專利名稱：提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)，是涉及提高大豆蛋白質(zhì)含量和 質(zhì)量的表達(dá)載體及其制法和用途。
背景技術(shù)：
大豆是我國(guó)重要農(nóng)作物之一，含有豐富的蛋白質(zhì)和人體及動(dòng)物不能合成的8 種必需氨基酸，是人類食物和動(dòng)物養(yǎng)殖的主要植物蛋白來(lái)源。近年來(lái)，聯(lián)合國(guó) 糧農(nóng)組織極力主張發(fā)展大豆食品，以解決目前發(fā)展中國(guó)家蛋白質(zhì)資源不足的現(xiàn) 狀。因此，提高大豆蛋白含量及質(zhì)量是最重要的內(nèi)容之一。目前隨著人們健康及保健意識(shí)的提高，優(yōu)質(zhì)的高蛋白大豆粉在市場(chǎng)的需求 量正逐年上升。對(duì)于有些不能食用動(dòng)物蛋白的特殊疾病患者，由優(yōu)質(zhì)大豆制成 的高蛋白制品對(duì)這樣的人群更為重要。大豆高蛋白育種對(duì)于動(dòng)物以及大豆早期 自身的生長(zhǎng)等多方面都會(huì)帶來(lái)一定的益處。以優(yōu)質(zhì)高蛋白大豆作為家畜的飼料， 減少和避免使用動(dòng)物飼料，將更有助于家畜的生長(zhǎng)。種子中的貯藏蛋白在種子 萌動(dòng)發(fā)芽中是一種氮源，具有非常重要的作用。如果以高蛋白大豆作為種子， 內(nèi)源氮素豐富，大豆早期的生長(zhǎng)將會(huì)更好。我國(guó)是一個(gè)人口眾多的發(fā)展中國(guó)家， 為滿足我國(guó)不斷增長(zhǎng)人口對(duì)農(nóng)作物的需求，采用增加種植面積來(lái)達(dá)到增產(chǎn)的目 的已經(jīng)不符合當(dāng)前我國(guó)的基本國(guó)策，而通過(guò)在現(xiàn)有單產(chǎn)基礎(chǔ)上提高農(nóng)作物蛋白 質(zhì)的生產(chǎn)率獲得更有營(yíng)養(yǎng)的農(nóng)作物，是一種更為科學(xué)和經(jīng)濟(jì)的增產(chǎn)方式。因此， 種植高蛋白大豆還可提高單位土地面積蛋白質(zhì)生產(chǎn)量，提高土地的生產(chǎn)率。在大豆蛋白質(zhì)中卯％是鹽溶性球蛋白(Fukushima D, Chemistry, technology ， and nutrition. Food Reviews Imational, 1991, 7:323 -351),按照在 一 定pH和鹽離 子濃度環(huán)境中沉降系數(shù)不同，鹽溶性球蛋白又可分為2S、 7S、 11S和15S四種 組分。其中7S和llS球蛋白是兩種主要的成分，分別被稱為豌豆球蛋白(Vicilin) 和豆球蛋白(Legumin)(蓋鈞鎰.大豆品質(zhì)育種.農(nóng)作物品質(zhì)育種(劉后利主編)， 湖北科學(xué)技術(shù)出版社.2001， pp: 269~331)。大豆的豆球蛋白主要為大豆球蛋白 (Glycinin)，約占成熟種子總蛋白含量的40 % (Utsumi S ， Adv Food Nutr Res,1992, 36:89 ~ 208; UtsumiS， etal, Food Proteins and Their Applications, Marcel Dekker， New York, 1997， 257 ~ 291)，是目前大豆鹽溶性球蛋白研究的重點(diǎn)。盡管大豆是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的作物，已具有完全蛋白的美稱，但是根據(jù) 人們對(duì)大豆蛋白氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，大豆缺乏含硫氨基酸(甲硫氨酸和胱氨 酸)(胡明祥等，大豆品質(zhì)育種.作物品質(zhì)育種(翟風(fēng)林等編著)，農(nóng)業(yè)出版社， 1988, pp: 407-453)，這已成為大豆蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要限制因素。因此設(shè) 法提高含硫氨基酸的含量，是當(dāng)今改良大豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)研究的重要課題。大豆的IIS球蛋白含有較豐富的甲硫氨酸(1.3%-1.8%)及胱氨酸(1.4%~ 1.7%)，而在7S豌豆球蛋白中兩種含硫氨基酸含量較少，分別為0.3%左右(蓋 鈞鎰.大豆品質(zhì)育種.農(nóng)作物品質(zhì)育種(劉后利主編)，湖北科學(xué)技術(shù)出版社.2001, pp: 269-331)。因此在大豆貯藏蛋白中增加11S蛋白含量，將能夠提高大豆蛋 白質(zhì)的質(zhì)量。從人們對(duì)大豆蛋白質(zhì)保健功能研究結(jié)果顯示，大豆球蛋白還具有 天然的降血脂和降低血漿膽固醇的作用。蓋鈞鎰在《大豆品質(zhì)育種》 一文中也 提出，從避免動(dòng)物性食品中的膽固醇問(wèn)題，由大豆制成的人造肉將是人類未來(lái) 的重要蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)來(lái)源(蓋鈞鎰.大豆品質(zhì)育種.農(nóng)作物品質(zhì)育種(劉后利主編)， 湖北科學(xué)技術(shù)出版社.2001, pp: 269~331)。在我國(guó)，大豆的主要用途之一是加 工豆腐制品，供人們食用。