專利名稱：：一種東方百合組織培養(yǎng)脫毒的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于植物栽培
技術領域：
，具體涉及一種東方百合組織培養(yǎng)脫毒的方法。
背景技術：
：東方百合"/7/咖spp,cv.orientalhybrids)是百合屬中的一個雜交品系，是國際巿場上最受歡迎的球根花卉之一。由于巿場的巨大需求，我國每年要從國外大量進口東方百合開花球和種植母本，僅以2006年為例，進口開花球約'7000萬頭、種植母本約800萬頭。不僅耗費大量外匯，而且增加了企業(yè)的經營成本和風險。'目前，東方百合種苗的人工培育均釆用常規(guī)的植物組織培養(yǎng)方法，即以鱗片為外植體，先誘導愈傷組織，轉接后使愈傷組織分化出根和莖，進而培養(yǎng)成瓶苗。但如果外植體帶病毒，則該方法只能降低種苗的病毒含量，難以使種苗徹底脫除病毒。病毒會在鱗莖逐年種植中積累，造成種球品質和優(yōu)良性狀的退化。同時，瓶苗移栽后還必須經過練苗過程，以使幼苗緩慢適應移栽環(huán)境。此時幼苗的成活率主要取決于練苗設施的好壞和管理者的精細程度，不僅生產周期過長，而且增加了生產管理的成本。根據報道，目前有12種病毒能夠危害東方百合生長，其中百合花葉病毒(LiMV)、百合無癥病毒(LSV)和黃瓜花葉病毒(CMV)是危害最嚴重的病毒，如果脫掉這三種病毒，便可以基本保證百合的品質。目前國內外有關百合的脫毒處理都是單獨采用莖尖、藥物或熱處理方法，這些方法效率低，脫毒效果差，大多脫毒率在30%以下。近年來有采取株芽用熱水('50土1)。C處理40分鐘后，切取莖尖的方法，雖獲得了一定的效果，但組織培養(yǎng)球在5(TC的高溫下處理40分鐘后，其成活率較低；同時由于珠芽未經消毒，經熱處理和切除莖尖后，也難以保證不受污染。迄今為止，現(xiàn)有技術中尚未見能有效克服上述問題的方法報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種成本低廉，效果顯著的東方百合組織培養(yǎng)脫毒方法。本發(fā)明的目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)。一種東方百合組織培養(yǎng)脫毒的方法，該方法采用以下步驟1、在生長后期選擇生長健壯的東方百合植株，取出鱗莖，從鱗莖上分下鱗片，并用清水清洗、消毒后，在無菌條件下，將鱗片分切為3~5塊，將切好的鱗片置于發(fā)生培養(yǎng)基上進行無菌培養(yǎng)，設定培養(yǎng)溫度為22°C~25。C、光照強度為10001x40001x,培養(yǎng)60天后誘導出不定芽；2、將不定芽轉接到生長培養(yǎng)基上，在人工氣候培養(yǎng)箱中變溫培養(yǎng)30天，所述的變溫培養(yǎng)條件為每天在溫度為37°C、光照強度為10001x40001x的條件下培養(yǎng)12小時，在溫度為22'C、黑暗環(huán)境下培養(yǎng)12小時，兩者交替進行；3、經過30天變溫處理后，在無菌條件下，切取0.8~1.Omm莖尖移植到生長培養(yǎng)基中繼續(xù)變溫培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照/黑暗各12小時交替進行，光照時，培養(yǎng)溫度為22。C~25°C、光照強度為10001x40001x;黑暗時，溫度為22°C~25°C;培養(yǎng)30~60天后，便可得到所需的無毒株系。所述的發(fā)生培養(yǎng)基為含萘乙酸(NAA)0.05-0.lmg/L、含蔗糖7%~9%、含瓊脂0.65%的MS高鹽培養(yǎng)基或1/2MS高鹽培養(yǎng)基。所述的生長培養(yǎng)基為含萘乙酸(NAA)0.05~0.lmg/L、含蔗糖7%~9%、含瓊脂0.65%的1/2~1/5MS高鹽培養(yǎng)基。