專利名稱：一種新型低毒農作物殺菌劑的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種金屬有機化合物殺菌劑，特別是涉及一種毒性低且對農作物病害具有防治作用的甲殼低聚糖金屬配合物殺菌劑的制備方法。該殺菌劑對作物病原菌有顯著抑制作用且具有SOD樣活性作用，可提高作物的抗逆性能。
背景技術：
在農用殺菌劑中開發(fā)最早，使用時間最長、應用面積最大、殺菌效果最好的品種就是銅基殺菌劑，銅制劑一般既能殺細菌又能殺真菌，具有保護和預防作用，又兼有一定的治療和鏟除作用。銅離子也是植物生長代謝所必須的微量元素，雖然過量的銅離子會造成植物藥害，但適量的銅離子可以使植物生長得更健壯，使用銅制劑作為殺菌劑，除了有防治病害的作用之外，還可以起到微量元素肥料的作用。在目前銅制劑市場上，無論是國產農藥還是進口農藥，大多數(shù)仍以無機銅制劑為主。雖然無機銅制劑在殺菌市場中占有極其重要地位，在農作物病害的防治中功不可滅，但它的局限性也是顯而易見的不可與大多數(shù)酸性殺蟲劑、殺菌劑、殺螨劑混用或混配，要求單獨使用；高溫、高濕或低溫、潮濕氣候時，容易發(fā)生藥害；容易誘發(fā)螨類的增殖，藥效不高，需加大用藥量來提高藥效；對桃、李、杏、蘋果等敏感作物要求嚴格慎用。為克服無機銅殺菌劑的上述弊端，發(fā)揮銅離子高效殺細菌殺真菌的優(yōu)勢，有機銅制劑的開發(fā)成為重要的發(fā)展方向。
鋅在農業(yè)中的重要性在20世紀早期就已認識到，而鋅在植物中的特殊作用直到20世紀60年代后期才被肯定。鋅是農作物生長所必需的一種微量元素，鋅的生理作用是多方面的。現(xiàn)已證明，鋅是多種酶的組成成分或催化劑。乙醇脫氫酶、碳酸酐酶、RNA聚合酶都含有結合態(tài)鋅，國內外的研究證明鋅能促進蛋白質的合成。鋅與生長素代謝有關，鋅能促進吲哚和絲氨酸合成色氨酸，從而間接影響生長素的形成。此外，鋅與光合作用、呼吸作用也有一定關系。鋅可提高小麥光合強度，同時也增強呼吸強度，但凈光合率仍然提高，對種子、果實的形成和發(fā)育起重要作用。鋅離子還可增強植物的抗菌活性，對植物病毒病也有一定的防治作用。在與病原菌接觸時，鋅離子緩慢釋放出來，由于鋅離子具有氧化還原性，并能與有機物(硫代基、羧基、羥基)反應，能與病原菌細胞膜及膜蛋白結合，破壞其結構，進入細胞后破壞電子傳遞系統(tǒng)的酶并于DNA反應，達到殺菌目的。在農業(yè)上使用最多的是硫酸鋅，主要起到鋅肥作用，增加鋅元素含量，其殺菌活性不高。無機鋅制劑具有一定的腐蝕性，穩(wěn)定性較差，藥效低，作物的吸收率也較低且大量使用會產生一定藥害。有機鋅制劑的開發(fā)也是重要的研究方向。
殼聚糖(Chitosan)是自然界中含量僅次于纖維素的天然生物高分子，具有無毒、無污染、良好的生物相容性和生物可降解性等多種優(yōu)良性能，抗菌性是其重要功能活性之一。殼聚糖能抑制多種細菌的生長和具有抗真菌活性，尤其對真菌和絲狀菌類有獨特的效果。因此可作為天然抗菌劑進一步開發(fā)利用。早在1979年，Allan等就提出殼聚糖具有廣譜抗菌性。Lee等人研究認為，在植物病原菌與寄生植物之間，殼聚糖對植物病原菌的孢子發(fā)芽和生長有阻礙作用。國內外研究表明，殼聚糖對椒疫霉病菌、水稻惡苗病菌、苗木立枯病菌、煙草黑脛病菌、水稻稻瘟病菌和油菜菌核病菌等多種病原真菌具有良好的抑制效果。趙蕾等人研究報道，殼聚糖除了對煙草黑脛病菌的抑制作用，還能誘導煙草植株的抗病性，提高葉片中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(PO)和多酚氧化酶(PPO)3種防御酶的活性。這幾種酶活性的增強對植物抗病反應是十分有利的。
