專利名稱：索爾邦百合組培培養(yǎng)基及其快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速繁殖百合組織培養(yǎng)苗的方法，包括選取索爾邦百合外植體部位，誘導(dǎo)、增殖繼代、生根培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)時(shí)間、條件及組培苗移栽的條件。
背景技術(shù)：
百合(Lilium tenuifolium Fisch)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)植物的統(tǒng)稱，百合是世界著名的觀賞花卉，同時(shí)又有藥用及食用價(jià)值。索爾邦百合(Sorbonne)屬于東方百合雜種系(The Oriental Hybrids)，為百合中的名貴品種群，由于其花色艷麗、花形奇特、芳香宜人而深受人們的喜愛，成為近年國內(nèi)外市場熱銷的花卉種類之一，東方百合是通過雜交育種選育出來的，種子高度敗育，常采用傳統(tǒng)的鱗莖球繁殖方法，繁殖速度緩慢，在短期內(nèi)難以滿足市場需求，目前國內(nèi)主要通過進(jìn)口種球進(jìn)行生產(chǎn)，為了降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)種球的自主繁育，進(jìn)行組織培養(yǎng)與快速繁殖已十分必要，并且在百合的優(yōu)良品種快速繁殖、脫毒復(fù)壯、新品種培育以及應(yīng)用生物技術(shù)進(jìn)行分子育種中，組織培養(yǎng)都是比較合宜的方法，百合許多器官和組織都可進(jìn)行組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗，索爾邦百合采用花絲、花托、子房等花器官進(jìn)行離體培養(yǎng)的研究有報(bào)導(dǎo)，但采用鱗莖球快繁的未見報(bào)導(dǎo)。而花器官作外植體取材易受開花期的限制，不能常年進(jìn)行組培生產(chǎn)，而鱗莖球卻不受此制約，可連年取材進(jìn)行組培生產(chǎn)。
組培快繁技術(shù)有一些報(bào)道如CN1631111斑葉蘭組培培養(yǎng)基及其快速繁殖方法，包括基本培養(yǎng)基及分別適用于不同組培階段的誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基壯苗培養(yǎng)、基生根培養(yǎng)基。CN1460409A報(bào)道了蘭州百合的快速繁殖方法，選取蘭州百合的鱗片、葉和根的切段，經(jīng)外植體消毒后，接入含不同植物激素的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)產(chǎn)生芽，繼代培養(yǎng)后接入生根培養(yǎng)基，當(dāng)試管苗高3-5cm時(shí)移栽入種植練苗，鱗片和不定芽的誘導(dǎo)和繁殖培養(yǎng)基為MS BA2mg/L、NAA0.2mg/L，根、葉誘導(dǎo)和繁殖培養(yǎng)基為MS BA2mg/L、NAA0.4mg/L，試管苗生根培養(yǎng)基為1/2MS NAA0.3mg/L，溫度27±2℃，光照為12h.d-1，pH5.8。
上述培養(yǎng)基和方法不能針對索爾邦百合Sorbonne(粉紅色)的鱗莖球的鱗片作外植體。國外引進(jìn)的索爾邦百合其快繁配方明顯不同于我國的本土品種蘭州百合的快繁方法，而這種索爾邦百合是東方百合中熱銷的品種，具有良好的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此其快繁方法有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用植物組織培養(yǎng)方法，短時(shí)間內(nèi)獲得室內(nèi)大規(guī)模繁殖的百合組培苗，或是應(yīng)用于花卉的工廠化生產(chǎn)，或是用作轉(zhuǎn)基因時(shí)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，并克服了傳統(tǒng)鱗莖繁殖倍數(shù)低，速度慢的缺點(diǎn)，同時(shí)改變了以花器官為外植體受花期限制的不足，可常年提供組培苗的新的繁殖方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是選取索爾邦百合鱗片葉為外植體，經(jīng)消毒后切塊接入含不同植物激素的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出愈傷及芽叢，經(jīng)繼代培養(yǎng)基增殖后，當(dāng)苗高3-6cm以上并且基部鱗莖球形成時(shí)移入生根培養(yǎng)基，經(jīng)練苗5-8天后移栽入基質(zhì)中。
本發(fā)明所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2，4-D 1.0～2.0mg/L和MS+BA 1.5mg/L+NAA0.2mg/L；增殖培養(yǎng)基為MS+2，4-D 1.0～1.5mg/L和MS+BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L；生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.2mg/L和NAA0.2mg/L。培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度22～26℃，光照度2000～2200lx，最優(yōu)條件選光照10-14h.d-1，pH5.5-6.2.
