專利名稱：：用于轉(zhuǎn)基因的種子特異性表達(dá)的棉花α－球蛋白啟動(dòng)子的制作方法發(fā)明人KeertiS.Rathore，GanesanSunilkumar，JamesP.Connell和AvutuS.Reddy發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明屬于用于植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)的基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子元件領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：種子特異性轉(zhuǎn)基因表達(dá)是許多使用遺傳工程的應(yīng)用所必需的。這些應(yīng)用包括通過操縱經(jīng)由代謝途徑的通量改善種子營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因方法(Hitz等，1995；Kinney，1996；Shintani和DellaPenna，1998；Goto等，1999)以及在便利的包裝即種子中生產(chǎn)具有工業(yè)或藥用價(jià)值的新化合物(Cahoon等，2000)。這些轉(zhuǎn)基因特征中某些可能需要在發(fā)育種子中表達(dá)不止一個(gè)轉(zhuǎn)基因(Ye等，2000)。在其它情況下，改善種子品質(zhì)的代謝工程可能需要在種子發(fā)育期間過表達(dá)和/或抑制多種基因。根據(jù)過表達(dá)或抑制的期望程度，每一步都將需要合適強(qiáng)度的啟動(dòng)子。另外，可能也需要具有合適的發(fā)育定時(shí)(developmentaltiming)的啟動(dòng)子。即使需要相同程度地表達(dá)不止一個(gè)基因，為多個(gè)引入的基因使用相同的啟動(dòng)子也是不明智的。在轉(zhuǎn)基因高拷貝數(shù)整合的某些情況下，啟動(dòng)子同源性可導(dǎo)致基因沉默(Vaucheret，1993；Brusslan和Tobin，1995；Park等，1996)。種子儲(chǔ)藏蛋白在種子發(fā)育期間高水平表達(dá)，且它們?cè)诎l(fā)育種子中的表達(dá)在空間上和時(shí)間上都被緊密地調(diào)控。因此，來自編碼種子儲(chǔ)藏蛋白的基因的調(diào)控序列代表了能夠用于驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因以種子特異性方式表達(dá)的啟動(dòng)子的有價(jià)值的來源。來自大豆β-conglycinin基因(Barker等，1988；Chen等，1988；Lessard等，1993)、法國(guó)菜豆菜豆蛋白基因(Bustos等，1989，1991；Kawagoe等，1994)、向日葵半日花素(helianthinin)基因(Bogue等，1990；Nunberg等，1995)的啟動(dòng)子以及胡蘿卜Dc3啟動(dòng)子(Seffens等，1990；Kim等，1997)是來自雙子葉植物的某些充分描述特征的種子特異性啟動(dòng)子的實(shí)例。盡管可獲得此類系列的其它啟動(dòng)子，表達(dá)水平和基因沉默的問題依然是一個(gè)問題。因而，來自不止一個(gè)來源的長(zhǎng)度不等的啟動(dòng)子的需求漸增，以滿足將來調(diào)控種子中一種或多種轉(zhuǎn)基因表達(dá)的需要。發(fā)明概述響應(yīng)植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域?qū)π聠?dòng)子元件的持續(xù)需要，自棉花α-球蛋白基因分離了1144bp的5′調(diào)控區(qū)，包括1108bp的啟動(dòng)子序列和36bp的5′轉(zhuǎn)錄非翻譯序列，并在功能上進(jìn)行了特征描述。球蛋白是棉花主要的種子儲(chǔ)藏蛋白，并在種子成熟期時(shí)構(gòu)成總蛋白的大約60％(Dure，1989)。在棉花中，存在兩個(gè)α-球蛋白基因，基因A和基因B，分別編碼分子量為48和51kDa的蛋白(Chlan等，1987)。本發(fā)明利用α-球蛋白基因啟動(dòng)子根據(jù)本文公開的教導(dǎo)提供植物中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。本說明書中共開的α-球蛋白基因啟動(dòng)子解決了植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域?qū)π聠?dòng)子元件的持續(xù)需求。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)如本文公開的教導(dǎo)所定義的那樣是種子特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)利用含1108bpα-球蛋白基因啟動(dòng)子序列的啟動(dòng)子DNA實(shí)施。在不同的實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)利用包含不干擾所述1108bp序列的啟動(dòng)子功能的附加序列的啟動(dòng)子DNA。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)利用僅含部分所述1108bp序列分啟動(dòng)子DNA，從而在種子和植物發(fā)育期間，該部分序列的啟動(dòng)子功能能力在功能上類似于全長(zhǎng)的1108bp序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用α-球蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)編碼多肽的RNA轉(zhuǎn)錄以在種子中表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，所述RNA編碼具有商業(yè)價(jià)值的多肽，例如酶、抗體和疫苗多肽。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，α-球蛋白基因啟動(dòng)子導(dǎo)致阻礙種子發(fā)芽的蛋白表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，α-球蛋白基因啟動(dòng)子導(dǎo)致改善種子營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的多肽的RNA轉(zhuǎn)錄。在另一個(gè)實(shí)施方案中，α-球蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)具有目的特性的RNA如反義RNA或核酶轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述反義RNA與編碼參與毒素即棉花中表達(dá)的棉酚(Gossypol)生物合成的酶的RNA互補(bǔ)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述反義RNA與一個(gè)或多個(gè)參與脂肪酸合成的酶的RNA互補(bǔ)。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，此類RNA能夠靶向病毒基因組或轉(zhuǎn)錄本以預(yù)防或減輕疾病。在另一個(gè)有利的實(shí)施方案中，此類RNA能夠靶向并調(diào)控內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，α-球蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)其轉(zhuǎn)錄本將形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA序列轉(zhuǎn)錄，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)通過RNA干預(yù)介導(dǎo)天然基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。