了一條經(jīng)濟、快速、有效的途徑。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應用空間和市場前景。圖1為水稻OsSPX3基因在低溫處理條件下與正常條件下(對照)的表達量比較。圖2為水稻QyS尸X3的植物表達載體(pCOUOsSPX3)的構(gòu)建圖(圖中A)和轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草的RT-PCR鑒定。圖3為轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草在不同溫度下的表型分析。圖4為轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草在不同溫度下的生理指標(包括離子滲透、脯氨酸含量、蔗糖含量和磷含量)的變化。具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物合成及測序工作均由北京奧科生物科技有限責任公司完成。實施例1、水稻S尸7基因在低溫處理條件下的表達特征檢測通過芯片數(shù)據(jù)挖掘，在水稻基因組序列中發(fā)現(xiàn)一個預測的PHOl亞家族不同的另一類只具有spx結(jié)構(gòu)域而無EXS結(jié)構(gòu)域的SPX基因，定位于第10號染色體從12,757,421bp到12,760,157bp，其NCBI定位號為NP—001064515，NCBI基因號(GENEID)為Osl0g0392600，TIGR號為LOC—Osl0g25310。利用實時定量RT-PCR的方法對上述預測的基因在冷處理條件下的表達譜進行驗證。依據(jù)NCBI的基因組數(shù)據(jù)庫的信息設(shè)計實時定量RT-PCR引物，正向引物Os-sl0F:5'-tcgccggacatggaaaggat-3';反向引物Os-sl0R:5'-cggcggcagcgagaacc-3'。以日本晴為材料，按照下述方法進行實時定量RT-PCR:將發(fā)芽約1周，芽長約5mm的日本晴幼苗置于4-5'C進行低溫處理，處理時間為6h，12h，24h，48h后，利用TRIZOL試劑提取RNA，以正常生長條件下的幼苗為對照。以此RNA為模板，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此cDNA為模板，以O(shè)s-s6F和Os-s6R為引物，進行實時定量RT-PCR檢測。實時定量RT-PCR檢測內(nèi)標基因選用水稻中的18srRNA基因，引物序列為18S-F:5'-GCTTTGGTGACTCTAGATAAC-3';18S-R:5'-GTCGGGAGTGGGTAATTTGC-3'。反應體系為4plcDNA模板(2ng/|il)，4.5piSYBRGreenMasterMix，1|^1特異引物，0.5^1ddH20。擴增程序如下(利用MJResearch公司生產(chǎn)的檢測系統(tǒng))95°C5min，1個循環(huán)，95。C30s，60。C30s，讀板(readplate)，85。CIsi賣板(readplate)，共40個循環(huán)，72。C2min，65°C-95°C每隔0.2。C作溶解曲線。上述實驗設(shè)3個重復。結(jié)果如圖l所示，結(jié)果表明，上述水稻S尸X基因在低溫處理6h，12h，24h和48h后，表達量持續(xù)增高，說明此基因確實為冷誘導基因。圖1的縱坐標表示的是低溫處理水稻S尸X基因表達量與正常條件下水稻S尸Z基因表達量的比。實施例2、水稻S尸X基因及其編碼蛋白的獲得及其功能驗證一、水稻S戶I基因及其編碼蛋白的獲得設(shè)計實施例1所述水稻S尸X基因的全長cDNA序列設(shè)計引物，并在引物兩端分別引入限制性內(nèi)切酶5g/II和尺;7"I識別位點及保護堿基，弓I物序列如下CDS-PF:5,-CGGGGTACCCCGATGAAGTTTGGGAAGAGGCTGAAG-3，(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶《;wl識別位點及保護堿基)；CDS-PR:5，-CGAGATCTCGTTAGGCATAAAAAAACTGTAAACTTGGAAT-3，(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶5g/II識別位點及保護堿基)。利用TRIZ0L試劑提取日本晴低溫處理12h(4°C)的芽期植株的RNA，以此RNA為模板，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以此cDNA為模板，在引物CDS-PF和引物CDS-PR的引導下，用常規(guī)PCR法擴增水稻S尸Z基因的cDNA序歹U，反應結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1X瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化得到834bp的DNA片段，將該片段進行測序，結(jié)果表明，PCR擴增得到的片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，將其命名為a^PZ5。序列表中序列2的核苷酸序列是由834個脫氧核苷酸組成，自序列表中序列2的5'端第1-834位核苷酸序列為編碼序列(ORF)，編碼具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。