由11S蛋白組分凝結(jié)制得的豆腐比7S蛋白組分凝結(jié) 制得的豆腐結(jié)構(gòu)要堅(jiān)實(shí)(胡明祥等，大豆品質(zhì)育種.作物品質(zhì)育種(翟風(fēng)林等編 著)，農(nóng)業(yè)出版社，1988, pp: 407-453)。而且從改善大豆分離蛋白的性質(zhì)與 功能出發(fā)，也要求增加IIS球蛋白含量(蓋鈞鎰.大豆品質(zhì)育種.農(nóng)作物品質(zhì)育種 (劉后利主編)，湖北科學(xué)技術(shù)出版社.2001， pp: 269-331)?，F(xiàn)已證實(shí)，大豆的IIS球蛋白是由多基因家族編碼，迄今為止已有七個(gè)大 豆球蛋白基因被克隆、測(cè)序。1982年，F(xiàn)ischer和Goldberg (Fischer RL， Goldberg RB.Cell， 1982, 29:651 ~ 660)首次報(bào)道了三個(gè)高度同源的非等位大豆球蛋白基 因，并命名為Gjl、 Gy2和G_y3。 1985年，Scallon等(Scallon B， et al， Theor Appl Genet, 1985, 70:510 ~ 519)首次報(bào)道了編碼大豆球蛋白的G;4、 Qy5基因。2002 年，Beilinson等(Beilinson V et al, Theor Appl Genet, 2002， 104: 1132 ~ 1140 ) 又報(bào)道了 Gy6及Gy7基因，其中Gy6基因?yàn)?'端缺陷型，不能編碼有功能的大 豆球蛋白。Nielsen等(Nielsen N C et al, The Plant Cell ， 1989， 1: 313 ~ 328 )按照大 豆球蛋白基因cDNA序列的同源性，曾對(duì)qW (^y5基因的不同區(qū)域的序列進(jìn)行了比較分析，并將(^yl、 qy2和G少3分為第一類群，G少4和Gy5分為第二類群。 Beilinson等(Beilinson V et al， Theor Appl Genet, 2002， 104:1132 ~ 1140 )按 照大豆球蛋白亞基的同源性，將(^6和G/7基因分為第三類群。Nielsen認(rèn)為， 第一、第二類群大豆球蛋白基因都在開(kāi)花后大約25天開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，約55天達(dá)到 最大，91天降到很低的水平，且第一類群的表達(dá)量高于第二類群(NidsenNCet al, ThePlantCell, 1989， 1: 313 -328 )。 Beilinson認(rèn)為第三類群的Qy7基因在 種子中熟期表達(dá)，比第一、第二類群晚，而且表達(dá)量最少，不到總蛋白的5% (Beilinson Vetal， Theor Appl Genet, 2002， 104:1132 ~ 1140 )。分析六種大豆 球蛋白基因啟動(dòng)子，造成基因表達(dá)量最少的原因是由于啟動(dòng)子保守序列 Legumin box堿基序列的突變，六種有功能大豆球蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)Legumin box 序列比較如下(陰影表示重要保守序列)cttcatgaggtgtagcacccaaggcttccatagccatgcata￡tgaagaatgtctcaagctcagcaccctactt ，cttaatgaggtgtaacacacaaggcttccatagccatgcata￡tgaagaatgtctcaagctcagcaccccacttcttaat a gtgtaagacagaagggttccatagccatgcata￡tgaagaatgtcttaagctcagcaccccacttatgtatgaggtgtaacaaaattggaaacaatagccatgcagggtgaagaatgtcaccaactcagaaacccttatatgtatgaggtgtaacaaaattggaaacaatagccatgcaaggtgaagaatgtcacaaactcagcaacccttatgttgatgaggtgtaagaaatgagggtttgaaagacatgcaggctgcagaatgtctacatctcagggactaatgt 分析比較Gyl、 Gy2、 @3、 Gy4、 C^5和Gy7六種功能性大豆球蛋白基因 合成的多肽氨基酸組成，不論從八種必需氨基酸、半必需氨基酸和含硫氨基酸 (Met+Cys)的百分含量，還是它們的實(shí)際數(shù)值，@7基因明顯比其他大豆球蛋 白基因更好，Gy7基因表達(dá)產(chǎn)物不僅具有最高的賴氨酸含量，同時(shí)含硫氨基酸也 是最高的(見(jiàn)表l所示)，是一個(gè)目前已發(fā)現(xiàn)的最優(yōu)質(zhì)的大豆球蛋白基因(李 建粵等，西北植物學(xué)報(bào)，2005, 25 (8) : 1706- 1712) 。 Qy7基因自2002年 Beilinson首次報(bào)道以來(lái)，關(guān)于利用該基因改良作物方面的研究目前還未見(jiàn)報(bào)道。