在不同的實(shí)施方案中，α-球蛋白基因啟動(dòng)子導(dǎo)致編碼內(nèi)源蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄，以通過共阻遏機(jī)制沉默所述蛋白的基因(美國(guó)專利No.6,100,450；12欄，42-60行)。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，α-球蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)調(diào)控雙子葉植物種子脂肪酸含量的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)。附圖的簡(jiǎn)短說明參照附圖中舉例說明的且在文中描述的實(shí)施方案，將對(duì)上文簡(jiǎn)要概述的發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的描述。不過，應(yīng)當(dāng)指出，所述附圖僅僅闡釋了本發(fā)明的某些實(shí)施方案，因而不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為限制了其范圍，因?yàn)楸景l(fā)明可允許其它等同有效的實(shí)施方案。圖1顯示了α-球蛋白啟動(dòng)子的序列和報(bào)告基因構(gòu)建體。A.啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列。B.本發(fā)明實(shí)施方案中所用的雙元載體pBIAGPGUS的T-DNA。圖2顯示了在來自穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的煙草、棉花和擬南芥屬植物以及發(fā)芽的擬南芥屬幼苗的發(fā)育中胚中的GUS活性的組織化學(xué)分布。A-E.來自T1-純合的煙草植物的胚中的活性A.開花后9天(dpa)的胚，B.10dpa的胚，C.13dpa的胚，D.17dpa的胚，E.來自干種子的成熟胚；F-N.來自T1-純合的棉花植物的胚中的GUS活性F.顯示初始GUS活性的16dpa胚的高放大倍數(shù)圖像，G.較低放大倍數(shù)下的相同胚，H.18dpa的胚，I.19dpa的胚，J.20dpa的胚，K.25dpa的胚，L.30dpa的胚，M.40dpa的胚，N.顯示胚根和下胚軸區(qū)染色的分離自干種子且從中間切開的胚；O.來自零分離(nullseqregant)棉花種子的胚；P-T擬南芥(Arabidopsisthalia)種子中的GUS活性P.魚雷期胚(4dpa)，Q.手杖期胚(5dpa)，R.反轉(zhuǎn)的U期胚(7dpa)，S.部分成熟的胚(9dpa)，T.來自干種子的成熟胚；U-Y轉(zhuǎn)基因擬南芥屬種子發(fā)芽期間的GUS活性U.分離自干種子的胚，V.1天齡幼苗，W.3天齡幼苗，X.5天齡幼苗，Y.8天齡幼苗。尺度A-E，P-T＝100μm；F-O，U-Y＝1mm。圖3顯示了煙草中α-球蛋白啟動(dòng)子對(duì)GUS表達(dá)的發(fā)育調(diào)控。A.煙草種子中α-球蛋白啟動(dòng)子對(duì)GUS表達(dá)的發(fā)育調(diào)控。B.在吸漲(imbibition)后不同天數(shù)的發(fā)芽期間煙草幼苗中的GUS特異性活性。圖4顯示了棉花胚中α-球蛋白啟動(dòng)子對(duì)GUS表達(dá)的發(fā)育調(diào)控。來自發(fā)育中棉花胚的提取物中的GUS特異性活性(實(shí)心圓)和總蛋白(空心圓)作為開花后天數(shù)(dpa)的函數(shù)。圖5顯示了來自獨(dú)立轉(zhuǎn)基因世系的T0煙草、T1擬南芥和T0棉花種子中的GUS活性。圖6顯示了分離自T1純合子種子以及單T1半合子棉花植物種子的單個(gè)胚中的GUS特異性活性。圖7顯示了α-球蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)來自棉花的δ-12去飽和酶基因反義表達(dá)，以提高不同轉(zhuǎn)基因世系的棉花種子中油酸的水平。C未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物。O棉花籽油(Supelco，Bellefonte，USA)。圖8顯示了四種世系的高油酸棉花種子單個(gè)種子水平上的脂肪酸水平。來自四種T0世系H50-2(A)、H41-1(B)、H4-2(C)和H42-2(D)的單個(gè)T1種子中的油酸(三角形)和亞油酸(空心正方形)水平。X軸數(shù)字代表單個(gè)種子。P收集的30個(gè)種子。圖9顯示了由兩種高油酸轉(zhuǎn)基因世系生長(zhǎng)的T2棉花種子中的脂肪酸水平。來自兩種高油酸世系H50-2(A)和H41-1(B)T1植物的T2種子中的油酸(三角形)和亞油酸(空心正方形)水平。測(cè)試了從每種世系15個(gè)不同T1植物收集的30個(gè)T2種子樣品。圖10顯示了圖1中所劃出的且獨(dú)立地示于SEQNOID3的336bp序列。圖11顯示了圖1中所示且獨(dú)立地示于SEQNOID2的1108bp序列。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明接下來的討論和實(shí)施例詳細(xì)描述了實(shí)施本發(fā)明的最好的已知方法。應(yīng)當(dāng)理解該方法的變形可以包括所述調(diào)控序列的異源或天然基因或構(gòu)建體或修飾，取決于靶植物物種和待轉(zhuǎn)移到靶植物中的性狀。在下列實(shí)施例中選擇棉花、煙草和擬南芥物種作為靶植物；不過，下文概括的棉花α-球蛋白啟動(dòng)子的用途以及驅(qū)動(dòng)天然或異源基因表達(dá)的方法適用于其它植物，而無需重大的實(shí)驗(yàn)或者偏離本發(fā)明的精神和范圍。已知球蛋白是雙子葉植物中最普遍的種子儲(chǔ)藏蛋白(Borroto和Dure，1987)，并且它們的調(diào)控序列潛在地是能夠用于賦予廣范圍的雙子葉物種中轉(zhuǎn)基因的強(qiáng)種子特異性表達(dá)性質(zhì)的啟動(dòng)子的有用來源。本發(fā)明提供了分離的核酸，其編碼種子特異性棉花α-球蛋白B(AG)基因的5′調(diào)控區(qū)，命名為α-球蛋白啟動(dòng)子或AGP。根據(jù)本發(fā)明，該5′調(diào)控區(qū)，當(dāng)可操作地連接于異源基因的編碼序列或者互補(bǔ)于天然植物基因的序列時(shí)，可指導(dǎo)所述編碼序列或互補(bǔ)序列在植物種子中的表達(dá)。本發(fā)明的AG5′調(diào)控區(qū)可用于構(gòu)建表達(dá)盒，其在5′到3′方向上包括該AG5′調(diào)控區(qū)、處于該調(diào)控區(qū)控制下的異源基因或互補(bǔ)于天然植物基因的序列以及3′終止序列。這種表達(dá)盒可摻入到許多自主復(fù)制的載體中以構(gòu)建表達(dá)載體。AG調(diào)控區(qū)的修飾，包括如SEQNOID1和SEQNOID2中所示的獨(dú)立啟動(dòng)子和5′非翻譯區(qū)，且保留了指導(dǎo)種子特異性表達(dá)的特征性性能，落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此類修飾包括插入、缺失以及一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代。指導(dǎo)種子特異性表達(dá)的種子特異性5′調(diào)控區(qū)及其修飾或缺失片斷的確認(rèn)，可通過構(gòu)建特定序列與異源基因編碼序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯融合體，將該嵌合基因轉(zhuǎn)移到合適的宿主中，并檢測(cè)異源基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。