專利名稱：運(yùn)用寡糖溶液綜合防治海帶脫苗或爛苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋水產(chǎn)領(lǐng)域，具體來(lái)講是海帶防治脫(爛)苗技術(shù)，即運(yùn)用分離、純化及鑒定后有效的褐藻酸降解菌株，對(duì)褐藻酸鈉進(jìn)行處理，獲得所產(chǎn)生的寡糖溶液，對(duì)海帶苗簾進(jìn)行浸泡處理，達(dá)到增加海帶幼苗抗氧化能力，結(jié)合育苗水環(huán)境總異氧菌總數(shù)的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)減少海帶脫(爛)苗發(fā)生的程度。
背景技術(shù)：
我國(guó)海藻栽培業(yè)年產(chǎn)值達(dá)2億美元，其中海帶栽培產(chǎn)量有30萬(wàn)噸，裙帶菜有20萬(wàn)噸，紫菜2萬(wàn)噸。海藻是公認(rèn)的綠色健康食品，由于陸地食品來(lái)源的安全性及局限性，21世紀(jì)海洋產(chǎn)業(yè)將有很大的發(fā)展。經(jīng)濟(jì)海藻種質(zhì)資源是海藻選種、育種的基礎(chǔ)。如海帶選育出“860”和“1170”高碘、高產(chǎn)海帶新品系、“901”新品系，促進(jìn)了我國(guó)海帶養(yǎng)殖及加工業(yè)的發(fā)展，為海帶的產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供了保證。
近年來(lái)，隨著全國(guó)海帶育苗及養(yǎng)殖的不斷發(fā)展，海帶幼苗的防治是養(yǎng)殖生產(chǎn)中所面臨的重要問(wèn)題，有的育苗單位育苗病害嚴(yán)重時(shí)，面臨減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)?！捌呶濉薄ⅰ鞍宋濉逼陂g，在國(guó)家及有關(guān)地方的支持下，曾開(kāi)展了海帶爛苗的防治研究，為解決海帶爛苗的問(wèn)題打下一定的基礎(chǔ)。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，特別是進(jìn)出口貿(mào)易的加大，建立合理的育苗及養(yǎng)殖技術(shù)，保證海帶種苗及成菜健康的生長(zhǎng)，是海洋與水產(chǎn)行業(yè)所面臨的迫切任務(wù)，這將保證養(yǎng)成后期的加工及海帶的出口，對(duì)中國(guó)的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)發(fā)展起重要作用。隨著國(guó)家海藻進(jìn)出口貿(mào)易的不斷擴(kuò)大，符合國(guó)家經(jīng)濟(jì)海藻研究與產(chǎn)業(yè)發(fā)展的要求。
國(guó)外在該領(lǐng)域中，只有日本、韓國(guó)在海帶、紫菜等經(jīng)濟(jì)海藻病害方面，開(kāi)展一些工作。歐洲一些國(guó)家的研究小組，用江籬開(kāi)展了寡糖誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生爆發(fā)式呼吸氧等基礎(chǔ)性工作，但結(jié)合海帶育苗生產(chǎn)，開(kāi)展海帶防脫(爛)苗的技術(shù)，在國(guó)內(nèi)外屬首次。因此，建立一套有效的防治海帶脫(爛)苗技術(shù)，將對(duì)海帶的健康養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有海帶育苗防治脫(爛)苗技術(shù)中運(yùn)用微生物檢測(cè)育苗水環(huán)境的不足，提供一種運(yùn)用寡糖溶液浸泡海帶幼苗綜合防治海帶脫(爛)苗的方法，即運(yùn)用有效的褐藻酸菌，對(duì)褐藻酸鈉進(jìn)行降解，獲得寡糖溶液，對(duì)海帶幼苗進(jìn)行浸泡，增加其抗病能力，減少脫(爛)苗發(fā)生。