綜上所述，殼聚糖不僅能抑制許多病原菌的生長，而且能誘導植物的多種抗病性反應，如幾丁質酶的積累，誘導葡聚糖酶的合成等。此外，殼聚糖具有無毒、施用后可被土壤微生物完全降解，不會對土壤微環(huán)境造成不利影響等優(yōu)點。但殼聚糖作為殺菌劑存在著藥效不高、見效慢的缺點，影響了其進一步應用。因此，開發(fā)抗菌活性更高的殼聚糖及其衍生物產品作為新型生物殺菌劑，是提高植物對病害的抗性，減少化學農藥的施用量的有效途徑。殼聚糖分子中含有大量的羥基、氨基或酰氨基，是金屬離子的良好配體，可與金屬離子進行配位反應制備金屬有機配合物，顯著提高其殺菌活性，同時減少金屬離子的使用量，降低其毒害作用并能大大提高作物的吸收利用率。國內外對殼聚糖金屬配合物的研究大多集中在催化活性方面以及作為微量元素補劑的應用方面，但將其用于農作物病害的防治尚未見報道。
近年來隨著人們對殼聚糖的深入研究，發(fā)現(xiàn)其抑菌活性與分子量密切相關。選擇特定分子量范圍的殼聚糖與金屬進行反應制備配合物，對增強配合物的抑菌效果具有重要意義?？偟膩碚f，低分子量的甲殼低聚糖具有一些獨特的功能性質和生理活性，其抑菌作用也最強。但分子量太小會影響其與金屬的配位能力，配合物的穩(wěn)定性較差，金屬離子易解離出來。綜合考慮以上因素，選擇分子量在3,000-30,000的甲殼低聚糖作為金屬離子的配體制備配合物，不但能發(fā)揮低聚糖本身較強的抑菌活性，而且有較強的金屬配位能力，使得配合物中金屬離子的含量較高，能充分發(fā)揮金屬離子殺菌活性強的優(yōu)勢，二者的相互作用，將起到協(xié)同增效作用，顯著增強對作物病害的防治效果。
作物生長隨時可能遭受到不良環(huán)境因子諸如病菌、高溫、低溫、干旱、水澇以及高鹽的影響，這些環(huán)境因子的變化有時非常劇烈，超過了作物正常生長所能忍受的范圍，從而導致作物傷害。這些不良環(huán)境因子所構成的不良環(huán)境就是逆境。處于逆境中的作物生長發(fā)育會受到不同程度的影響，如生長抑制物質增多、光合作用下降等，輕則出現(xiàn)生長不良、萎焉、部分壞死等，重則導致作物死亡。生活在自然界的植物之所以能夠適應一定程度的逆境是因為它們都具有一套抵御逆境傷害的機制。作為一種重要的氧自由基清除酶——超氧化物歧化酶(SOD)，其活性水平對植物抗逆性有著重要影響，國內外研究表明，在逆境條件下植物的抗性與植物體內能否維持較高的SOD活性水平有關，而甲殼低聚糖金屬配合物具有SOD樣活性作用，對氧自由基具有很強的清除能力，其模擬酶的功能對于增強作物的抗逆性具有重要作用。
近半個世紀，隨著化學農藥和化肥等化學物質的使用，造成有害物質在植物體內、水中及土壤中富集，一部分有害物質通過物質循環(huán)進入農作物及人畜體內，特別是近年來使用量越來越大，對農產品及生態(tài)環(huán)境造成極大威脅，從而危害人體健康，引發(fā)各種疾病。新的趨勢是開發(fā)無公害，具廣譜抑菌的生物農藥。甲殼低聚糖金屬配合物具有殺菌作用、保護作用并能促進作物生長、提高其抗逆性等多種功能活性，是一類很有開發(fā)潛力的金屬有機殺菌劑。
通過降解反應制備低分子量殼聚糖的方法大致可分為酶降解法、氧化降解法及酸降解法三大類。氧化降解法因無污染、易于工業(yè)化等有點，成為目前研究較多的方法。但傳統(tǒng)的水浴加熱方式，反應時間較長且降解不均勻。微波的熱效與傳統(tǒng)加熱不同后者是外部加熱，通過表面能量吸收再傳導到內部，前者是微波進入物體內部，分子在電磁波作用下，并隨電磁場的變化而變化，產生高頻振蕩，這樣極化分子本身的熱運動和分子之間的相對運動會產生類似摩擦、碰撞、振動、擠壓的作用，使所在體系能量增高并快速升溫。將微波輻射技術取代傳統(tǒng)加熱方式應用于化學領域，是80年代后期興起的一項新技術，目前微波輻射已廣泛應用于多種化學反應，充分顯示出廣闊的應用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是提供一種對農作物病害具有防治作用的甲殼低聚糖金屬配合物殺菌劑的制備方法及其對作物病害的防治作用。利用殼聚糖結構的特殊性，含有活潑的-OH、-NH2，在N或O上可接入殺菌活性較強的金屬離子，發(fā)揮殼聚糖分子和金屬離子的協(xié)同增效作用，顯著增強其殺菌活性，并能減少金屬離子的使用量，降低其毒害作用。同時，采用微波輻射技術降解殼聚糖，并直接在其降解液中加入金屬化合物進行配位反應，通過一步法制備甲殼低聚糖金屬配合物。微波技術的應用，能夠降低能耗，減少污染，節(jié)省時間和原料，降低生產成本，是一項具有產業(yè)化前景和廣泛市場潛力的應用技術。