檢測(cè)表達(dá)所用的測(cè)定法取決于異源序列的性質(zhì)。例如，以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)作為例證的報(bào)告基因，通常用來評(píng)價(jià)嵌合構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄和翻譯能力。標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法可用來靈敏地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物體中的報(bào)告酶。β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因在轉(zhuǎn)基因植物中可用作啟動(dòng)子活性的報(bào)告分子，因?yàn)樵撁冈谥参锛?xì)胞中具有高穩(wěn)定性，高等植物中缺乏內(nèi)在葡糖醛酸糖苷酶活性，并且可利用定量熒光測(cè)定和組織化學(xué)定位技術(shù)。Jefferson等(1987b)EMBOJ63901-3907已建立了用于在植物組織中生物化學(xué)和組織化學(xué)檢測(cè)GUS活性的標(biāo)準(zhǔn)方法。生物化學(xué)測(cè)定通過將植物組織裂解物與4-羥甲基香豆素(methylumbelliferyl)β-D-葡糖苷酸(一種GUS熒光底物)混合，于37℃溫育1小時(shí)，然后測(cè)量所得的4-甲基-7-羥基香豆素(umbelliferone)的熒光實(shí)施。GUS活性的組織化學(xué)定位通過于37℃在5-溴-4-氯-3-吲哚-葡糖苷酸(X-Gluc)中溫育植物組織樣品大約18小時(shí)并觀察X-Gluc的染色模式測(cè)定。此類嵌合基因的構(gòu)建能限定具體的調(diào)控序列，并證明這些序列能夠指導(dǎo)異源基因以種子特異性的方式表達(dá)。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及表達(dá)盒和表達(dá)載體(文中也稱之為“嵌合基因”)，其包含可操作地連接于異源基因編碼序列的指導(dǎo)種子特異性表達(dá)的AG基因的5′調(diào)控區(qū)或其部分，從而該調(diào)控元件能夠調(diào)節(jié)由所述異源基因編碼的產(chǎn)物的表達(dá)。所述異源基因可以是AG之外的任何基因。如有必要，嵌合構(gòu)建體中包括另外的來自AGP之外的基因的調(diào)控元件，或者足以導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)生有效量的由所述異源基因編碼的多肽的此類元件的一部分。從而，本發(fā)明提供了嵌合基因，其包含賦予種子特異性表達(dá)的AG5′調(diào)控區(qū)序列，可操作地連接于編碼異源基因如脂類代謝酶的序列?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的脂類代謝基因的實(shí)例包括脂類去飽和酶，例如δ6-去飽和酶、δ12-去飽和酶、δ15-去飽和酶及其它相關(guān)去飽和酶，例如硬脂酰-ACP去飽和酶、?；d體蛋白(ACP)、硫酯酶、乙酰轉(zhuǎn)酰酶、乙酰輔酶A羧化酶、酮脂酰合酶、丙二酰轉(zhuǎn)酰基酶、以及延伸酶(elongase)。此類脂類代謝基因已從許多不同的細(xì)菌和植物物種中分離并描述了特征。它們的核苷酸編碼序列以及分離此類編碼序列的方法公開在出版的文獻(xiàn)中，并廣泛地為本領(lǐng)域技術(shù)人員所用。本發(fā)明的嵌合基因通過將AG基因組DNA的5′調(diào)控區(qū)或其部分連接到異源基因的編碼序列上構(gòu)建。這些序列的并置可由許多方式實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，5′到3′方向的序列次序是AG啟動(dòng)子、編碼序列以及終止序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，5′到3′方向的序列次序是AG啟動(dòng)子、AG非翻譯區(qū)、編碼序列以及包括多聚腺苷?；稽c(diǎn)的終止序列。構(gòu)建此類嵌合基因的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的，并且可見于參考文獻(xiàn)例如Sambrook等(1989)。許多策略可用于連接DNA片段，其選擇取決于DNA片段末端的性質(zhì)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到為了表達(dá)異源基因，構(gòu)建需要至少一個(gè)啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄本有效聚腺苷?；男盘?hào)。從而，可以直接將含有稱之為TATA框的保守啟動(dòng)子序列的AG5′調(diào)控區(qū)連接到無啟動(dòng)子的異源編碼序列上。含AGTATA框的限制性或缺失片段正向連接于無啟動(dòng)子的異源基因如β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的編碼序列上。熟練技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到該AG5′調(diào)控區(qū)及其部分可通過其它方式提供，例如化學(xué)或酶促合成。異源編碼序列的3′端可操作地連接于包括多聚腺苷酰化位點(diǎn)的終止序列，所述終止序列例示為但不限于，胭脂堿合酶多聚腺苷?；稽c(diǎn)或者章魚堿T-DNA基因7多聚腺苷?；稽c(diǎn)?；蛘撸嗑巯佘挣；稽c(diǎn)可以由異源基因提供?；蛘?，含RNA定位信號(hào)(“拉鏈編碼zipcode”)序列的3′UTR。這些決定因子可能對(duì)種子表達(dá)系統(tǒng)很重要。本發(fā)明也提供了提高天然基因的表達(dá)或者在植物種子中表達(dá)異源基因的方法。根據(jù)此方法，將所述表達(dá)盒和表達(dá)載體引入植物中，以實(shí)現(xiàn)異源基因的表達(dá)。例如，提供了通過用包含可操作地連接于脂肪酸合成或脂類代謝基因的AG5′調(diào)控區(qū)或其部分的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、并再生具有提高水平的所述脂肪酸合成或脂類代謝基因產(chǎn)物的植物，產(chǎn)生具有提高水平的脂肪酸合成或脂類代謝基因產(chǎn)物的植物的方法。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了降低植物天然基因產(chǎn)物水平的方法，其包括用包含可操作地連接于與所述天然植物基因互補(bǔ)的核酸序列的AG5′調(diào)控區(qū)或其部分的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。以這種方式，天然植物基因內(nèi)源產(chǎn)物的水平通過稱之為反義調(diào)控的機(jī)制降低。因而，舉例來說，通過用包含可操作地連接于與編碼天然脂肪酸合成或脂類代謝基因的核酸序列的互補(bǔ)的核酸序列的AG5′調(diào)控區(qū)或其部分的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，可降低脂肪酸合成基因或脂類代謝基因的產(chǎn)物水平。本發(fā)明也提供了共阻遏(cosuppressing)植物天然基因的方法，其包括用包含可操作地連接于編碼天然植物基因的核酸序列的AG5′調(diào)控區(qū)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。以這種方式，天然植物基因內(nèi)源產(chǎn)物的水平通過稱之為共阻遏的機(jī)制降低。因而，舉例來說，通過用包含可操作地連接于編碼天然脂肪酸合成或植物天然脂類代謝基因的核酸序列的AG5′調(diào)控區(qū)或其部分的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，可降低脂肪酸合成基因或脂類代謝基因的產(chǎn)物水平。