表l六種大豆球蛋白重要氨基酸百分含量(％)和實(shí)際值(個(gè))氨基酸種類GlG2G3G4G5G7Lys5.644.334.355.344.086.99重Thr3.833.523.543.183.51■要Met雄1.7;1.230.420,691.38氨Trp1.311.341.01認(rèn)1.271.83基lie5.494.965.203.873.665.49酸Val4.335.014.845.776.357.53百Leu6.967.126.727.017.117.06分Phe認(rèn)5.16雄3.254.093.70含Arg7.568.308.358.828.36繊量His2.001.021.543.273.855.10(%)Met+Cys3.00認(rèn)2.831.441.823.33Phe+Tyr8.518.4310.097.07謹(jǐn)6.95Lys2418192^18重Thr181812要Met23會(huì)氨Trp4434基lie2^23242118酸Val232625望實(shí)Leu333331巡3536際Phe192^141615值A(chǔ)rg27292931(個(gè)His84615Met+Cys141513812Phe+Tyr3130292i27*表中單下劃線表示氨基酸在六種大豆球蛋白中排列第一，雙下劃線表示排列第二； Gl G7分別表示(^l G/7基因相應(yīng)的多肽產(chǎn)物。改良大豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)育種在國(guó)內(nèi)外很早就引起了人們的興趣，不同學(xué)者曾先 后釆用雜交、輻射育種等方法開(kāi)展高蛋白大豆育種及遺傳研究(胡明祥等，大豆 品質(zhì)育種.作物品質(zhì)育種(翟風(fēng)林等編著)，農(nóng)業(yè)出版社，1988， pp: 407~453;許月等，大豆科學(xué)，1998， 17 (3): 262 ~ 267)。國(guó)內(nèi)學(xué)者在20世紀(jì)90年代起， 多釆用總DNA導(dǎo)入法提高大豆蛋白質(zhì)含量，進(jìn)行大豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)改良研究(雷勃 鈞等，中國(guó)科學(xué)(B輯)，1994, 24 (6) : 596~601;雷勃鈞等，大豆科學(xué)， 14 (3) : 203-207;許守民等，大豆科學(xué)，1995， 14 (4) : 316-320;劉廣 陽(yáng)等，中國(guó)油料，1996， 18(3): 20-22;雷勃鈞等，作物學(xué)報(bào)，2000， 26(6):725 ~ 730)。盡管利用如上方法在提高大豆總蛋白含量方面已有成功的報(bào)道，也有極 少數(shù)研究增加了大豆11S球蛋白含量，但是從總體而言，釆用這些技術(shù)要快速 有效地提高優(yōu)質(zhì)大豆IIS球蛋白含量還是比較困難的。在國(guó)外，利用基因工程技術(shù)成功改良大豆蛋白質(zhì)品質(zhì)方面報(bào)道也較少。20 世紀(jì)90年代初期，有人設(shè)想通過(guò)改變現(xiàn)有大豆IIS球蛋白基因序列，將制備的 新基因改良大豆品質(zhì)。如Kim等人(Kim等，ProteinEng， 1990， 3(8):725~31) 在1990年曾在Gj3基因的基礎(chǔ)上通過(guò)刪除3個(gè)氨基酸殘基或增加4個(gè)含硫氨基 酸殘基的核苷酸構(gòu)建了重組載體，并導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)有 一個(gè)重組載體表達(dá)的蛋白質(zhì)比較理想，但利用該設(shè)計(jì)改良大豆一直未見(jiàn)報(bào)道。 在1988年，Hoffinan等人(Hoffinan等，PlantMolBiol， 1988, 11: 717-729) 也曾將來(lái)自玉米15KDZein基因中富含6個(gè)甲硫氨酸殘基密碼子的45bpDNA片 段插入菜豆貯藏蛋白基因中并導(dǎo)入煙草，結(jié)果顯示新基因在煙草中能夠表達(dá)出 相應(yīng)的蛋白質(zhì)，但無(wú)法在細(xì)胞中完成正確的運(yùn)輸過(guò)程聚集在蛋白體內(nèi)。利用體 外合成新基因改良作物種子營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，除了要考慮新基因表達(dá)的多肽能否在細(xì) 胞中正確運(yùn)輸外，還需要對(duì)改變核苷酸序列后的多肽產(chǎn)物之間能否相互作用形 成正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。在20世紀(jì)90年代中期，改良大豆品質(zhì)最有影響 的報(bào)道是將含硫氨基酸較髙的巴西果2S白蛋白導(dǎo)入大豆。但是由于巴西果是眾 所周知的過(guò)敏性植物，Nordlee等(NordleeJAetal, NEngl J Med， 1996,334(11): 688-692)對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆中的2S白蛋白進(jìn)行放射變異原吸附測(cè)定、免疫印跡鑒定 及皮試分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因大豆會(huì)導(dǎo)致人的過(guò)敏反應(yīng)。目前在國(guó)內(nèi)外都還未 見(jiàn)釆用基因工程技術(shù)直接導(dǎo)入優(yōu)質(zhì)大豆11S球蛋白基因改良大豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)方面 的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá) 載體及其制法和用途，以克服現(xiàn)有技術(shù)不能針對(duì)性地增加某一種優(yōu)質(zhì)的IIS球蛋白表達(dá)量及采用異源蛋白基因可能導(dǎo)致人體食用產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的缺陷。