本發(fā)明涉及的殼聚糖硫酸酯金屬配合物是式(1)化合物。其化學一般式為 式(1)其中M＝Cu或Zn，n為18.6-186，m∶n為(1∶4)-(1∶2)，R1為H或Ar。
本發(fā)明中，金屬離子M主要是與殼聚糖C2位的氨基(-NH2)和C3位羥基(-OH)配位，配位的殼聚糖單元可以是連續(xù)的也可以是不連續(xù)的。金屬含量為10.02-15.16％(重量百分比)。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的所采取的技術措施如下1、準確稱取一定量的殼聚糖原料，溶于15-20倍體積的0.5-5％鹽酸或乙酸溶液中，攪拌均勻，形成均一膠體后，加入與殼聚糖一定配比的H2O2(過氧化氫與殼聚糖的摩爾比為0.5-3)，封蓋，將反應器置于微波爐中，在微波功率340-850W下，反應2-10min(間歇操作，間隔時間為1～2min)，取出快速冷卻至室溫(在冰水浴中冷卻)，在磁力攪拌下滴加金屬化合物水溶液，在偏酸性條件下攪拌一定時間，加入3-4倍量的丙酮或乙醇(或二者等體積的混合液)生成沉淀，過濾，用70-80％乙醇洗滌至氯化鋇溶液檢測無白色沉淀生成；最后用無水乙醇洗滌2次，在50-80℃下烘干至恒重，粉碎機粉碎后獲得甲殼低聚糖金屬配合物。
2、本發(fā)明涉及的殼聚糖分子量在50-100萬之間，脫乙酰度為65-100％。
3、本發(fā)明中，金屬化合物為銅化合物或鋅化合物，對其沒有特別限定，銅化合物包括硫酸銅、氯化銅、硝酸銅、醋酸銅，鋅化合物包括硫酸鋅、氯化鋅、硝酸鋅、醋酸鋅。殼聚糖與金屬化合物的摩爾比為1∶1。反應在室溫下進行，反應時間為2-12小時，反應溶液pH為4-6，用稀氨水調pH。
4、本發(fā)明制備的甲殼低聚糖銅配合物為藍色粉末狀固體，甲殼低聚糖鋅配合物為白色粉末狀固體。
5、本發(fā)明的甲殼低聚糖金屬配合物不溶于水，易溶于稀鹽酸。
6、本發(fā)明的甲殼低聚糖金屬配合物可以用一般的化學分析手段進行表征。例如，紅外光譜，紫外光譜、核磁共振、元素分析等。
7、本發(fā)明中甲殼低聚糖金屬配合物中的金屬含量采用絡合滴定法測定，其中甲殼低聚糖銅配合物中銅含量為12.25-15.16％，甲殼低聚糖鋅配合物中鋅含量為10.02-13.38％。
本發(fā)明的特點1、本發(fā)明采用一步法制備甲殼低聚糖金屬配合物，通過以高分子量的殼聚糖為原料，在均相溶劑中采用微波輻射技術進行降解，在降解液中直接加入金屬化合物進行配位反應，經(jīng)沉淀、洗滌、烘干后得甲殼低聚糖金屬配合物。殼聚糖采用微波均相降解法降解成甲殼低聚糖后，其生物活性功能特別是抑菌及對氧自由基清除活性有顯著提高。
2、本發(fā)明中的銅、鋅離子本身具有很強的殺菌活性，又能促進植物的生長，但其藥效低、大量施用對某些植物易產生藥害，在病害防治方面存在一定的局限性。甲殼低聚糖是一種天然高分子多糖，具有廣譜的殺菌活性和多種生物活性，且能夠誘導植物抗病體系產生免疫力，但其殺菌活性不是很高，也不具有特異性。二者形成配合物后可產生協(xié)同增效作用，殺菌活性顯著增強，且作物吸收利用率大大提高，可擴大其應用范圍，同時降低金屬離子的使用量。為金屬有機化合物在農用殺菌劑方面的應用開辟新途徑。