雖然共阻遏的確切機(jī)制尚未完全了解，但本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉報(bào)道共阻遏相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件和結(jié)果的公開著作(Napoli等1990；VanderKrol1990)。本發(fā)明也提供了調(diào)控天然基因表達(dá)的方法，其包括用包含可操作地連接于編碼與天然植物基因反義部分相連的有義部分的核酸序列的AG5′調(diào)控區(qū)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。來自此具有自身互補(bǔ)臂的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄本形成雙鏈RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并引起來自天然基因的轉(zhuǎn)錄本的降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Waterhouse等，1998；Wang和Waterhouse，2000；Chuang和Meyerowitz，2000)。這類似于RNA干擾機(jī)制。為提供異源或天然基因的調(diào)控表達(dá)，用本發(fā)明的嵌合基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物?；蜣D(zhuǎn)移的方法是本領(lǐng)域熟知的。嵌合基因可通過如Horsch等(1988)所述的葉盤轉(zhuǎn)化-再生方法引入到植物中。也可以利用其它轉(zhuǎn)化方法例如原生質(zhì)體培養(yǎng)，其落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用土壤桿菌(Agrobacterium)來源的載體例如Klee等(1987)描述的那些載體轉(zhuǎn)化植物。其它熟知的方法可用來將本發(fā)明的嵌合基因插入到植物細(xì)胞中。此類替代方法包括生物轟擊(biolistic)途徑(描述于Klein等，1987中)、電轉(zhuǎn)化、化學(xué)誘導(dǎo)的DNA攝取以及使用病毒或花粉作為載體。對(duì)于轉(zhuǎn)化方法，當(dāng)必要時(shí)，可將本發(fā)明的嵌合基因插入到植物轉(zhuǎn)化載體，例如由Bevan(1984)所述的雙元載體中。植物轉(zhuǎn)化載體可通過修飾天然根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)獲得。所述天然系統(tǒng)包含含有大片段的大Ti(腫瘤誘導(dǎo))質(zhì)粒，稱之為T-DNA，它被轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化的植物中。另一個(gè)Ti質(zhì)粒片段vir區(qū)負(fù)責(zé)T-DNA的轉(zhuǎn)移。所述T-DNA區(qū)鄰接末端重復(fù)。在修飾的雙元載體中，腫瘤誘導(dǎo)基因已被缺失，且利用vir區(qū)功能轉(zhuǎn)移T-DNA邊界序列鄰接的外源DNA。所述T-區(qū)也含有可選擇的抗生素抗性標(biāo)志以及多克隆位點(diǎn)用于插入轉(zhuǎn)移的序列。此類改造菌株被稱之為“disarmed”根癌土壤桿菌菌株，并且允許將T-區(qū)鄰接的序列有效地轉(zhuǎn)移到植物的核基因組中。表面消毒的葉盤及其它易感組織接種所述“disarmed”含外源DNA的根癌土壤桿菌，培養(yǎng)數(shù)天，然后轉(zhuǎn)移到含抗生素的培養(yǎng)基中。在含合適抗生素的培養(yǎng)基中生根后，則選擇轉(zhuǎn)化的芽，并轉(zhuǎn)移到土壤中。對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行授粉，并從這些植物中收集種子且在抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)。異源或報(bào)告基因在發(fā)育種子、年輕幼苗和成熟植物中的表達(dá)可通過免疫學(xué)、組織化學(xué)或活性測(cè)定監(jiān)控。如本文所討論的，嵌合基因表達(dá)測(cè)定法的選擇取決于異源編碼區(qū)的性質(zhì)。例如，如果可獲得合適的核苷酸探針，則Northern分析可用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)錄。如果可獲得由異源基因編碼的多肽的抗體，則可利用Western分析和免疫組織化學(xué)定位評(píng)價(jià)所述多肽的產(chǎn)量和分布。根據(jù)異源基因，可使用合適的生物化學(xué)測(cè)定法。例如，乙酰基轉(zhuǎn)移酶通過測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)底物的乙?；瘷z測(cè)。脂類去飽和酶基因的表達(dá)可通過分析脂肪酸甲酯(FAMES)測(cè)定。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含本發(fā)明的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物或這些植物的子代。單子葉植物和雙子葉植物都考慮在內(nèi)。通過上述的任何植物轉(zhuǎn)化方法用嵌合基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，通常為愈傷組織培養(yǎng)物、葉盤、外植塊或全植物(介由Bechtold等，1993的真空浸潤(rùn)法)的形式，通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法再生為完整的轉(zhuǎn)基因植物(如Horsh等，1985)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物是向日葵、棉花、油料油菜(oilseedrape)、玉米、煙草、擬南芥屬植物、花生或大豆。由于轉(zhuǎn)化植物的子代遺傳得到該嵌合基因，因此利用來自轉(zhuǎn)化植物的種子或插條維持該轉(zhuǎn)基因世系。定義如本文所用的術(shù)語“α球蛋白基因啟動(dòng)子和5′非翻譯區(qū)”(″AGP″)是指圖1A中所示的1144bpDNA序列(SEQIDNO1)、包括該1144bp序列的任何更大的DNA序列以及由該1144bp序列的一部分構(gòu)成的任何更小的DNA序列，且就時(shí)空發(fā)育(saptio-developmental)表達(dá)模式和/或表達(dá)水平而言，它們與全長(zhǎng)1144bp序列以相同的方式或相似的方式行使轉(zhuǎn)錄方面的功能。如本文所用的術(shù)語“α球蛋白基因啟動(dòng)子”是指圖1A中所示的1108bpDNA序列(SEQIDNO2)、包括該1108bp序列的任何更大的DNA序列以及由該1108bp序列的一部分構(gòu)成的任何更小的DNA序列，且就時(shí)空發(fā)育表達(dá)模式和/或表達(dá)水平而言，它們與全長(zhǎng)1108bp序列以相同的方式或相似的方式行使轉(zhuǎn)錄方面的功能。如本文所用，術(shù)語“可操作地連接”是指調(diào)控區(qū)如啟動(dòng)子與編碼區(qū)以一種方式連接，從而所述編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄受所述調(diào)控區(qū)的調(diào)節(jié)和調(diào)控。將啟動(dòng)子可操作地連接于編碼區(qū)的方法是本領(lǐng)域熟知的。如本文所用，術(shù)語“盒”是指能夠表達(dá)特定基因的核苷酸序列，如果所述基因插入從而可操作地連接于該核苷酸序列中存在的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控區(qū)的話。