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是一種運(yùn)用寡糖溶液綜合防治海帶脫苗或爛苗的方法，運(yùn)用褐藻酸降解菌處理褐藻酸鈉，運(yùn)用所產(chǎn)生的寡糖溶液浸泡海帶幼苗，增加海帶幼苗抗氧化能力，減少脫、爛苗發(fā)生的程度及掉苗的比例，具體步驟為1)通過(guò)分離、純化及鑒定，獲得有效的褐藻酸降解菌株交替假單胞菌和假單胞菌，用于制備寡糖溶液；2)運(yùn)用有效的褐藻酸降解菌接種于褐藻酸鈉培養(yǎng)基，褐藻酸鈉培養(yǎng)基的濃度為2.5％(w/v)，接種濃度為107-108cfu/ml，通過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)，獲得寡糖溶液，準(zhǔn)備用于處理海帶幼苗；3)通過(guò)不同濃度的寡糖溶液的處理，即在原溶液濃度的基礎(chǔ)上稀釋100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，獲得有效的處理濃度在10-3到10-4范圍內(nèi)，處理時(shí)間分別為1min、5min、10min、30min、60min，獲得的有效處理時(shí)間為10min到30min，在上述處理時(shí)間及處理濃度條件下，海帶脫苗或爛苗發(fā)生率為10-20％。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明克服了現(xiàn)有海帶育苗防治脫(爛)苗技術(shù)中運(yùn)用微生物檢測(cè)育苗水環(huán)境的不足，運(yùn)用有效的褐藻酸菌，對(duì)褐藻酸鈉進(jìn)行降解，獲得寡糖溶液，對(duì)海帶幼苗進(jìn)行浸泡，在適宜的濃度及處理時(shí)間下，增加海帶幼苗抗氧化、抗病能力，減少脫(爛)苗發(fā)生的比例，海帶脫(爛)苗發(fā)生率為10-20％。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，無(wú)效的褐藻酸降解菌及非有效的處理時(shí)間、處理濃度，海帶幼苗的脫(爛)苗發(fā)生率為80％，結(jié)合海帶育苗水環(huán)境異養(yǎng)菌檢測(cè)結(jié)果看，水中總異養(yǎng)菌數(shù)量如果大于107cfu/ml，幼苗藻體表面的總異養(yǎng)菌數(shù)量108cfu/g，海帶的爛苗發(fā)生率為85％。


圖1是海帶苗經(jīng)過(guò)寡糖溶液處理24小時(shí)后的圖片。
圖2是對(duì)比實(shí)驗(yàn)中海帶苗繩的圖片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明首先獲得有效的褐藻酸降解菌株，對(duì)海帶苗簾進(jìn)行處理，包括步驟如下1、分離、純化及鑒定，獲得有效的褐藻酸降解菌株(交替假單胞菌和假單胞菌)，用于制備寡糖溶液。
細(xì)菌分離培養(yǎng)基1、2216E固體培養(yǎng)基；2、褐藻酸鈉固體培養(yǎng)基；其中2216E固體培養(yǎng)基由5g (NH4)2SO4、2g K2HPO4、1g MgSO4·7H2O、0.01g FeSO4·7H2O、30g NaCl混制而成；褐藻酸鈉固體培養(yǎng)基由褐藻酸鈉10g、瓊脂15g、蒸餾水1L混制而成，其pH＝7.2-7.4。
將小海帶苗稱取重量為5g，在無(wú)菌海水中輕度漂洗以除去附著于藻體上的外來(lái)污物，然后放于滅菌的研磨器中磨碎，加入2mL無(wú)菌海水混勻，靜置片刻，用無(wú)菌移液管取上清液0.1mL或上清液的適度稀釋液(10-2-10-3)涂布細(xì)菌分離培養(yǎng)基平板，在22℃培養(yǎng)7-10天。在2216E培養(yǎng)基平板上計(jì)數(shù)總異養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)，在褐藻酸鈉固體培養(yǎng)基平板上計(jì)數(shù)褐藻酸降解菌菌落數(shù)，換算為每克藻體上細(xì)菌數(shù)量。根據(jù)菌落不同形態(tài)將2216E培養(yǎng)基平板上的菌落挑下，分離、純化并進(jìn)行鑒定，鑒定是常規(guī)的海洋微生物鑒定方法，通過(guò)將藻體組織用消毒海水沖洗5次，然后放置在2216E平板培養(yǎng)基上，12小時(shí)，從中分離、劃線、純化再培養(yǎng)，按照海洋微生物鑒定方法進(jìn)行鑒定，最終確定褐藻酸降解菌的分類名稱。在此基礎(chǔ)上，分別進(jìn)行褐藻酸鈉(固體)及褐藻酸粉的降解實(shí)驗(yàn)，24小時(shí)內(nèi)，根據(jù)完全使固體變成液體，可以判斷為該菌株是否具有降解褐藻酸的能力。