3、本發(fā)明的甲殼低聚糖金屬配合物對氧自由基具有很強的清除能力，具有SOD樣活性作用，可維持植物體內較高的SOD活性水平，增強植物的抗逆性能，使植物體能夠降低各種不良環(huán)境因子對其的影響，從而間接促進植物的生長發(fā)育。
4、本發(fā)明與傳統(tǒng)的加熱方法相比，微波輻射技術能夠大大縮短反應時間，具有反應速度快，副反應少，產品質量均一，產率高，操作簡單等優(yōu)點。本發(fā)明采用微波輻射均相降解殼聚糖，與非均相降解相比較，反應速度快，且產物分子量分布較窄。本發(fā)明采用一步法制備甲殼低聚糖金屬配合物，減少了中間環(huán)節(jié)，降低了生產成本且產率提高。
5、本發(fā)明的甲殼低聚糖金屬配合物對農作物病原菌具有很強的抑制作用，無毒無害無副作用，制備方法簡單，可有效抑制蘋果腐爛病菌、黃瓜枯萎病菌等病菌的生長，可作為高效、低毒的農用殺菌劑，用于農作物病害的防治。


圖1為甲殼低聚糖金屬配合物及其配體的紫外譜圖。
圖2為甲殼低聚糖銅配合物的紅外譜圖，其特征紅外(cm-1)3389.42；2929.93；1645.52；1379.73；1317.19；1088.88；888.55；603.26。
圖3為甲殼低聚糖鋅配合物的紅外譜圖，其特征紅外(cm-1)3383.46；1617.21；1429.39；1397.98；1321.57；1109.695；895.43；618.41。
圖4為甲殼低聚糖的紅外譜圖，其特征紅外(cm-1)3447.38；2879.33；1661.11；1602.60；1420.30；1381.33；1321.89；1160.43；1075.65；891.48；664.32。
具體實施例方式
實施例110g殼聚糖(Mw＝7.6×105，脫乙酰度為84.1％)，溶于150mL1％鹽酸溶液中，攪拌均勻形成均一膠體后，加入與殼聚糖等摩爾量的H2O2，封蓋，將反應器置于微波爐中，850W微波功率下反應3min(間歇操作，每間隔1-2min，啟動微波1min)，得淡黃色透明溶液，取出快速冷卻至室溫，然后在磁力攪拌下(磁力攪拌采用78-1型磁力攪拌器)反應液中直接滴加與殼聚糖等摩爾量的CuSO4水溶液，在pH為6條件下攪拌4h，加入3-4倍量的丙酮形成沉淀，過濾，70-80％乙醇洗滌數(shù)次，用氯化鋇溶液檢測無白色沉淀生成；最后用無水乙醇洗滌2次，烘干至恒重，粉碎機粉碎后，即得藍色粉末狀固體。
該配合物采用絡合滴定法測定表明銅含量為15.16％(重量百分比)。紫外光譜分析(圖1)表明，甲殼低聚糖銅配合物(圖1b)的最大吸收峰與甲殼低聚糖(圖1a)相比，向低波長移動35nm。這是由于配合物中分子內電子躍遷所需量較高，表明配位作用的發(fā)生。紅外光譜分析(圖2)表明，甲殼低聚糖銅配合物與甲殼低聚糖(圖4)相比，位于3447cm-1處的吸收峰向低頻分別位移58cm-1，且吸收峰變尖，說明-NH2和-OH參與了配位反應。位于1602cm-1處的δN-H吸收峰，與Cu配位后該峰消失，進一步說明-NH2參與了配位反應；位于1661cm-1處的乙酰氨基吸收峰，形成銅配合物后向低頻位移16cm-1，且位于1381cm-1處的乙酰基的δC-H吸收峰和位于1321cm-1處的νC-N吸收峰都發(fā)生一定位移，說明部分乙酰氨基參與了配位反應，位于1076cm-1處表征仲羥基的吸收峰有一定位移，向高頻位移了13cm-1，這說明仲羥基參與了配位反應；形成配合物后，于603cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰為自由SO42-的吸收峰。
通過紫外、紅外等分析手段對其結構進行分析。從紫外光譜可知，配合物的最大吸收峰與低分子量殼聚糖相比均發(fā)生了較大的位移；紅外光譜顯示，形成配合物后，殼聚糖的部分特征吸收峰也發(fā)生了一定位移，證明殼聚糖金屬配合物中確實存在配位鍵，殼聚糖中主要是-NH2和-OH參與了與金屬的配位，部分乙酰氨基也參與了配位。