因而，舉例來說，表達(dá)盒可包含期望在植物種子中表達(dá)的異源編碼序列。本發(fā)明的表達(dá)盒和表達(dá)載體因此可用于指導(dǎo)任何數(shù)目的異源基因的種子特異性表達(dá)。如本文所用，術(shù)語“種子特異性表達(dá)”是指在植物種子的胚部分表達(dá)。實(shí)施例圖1顯示了α-球蛋白啟動(dòng)子的序列和報(bào)告基因的構(gòu)建體。圖1A(SEQIDNO.1)顯示了本研究中分離且在功能上描述了特征的1144bp序列。推斷的順式作用元件在框內(nèi)顯示。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以+1指示。5′非翻譯區(qū)以斜體表示，并且額外的未公開的336bp序列以下劃線標(biāo)出。所述336bp序列示于圖10(SEQIDNO.3)中。按照Siebert等(1995)所述的方法，利用來自棉花分期胚cDNA文庫(kù)的α-球蛋白克隆的序列信息克隆5′側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū)。該克隆朝此處所示序列3′端的772bp與公開的α-球蛋白基因B的5′基因組側(cè)翼序列相匹配(Chlan等，1987)。進(jìn)一步的PCR步行法產(chǎn)生了額外的上游序列的336個(gè)核苷酸(下劃線)。根據(jù)啟動(dòng)子序列信息，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增了1144個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段，含有組合的啟動(dòng)子和來自棉花cv.Coker312)基因組DNA的α-球蛋白B基因非翻譯前導(dǎo)區(qū)。所用的引物是AGP5＝5′-aag-ctt-gca-tgc-ctg-cag-CTA-TTT-TCA-TCC-TAT-TTA-GAA-ATC-3′；AGP3＝5′-ggg-acg-cgt-atc-GAT-TAC-GAT-AAG-CTC-TGT-ATT-TTG-3′(摻入到引物中的唯一的限制性位點(diǎn)以小寫字母表示)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆到TA克隆載體pCRII(Invitrogen)中產(chǎn)生pCRII-AGP。插入物的完整性通過測(cè)序證實(shí)。用所述的引物擴(kuò)增基因組棉花DNA，接著進(jìn)行常規(guī)克隆和測(cè)序，允許本領(lǐng)域任何技術(shù)人員無需過度實(shí)驗(yàn)就可獲得該DNA片段。然后將來自pCRII-AGP的α-球蛋白啟動(dòng)子以HindIII-XbaI片段引入到位于pBI101.3(Clontech)gusA基因上游的多聚接頭序列中。在GUS編碼序列上游發(fā)現(xiàn)的框外ATG(來自pCRII多聚接頭)通過缺失NotI和SmaI位點(diǎn)之間的區(qū)域除去，產(chǎn)生測(cè)試構(gòu)建體pBIAGPGUS。對(duì)全部推斷的啟動(dòng)子和5′UTR進(jìn)行測(cè)序，以證實(shí)最終構(gòu)建體的完整性。然后利用An等(1988)描述的方法，將圖1b所示的持有nptII作為植物選擇性標(biāo)記基因的雙元載體pBIAGPGUS引入到土壤桿菌菌株LBA4404和GV3101中。參照?qǐng)D1A，TATA框和CAAT框以粗體字母表示，而5′非翻譯區(qū)以斜體表示。啟動(dòng)子序列的視覺分析揭示了許多推斷的可能參與α-球蛋白基因B組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA基序。存在四個(gè)CANNTG基序(Kawagoe和Murai，1992)，一個(gè)CATGCACA(RY重復(fù)，Dickinson等，1988)以及兩個(gè)AACACA基序(Goldberg，1986)。這些順式元件據(jù)信賦予了啟動(dòng)子種子特異性表達(dá)的性質(zhì)。瞬時(shí)表達(dá)測(cè)定提示了圖11(SEQNO.ID2)中所示的1108bp序列高度的組織(種子)特異性。該序列的功能分析通過用圖1B中所示的雙元載體構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化3個(gè)不同物種實(shí)施，所述載體包含處于α-球蛋白啟動(dòng)子控制下的報(bào)告基因β-葡糖醛酸糖苷酶。在種子發(fā)育期間GUS活性的組織化學(xué)定位。處于α-球蛋白啟動(dòng)子調(diào)控下的葡糖醛酸糖苷酶基因的表達(dá)，首先在顆粒轟擊介導(dǎo)轉(zhuǎn)化高粱(sorghum)和棉花的發(fā)育中胚、胚乳及葉子之后，利用瞬時(shí)表達(dá)測(cè)定法測(cè)試。結(jié)果(未顯示)表明啟動(dòng)子僅在棉花的發(fā)育中胚中具有活性。根據(jù)這些結(jié)果，對(duì)煙草、擬南芥和棉花進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，以更詳細(xì)地描述棉花α-球蛋白啟動(dòng)子活性的特征。如Jefferson等(1987)所述，對(duì)煙草和棉花T1種子以及擬南芥T2種子進(jìn)行GUS測(cè)定。這些代的種子將產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的分離。為了使因零分離(nullseqregant)和純合子種子引入的差異最小化，用大量種子進(jìn)行所述測(cè)定。對(duì)每種轉(zhuǎn)基因世系進(jìn)行一式三份測(cè)定，對(duì)每份棉花、煙草和擬南芥分別用25(～2gm)、150(～15mg)和300(～5mg)個(gè)種子。總蛋白利用Bradford(1976)的方法測(cè)量。GUS活性相對(duì)于總蛋白而被標(biāo)準(zhǔn)化，且結(jié)果表示為GUS比活(每mg蛋白每分鐘釋放的4-MU的納摩爾數(shù))。也在種子中表現(xiàn)出GUS活性的植物的葉子、根、莖和花組織中進(jìn)行GUS表達(dá)分析。T1純合子煙草和T2純合子擬南芥的種子在MSO培養(yǎng)基中發(fā)芽，并對(duì)發(fā)芽后不同天數(shù)的幼苗進(jìn)行GUS活性的組織化學(xué)測(cè)定(在擬南芥的情況下)或熒光測(cè)定(在煙草的情況下)。在GUS染色后，幼苗在乙醇中處理，以清除葉綠素。在煙草和擬南芥的情況下，利用KodakElitechromeTungsten160T膠片對(duì)胚/幼苗進(jìn)行拍照。掃描幻燈片并進(jìn)行數(shù)值放大。棉花胚圖像利用ZeissM2BIOZoomStereo/Compound顯微鏡配置的ZeissAxioCam數(shù)碼相機(jī)捕獲。圖2利用Canvas7.0軟件編輯。來自T0轉(zhuǎn)基因棉花植物表現(xiàn)出種子特異性表達(dá)的種子首先在100mg/l卡那霉素中發(fā)芽以消除零分離。將發(fā)芽并在卡那霉素存在下生長(zhǎng)的那些種子轉(zhuǎn)移到土壤中并培養(yǎng)至成熟。通過對(duì)種子的GUS組織化學(xué)分析測(cè)定這些T1植物的接合狀態(tài)。選擇一個(gè)純合子植物和一個(gè)半合子植物進(jìn)行種子GUS活性的定量分析。利用早先描述的熒光測(cè)定方法對(duì)分離自種子的胚獨(dú)立地進(jìn)行GUS活性分析。圖2顯示了在來自穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的煙草、棉花和擬南芥屬植物以及發(fā)芽的擬南芥幼苗的發(fā)育中胚中的GUS活性的組織化學(xué)定位。GUS活性的組織化學(xué)分析可用于鑒定α-球蛋白啟動(dòng)子調(diào)控的表達(dá)的定時(shí)和定位。分離自T1純合子煙草植物不同胚發(fā)育階段種子的胚中GUS活性的組織化學(xué)分析結(jié)果示于圖2A-E中。AGP在來自3種T1純合子煙草植物的種子中評(píng)價(jià)gusA表達(dá)。