本發(fā)明的提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體，包括大豆球蛋白基因啟動(dòng) 子、大豆球蛋白基因片段、信號(hào)肽編碼序列、終止子及內(nèi)切酶敏感序列，其特征在于所述大豆球蛋白基因啟動(dòng)子為第一類群大豆US球蛋白基因啟動(dòng)子， 所述大豆球蛋白基因片段為大豆IIS球蛋白Gy7基因片段。所述第一類群大豆11S球蛋白基因啟動(dòng)子可選自Gyl、 Gy2或qy3基因啟 動(dòng)子，優(yōu)選C^1基因啟動(dòng)子。所述大豆llS球蛋白Gy7基因片段可為qy7全基因序列或(^7基因的cDNA編碼序列片段。所述信號(hào)肽編碼序列可在大豆11S球蛋白基因啟動(dòng)子的下游，也可在大豆 IIS球蛋白基因片段的上游。所述終止子優(yōu)選CaMV 35S基因終止子。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無(wú)需通過(guò)特珠的試驗(yàn)即可知道，所述的大豆球蛋白 G/7全基因或者G少7基因的cDNA編碼序列可以指與GenBank序列號(hào)AF319776 基因或是和AF319777同源的基因。本發(fā)明所述的提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體的制備方法，包括如下 步驟1) 釆用PCR方法擴(kuò)增第一類群大豆11S球蛋白基因啟動(dòng)子，然后將擴(kuò)增產(chǎn) 物與T載體連接得中間載體T-1;2) 釆用PCR方法擴(kuò)增下游帶有信號(hào)肽編碼序列的第一類群大豆11S球蛋白 基因啟動(dòng)子，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接得中間載體T-2;3) 采用PCR方法擴(kuò)增大豆llS球蛋白Gy7全基因中信號(hào)肽后的序列或采用 反轉(zhuǎn)錄及PCR方法擴(kuò)增大豆11S球蛋白Gy7基因的cDNA編碼序列中信號(hào)肽后 片段，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接獲得中間載體T-3;4) 采用PCR方法擴(kuò)增上游帶有信號(hào)肽編碼序列的大豆IIS球蛋白Gy7全基 因序列或采用反轉(zhuǎn)錄及PCR方法擴(kuò)增上游帶有信號(hào)肽編碼序列的大豆IIS球蛋 白Gy7基因的cDNA編碼序列，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接獲得中間載體T-4;5) 將中間載體T-1和中間載體T-4或中間載體T-2和中間載體T-3進(jìn)行酶切、 并與基因終止子、植物通用載體其他序列連接，即得本發(fā)明的表達(dá)載體。本發(fā)明的提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體可應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大豆，以獲得本發(fā)明的提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體還可應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大豆，以獲 得無(wú)抗性選擇標(biāo)記基因、無(wú)報(bào)告基因的高含量?jī)?yōu)質(zhì)大豆IIS球蛋白新品種。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下1) 本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)不能快速有效地提高優(yōu)質(zhì)大豆IIS球蛋白含量的 困難，所述表達(dá)載體可利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)直接將優(yōu)質(zhì)的目的大豆球蛋白基因?qū)?大豆，避免了育種上的盲目性；2) 本發(fā)明采用作物自身的優(yōu)質(zhì)基因改良同一種作物，避免了采用異源蛋白 基因有可能導(dǎo)致人體食用產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的缺陷，為今后利用源自于作物本身的 優(yōu)質(zhì)基因進(jìn)行大豆等作物優(yōu)質(zhì)育種的可能性提供重要參考；3) 本發(fā)明的提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化獲得的大豆新品 種，其后代種子中優(yōu)質(zhì)大豆11S球蛋白Gy7基因合成的多肽含量至少比未轉(zhuǎn)化 的對(duì)照大豆增加l倍。本文所用的術(shù)語(yǔ)"C^7基因"是指編碼大豆種子貯藏蛋白中沉降值為IIS的球 蛋白(Glycinin )家族之中的一類球蛋白的基因，比如GenBank序列號(hào)為AF319776 的全基因或者GenBank序列號(hào)為AF319777的mRNA序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)"PCR方法"是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的基因擴(kuò)增方法。