實施例210g殼聚糖(Mw＝7.6×105，脫乙酰度為84.1％)，溶于150mL1％鹽酸溶液中，攪拌均勻形成均一膠體后，加入與殼聚糖等摩爾量的H2O2，封蓋，將反應器置于微波爐中，850W微波功率下反應3min(間歇操作，每間隔1-2min，啟動微波1min)，得淡黃色透明溶液，取出快速冷卻至室溫，然后在磁力攪拌下(磁力攪拌采用78-1型磁力攪拌器)反應液中直接滴加與殼聚糖等摩爾量的ZnSO4水溶液，在pH為6條件下攪拌4h，加入3-4倍量的丙酮形成沉淀，過濾，70-80％乙醇洗滌數(shù)次，用氯化鋇溶液檢測無白色沉淀生成；最后用無水乙醇洗滌2次，烘干至恒重，粉碎機粉碎后，即得白色粉末狀固體。
該配合物采用絡合滴定法測定表明鋅含量為13.38％(重量百分比)。紫外光譜分析(圖1)表明，甲殼低聚糖鋅配合物(圖1c)的最大吸收峰與甲殼低聚糖(圖1a)相比向低波長移動46nm。這是由于配合物中分子內電子躍遷所需量較高，表明配位作用的發(fā)生。紅外光譜分析(圖3)表明，甲殼低聚糖銅配合物與甲殼低聚糖(圖4)相比，位于3447cm-1處的吸收峰向低頻分別位移64cm-1，且峰形發(fā)生變化，說明-NH2和-OH參與了配位反應。位于1602cm-1處的δN-H吸收峰，與Zn配位后向高頻位移了15cm-1左右，進一步說明-NH2參與了配位反應；位于1661cm-1處的乙酰氨基吸收峰，形成鋅配合物后該峰消失，且位于1381cm-1處的乙?；摩腃-H吸收峰發(fā)生一定位移，說明部分乙酰氨基參與了配位反應；位于1076cm-1處表征仲羥基的吸收峰有一定位移，向高頻位移了34cm-1，這說明仲羥基參與了配位反應；形成配合物后，于618cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰為自由SO42-的吸收峰。
通過紫外、紅外等分析手段對其結構進行分析。從紫外光譜可知，配合物的最大吸收峰與低分子量殼聚糖相比均發(fā)生了較大的位移；紅外光譜顯示，形成配合物后，殼聚糖的部分特征吸收峰也發(fā)生了一定位移，證明殼聚糖金屬配合物中確實存在配位鍵，殼聚糖中主要是-NH2和-OH參與了與金屬的配位，部分乙酰氨基也參與了配位。
實施例310g殼聚糖(Mw＝7.6×105，脫乙酰度為84.1％)，溶于200mL1％鹽酸溶液中，攪拌均勻形成均一膠體后，加入與殼聚糖摩爾比為0.5的H2O2，封蓋，將反應器置于微波爐中，340W微波功率下反應10min(間歇操作，每間隔1-2min，啟動微波1min)，得黃棕色透明溶液，取出快速冷卻至室溫，然后在磁力攪拌下(磁力攪拌采用78-1型磁力攪拌器)反應液中直接滴加與殼聚糖等摩爾量的CuSO4水溶液，在pH為4條件下攪拌12h，加入3-4倍量的丙酮/乙醇混合液(1∶1)形成沉淀，過濾，70-80％乙醇洗滌數(shù)次，用氯化鋇溶液檢測無白色沉淀生成；最后用無水乙醇洗滌2次，烘干至恒重，粉碎機粉碎后，即得藍色粉末狀固體。
該配合物采用絡合滴定法測定表明鋅含量為12.25％(重量百分比)。按實施例3殼聚糖微波降解的方法，采用粘度法測定甲殼低聚糖的分子量為3,600，甲殼低聚糖收率為55.1％。
實施例410g殼聚糖(Mw＝7.6×105，脫乙酰度為84.1％)，溶于200mL1％乙酸溶液中，攪拌均勻形成均一膠體后，加入與殼聚糖摩爾比為3的H2O2，封蓋，將反應器置于微波爐中，680W微波功率下反應2min(間歇操作，每間隔1-2min，啟動微波1min)，得黃棕色透明溶液，取出快速冷卻至室溫，然后在磁力攪拌下(磁力攪拌采用78-1型磁力攪拌器)反應液中直接滴加與殼聚糖等摩爾量的ZnSO4水溶液，在pH為5條件下攪拌2h，加入3-4倍量的乙醇形成沉淀，過濾，70-80％乙醇洗滌數(shù)次，用氯化鋇溶液檢測無白色沉淀生成；最后用無水乙醇洗滌2次，烘干至恒重，粉碎機粉碎后，即得白色粉末狀固體。