煙草(Nicotianatabacumcv.Havana)由土壤桿菌菌株LBA4404(pBIAGPGUS)利用葉盤轉(zhuǎn)化方法(Horsch等，1988)轉(zhuǎn)化。在含100mg/ml卡那霉素和500mg/ml羧芐青霉素的再生培養(yǎng)基(MS鹽，100mg/l肌醇，0.4mg/l硫胺HCl，4μMBAP，0.5μMNAA，3％蔗糖，pH5.6，由0.8％Dufci-Bacto瓊脂固化)中選擇轉(zhuǎn)化株。將再生根切離并在MSO培養(yǎng)基(MS鹽，B-5有機(jī)物，2％蔗糖，pH5.7，用0.8％Difco-Bacto瓊脂固化)(含有100mg/l卡那霉素和500mg/l羧芐青霉素)中生長(zhǎng)。將具有較好的根系統(tǒng)的植物轉(zhuǎn)移到土壤并在溫室中生長(zhǎng)至成熟。自數(shù)個(gè)蒴果的種子分離胚，而且它們的顯微鏡觀察顯示胚在開花后9天(dpa)左右達(dá)到心期。在心期或晚心期的胚中檢測(cè)不到可見的GUS活性。不過，在晚魚雷期及發(fā)育較老階段的胚中觀察到GUS活性。圖2F-2N顯示了T1-純合子棉花植物胚中的GUS活性。在分離自T1-純合子棉花植物種子的發(fā)育中的胚中進(jìn)行GUS活性的組織化學(xué)分析。棉花(Gossypiumhirsutumcv.Coker312)下胚軸區(qū)段幼苗用土壤桿菌[LBA4404(pBIAGPGUS)]根據(jù)Sunilkumar和Rathore(2001)描述的方法轉(zhuǎn)化。從卡那霉素抗性轉(zhuǎn)基因愈傷組織(calli)再生植物并培養(yǎng)至成熟。GUS染色最早在16dpa的胚中檢測(cè)到。在該階段，如圖2F和2G所示，子葉剛剛開始伸展，且GUS活性剛好出現(xiàn)在子葉下方，處于子葉和下胚軸交接處。該活性隨著種子發(fā)育進(jìn)程提高并散布于整個(gè)胚中，如圖2H-2N所示。在40dpa的胚和分離自干種子的成熟胚中觀察到強(qiáng)烈染色。圖20顯示了分離自零分離種子的胚，其在組織化學(xué)GUS測(cè)定后為陰性。來自3種植物物種的轉(zhuǎn)基因植物的成熟胚的GUS活性的組織化學(xué)分布結(jié)果提示所述1108bp啟動(dòng)子區(qū)具有賦予胚中表達(dá)所需的順式作用結(jié)構(gòu)域。圖2P-2T顯示了T2-純合子擬南芥(Arabidopsisthaliana)C24植物種子的發(fā)育中的胚中的GUS活性。利用由AGPgusA轉(zhuǎn)化的擬南芥純合子T2代的種子進(jìn)行組織化學(xué)分析。擬南芥(Arabidopsisthaliana)C24植物利用土壤桿菌菌株GV3101(pBIAGPGUS)通過真空浸潤(rùn)法(Bechtold和Pelletier，1998)轉(zhuǎn)化。在含50mg/ml卡那霉素的MSO培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化的種子(T1)。將所述卡那霉素抗性植物轉(zhuǎn)移到土壤并于培養(yǎng)室中生長(zhǎng)至成熟(23℃，65％濕度，14小時(shí)/10小時(shí)光周期)。在分離自不同發(fā)育階段種子的胚中檢測(cè)AGPgusA的表達(dá)。GUS染色在心期和晚心期胚中不可見(結(jié)果未顯示)。在魚雷期胚中觀察到低水平的GUS活性，如圖2P所示，并且隨著胚生長(zhǎng)至成熟藍(lán)染色的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，如圖2Q-2T所示。在分離自干種子的胚中觀察到強(qiáng)烈的GUS染色。綜合考慮，來自這三種雙子葉物種的結(jié)果提示由AGP驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)限于胚發(fā)育的中期到晚期。圖2U-2Y顯示了轉(zhuǎn)基因擬南芥種子發(fā)芽期間的GUS活性。為了確定AGP活性是否嚴(yán)格地限于發(fā)育中的胚/種子，在發(fā)芽的擬南芥幼苗中監(jiān)測(cè)GUS活性。利用生物化學(xué)方法在發(fā)芽的幼苗中分析GUS活性。圖2U-Y中所示的結(jié)果表明GUS染色的強(qiáng)度隨著幼苗生長(zhǎng)逐漸下降。在吸漲后5天，仍可見某些殘余的GUS活性。不過，7天后，僅在下胚軸的兩端觀察到藍(lán)染色的弱斑。GUS染色在子葉、根或下胚軸中央部分不可見。在吸漲后超過7天的幼苗中未觀察到GUS活性(圖2Y)。圖3介由定量分析顯示了煙草中α-球蛋白啟動(dòng)子對(duì)GUS表達(dá)的發(fā)育調(diào)控。組織化學(xué)分析不能檢測(cè)低水平的GUS活性，而且也不能給出GUS表達(dá)水平提高的精確測(cè)量。因此，通過在開花后不同時(shí)間點(diǎn)的定量熒光GUS測(cè)定，檢測(cè)發(fā)育中種子(煙草)和發(fā)育的胚(棉花)中的GUS表達(dá)，來研究種子發(fā)育期間的AGP活性。如圖3A所示，可檢測(cè)的GUS特異性活性最早在12dpa在T1純合子煙草植物的種子中檢測(cè)到。該活性隨之迅速升高，最后在20dpa達(dá)到最大。圖3B顯示了煙草幼苗在吸漲后不同天數(shù)發(fā)芽期間的GUS活性。表面消毒的來自T1純合子煙草植物的種子在MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)中發(fā)芽。利用吸漲后0、2、4、6、8和10天的全幼苗提取物進(jìn)行GUS熒光測(cè)定。GUS活性在種子發(fā)芽后持續(xù)下降(圖3B)，并且8天后僅發(fā)現(xiàn)初始活性的2％。在發(fā)芽后10天的幼苗中未檢測(cè)到GUS活性。GUS活性在擬南芥(圖2A-2E)和煙草(圖3B)種子發(fā)芽后迅速跌至不可檢測(cè)水平的事實(shí)提示啟動(dòng)子僅在種子發(fā)育期間有活性，而在種子發(fā)芽和成熟植物中失活。圖4介由定量分析顯示了棉花胚中α-球蛋白啟動(dòng)子對(duì)GUS表達(dá)的發(fā)育調(diào)控。由于大的種子粒徑、相對(duì)慢的胚發(fā)育進(jìn)程、以及從發(fā)育種子中分離胚的容易性，棉花為在單個(gè)種子水平詳細(xì)描述AGPgusA表達(dá)特征提供了最好的系統(tǒng)。分離自T1純合子棉花植物種子的發(fā)育中胚的GUS活性定量分析結(jié)果、蛋白水平以及鮮重示于圖4。植物在溫室中于4月份生長(zhǎng)，并且在每年的這個(gè)時(shí)候，棉蒴在大約43dpa時(shí)打開。GUS表達(dá)最早在15dpa時(shí)檢測(cè)到(60pmole/mg蛋白/分)。之后GUS活性緩慢升高直到20dpa，然后迅速上升直至40dpa。從該頂峰直到種子成熟，出現(xiàn)小但統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的活性下降。在種子發(fā)育期間，蛋白水平(如在GUS抽提緩沖液中測(cè)量的)從15dpa到30dpa迅速升高，接著緩慢增長(zhǎng)直至40dpa然后停止增加。在18dpa前不可能確切地稱重胚。不過，自該時(shí)間點(diǎn)起，胚鮮重升高直至40dpa，緊接著隨種子達(dá)到干態(tài)而下降。這些結(jié)果印證了組織化學(xué)分析。AGPgusA在15dpa左右在棉花胚中開始表達(dá)，并且該活性在超過40dpa后或者停止增加或者下降。表1顯示了T1-純合子轉(zhuǎn)基因棉花植物不同組織和對(duì)照種子中的GUS特異性活性。對(duì)在胚中表達(dá)報(bào)告基因的3種不同T0轉(zhuǎn)基因棉花植物的不同部分進(jìn)行組織化學(xué)GUS分析。在轉(zhuǎn)基因植物的組織例如莖、葉、葉柄、花柄(flowerstock)、萼片、花瓣或棉蕾中未檢測(cè)到GUS活性依賴性組織化學(xué)染色。另外，進(jìn)行更靈敏的熒光測(cè)定分析檢測(cè)一個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花植物不同器官和組織中的AGP活性。