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點l.通過在變溫處理條件下保證組織培養(yǎng)球的生長，同時鈍化病毒，減少病毒轉移到莖尖，保證生長點不帶毒，然后切取0.8-1.Omm莖尖培養(yǎng)，來到達脫毒的目的。2.脫毒效果顯著，效率高，一般品種可達到90/。~100%。具體實施方式為了更好地理解本發(fā)明的實質，下面結合實施例和實驗例對本發(fā)明作進一步說明，但它們不是對本發(fā)明的限制。實施例1在9月份選擇生長健壯的東方百合植株，取出鱗莖，從鱗莖上分下鱗片，并用清水清洗、消毒后，在無菌條件下，將鱗片分切成3~5小快，將切好的鱗片置于發(fā)生培養(yǎng)基上進行無菌培養(yǎng)，設定培養(yǎng)溫度為23.5°C、光照強度為2000~30001x,培養(yǎng)60天后誘導出不定芽；將不定芽轉接到生長培養(yǎng)基上，在人工氣候培養(yǎng)箱中變溫培養(yǎng)30天，所述的變溫培養(yǎng)為每天分別在溫度為37°C、光照強度^00-30001x下培養(yǎng)12小時，在溫度為22。C、黑暗環(huán)境下培養(yǎng)U小時，兩者交替進行；經過30天變溫處理后，在無菌條件下，切取0.8mm莖尖，移植到生長培養(yǎng)基中繼續(xù)變溫培養(yǎng)30-60天，便可得到所需的無毒株系。培養(yǎng)條件為光照/黑暗各12小時交替進行，光照時，培養(yǎng)溫度為22°C~25°C、光照強度為10001x~40001x;黑暗時，溫度為22°C~25。C。其中所述的發(fā)生培養(yǎng)基為含萘乙酸(NAA)0.05~0.lmg/L、含蔗糖7%~9%、含瓊脂0.65%的MS高鹽培養(yǎng)基或1/2MS高鹽培養(yǎng)基。所述的生長培養(yǎng)基為含萘乙酸(NAA)0.05~0.lmg/L、含蔗糖7%~9%、含瓊脂0.65%的1/2~1/5MS高鹽培養(yǎng)基。所述的MS高鹽培養(yǎng)基配方見附表1表lMS高鹽培養(yǎng)基配方<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2重復實施例l，有以下不同點分切好的鱗片置于22匸條件下培養(yǎng)。實施例3重復實施例l,有以下不同點分切好的鱗片置于25匸條件下培養(yǎng)。實施例4重復實施例1，有以下不同點分切好的鱗片置于光照強度1000~20001x條件下培養(yǎng)。實施例5重復實施例1,有以下不同點分切好的鱗片置于光照強度3000~40001x條件下培養(yǎng)。實施例6重復實施例l,有以下不同點將不定芽轉接到生長培養(yǎng)基上，在人工氣候培養(yǎng)箱中變溫培養(yǎng)30天，所述的變溫培養(yǎng)條件為每天在溫度為37°C、光照強度為10001x20001x的條件下培養(yǎng)12小時；在溫度為22°C、黑暗環(huán)境下培養(yǎng)12小時，兩者交替進行。實施例7重復實施例l,有以下不同點將不定芽轉接到生長培養(yǎng)基上，在人工氣候培養(yǎng)箱中變溫培養(yǎng)30天，所述的變溫培養(yǎng)條件為每天在溫度為37°C、光照強度為30001x40001x的條件下培養(yǎng)12小時；在溫度為22°C、黑暗環(huán)境下培養(yǎng)12小時，兩者交替進行。實施例8重復實施例l，有以下不同點不定芽經過30天變溫處理后，在無菌條件下，切取l.Omm莖尖，移植到生長培養(yǎng)基中變溫培養(yǎng)。實施例9重復實施例l,有以下不同點不定芽經過30天變溫處理后，在無菌條件下，切取0.9mm莖尖，移植到生長培養(yǎng)基中變溫培養(yǎng)。