該配合物采用絡合滴定法測定表明鋅含量為10.02％(重量百分比)。按實施例4殼聚糖微波降解的方法，采用粘度法測定甲殼低聚糖的分子量為8,200，甲殼低聚糖收率為72.8％。
實施例5(比較例)10g殼聚糖(Mw＝7.6×105，脫乙酰度為84.1％)，溶于150mL1％鹽酸溶液中，攪拌均勻形成均一膠體后，加入與殼聚糖等摩爾量的H2O2，封蓋，將反應器置于微波爐中，850W微波功率下反應3min(間歇操作，間隔時間1-2min)，得淡黃色透明溶液，取出快速冷卻至室溫，用1mol/LNaOH溶液調樣品液pH至中性，70-80％乙醇洗滌數(shù)次，最后用無水乙醇洗滌2次，烘干至恒重，粉碎機粉碎后，即得淡黃色粉末狀甲殼低聚糖。
該配合物采用粘度法測定殼聚糖的分子量為20,000。產物收率為95.8％。
抑菌活性實驗研究采用生長速率法測定試樣對四種作物病原菌的抑菌活性。樣品用0.1mol/LHCl溶液溶解，配制成一定濃度的溶液。以50％多菌靈可濕性粉劑作陽性對照，以0.1mol/L HCl溶液作空白對照，測定不同濃度的樣品對蕃茄早疫病菌的抑菌活性、黃瓜枯萎病菌、蘋果腐爛病菌和蘋果輪紋病菌4種病原菌的抑制效果。
應用例1(對蘋果腐爛病菌的抑制效果)稱取實施例1合成的甲殼低聚糖銅配合物(LCTS-Cu)、實施例2合成的甲殼低聚糖鋅配合物(LCTS-Zn)、甲殼低聚糖(LCTS，比較例)、殼聚糖原料(CTS，比較例)，用0.1mol/L HCl溶液溶解配制成一定濃度的溶液。以50％多菌靈可濕性粉劑為陽性對照，以0.1mol/L HCl溶液為陰性對照。測試在3個樣品濃度下，即5μg/mL，50μg/mL和500μg/mL，對蘋果腐爛病菌的抑制效果。
方法PDA培養(yǎng)基(1000mL水；200g馬鈴薯；20g蔗糖；10g瓊脂粉)，培養(yǎng)基配制好后，裝入三角瓶中，滅菌備用。將滅菌的培養(yǎng)基加熱熔化，然后放置于水浴鍋中冷卻至60℃，備用。分別將2mL、200μl和20μl樣品溶液加入38ml、40ml和40ml 60℃的培養(yǎng)基中，配成含藥量分別為500μg/mL、50μg/mL和5μg/mL的培養(yǎng)基，試驗以50％多菌靈可濕性粉劑(威海韓孚生化農藥有限公司)為陽性對照，以0.1mol/L HCl溶液為陰性對照。將培養(yǎng)基均勻倒入2個直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，待完全凝固后，在每個培養(yǎng)皿中接種3塊直徑為6mm的菌餅。在25℃下培養(yǎng)48h或72h后，測量菌落直徑，計算樣品的抑菌率。全部試驗共有(4個樣品+2個對照)×3個濃度×4種病原菌＝72個處理，每處理設置2個培養(yǎng)皿，每皿接種3個菌落，對每個菌落測定最大直徑和最小直徑。全部試驗重復一次。實驗結果見表1.1。
對蘋果腐爛病菌的抑制作用實驗結果表明，甲殼低聚糖銅配合物(實施例1)和甲殼低聚糖鋅配合物(實施例2)均對蘋果腐爛病菌具有很強的抑制作用，隨著樣品濃度的提高，抑菌活性顯著增強，高濃度組樣品(500μg/mL)的抑菌效果與陽性對照多菌靈相當或接近。甲殼低聚糖金屬配合物在相同樣品濃度下的抑菌活性高于殼聚糖及甲殼低聚糖(實施例5)，甲殼低聚糖銅配合物對蘋果腐爛病菌的抑制效果尤為顯著。證明金屬離子與甲殼低聚糖形成的配合物具有協(xié)同增效作用，可提高對蘋果腐爛病菌的殺菌活性。
表1.1對蘋果腐爛病菌的抑制作用

*“-”表示在該濃度下無抑菌活性應用例2(對蘋果輪紋病菌的抑制效果)操作同應用例1，但測試對象為蘋果輪紋病菌。測定不同濃度的樣品對蘋果輪紋病菌的抑制效果。實驗結果見表1.2。
對蘋果輪紋病菌的抑制作用實驗結果表明，甲殼低聚糖銅配合物(實施例1)和殼聚糖對蘋果輪紋病菌具有較強的抑制作用，隨著樣品濃度的提高，抑菌活性逐漸增強。但甲殼低聚糖鋅配合物對蘋果輪紋病菌(實施例2)無抑制作用。
陽性對照多菌靈有較好的抑制活性。
表1.2對蘋果輪紋病菌的抑制作用