該分析的結(jié)果示于表1，清楚地證明在莖、葉、花蕾、花粉和根中沒有可檢測(cè)的GUS活性。僅在種子中檢測(cè)到高水平的GUS活性。這些結(jié)果提示AGP驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因活性被緊密調(diào)控，并且是種子特異性的。表1.T1純合子轉(zhuǎn)基因棉花植物不同組織和對(duì)照種子中的GUS比活GUS活性aa數(shù)值為三份重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均GUS活性±SE。b重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)目不足以計(jì)算SE(該測(cè)定中利用了5.7mg花粉)。c對(duì)每一重復(fù)實(shí)驗(yàn)在混合10個(gè)種子的胚中進(jìn)行測(cè)定。圖5顯示了獨(dú)立轉(zhuǎn)基因世系T0煙草、T1擬南芥和T0棉花種子中以對(duì)數(shù)等級(jí)繪制的GUS活性。初步結(jié)果顯示AGP驅(qū)動(dòng)的GUS活性在這三種物種中區(qū)別極大。對(duì)許多來自擬南芥、煙草和棉花的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因世系的種子(通過組織化學(xué)法測(cè)試為GUS活性陽性)進(jìn)行的深入分析證實(shí)了這種觀察結(jié)果。如圖5所示，來自11個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因煙草世系的種子的GUS活性范圍從0.6到18nanomole4-MU/mg蛋白/分。來自10個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因擬南芥世系的種子的相似分析顯示了從49到203nanomole4-MU/mg蛋白/分的范圍。10個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因棉花世系的GUS活性范圍從118到1777nanomole4-MU/mg蛋白/分。也已在由谷蛋白啟動(dòng)子gusA和玉米蛋白啟動(dòng)子gusA轉(zhuǎn)化株獲得的玉米種子中報(bào)道了相似的高水平種子特異性啟動(dòng)子表達(dá)(Russell和Fromm，1997)。該結(jié)果提示棉花AGP雖然作為種子特異性啟動(dòng)子被不同的異源系統(tǒng)識(shí)別，但在棉花中表現(xiàn)出最高水平的活性。圖6顯示了分離自T1純合子種子以及單一半合子棉花植物種子的單個(gè)胚的GUS特異性活性。純合子和半合子T1植物都來自于單一T0轉(zhuǎn)基因世系。棉花大的種子粒徑允許在單個(gè)種子水平分析GUS活性。這為我們提供了在由半合子T1植物產(chǎn)生的分離的T2種子群內(nèi)定量檢測(cè)單個(gè)種子的GUS活性，并將這些數(shù)值與由純合子T1植物產(chǎn)生的單個(gè)種子的活性進(jìn)行比較的機(jī)會(huì)。如圖6所示，來自純合子T1親本的所有T2種子都表現(xiàn)出GUS活性(圖6，底部柱形圖)，提示再引入天然啟動(dòng)子，即使是在純合子的條件下，不導(dǎo)致該世系的轉(zhuǎn)基因沉默。來自半合子T1親本的T2種子表現(xiàn)出清楚的轉(zhuǎn)基因活性的表型分離(31)(圖6，頂部柱形圖)。而且，在表現(xiàn)出GUS活性的種子中，在大多數(shù)情況下明顯有兩種不同的活性水平。大約四分之一來自半合子親本的T2種子中的較高水平活性與來自純合子親本的T2種子中觀察到的水平相似。因而，半合子植物種子中兩種不同水平的GUS活性可能是單個(gè)種子半合子或純合子轉(zhuǎn)基因狀態(tài)的結(jié)果，其揭示一種基因劑量效應(yīng)。圖7顯示α-球蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)棉花δ-12去飽和酶基因反義表達(dá)，提高不同轉(zhuǎn)基因世系棉花籽中油酸的水平。用其中來自Gossypiumhirsutum的δ-12去飽和酶基因以反義方向處于棉花α-球蛋白啟動(dòng)子控制下的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化棉花(Coker312)。棉花轉(zhuǎn)化如Sunilkumar和Rathore(2001)所述實(shí)施?？傆?jì)45株植物由26個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因愈傷組織世系再生。利用研缽和研杵使單個(gè)T1棉花種子或者每株植物隨機(jī)挑取的30個(gè)種子的混合樣品的內(nèi)核均質(zhì)化為細(xì)粉。如Dahmer等(1989)所述從50mg該粉末樣品中提取總脂肪酸。利用氣相色譜進(jìn)行脂肪酸分析。結(jié)果表達(dá)為總脂肪酸百分?jǐn)?shù)。棉花籽油的脂肪酸組成為肉豆蔻酸(0.9％)、棕櫚酸(24.7％)、硬脂酸(2.3％)、油酸(17.6％)及亞油酸(53.3％)(White等，2000)。轉(zhuǎn)基因植物T1種子的油酸水平范圍在15％到29％(圖7)。這些植物中亞油酸水平范圍在53％到40％之間。亞油酸水平下降的世系表現(xiàn)出相伴的油酸水平的提高。這種負(fù)相關(guān)是預(yù)期的，如果這種改變是δ-12去飽和酶活性阻遏的結(jié)果的話。圖8顯示了四種高油酸棉花種子世系在單個(gè)種子水平的脂肪酸水平。選擇四種高油酸世系在單個(gè)種子水平進(jìn)行脂肪酸分析。因?yàn)門1種子將發(fā)生轉(zhuǎn)基因分離，預(yù)期少數(shù)種子(零分離)具有野生型水平的油酸/亞油酸。然而，大多數(shù)種子將表現(xiàn)出較高油酸/較低亞油酸表型。如圖8所示，來自轉(zhuǎn)基因世系H50-2和H41-1的某些種子分別具有高達(dá)34.2％和34.3％的油酸水平。正如預(yù)期的那樣，來自所有四種世系的少數(shù)種子(很可能是零分離)表現(xiàn)出野生型水平的油酸/亞油酸。圖9顯示了T2棉花種子中的脂肪酸水平。種子由兩種高油酸世系萌發(fā)且植物生長(zhǎng)至成熟。對(duì)隨機(jī)挑取的30個(gè)T2種子的混合樣品進(jìn)行脂肪酸分析。來自H50-2世系#13和#15植物的T2種子分別具有32.3％和32.8％的油酸含量(圖9)。它們的亞油酸含量分別為35.9％和36.7％。在H41-1世系中，#1植物的T2種子含有32％油酸和37％亞油酸。如圖9所示，與野生型對(duì)照相比，某些轉(zhuǎn)基因世系種子的油酸水平增長(zhǎng)超過80％。這種油酸的增長(zhǎng)與相伴的亞油酸水平大約30％的下降相關(guān)。如圖7-9中所反映的，α-球蛋白啟動(dòng)子通過驅(qū)動(dòng)基因沉默構(gòu)建體的表達(dá)有效地操縱油料種子的脂肪酸水平。表2顯示了對(duì)照和AGPgusA轉(zhuǎn)基因棉花植物不同組織中的GUS活性，其反映了α-球蛋白啟動(dòng)子嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆N子特異性表達(dá)。種子特異性啟動(dòng)子表達(dá)的緊密調(diào)控在營(yíng)養(yǎng)部即使是最低水平的啟動(dòng)子活性也是不可接受的情況下很重要。為確定α-球蛋白啟動(dòng)子是否在種子中是絕對(duì)活性的，以及棉花α-球蛋白啟動(dòng)子是否能夠用于在種子中表達(dá)不期望在非種子組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因，測(cè)量了對(duì)照和AGPgusA轉(zhuǎn)基因植物不同組織中的GUS活性。如表2所示，基于MU(一種熒光反應(yīng)產(chǎn)物)定量的GUS測(cè)定表明AGPgusA基因僅在種子中表達(dá)，并且營(yíng)養(yǎng)和花組織中只記錄了極低水平的熒光讀數(shù)。表2.