本發(fā)明以索爾邦百合Sorbonne(粉紅色)鱗莖球的鱗片作外植體，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后經(jīng)80-100d，誘導(dǎo)出愈傷與芽叢，增值出新植株，又經(jīng)繼代增值培養(yǎng)基培養(yǎng)約30-40d后愈傷增值又新增出更多的芽及愈傷，長大的苗經(jīng)生根培養(yǎng)基培養(yǎng)約40-50d后生出大量根系，即再生出完整植株，經(jīng)練苗移栽入基質(zhì)中。每次繼代增值芽數(shù)達(dá)到了約2-3倍。即從接入外植體后經(jīng)歷約150-180d(加上生根和練苗時(shí)間)芽增殖倍數(shù)達(dá)到了1∶5～7以上(每個(gè)3mm×3mm3的外植體塊經(jīng)歷一次繼代至少可獲得5-7株苗)。該方法繁殖速度快，繁殖倍數(shù)大，優(yōu)于傳統(tǒng)的分株繁殖方法。
本發(fā)明的特點(diǎn)是利用植物組織培養(yǎng)方法，短時(shí)間內(nèi)獲得室內(nèi)大規(guī)模繁殖的優(yōu)質(zhì)百合組培苗，可應(yīng)用于花卉的工廠化生產(chǎn)，本發(fā)明確定的三種培養(yǎng)基配方，具有良好的作用。
具體實(shí)施例方式
1.百合無菌鱗莖球外植體的處理中國芊卉種苗公司購買的國外進(jìn)口的百合鱗莖球，先經(jīng)自來水流水沖洗2h后，用細(xì)軟毛刷刷去泥土沖洗干凈，把鱗莖球中的鱗片葉剝下后，剔出病殘者，挑選靠近鱗莖盤基部的幼嫩鱗片葉，用刀修整，剔除菌斑及瑕眥，放入培養(yǎng)皿中待用。在超凈工作臺上，用75％酒精浸泡30s，用無菌水漂洗后再放入0.1％Agcl2(0.02％吐溫)中浸泡5-8min，用無菌水漂洗5次后，放入無菌的培養(yǎng)皿中用滅菌的濾紙吸干水分，切成3mm×3mm的小塊作外植體備用。
2.百合組培的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件包括基本培養(yǎng)基附加不同激素組合，適用于不同組培階段的培養(yǎng)基組成，具體各階段培養(yǎng)基如下①基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均加入0.55％瓊脂，3％蔗糖，pH5.8，培養(yǎng)溫度22～26℃，光照度2000～2200lx，光照12h.d-1；②誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2，4-D 1.0～2.0mg/L和MS+BA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L的一種；③增殖培養(yǎng)基MS+2，4-D 1.0～1.5mg/L和MS+BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L中的一種；④生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA0.2mg/L和1/2MS+NAA0.2mg/L中的一種。
3.百合鱗片愈傷、芽的誘導(dǎo)、繼代及生根過程在超凈工作臺上，將由步驟1獲得的外植體小塊背面朝下放在誘導(dǎo)基①中，在組織培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)一周后進(jìn)行光照培養(yǎng)，20d左右時(shí)鱗片表面及切口處出現(xiàn)白色及淺綠色突起，40-45d后在突起中誘導(dǎo)出芽叢，同時(shí)基部淡黃綠色愈傷組織長大。培養(yǎng)至80-100d愈傷組織中一部分發(fā)出芽叢，還有一部分繼續(xù)增殖長大，培養(yǎng)至120d時(shí)將高度生長至5cm以上并生出鱗莖球的小苗移至生根培養(yǎng)基中生根，其它在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的愈傷組織部分可經(jīng)切割后移至增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)誘導(dǎo)，繼代產(chǎn)生大量的愈傷和芽叢。繼代培養(yǎng)每隔30-40d進(jìn)行一次，每次繼代芽的增殖達(dá)到了2-3倍，愈傷的增殖達(dá)到了3-4倍，增殖循環(huán)不斷進(jìn)行下去就達(dá)到的擴(kuò)繁的目的。
在組織培養(yǎng)室培養(yǎng)期間注意觀察，隨時(shí)剔除污染的材料，以免交叉感染。
4.練苗及移栽移入生根培養(yǎng)基中的苗經(jīng)40-50d生長出大量根系，并且苗基部的鱗莖球發(fā)育至直徑達(dá)3mm，就可敞開瓶口在培養(yǎng)室中練苗。一周后，用流動水清洗干凈根系上的培養(yǎng)基，移入事先噴灑過0.2％達(dá)克寧的基質(zhì)(沙∶花肥∶椰糠為1∶1∶1)中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為25℃，平均光照強(qiáng)度2000lx，每日光照12h。每隔兩天澆水，培養(yǎng)15d后再移入花盆或大田中生長。