*“-”表示在該濃度下無抑菌活性應用例3(對黃瓜枯萎病菌的抑制效果)操作同應用例1，但測試對象為黃瓜枯萎病菌。測定不同濃度的樣品對黃瓜枯萎病菌的抑制效果。實驗結果見表1.3。
對黃瓜枯萎病菌的抑制作用實驗結果表明，甲殼低聚糖銅配合物(實施例1)和甲殼低聚糖鋅配合物(實施例2)均對黃瓜枯萎病菌具有很強的抑制作用，隨著樣品濃度的提高，抑菌活性顯著增強，高濃度組樣品(500μg/mL)的抑菌效果與陽性對照多菌靈相當或接近。在相同樣品濃度下，甲殼低聚糖金屬配合物的抑菌活性高于殼聚糖及甲殼低聚糖(實施例5)。證明金屬離子與甲殼低聚糖形成的配合物具有協(xié)同增效作用，可提高對黃瓜枯萎病菌的殺菌活性。
表1.3對黃瓜枯萎病菌的抑制作用

*“-”表示在該濃度下無抑菌活性應用例4(對番茄早疫病菌的抑制效果)操作同應用例1，但測試對象為番茄早疫病菌。測定不同濃度的樣品對番茄早疫病菌的抑制效果。實驗結果見表1.4。
對番茄早疫病菌的抑制作用實驗結果表明，甲殼低聚糖鋅配合物(實施例2)高濃度組(500μg/mL)對番茄早疫病菌有一定的抑制作用，而陽性對照多菌靈對番茄早疫病菌無效。證明金屬鋅離子與甲殼低聚糖配位后，可提高對番茄早疫病菌的殺菌活性。
表1.4對番茄早疫病菌的抑制作用

*“-”表示在該濃度下無抑菌活性對氧自由基的清除活性實驗研究實施例1(對超氧陰離子自由基的清除作用)稱取實施例1合成的甲殼低聚糖銅配合物(LCTS-Cu)、實施例2合成的甲殼低聚糖鋅配合物(LCTS-Zn)、甲殼低聚糖(LCTS，比較例)及殼聚糖原料(CTS，比較例)，用0.1mol/L HCl溶液溶解配制成一定濃度的溶液。測試不同濃度下(0.025～1.6mg/mL)的樣品液對超氧陰離子自由基(O2·-)的清除活性。
方法采用還原型輔酶I-吩嗪硫酸甲酯-氯化硝基四氮唑藍體系(NADH-PMS-NBT)產生超氧陰離子自由(O2·-)。反應體系為3.0mL的Tris-HCl緩沖液(16mmol/L，pH8.0)，其中含有78μmol/L還原性輔酶I(NADH)，50μmol/L硝基四氮唑藍(NBT)，10μmol/L吩嗪硫酸甲酯(PMS)，以及不同濃度的樣品溶液(0.025～1.6mg/mL)。超氧陰離子自由基和NBT的顯色反應采用分光光度法在560nm波長下測定反應液的吸光度(A)。空白用Tris-HCl緩沖液替換NADH，對照用Tris-HCl緩沖液代替樣品液。按以下公式計算清除率(E)E(％)＝(A1-A2)/A1×100(1)式(1)中A1為對照試驗吸光度，A2為樣品吸光度對超氧陰離子自由基的清除活性測定結果見表2.1。結果表明，甲殼低聚糖金屬配合物能夠有效地清除NADH-PMS-NBT系統(tǒng)產生的O2·-，隨著樣品質量濃度的增加，清除率逐漸提高。在甲殼低聚糖銅配合物(實施例1)濃度為0.4mg/mL時對O2·-清除率達96.97％，相同濃度下的甲殼低聚糖鋅配合物(實施例2)為77.34％，甲殼低聚糖(實施例5)為42.14％，殼聚糖原料為21.36％。兩種金屬配合物對O2·-的清除活性明顯高于其配體。特別值得提出的是，在極低濃度下(0.025mg/mL)，銅配合物即表現(xiàn)出顯著的清除O2·-能力，清除率高達89.18％。證明金屬離子與甲殼低聚糖結合在一起，可產生協(xié)同增效作用，具有較強的SOD樣活性作用，顯著增強作物的抗逆能力。
表2.1甲殼低聚糖金屬配合物、甲殼低聚糖及殼聚糖對O2·-的清除作用

*“-”表示在該濃度下無清除活性。
實施例2(對羥自由基的清除作用)具體操作同實施例1。測試不同濃度下(0.05～1.6mg/mL)的樣品液對羥自由基(·OH)的清除活性。