將該蛋白命名為OsSPX3。序列表中序列3所示的蛋白序列共有277氨基酸，自氨基端(N端)第1-159位氨基酸殘基為SPX蛋白結(jié)構(gòu)域。通過序列比對，與TIGR水稻基因組數(shù)據(jù)庫進行比較，確認其定位號為LOCJ)sl0g25310，與實施例1中所預測的基因相一致，其基因組基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，自序列表中序列1的5'端第1-237位核苷酸序列為第一個外顯子，自序列表中序列1的5'端第328-478位核苷酸序列為第二個外顯子，自序列表中序列1的5'端第1548-1993位核苷酸序列為第三個外顯子；自序列表中序列1的5'端第238-327位核苷酸序列為第一個內(nèi)含子，自序列表中序列1的5'端第479-1547位核苷酸序列為第二個內(nèi)含子。二、水稻S尸Z基因及其編碼蛋白的耐低溫功能驗證1、水稻OsS尸X的植物表達載體(pCOUOsSPX3)的構(gòu)建將步驟一PCR擴增得到的片段具有序列表中序列2的核苷酸序列的的cDNA片段，用5g/II和尺/wI進行雙酶切，回收純化后，將其插入到植物表達載體pCambial301-UbiN(GenBank號AF234296)多克隆位點的和《;"I酶切位點之間，得到重組表達載體，將該重組表達載體進行酶切和測序鑒定，將鑒定表明含有序列表中序列2的核苷酸序列的重組表達載體命名為pCOUOsSPX3(其結(jié)構(gòu)簡圖如圖2中A所示)。2、轉(zhuǎn)OsSilO煙草的獲得1)轉(zhuǎn)化煙草將步驟1構(gòu)建的水稻aySPX3的植物表達載體pCOUOsSPX3用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草(iV/corifl"ato6acwwL.cv.Xanthinn)的外植體。具體方法為(1)將pCOUOsSPX3轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌得到含有pCOUOsSPX3的農(nóng)桿菌，將含有pCOUOsSPX3的農(nóng)桿菌接種于YEB液體培養(yǎng)液(100嗎/mlKan，75pg/mlRif)中，28°C振蕩培養(yǎng)至OD6oo為0,6-0.8;以10，000rpm室溫離心lmin，用MS鹽溶液(pH7.0)重新懸浮菌體，使用時采用MS鹽溶液稀釋至原體積的20-50倍得到含有pCOUOsSPX3的農(nóng)桿菌菌液。(2)無菌的煙草(Mco"fl脂toZ)acwwL.cv.Xanthinn)葉片切去邊緣和主要葉脈，切成0.4x0.6cm2大小，得到外植體；(3)將步驟(2)得到的外植體在步驟(1)得到的含有pCOUOsSPX3的農(nóng)桿菌菌液中浸泡10min;(4)用無菌濾紙吸干外植體材料表面的菌液，轉(zhuǎn)入上鋪一層濾紙的MS基本培養(yǎng)基，28。C暗培養(yǎng)；3天后，將材料轉(zhuǎn)到含有相應抗生素的MS分化培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；待抗性芽生長至2-3cm高時，切下小芽轉(zhuǎn)入MS生根培養(yǎng)基中誘導生根，分化得到轉(zhuǎn)基因植株。2)轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定提取步驟l)得到的轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA并以此為模板，在引物l:5'-ATGAAGTTTGGGAAGAGGCTGAAG-3'和引物2:5'-TTAGGCATAAAAAAACTGTAAACTTGGAAT-3'的引導下，進行PCR檢測，PCR反應條件為先94。C5min;然后94°C30s，58°C45s，72°Clmin，共35個循環(huán)；最后72°C10min。反應結(jié)束后，對擴增產(chǎn)物進行10%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2中B所示，陽性O(shè)M尸X3轉(zhuǎn)基因植株可擴增出約834bp的條帶。結(jié)果得到6株P(guān)CR鑒定陽性的轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草T0代植株。圖2中B的泳道WT為野生型煙草對照，其他的泳道為轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草PCR鑒定結(jié)果，圖2中B中的actin表示微絲中的肌動蛋白，在這里作為轉(zhuǎn)基因檢測的對照。3、轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草的耐低溫功能驗證將步驟2的步驟2)PCT鑒定陽性的轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草和野生型煙草(WT，A^oto"ato6acMwL.cv.Xanthinn)正常(25°C，16小時晝/8小時夜周期)生長4周，然后分別置于0'C，培養(yǎng)24小時，然后再在-2"冷凍處理3小時，然后再置于正常(25°C)條件進行恢復生長2天，此過程中，觀察轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草和野生型煙草的生長狀況，同時檢測了它們的離子滲透、脯氨酸含量、蔗糖含量和葉片磷含量。