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"CaMV 35S基因終止子"是指來(lái)自于花椰菜花葉病毒的35S 終止子。本文所用的術(shù)語(yǔ)"中間載體"是指在目標(biāo)載體制備過(guò)程中獲得的載體。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"T-DNA"是指根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中可轉(zhuǎn)移并整合到寄主植 物細(xì)胞染色體上去的特定DNA片段，亦即一種轉(zhuǎn)位單元。


圖1是pCAMBIA1300質(zhì)粒的T-DNA結(jié)構(gòu)圖，圖中LB、 RB為T-DNA的 左右邊界；35S-pro、 35S-ter為CaMV35S基因啟動(dòng)子和終止子；々pf為潮霉素抗 性基因；Xh為J^oI的縮寫；Bs為5^XI的縮寫；E為五coi I的縮寫；Sa為Sacl 的縮寫；K為/C; M的縮寫；S為Smal的縮寫；B為5amffl的縮寫；X為^feal 的縮寫；Sal為S"/I的縮寫；P為尸wl的縮寫；H為/^"dlI的縮寫；圖2是實(shí)施例1構(gòu)建的表達(dá)載體的T-DNA結(jié)構(gòu)圖，圖中LB、RB為T-DNA 的左右邊界；G/7指大豆球蛋白G/7基因去除信號(hào)肽后全長(zhǎng)序列；Qy7cDNA指 大豆球蛋白qy7基因去除信號(hào)肽后編碼序列；q^-pro-Sl指大豆球蛋白^yl基因啟動(dòng)子和信號(hào)肽；Terminator指基因終止子；圖3是實(shí)施例2構(gòu)建的表達(dá)載體的T-DNA結(jié)構(gòu)圖，圖中LB、 RB為T-DNA 的左右邊界；Qy7-S7指大豆球蛋白G/7基因包含信號(hào)肽全長(zhǎng)序列；Gy7cDNA-S7 指大豆球蛋白G/7基因包含信號(hào)肽所有編碼序列；Gyl-pro指大豆球蛋白@1 基因啟動(dòng)子；Terminator指基因終止子；圖4是pCAMBIA1301質(zhì)粒的T-DNA結(jié)構(gòu)圖，圖中LB、 RB為T-DNA的 左右邊界；35S-pro、 35S-ter為CaMV35S基因啟動(dòng)子和終止子；/2/^為潮霉素抗 性基因；gws為P-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Nos-ter為Nos基因終止子；Xh為A7wl 的縮寫；Bs為&fXI的縮寫；E為的縮寫；Sa為S"cI的縮寫；K為 的縮寫；S為5Vwfll的縮寫；B為J5awffl的縮寫；X為^al的縮寫；Sal為Sa/I 的縮寫；P為戶M的縮寫；H為歷'"c/in的縮寫；圖5是實(shí)施例3構(gòu)建的表達(dá)載體的T-DNA結(jié)構(gòu)圖，圖中LB、RB為T-DNA 的左右邊界；G/7指大豆球蛋白Gy7基因去除信號(hào)肽后全長(zhǎng)序列；G/7cDNA指 大豆球蛋白Gy7基因去除信號(hào)肽后編碼序列；G^W-pro-Sl指大豆球蛋白Qvl基 因啟動(dòng)子和信號(hào)肽；Terminator指基因終止子；35S-pro、 35S-ter為CaMV 35S 基因啟動(dòng)子和終止子；/2^為潮霉素抗性基因；gt/5為|3-葡萄糖醛酸糖苷酶基因； Nos-ter為Nos基因終止子；圖6是實(shí)施例4構(gòu)建的表達(dá)載體的T-DNA結(jié)構(gòu)圖，圖中LB、 RB為T-DNA 的左右邊界；(&7-S7指大豆球蛋白Gy7基因包含信號(hào)肽全長(zhǎng)序列；Gy7cDNA-S7 指大豆球蛋白基因包含信號(hào)肽所有編碼序列；G^-pro指大豆球蛋白Gyl 基因啟動(dòng)子；Terminator指基因終止子；35S-pro、 35S-ter為CaMV 35S基因啟 動(dòng)子和終止子；/^f為潮霉素抗性基因；gws為p-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Nos-ter 為Nos基因終止子。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明 本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。在構(gòu)建載體搡作中涉及的常規(guī)PCR擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶酶切和連接等方法 主要參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(薩姆布魯克J等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)， 科學(xué)出版社，1992)。