本發(fā)明的效果在于1)獲得了百合的無菌苗。百合鱗莖本身帶有許多雜菌和病毒，該方法經(jīng)自來水流水沖洗2h后，又經(jīng)人工用毛刷清洗，初步降低污染，然后通過75％酒精和Agcl2徹底滅菌，在超凈工作臺上進(jìn)行系列無菌操作，獲得了再生的無菌苗，該無菌苗可用作轉(zhuǎn)基因研究中的轉(zhuǎn)化受體，該方法可達(dá)到接種無菌率75％，存活率60％以上。
2)建立了百合組培苗的快速繁殖途徑。百合經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后生出了愈傷和新的芽叢，每隔30-40d繼代1次的頻率，即從接入外植體后經(jīng)歷約150-180d(加上生根和練苗時(shí)間)芽增殖倍數(shù)達(dá)到了1∶5～7以上(每個(gè)3mm×3mm3的外植體塊經(jīng)歷一次繼代至少可獲得5-7株苗)。而每個(gè)新生的無菌小苗，可繼續(xù)進(jìn)行以上的增殖培養(yǎng)。技術(shù)簡單，操作方便，而且所用的試劑均為常規(guī)化工產(chǎn)品，成本低廉，有利于大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)。
3)本項(xiàng)發(fā)明可不分季節(jié)，可隨時(shí)提供健康的百合無菌小苗。該方法克服傳統(tǒng)的鱗莖球繁殖方法繁殖速度緩慢的缺點(diǎn)，即使百合的工廠化生產(chǎn)成為可能，也為轉(zhuǎn)基因等生物工程方面的研究提供無菌小苗或愈傷。
上述實(shí)施例說明本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例1
1材料與方法如上具體實(shí)施方式
中1和2所述2結(jié)果2.1百合鱗片不定芽的誘導(dǎo)鱗片塊接入培養(yǎng)基在組織培養(yǎng)室中先暗培養(yǎng)7d，約15d左右鱗片顏色由白變成綠色，20d時(shí)鱗片表面及切口處出現(xiàn)白色及淺綠色突起，每個(gè)鱗片上有數(shù)個(gè)這種突起，40-45d時(shí)突起上長出很密的綠色的芽叢同時(shí)鱗片基部出現(xiàn)的愈傷組織并增大，至70-80d已出的芽叢繼續(xù)長高，而基部愈傷在生長的同時(shí)又出現(xiàn)新的芽點(diǎn)及芽叢。至60d(約8周)四個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)基芽的分化率都大于40％。誘導(dǎo)培養(yǎng)情況見表1。芽叢在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上能正常生長說明誘導(dǎo)培養(yǎng)基也能繼續(xù)培養(yǎng)愈傷與芽叢的共生體，培養(yǎng)時(shí)的120d(約17周)結(jié)果如表2所示。
表1不同激素含量培養(yǎng)基60d誘導(dǎo)芽分化情況

表2誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長120d時(shí)芽的生長情況

2.2繼代增殖培養(yǎng)120d時(shí)，將高度為大于5cm并且基部鱗莖球已形成的苗接入生根培養(yǎng)基，其余的愈傷和小芽叢切成小塊，接入不同的芽增殖培養(yǎng)基中繼代增殖，培養(yǎng)約40d后，便又形成新的從生芽，同時(shí)愈傷還在繼續(xù)增大，同時(shí)芽在長大過程中鱗莖球也在形成、生長，每次繼代芽的增殖倍數(shù)如表3所示。
表3不同激素含量培養(yǎng)基繼代增殖結(jié)果

2.3生根將苗高達(dá)5cm以上且基部鱗莖球達(dá)到直徑3mm的無菌苗移入生根培養(yǎng)基中，經(jīng)40d后，生根情況見表4，其中的效果較好的培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.2mg/L、1/2MS+IBA0.2mg/L。
表4不同激素含量生根培養(yǎng)基繼代增殖結(jié)果

2.4練苗及移栽移入生根培養(yǎng)基中的苗15d開始生根，經(jīng)40-50d生長出大量根系，并且苗基部的鱗莖球發(fā)育至直徑達(dá)3mm，就可敞開瓶口在培養(yǎng)室中練苗。一周后，用流動水清洗干凈根系上的培養(yǎng)基，移入事先噴灑過0.2％達(dá)克寧的基質(zhì)(沙∶花肥∶椰糠比為1∶1∶1)中，放入培養(yǎng)箱中，溫度為25℃，平均光照強(qiáng)度2000lx，每日光照12h。每隔兩天澆水管理，15d后再移入花盆或大田中生長。