生長狀況結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，正常培養(yǎng)4周的時間內(nèi)，轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草和野生型煙草的生長情況無明顯差異(圖3中A)，當將它們置于0°C24小時后，野生型植株較轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草植株明顯萎蔫(圖3中B);當將它們再在-2'C冷凍處理3小時后，雖然野生型和轉(zhuǎn)基因植株都表現(xiàn)出冷凍傷害，但野生型煙草植株要更加明顯，所有植株幾乎完全萎蔫(圖3中C);再經(jīng)過兩天正常條件下的恢復生長，部分轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出生長恢復跡象，而絕大部分野生型植株無法恢復(圖3中D)。圖3中A、B、C、D中的ffT均表示上述野生型煙草，t/6"..a"戶Z均表示轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草。與抗冷性相關(guān)的一些生理生化指標(離子滲透、脯氨酸含量、蔗糖含量、磷含量)檢測結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草較野生型煙草具有更強的抗凍性(圖4)。同時，葉片磷含量的測定表明在低溫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草的植株中磷含量的下降程度要大于野生型煙草(圖4)，圖4中A為轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草的電導率檢測結(jié)果；圖4中B為轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草的脯氨酸含量檢測結(jié)果；圖4中C為轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草的蔗糖含量檢測結(jié)果；圖4中D為轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草的磷含量檢測結(jié)果。圖4中A、B、C、D中的『r均表示上述野生型煙草，f/6/:.均表示轉(zhuǎn)pCOUOsSPX3煙草。圖4中的FW表示鮮重，DW表示干重。序列表〈160>3<210>1〈211>1993<212〉DNA〈213>稻屬水稻(Oryzas加'vaL.)〈400〉1atg肌gtttgggaagaggctgtggagg卿gcctcccggagtggagggac60aagttcttggcgtac犯gcgcctcaagaa_gctcgtcaggctcgtctcctcctcctccggc120gatgtcggcggcggcggcggcggcgsggccgaattcgtgcggctgctcgacggcgaggtc180ggic8gg3tcaacgccttcttcctcgagcagg鄉(xiāng)agggigttcgtcatacggc卿gggtc240tctgcattagctatttctgcagcaaagatttttggttttgggaagttgagatgatgattg300tgagcctgcgtgcattgttcgtcgcaggagctgcaggagacagtggagaaggtggccggc360ggcggcggtgg鄉(xiāng)gcggcggccggcggcggcggagatgaggagggtgaggaaggagatc420gtggacctgcElCgggg卿tggtgctgctgcttaactacagcgccgtcaactacacaggt480ttgagtttggtttcaeiatttcttaggaggtgaaaactttcagaattttcg540tatacgacccgtgac犯ggttcgtacggagtaattacgaactggtattcccaaagagatc600tcaattcccaaatttcaaatatttcgatgggcccgggtagagcaccataccagggggaat660agttttttcttttteiaaatcuttttuttggcgcaaacaggtgagcatcatttgtagta720gctgtgtgcttaacaacttctgatax:a^cEigtactcctccgtccta^aataaatgcagtt780ttgcactattcacattcaacgtttgaccgttcgtcttatttaaaccttttttatgattag840tatttttattactattagatgataaaacstaaatagtsctttacgtgtgact肌atattt900tcaaatttttt3ca犯ttttttaaataagacggacggtcaaacattgggcacggatatcc960acggctacacttattttaggacggatgtagcactaax:Eigtgattttttgacttg肌肌tt1020ttcttatgatttgatcactgttcaacttgagacttgtcgtagccgtccccatgtgagtca1080acagtatcttcaggctgcacattacagccaaaattttctctacacaacaaaattcattca1140gtgcatttgcacagetacagtaactgcaaccta犯gdcaatctgtttatccatatagatta1200cgatgatgatctgtttatccacaaatattatagactaatcgtcttcccta1260tcgatcggtaagtgactaggctgtgttccttactgggttggaacccactttctccgcgcg1320aaa肌cggaacagtttattagcacattattaattaagtattagcttttttaaaaaataaa1380ttaatttgatttttttaaaacaactttcgtctaaaaaaatcacaccgttt14403gC3gCgCCgataacaaaggataagggttgggaccatgctga朋cgaacgcagccagaga1500ggctgaacatggtgatgaattsttgatgstgatctgtgaaattgc鄉(xiāng)gctggccaagat1560cctg肌ga犯t8Cg3C犯gCgcaccggccgcctcctccggctgccgttcatcgagaaggt1620gctccggcagccgttcttcacgacggagctcatctcgaggctcgtccgcg3CtgCg3ggC1680caccertgg3ggccatcttcacctcctccgtggcgacgacggcgstggccggcgatcgccg1740gacatggaaaggatgctccggcgacgccgggatggctccgatggcagaccagcagggcat1800cttccggaacaccgtcgccgcgctggcgacgatgaaggagctccggagcgggagctcgac1860gtacgggcggttctcgctgccgccgatggcggcgccggcctcgccggagtccgacgtgct1920gcagtccatccgatccgatccccatctgaaagagaatggaagaattccaagtttacagtt1980tttttatgcctaa1993〈210〉2<211>834<212〉DNA<213〉稻屬水稻(Otyzas加VflL.)<400>2atggisgtttgaagttcttgggatgtcggcgga_ceigga_tcactgcaggagagcgg卿tgacttaactacacgcaccggccacgscggagcacctcctccgggcgacgccggcgctggcgaccgccgatggccccettctgagga卿ggctcgtacaagcggcggcggcggacgccttcttcagtggagaaggagggtgaggcgccgtcaagcctcctccgtcatctcgagtggcgacgacggatggctcccgatg肌ggacggcgccggc犯gag犯tggga卿agcagCCtC33g朋gcggcgaggcccctcgagcagggtggccggcgaagg卿tcctacaceiggggctgccgttcgctcgtccgcggcgatggccgatggcageicgctccggagcctcgccggagaagaattccagtggsgg卿ctcgtcaggcgaattcgtgcg鄉(xiāng)agg站tggcggcggtggtggacctgcctggccaagaatcgag肌gggactgcgaggggcgatcgcccagcagggcagggagctcgatccgacgtgcagttt8C3gtgcctcccggatcgtctcctcggctgctcgatcgtcatacggagggcggcgacggggagattcctgaagaatgctccggcaccaccatggaggacatgg肌tcttccggaacgtacgggcgtgcagtccatttttttatgcgtggagggacctcctccggccggcg鄉(xiāng)tcgc卿ggg明gccggcggcgggtgctgctgatacgacaaggccgttcttcggccatcttcaggatgctcccaccgtcgccgttctcgctgccgatccgat60120180240300360420480540600660720780834<210〉3<211>277<212>PRT<213>稻屬水稻(Oiyzasa"wL.)〈400〉3MetLysPheGlyLysArgLeuLysLysGinValGluGluSerLeuPro151015GluTrpArgAspLysPheLeuAlaTyrLysArgLeuLysLysLeuVal202530ArgLeuValSerSerSerSerGly40LeuGluVal35GluPheValArgAla50PhePheLeuGluAspAspAla65LeuGinGluThrLeu55GluGluGluPheValGlyGlyGluGlyGin70GluLysValAlaVal85AlaGluMetArgArgProAlaAla100GluMetValLeuLeuHisGly115LeuAlaLyslieThrGly130LeuArgLeuProLeu120LysArg105LeuGly90ValLeu145ThrThrGluLeuGluAlaliePhe180TrpTyrLeuLysLys135lieGluLysValVal75GlyArgTyrAspVal60lieGlyLysAsnTyrSerGly45AspArgGlyGluAla125ArgGlyArgGinGlylie