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件， 或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1a) 根據(jù)Genbank AF319776公布的大豆球蛋白7基因序列設(shè)計(jì)特異PCR 引物，上游引物一端引入XbaI位點(diǎn)，在下游引物一端引入XhoI位點(diǎn)；利用常 規(guī)PCR從大豆(G(Kdwe wox)總DNA中擴(kuò)增約2.2kb大豆球蛋白Qy7基因序列信 號(hào)肽以后的部分；或提取中熟期大豆(Gfydwe附ox)種子RNA，根據(jù)Genbank AF319777公布的大豆球蛋白Gy7基因mRNA序列設(shè)計(jì)特異引物，在上游和下 游引物也分別引入Xbal位點(diǎn)和Xhol位點(diǎn)，采用反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增獲得約 1.6kb^y7基因cDNA片段信號(hào)肽以后的序列；將PCR產(chǎn)物與T載體連接獲得中 間載體T-3，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；利用分子生物學(xué)酶切、PCR等常規(guī)方法檢 測(cè)中間載體T-3;利用Xbal和Xhol對(duì)中間載體T-3進(jìn)行雙酶切后，與 pCAMBIA1300 (簡(jiǎn)稱p1300，來(lái)自于中科院上海植物生理與生態(tài)研究所王宗陽(yáng) 研究員)質(zhì)粒(見(jiàn)圖1所示)Xbal和Xhol雙酶切后回收的大片段進(jìn)行連接形成 pl300-Gy7 (1)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；利用分子生物學(xué)酶切、PCR等常 規(guī)方法檢測(cè)p1300 - Gy7 (1)載體；b) 分別參照GenBankE07850和X15121顯示的大豆IIS球蛋白基因啟 動(dòng)子及基因編碼序列，設(shè)計(jì)一對(duì)能夠與G，yl基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽(-1117 +57) 特異配對(duì)的引物；上游引物一端引入PstI位點(diǎn)，在下游引物一端引入XbaI位點(diǎn)； 以大豆(67yc/we wflw:)總DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得U74bp大小的DNA 片段，將PCR產(chǎn)物與T載體連接獲得中間載體T-2，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌； 利用分子生物學(xué)酶切、PCR等常規(guī)方法檢測(cè)中間載體T-2;利用XbaI和PstI對(duì) 中間載體T-2進(jìn)行雙酶切后，與p1300 - Gy7 (1 )載體Xbal和Pstl雙酶切后回 收的片段進(jìn)行連接形成pl300-Gyl-Sl-Gy7 (1)載體，即目標(biāo)載體-1 (見(jiàn)圖2所 示)。實(shí)施例2a)按照實(shí)施例1的同樣方法，根據(jù)Genbank AF319776公布的大豆球蛋白 C^7基因序列設(shè)計(jì)特異PCR引物，上游引物一端引入XbaI位點(diǎn)，在下游引物一 端引入Xhol位點(diǎn)，利用常規(guī)PCR從大豆(Gfy"Vie附ox)總DNA中擴(kuò)增約2.25kb 大豆球蛋白Gy7基因全序列(從ATG開(kāi)始，帶有Gj;7基因信號(hào)肽)；或提取中 熟期大豆(G7k/"c w做)種子RNA,根據(jù)Genbank AF319777公布的大豆球蛋白 (5v7基因mRNA序列設(shè)計(jì)特異引物，在上游和下游引物也分別引入Xbal位點(diǎn)和 Xhol位點(diǎn)，采用反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增獲得約1.65kbG少7基因cDNA序列(同樣從ATG開(kāi)始，帶有Qy7基因信號(hào)肽);將PCR產(chǎn)物與T載體連接獲得中間載體T-4, 并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；利用分子生物學(xué)酶切、PCR等常規(guī)方法檢測(cè)中間載體 T-4;利用Xbal和Xhol對(duì)中間載體T-4進(jìn)行雙酶切后，與p1300質(zhì)粒(見(jiàn)圖1 所示)Xbal和Xhol雙酶切后回收的大片段進(jìn)行連接形成p1300 - Gy7 ( 2 )載體， 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；利用分子生物學(xué)酶切、PCR等常規(guī)方法檢測(cè)pl300-Gy7 (2)載體；b)參照GenBarikE07850顯示的大豆llS球蛋白Gyl基因啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì) 一對(duì)能夠與Gyl基因啟動(dòng)子(-1117到轉(zhuǎn)錄+1位點(diǎn)前)特異配對(duì)的引物；上游 引物一端引入PstI位點(diǎn)，在下游引物一端引入XbaI位點(diǎn)；以大豆(Gfyc/股w似) 總DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得1117bp大小的DNA片段，將PCR產(chǎn)物與 T載體連接獲得中間載體T-l,并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；利用分子生物學(xué)酶切、 PCR等常規(guī)方法檢測(cè)中間載體T-1;利用XbaI和PstI對(duì)中間載體T-l進(jìn)行雙酶 切后，與pl300-Gy7 (2)載體Xbal和Pstl雙酶切后回收的片段進(jìn)行連接形成 pl300-Gyl-S7-Gy7 (2 )載體，即目標(biāo)載體-2 (見(jiàn)圖3所示)。