方法根據(jù)Fenton反應原理，H2O2在Fe2+存在的情況下生成·OH，·OH可使番紅花T褪色，在520nm可測出·OH的生成情況，進而檢測出樣品對·OH的清除活性。反應終體積4.5mL，其中含150mmol/L磷酸鈉鹽緩沖液(pH7.4)1mL，1.0mmol/L的番紅花T 1mL，2mmol/L EDTANa2.Fe(II)0.5mL(新鮮配制)，不同濃度的樣品液1.0mL，w＝0.3H2O21mL(新鮮配制)，于試管中混勻，37℃水浴中反應30min后，測定樣品在520nm處的吸光度(A)，空白組以1.0mL蒸餾水替代供試樣品，對照組以1.5mL蒸餾水替代供試樣品和EDTANa2.Fe(II)。按以下公式計算清除率(E)
E％＝(A2-A3)/A1×100(2)式(2)中A1為對照試驗吸光度，A2為樣品吸光度，A3為樣品空白對照對羥自由基的清除活性測定結果見表2.2。結果表明，甲殼低聚糖金屬配合物對·OH有一定的清除作用，且成量效關系，但明顯弱于對O2·-的抑制作用。甲殼低聚糖鋅配合物對·OH具有較強的抑制作用，明顯強于其配體甲殼低聚糖，而甲殼低聚糖銅配合物對·OH的清除活性則比其配體弱，但隨著樣品濃度的增加，其清除活性顯著提高，在高濃度區(qū)，甲殼低聚糖銅配合物的清除率接近其配體，并有上升的趨勢。當樣品濃度為1.6mg/mL時甲殼低聚糖鋅配合物對·OH的清除率達72.78％，甲殼低聚糖銅配合物為53.20％，甲殼低聚糖為61.88％，殼聚糖為12.97％。證明金屬離子與甲殼低聚糖結合在一起，可發(fā)揮協(xié)同作用，增強其對羥自由基的清除活性，從而提高其抗逆性。
表2.2甲殼低聚糖金屬配合物、甲殼低聚糖及殼聚糖對·OH的清除作用

權利要求
1.一種新型低毒農作物殺菌劑的制備方法，其特征在于以高分子量殼聚糖為原料，在均相溶劑中，殼聚糖采用微波輻射技術進行降解反應，并且在降解液中直接加入金屬化合物進行配位反應，微波輻射功率為340-850W，反應時間2-10min；然后進行沉淀，沉淀物用70-80％乙醇洗滌；最后用無水乙醇洗滌，50-80℃烘干后獲得甲殼低聚糖金屬配合物。
2.按照權利要求書1所述低毒農作物殺菌劑的制備方法，其特征在于所述均相溶劑采用鹽酸或乙酸作為溶劑，體積濃度為0.5-5％，將殼聚糖溶于15-20倍體積的上述溶劑中，形成均一膠體后，加入過氧化氫為氧化劑，過氧化氫與殼聚糖的摩爾比為0.5-3。
3.按照權利要求書1所述低毒農作物殺菌劑的制備方法，其特征在于所述微波輻射后，將降解液取出冷卻至室溫，在磁力攪拌下滴加金屬化合物水溶液，殼聚糖與金屬化合物的摩爾比為1∶1，反應在室溫下進行，反應時間為2-12小時，反應溶液pH為4-6，沉淀采用加入3-4倍量的丙酮或乙醇，或二者等體積的混合液生成沉淀。
4.按照權利要求1所述低毒農作物殺菌劑的制備方法，其特征在于所述殼聚糖分子量在50-100萬之間，脫乙酰度為65-100％。
5.按照權利要求書1所述低毒農作物殺菌劑的制備方法，其特征在于金屬化合物為銅化合物或鋅化合物。
6.按照權利要求書1所述低毒農作物殺菌劑的制備方法，其特征在于該甲殼低聚糖金屬配合物為式(1)化合物，一般化學式為 式(1)其中M＝Cu或Zn，n為18.6-186，m∶n為(1∶4)-(1∶2)，R1為H或Ar。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殺菌活性強且毒性低、對農作物病害具有防治作用的甲殼低聚糖金屬配合物殺菌劑的制備方法。本發(fā)明通過以高分子量的殼聚糖為原料，在均相溶劑中采用微波輻射技術進行降解，在降解液中直接加入金屬化合物進行配位反應，再通過沉淀、過濾、洗滌、烘干后，即得甲殼低聚糖金屬配合物。本發(fā)明的配合物對農作物病原菌具有很強的抑制效果，無毒無害無副作用，制備方法簡單且使用范圍廣，可作為植物殺菌劑應用于農作物病害的防治。
文檔編號A01N55/00GK1751576SQ200410050480
公開日2006年3月29日 申請日期2004年9月22日 優(yōu)先權日2004年9月22日
發(fā)明者李鵬程, 劉松, 邢榮娥, 于華華, 郭占勇, 王丕波, 李翠萍 申請人:中國科學院海洋研究所