110ValGlylieArgGly95ValGlyAsnGlu80ArgAspAsnTyrThrGlyArgPhe150SerArgLeuValLys140ArgGinProPhelie165ThrSerSerValLeu155AspCysGluAlaArg170ThrThrAlaMetArgAlaArgAsp210LysThr195GinMet225ProProMetAlalieArgSerAsp260GinPhePheTyr275LysGlyCysGlyGluLeuArgAla185GlyAspAlaGlyThr175GlyPhe160MetAspGinGlylieSer200ArgAsnThrValAla190AlaProMetPhe215GlySerSerThrMet205AhLeuAlaThrSer230ProAlaSerProAla245ProHisLeuLysAlaGlu265Glu250AsnTyr235SerAla220GlyArgPheSerAspValLeuGin255GlyArglieProSerPro270Leu240SerLeu權(quán)利要求1、一種植物耐低溫蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQID№.3的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID№.3氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐低溫蛋白活性的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述的植物耐低溫蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述植物耐低溫蛋白的cDNA基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDJVf2:2的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQIDW2:3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDWs:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述植物耐低溫蛋白的基因組基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDW2:1的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQIDW2:3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDW:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。5、含有權(quán)利要求2-4中任意一項所述的植物耐低溫蛋白編碼基因的重組表達載體。6、含有權(quán)利要求2-4中任意一項所述的植物耐低溫蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。7、含有權(quán)利要求2-4中任意一項所述的物耐低溫蛋白編碼基因的宿主菌。8、權(quán)利要求2-4中任意一項所述的植物耐低溫蛋白編碼基因在提高植物耐凍性中的應用。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于所述提高植物耐凍性的方法是權(quán)利要求2-4中任意一項所述的植物耐低溫蛋白編碼基因通過植物表達載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選得到耐凍性提高的植物。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于:所述植物表達載體為pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301或pCAMBIA1301-UbiN;所述植物為農(nóng)作物，優(yōu)選為水稻、煙草。全文摘要本發(fā)明公開了一種植物耐低溫蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQID№.3的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID№.3氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐低溫蛋白活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的耐低溫蛋白的編碼基因可轉(zhuǎn)入植物中提高植物抗凍性。該基因?qū)τ谥参锬屠?凍)分子機制的研究，植物抗逆性品種的選育具有重要的理論及實際意義，并為改良作物的耐冷性提供了一條經(jīng)濟、快速、有效的途徑。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應用空間和市場前景。文檔編號A01H1/00GK101289502SQ20081011517公開日2008年10月22日申請日期2008年6月18日優(yōu)先權(quán)日2008年6月18日發(fā)明者于靜娟,劉鳳霞,周少霞,徐文英,震蘇,趙琳娜申請人:中國農(nóng)業(yè)大學