從計(jì)數(shù)褐藻酸降解菌菌落數(shù)的褐藻酸鈉固體培養(yǎng)基平板中選擇菌落數(shù)目適中的平板(即每個(gè)平板約30-50個(gè)菌落)，從中逐一挑取出全部單菌落，分別接種到褐藻酸鈉液體培養(yǎng)基試管中，于25℃培養(yǎng)5天，測(cè)定其對(duì)褐藻酸鈉的降解能力，將可明顯降解褐藻酸鈉的細(xì)菌再分離、純化。
來(lái)源于2216E培養(yǎng)基平板上的細(xì)菌菌株分離、純化后，分別接種到褐藻酸鈉液體培養(yǎng)基試管中，于25℃培養(yǎng)5天，測(cè)定其對(duì)褐藻酸鈉的降解能力，將可降解褐藻酸鈉的菌株同來(lái)源于褐藻酸鈉固體培養(yǎng)基平板上的可降解褐藻酸鈉的菌株進(jìn)行對(duì)比分析，完全將固體降解成液體的菌株，可以作為有效的降解褐藻酸能力的菌。
2、運(yùn)用有效的褐藻酸降解菌株接種于褐藻酸鈉培養(yǎng)基(2.5％，w/v)，接種濃度為108cfu/ml，通過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)，獲得寡糖溶液，準(zhǔn)備用于處理海帶幼苗。將海帶苗簾拆剪成5cm的苗繩，分別置于培養(yǎng)皿中，然后準(zhǔn)備加入不同濃度的寡糖溶液。
3、通過(guò)不同濃度的寡糖溶液的處理，在寡糖降解溶液濃度的基礎(chǔ)上分別稀釋(100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)倍，分別加到不同稱有海帶苗簾的塑料盤(pán)中，最終獲得有效的處理濃度在10-3到10-4范圍內(nèi)，處理時(shí)間分別為1min、5min、10min、30min、60min，獲得的有效處理時(shí)間為10min到30min。在上述處理時(shí)間及處理濃度條件下，通過(guò)統(tǒng)計(jì)，得到海帶脫(爛)苗發(fā)生率為15％。
4、通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，即接種無(wú)效的褐藻酸降解菌，在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，獲得的24小時(shí)后的寡糖溶液，分別稀釋100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，同時(shí)處理時(shí)間為1min、5min、10min、30min、60min，通過(guò)統(tǒng)計(jì)得到，海帶幼苗的脫(爛)苗發(fā)生率為80％。
5、結(jié)合海帶育苗水環(huán)境異養(yǎng)菌檢測(cè)結(jié)果看，水中總異養(yǎng)菌數(shù)量如果大于107cfu/ml，幼苗藻體表面的總異養(yǎng)菌數(shù)量108cfu/g，海帶的爛苗發(fā)生率為85％。
如圖1所示，海帶苗經(jīng)過(guò)寡糖溶液處理24小時(shí)后的結(jié)果，海帶顏色呈褐黃色，藻體色澤鮮亮健康。如圖2所示，對(duì)比實(shí)驗(yàn)中海帶苗繩的結(jié)果，大部分海帶苗已經(jīng)變綠爛，有的苗繩已開(kāi)始脫苗。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)可以看出，在獲得有效的褐藻酸降解菌株前提條件下，在褐藻酸鈉24小時(shí)培養(yǎng)的條件下，獲得寡糖溶液，經(jīng)過(guò)有效處理濃度及處理時(shí)間，可以減輕海帶脫(爛)苗的程度，減少海帶育苗生產(chǎn)中的脫苗及爛苗，對(duì)海帶育苗生產(chǎn)有重要意義。
實(shí)施例12003年6-7月，從山東煙臺(tái)東方海洋公司海帶育苗場(chǎng)，取海帶苗簾1簾，帶回中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，進(jìn)行室內(nèi)寡糖溶液的處理，通過(guò)有效的處理時(shí)間及濃度，所得到海帶爛苗率低于10％。
實(shí)施例22002年6-7月，從山東煙臺(tái)東方海洋公司海帶育苗場(chǎng)，取海帶苗簾2簾，帶回中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，進(jìn)行室內(nèi)寡糖溶液的處理，通過(guò)有效的處理時(shí)間及濃度，所得到海帶爛苗率低于15％。