3討論 本培養(yǎng)經(jīng)歷初代培養(yǎng)中短暫愈傷階段很快就進(jìn)入芽叢階段，可以說愈傷與芽叢是共生的，MS+2，4-D 1.0～1.5mg/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷效果很好，誘導(dǎo)芽密度大，但苗的健壯成度比在MS+BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L誘導(dǎo)的差。而在MS+BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L繼代培養(yǎng)的芽密度中等，增殖倍數(shù)較好芽更健壯。因此若為轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)時(shí)愈傷增殖用MS+2，4-D 1.0～1.5mg/L繼代最好，而為獲得無菌組培苗可選用MS+BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L繼代最好。經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)120d后每隔30-40d進(jìn)行繼代增殖，達(dá)到每個(gè)外植體新生芽5-7株，其中愈傷增殖倍數(shù)也達(dá)到了3-4倍。
權(quán)利要求
1.索爾邦百合組培培養(yǎng)基及其快速繁殖方法，其特征是該方法由以下步驟組成選取索爾邦百合鱗片葉為外植體，經(jīng)消毒后切塊接入含不同植物激素的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出愈傷及芽叢，經(jīng)繼代培養(yǎng)基增殖后，當(dāng)苗高3-6cm以上并且基部鱗莖球形成時(shí)移入生根培養(yǎng)基，經(jīng)練苗5-8d后移栽入基質(zhì)中。
2.由權(quán)利要求1所述的索爾邦百合組培培養(yǎng)基及其快速繁殖方法，其特征是所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用如下配方MS+2，4-D 1.0～2.0mg/L和MS+BA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L；增殖培養(yǎng)基為MS+2，4-D 1.0～1.5mg/L和MS+BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L；生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.2mg/L和NAA0.2mg/L。培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度22～26℃，光照度2000～2200lx，光照10-14h.d-1，pH5.5-6.2。
3.由權(quán)利要求1或2所述的索爾邦百合組培培養(yǎng)基及其快速繁殖方法，其特征是組織培養(yǎng)的條件為培養(yǎng)溫度22～26℃，光照度2000～2200lx，光照10-14h.d-1
4.由權(quán)利要求1或2所述的索爾邦百合組培培養(yǎng)基及其快速繁殖方法，其特征是當(dāng)移入生根培養(yǎng)基中的苗經(jīng)40-50d根系生長基本完成，并且苗基部的鱗莖球發(fā)育至直徑達(dá)3mm，就可敞開瓶口在培養(yǎng)室中練苗，一周后，用流動水清洗干凈根系上的培養(yǎng)基，移入事先噴灑過0.2％達(dá)克寧的基質(zhì)中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為25℃，平均光照強(qiáng)度2000lx，每日光照12h；每隔兩天澆水培養(yǎng)，15d后再移入花盆中生長備用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。運(yùn)用組織培養(yǎng)方法，通過室內(nèi)擴(kuò)繁獲得大量的索爾邦百合無菌組培苗。選取索爾邦百合鱗片葉為外植體，經(jīng)消毒后切塊接入含不同植物激素的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出愈傷及芽叢，經(jīng)繼代培養(yǎng)基增殖后，當(dāng)苗高5cm以上并且基部鱗莖球形成時(shí)移入生根培養(yǎng)基，經(jīng)煉苗7天后移栽入基質(zhì)中。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2，4－D1.0～2.0mg/L和MS+BA1.5mg/L+NAA 0.2mg/L；增殖培養(yǎng)基為MS+2，4－D 1.0～1.5mg/L和MS+BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L；生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.2mg/L和NAA0.2mg/L。培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度22～26℃，光照度2000～2200lx，光照12h.d
文檔編號A01G7/00GK1810097SQ20051013497
公開日2006年8月2日 申請日期2005年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月31日
發(fā)明者陳建群, 張偉麗, 金欣慶, 袁慧中, 經(jīng)志強(qiáng) 申請人:南京大學(xué)