實驗例(l)材料供實品種為索爾邦(Sorbone),帝撥(Tiber)和西北利亞(Siberia)三個品種，經血清和分子檢測分別帶有百合花葉病毒(LiMV)、百合無癥病毒(LSV)和黃瓜花葉病毒(CMV)的種球。(2)方法按實施例1所述方法將帶毒的種球，通過鱗片培養(yǎng)，獲得帶毒的組織培養(yǎng)苗，將帶毒的培養(yǎng)球轉移到新的培養(yǎng)瓶中，每瓶5粒，每種病毒轉接種5瓶，其中1瓶作為對照放置在22'C12小時光照/12小時黑暗中培養(yǎng)。其余4瓶放置在人工氣候箱中培養(yǎng)30天，培養(yǎng)期間，設定溫度變化為37°C、光照培養(yǎng)12小時，22'C、黑暗培養(yǎng)12小時，培養(yǎng)1月后，在無菌條件下切取0.8~1.Oinm莖尖進行培養(yǎng)，培養(yǎng)2月后進行病毒檢測。(3)結果表l:脫毒處理后脫毒率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結果表明，組織培養(yǎng)球經變溫處理30天后，切取O.81.0mra莖尖培養(yǎng)的脫毒效果最好，百合花葉病毒(LiMV)、百合無癥病毒(LSV)脫毒率達100%,黃瓜花葉病毒(CMV)脫毒率達90%以上。權利要求1、一種東方百合組織培養(yǎng)脫毒的方法，該方法采用以下步驟(1)在生長后期選擇生長健壯的東方百合植株，取出鱗莖，從鱗莖上分下鱗片，并用清水清洗、消毒后，在無菌條件下，將鱗片分切為3～5塊，將切好的鱗片置于發(fā)生培養(yǎng)基上進行無菌培養(yǎng)，設定培養(yǎng)溫度為22℃～25℃、光照強度為1000lx～4000lx，培養(yǎng)60天后誘導出不定芽；(2)將不定芽轉接到生長培養(yǎng)基上，在人工氣候培養(yǎng)箱中變溫培養(yǎng)30天，所述的變溫培養(yǎng)條件為每天在溫度為37℃、光照強度為1000lx～4000lx的條件下培養(yǎng)12小時，在溫度為22℃、黑暗環(huán)境下培養(yǎng)12小時，兩者交替進行；(3)經過30天變溫處理后，在無菌條件下，切取0.8～1.0mm莖尖移植到生長培養(yǎng)基中繼續(xù)變溫培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照/黑暗各12小時交替進行，光照時，培養(yǎng)溫度為22℃～25℃、光照強度為1000lx～4000lx；黑暗時，溫度為22℃～25℃；培養(yǎng)30～60天后，便可得到所需的無毒株系。2、根據權利要求1所述的脫毒方法，其特征在于所述的發(fā)生培養(yǎng)基為含萘乙酸(NAA)0.05~0.lmg/L、含蔗糖7%~9%、含瓊脂0.65。/。的MS高鹽培養(yǎng)基或1/2MS高鹽培養(yǎng)基。3、根據權利要求1所述的脫毒方法，其特征在于所述的生長培養(yǎng)基為含萘乙酸(NAA)O.05~0.lmg/L、含蔗糖7%~9%、含瓊脂0.65%的1/2-1/5MS高鹽培養(yǎng)基。全文摘要本發(fā)明公開了一種東方百合組織培養(yǎng)脫毒的方法，選擇健康的百合鱗片分切后誘導出不定芽，將不定芽轉接到生長培養(yǎng)基上，變溫培養(yǎng)30天后，切取莖尖移植到生長培養(yǎng)基中繼續(xù)變溫培養(yǎng)30～60天后，便可得到所需的無毒株系。本發(fā)明脫毒效果顯著，效率高，一般品種可達到90％～100％。其操作簡便，成本低廉，具有良好的應用前景。文檔編號A01H4/00GK101156552SQ200710066339公開日2008年4月9日申請日期2007年11月2日優(yōu)先權日2007年11月2日發(fā)明者丁元明,捷和,和蓮彩,寸東義,楊紅梅,勁熊,熊燦坤申請人:云南格?；ɑ苡邢挢熑喂?