比較例12002年6-7月，在山東威海泊于、威海崮山及榮成三家海帶育苗場(chǎng)，對(duì)采集的海帶藻體表面褐藻酸降解菌數(shù)量分布及特點(diǎn)進(jìn)行了初步研究。表明采自榮成的病爛海帶幼苗上，其總異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量(1.22×108cfu/g)比威海兩家育苗場(chǎng)的正常海帶幼苗上總異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量(崮山1.15×106cfu/g及泊于1.11×106cfu/g)高100多倍，其褐藻酸降解菌的數(shù)量(4.88×107cfu/g)比后兩家(崮山8.0×104cfu/g及泊于4.3×105cfu/g)的高100-500倍。與正常海帶幼苗相比，爛苗脫落后的總異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量較高(2.42×1071.11×106cfu/g)，而褐藻酸降解菌的數(shù)量相對(duì)更高(1.50×1074.3×105cfu/g)；其中，脫落爛苗上的褐藻酸降解菌數(shù)量約占其總異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的61.98％。對(duì)海帶苗沒(méi)有進(jìn)行寡糖溶液的處理，結(jié)果榮成三家海帶育苗廠的海帶爛苗網(wǎng)簾發(fā)生率達(dá)到70％。
權(quán)利要求
1.一種運(yùn)用寡糖溶液綜合防治海帶脫苗或爛苗的方法，其特征在于運(yùn)用褐藻酸降解菌處理褐藻酸鈉，運(yùn)用所產(chǎn)生的寡糖溶液浸泡海帶幼苗，增加海帶幼苗抗氧化能力，減少脫、爛苗發(fā)生的程度及掉苗的比例，具體步驟為1)通過(guò)分離、純化及鑒定，獲得有效的褐藻酸降解菌株交替假單胞菌和假單胞菌，用于制備寡糖溶液；2)運(yùn)用有效的褐藻酸降解菌接種于褐藻酸鈉培養(yǎng)基，褐藻酸鈉培養(yǎng)基的濃度為2.5％(w/v)，接種濃度為107-108cfu/ml，通過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)，獲得寡糖溶液，準(zhǔn)備用于處理海帶幼苗；3)通過(guò)不同濃度的寡糖溶液的處理，即在原溶液濃度的基礎(chǔ)上稀釋100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，獲得有效的處理濃度在10-3到10-4范圍內(nèi)，處理時(shí)間分別為1min、5min、10min、30min、60min，獲得的有效處理時(shí)間為10min到30min，在上述處理時(shí)間及處理濃度條件下，海帶脫苗或爛苗發(fā)生率為10-20％。
全文摘要
本發(fā)明涉及運(yùn)用寡糖溶液浸泡海帶幼苗綜合防治海帶脫(爛)苗的技術(shù)，具體步驟為1)通過(guò)分離、純化及鑒定，獲得有效的褐藻酸降解菌株；2)運(yùn)用有效的褐藻酸降解菌接種于褐藻酸鈉培養(yǎng)基，獲得寡糖溶液；3)通過(guò)不同濃度的寡糖溶液的處理，獲得有效的處理濃度和有效處理時(shí)間，在上述處理時(shí)間及處理濃度條件下，海帶脫(爛)苗發(fā)生率為10－20％；通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，無(wú)效的褐藻酸降解菌及非有效的處理時(shí)間、處理濃度，海帶幼苗的脫(爛)苗發(fā)生率為80％；結(jié)合海帶育苗水環(huán)境異養(yǎng)菌檢測(cè)結(jié)果看，水中總異養(yǎng)菌數(shù)量如果大于10
文檔編號(hào)A01G33/00GK1736162SQ20041005026
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2004年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月17日
發(fā)明者段德麟, 林偉, 王高歌 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所