實(shí)施例3在pCAMBIA1300質(zhì)粒載體(見(jiàn)圖1所示)35S基因終止子下游設(shè)計(jì)PCR 引物， 一端引入PstI酶切位點(diǎn)；利用該引物和原先與( yl基因啟動(dòng)子上游序列 配對(duì)的引物(也帶有Pstl酶切位點(diǎn))對(duì)實(shí)施例1所構(gòu)建的目標(biāo)載體一 pl300-Gyl-Sl-Gy7 (1)載體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含有基因啟動(dòng)子及信號(hào) 肽和Gy7基因序列及35S基因終止子，將PCR產(chǎn)物與T載體連接獲得載體2， 并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；利用分子生物學(xué)酶切、PCR等常規(guī)方法檢測(cè)載體2;將 載體2利用Pstl酶切，回收酶切后的大片段，并與pCAMBIA1301 (簡(jiǎn)稱pl301， 來(lái)自于中科院上海植物生理與生態(tài)研究所王宗陽(yáng)研究員)質(zhì)粒(見(jiàn)圖4所示) 經(jīng)PstI酶切產(chǎn)物連接；采用PCR、酶切及測(cè)序鑒定，形成pl301-Gyl-Sl-Gy7(1) 載體，即目標(biāo)載體-3 (見(jiàn)圖5所示)。實(shí)施例4a)按照實(shí)施例3的同樣方法，在pCAMBIA1300質(zhì)粒載體(見(jiàn)圖1所示) 35S基因終止子下游設(shè)計(jì)PCR引物， 一端引入PstI酶切位點(diǎn)；利用該引物和原 先與Qyl基因啟動(dòng)子上游序列配對(duì)的引物(也帶有Pstl酶切位點(diǎn))對(duì)實(shí)施例2 所構(gòu)建的目標(biāo)載體一pl300-Gyl-S7-Gy7 (2)載體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含有Gyl 基因啟動(dòng)子和Gy7基因序列DNA及35S基因終止子；將PCR產(chǎn)物與T載體連接獲得載體3，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；利用分子生物學(xué)酶切、PCR等常規(guī)方法 檢測(cè)載體3;將載體3利用Pstl酶切，回收酶切后的大片段，并與p1301質(zhì)粒(見(jiàn) 圖4所示)經(jīng)Pstl酶切產(chǎn)物連接；采用PCR、酶切及測(cè)序鑒定，形成 pl301-Gyl-S7-Gy7 (2)載體，即目標(biāo)載體-4 (見(jiàn)圖6所示)。 實(shí)施例5分別利用目標(biāo)載體-3和目標(biāo)載體-4單質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大豆或者利用目標(biāo)載體-1和 目標(biāo)載體-2與含有抗性基因、報(bào)告基因的pCAMBIA1301質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化大豆。 在轉(zhuǎn)基因大豆開(kāi)花后的25-30天，釆用RT-PCR即可以從幼嫩種子中檢測(cè)到 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而在非轉(zhuǎn)基因大豆中無(wú)C^7基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，由此說(shuō)明利用 Qyl基因啟動(dòng)子引導(dǎo)基因可使優(yōu)質(zhì)的G/7基因產(chǎn)物提前表達(dá)。參照Natarajan (Natarajan et al, Anal Biochem. 2005, 342(2):214 ~ 220 )報(bào)道方法定量提取轉(zhuǎn) 基因和對(duì)照成熟大豆種子蛋白質(zhì)，結(jié)合釆用等電聚焦電泳和SDS-PAGE檢測(cè)G7 蛋白，并根據(jù)Beilinson等(Beilinson V et al， Theor Appl Genet, 2002， 104: 1132 ~ 1140)報(bào)道中描述的G7蛋白前體、酸性肽和堿性肽等電點(diǎn)及相應(yīng)的分子量，利 用凝膠圖像分析儀確定在轉(zhuǎn)基因成熟大豆種子中G7蛋白表達(dá)量至少比非轉(zhuǎn)基因 對(duì)照大豆種子增加l倍。
權(quán)利要求
1.一種提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體，包括大豆球蛋白基因啟動(dòng)子、大豆球蛋白基因片段、信號(hào)肽編碼序列、終止子及內(nèi)切酶敏感序列，其特征在于所述大豆球蛋白基因啟動(dòng)子為第一類群大豆11S球蛋白基因啟動(dòng)子，所述大豆球蛋白基因片段為大豆11S球蛋白Gy7基因片段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體，其特征 在于所述第一類群大豆11S球蛋白基因啟動(dòng)子為Gyl、 Qy2或C^3基因啟動(dòng)子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體，其特征 在于所述第一類群大豆IIS球蛋白基因啟動(dòng)子為GW基因啟動(dòng)子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體，其特征 在于所述大豆11S球蛋白Gy7基因片段為C^7全基因序列或G;/7基因的cDNA 編碼序列片段。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體，其特征 在于所述信號(hào)肽編碼序列在第一類群大豆IIS球蛋白基因啟動(dòng)子的下游。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體，其特征 在于所述信號(hào)肽編碼序列在大豆IIS球蛋白Gy7基因片段的上游。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體，其特征 在于所述終止子為CaMV35S基因終止子。
8. —種權(quán)利要求l所述的提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體的制備方 法，其特征在于，所述方法包括如下步驟1) 采用PCR方法擴(kuò)增第一類群大豆IIS球蛋白基因啟動(dòng)子，然后將擴(kuò)增產(chǎn) 物與T載體連接得中間載體T-1;2) 采用PCR方法擴(kuò)增下游帶有信號(hào)肽編碼序列的第一類群大豆11S球蛋白 基因啟動(dòng)子，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接得中間載體T-2;3) 采用PCR方法擴(kuò)增大豆llS球蛋白Gy7全基因中信號(hào)肽后的序列或采用 反轉(zhuǎn)錄及PCR方法擴(kuò)增大豆11S球蛋白Gy7基因的cDNA編碼序列中信號(hào)肽后 片段，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接獲得中間載體T-3;4) 釆用PCR方法擴(kuò)增上游帶有信號(hào)肽編碼序列的大豆llS球蛋白Gy7全基 因序列或采用反轉(zhuǎn)錄及PCR方法擴(kuò)增上游帶有信號(hào)肽編碼序列的大豆IIS球蛋白Gy7基因的cDNA編碼序列，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接獲得中間載體T-4; 5)將中間載體T-1和中間載體T-4或中間載體T-2和中間載體T-3進(jìn)行酶切、并與基因終止子、植物通用載體其他序列連接，即得本發(fā)明的表達(dá)載體。
9. 一種權(quán)利要求l所述的提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體的用途， 其特征在于，所述表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化大豆，以獲得高含量?jī)?yōu)質(zhì)大豆US球蛋白 新品種。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體的用途， 其特征在于，所述表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化大豆，以獲得無(wú)抗性選擇標(biāo)記基因、無(wú)報(bào) 告基因的高含量?jī)?yōu)質(zhì)大豆11S球蛋白新品種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種提高大豆蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的表達(dá)載體及其制法和用途，所述表達(dá)載體包括大豆球蛋白基因啟動(dòng)子、大豆球蛋白基因片段、信號(hào)肽編碼序列、終止子及內(nèi)切酶敏感序列，所述大豆球蛋白基因啟動(dòng)子為第一類群大豆11S球蛋白基因啟動(dòng)子，所述大豆球蛋白基因片段為大豆11S球蛋白Gy7基因片段。本發(fā)明的表達(dá)載體可應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大豆，獲得高含量?jī)?yōu)質(zhì)大豆11S球蛋白新品種和無(wú)抗性選擇標(biāo)記基因、無(wú)報(bào)告基因的高含量?jī)?yōu)質(zhì)大豆11S球蛋白新品種。本發(fā)明避免了育種上的盲目性和采用異源蛋白基因有可能導(dǎo)致人體食用產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的缺陷，所轉(zhuǎn)化獲得的大豆后代種子中優(yōu)質(zhì)大豆11S球蛋白Gy7基因合成的多肽含量至少比未轉(zhuǎn)化的對(duì)照大豆增加1倍。
文檔編號(hào)A01H1/00GK101250551SQ20081003571
公開(kāi)日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2008年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月8日
發(fā)明者李建粵, 帆 王, 石少華, 剛 肖, 慧 逯, 顧婷玉 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)