來自對(duì)照和AGPgusA轉(zhuǎn)基因棉花植物的各種組織中的GUS活性*重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)目不足以計(jì)算SE。測(cè)定進(jìn)行一式三份。數(shù)字為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。表3A和3B顯示了水脅迫(water-stressed)AGPgusA轉(zhuǎn)基因植物的GUS活性。已知某些Lea類種子特異性啟動(dòng)子成員因ABA以及干旱條件在營(yíng)養(yǎng)組織中活化(Seffens等，1990；Vivekananda等，1992，Siddiqui等，1998)。外源ABA被證明可誘導(dǎo)β-菜豆球蛋白啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)分離的轉(zhuǎn)基因煙草胚中的gusA基因(Bustos等，1998)。為排除，棉花α-球蛋白啟動(dòng)子(AGP)可能在已知導(dǎo)致內(nèi)源ABA水平提高的水脅迫條件下在營(yíng)養(yǎng)部活化的可能性，對(duì)通過禁止?jié)菜糜谒{迫下的3種不同轉(zhuǎn)基因世系植物的葉提取物進(jìn)行GUS熒光測(cè)定。在末次澆水后直至它們表現(xiàn)出徹底的萎蔫不同的時(shí)間點(diǎn)分析葉樣品的GUS活性。如表3A和3B所示，即使在它們徹底萎蔫后，這3種轉(zhuǎn)基因植物的任何葉樣品中未檢測(cè)到可檢測(cè)的GUS活性。該結(jié)果表明α-球蛋白啟動(dòng)子在種子中是絕對(duì)活性的，并且不因水脅迫條件在植物的營(yíng)養(yǎng)部誘導(dǎo)。表3A.水脅迫AGPgusA轉(zhuǎn)基因植物#1和#2的GUS活性。在葉提取物中進(jìn)行測(cè)定。表3B.水脅迫AGPgusA轉(zhuǎn)基因植物#3的GUS活性。在葉提取物中進(jìn)行測(cè)定。*測(cè)定進(jìn)行一式三份。數(shù)字為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。顯然在本研究中描述特征的1108bp棉花α-球蛋白啟動(dòng)子，能夠賦予棉花籽及兩種其它雙子葉植物種子強(qiáng)有力的種子特異性表達(dá)。AGP將可用于雙子葉植物種子發(fā)育期間涉及轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)的過表達(dá)或阻遏的任何應(yīng)用，因而增加了種子特異性啟動(dòng)子的可獲得性。本文已闡述了本發(fā)明的各種原理。所公開的各種技術(shù)和設(shè)備代表了本領(lǐng)域技術(shù)人員由本申請(qǐng)的教導(dǎo)可容易理解的技術(shù)和設(shè)備的一部分?？捎杀绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員添加執(zhí)行之的細(xì)節(jié)。附圖可能包含未在文本中具體討論的附加信息，且此類信息可無需增加新主題而加以描述。另外，可創(chuàng)建并提出所有要素或應(yīng)用的組合及排列?？蓪?shí)施一切以優(yōu)化具體應(yīng)用的功效。本文描述的各種步驟可聯(lián)合其它步驟，除非另行具體限定，能以許多順序發(fā)生，不同步驟可插入所闡述的步驟中間，且所闡述的步驟可拆分為多個(gè)步驟。除非是上下文另有需要，措辭“包括”或該措辭的變形“包含”或“含”應(yīng)理解為暗指包含所闡述的要素或步驟或要素或步驟構(gòu)成的組，但不排除其它要素或步驟或要素或步驟構(gòu)成的組。此外，特此將本專利申請(qǐng)中提及的任何參考文獻(xiàn)以及隨本申請(qǐng)遞交的參考文獻(xiàn)列表中所列的所有參考文獻(xiàn)并入作為參考。然而，就可能被認(rèn)為與本發(fā)明的專利性不一致的陳述而言，此類陳述明顯地不應(yīng)當(dāng)考慮為是由申請(qǐng)人作出的。參考文獻(xiàn)AnG，EbertPR，MitraAandHaSB(1988)Binaryvectors.InGelvinSBandShilperoortRA(eds.)PlantMolBiolManual(pp.A31-19)KluwerAcademicPublishers，Dordrecht.BarkerSJ，HaradaJJandGodbergRB(1988)CellularlocalizationofsoybeanstorageproteinmRNAintransformedtobaccoseeds.ProcNatlAcadSciUSA85458-462.BechtoldNandPelletierG(1998)InplantaAgrobacterium-mediatedtransformationofadultArabidopsisthalianaplantsbyvacuuminfiltration.MethodsMolBiol82259-266.BevanM(1984)BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation.NucleicAcidsRes.128711-8721BogueMA，VonderHaarRA，NuccioML，GriffingLRandThomasTL(1990)Developmentallyregulatedexpressionofasunflower11Sseedproteingeneintransgenictobacco.MolGenGenet22249-57.BorrotoKandDureIIIL(1987)Theglobulinseedstorageproteinsoffloweringplantsarederivedfromtwoancestralgenes.PlantMolBiol8113-131.BradfordMM(1976)Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.AnalBiochem72248-254.BrusslanJAandTobinEM(1995)Isolationofnewpromoter-mediatedco-suppressedlinesinArabidopsisthaliana.PlantMolBiol27809-813.BustosMM，BegumD，KalkanFA，BattrawMJandHallTC(1991)Positiveandnegativecis-actingDNAdomainsarerequiredforspatialandtemporalregulationofgeneexpressionbyaseedstorageproteinpromoter.EMBOJ101469-1479.BustosMM，GuiltinanMJ，JordanoJ，BegumD，KalkanFAandHallTC(1989)Regulationofβ-glucuronidaseexpressionintransgenictobaccoplantsbyanA/T-rich，cis-actingsequencefoundupstreamofaFrenchbeanβ-phaseolingene.Pla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)載體，其包含權(quán)利要求45的表達(dá)盒。66.細(xì)胞，其包含權(quán)利要求45的表達(dá)盒。67.轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求45的表達(dá)盒。68.表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求46的表達(dá)盒。69.細(xì)胞，其包含權(quán)利要求46的表達(dá)盒。70.轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求46的表達(dá)盒。71.獲得生產(chǎn)至少一種種子的植物的方法，所述種子具有不同于來自相同物種但未用此方法處理的植物的蛋白含量，所述方法包括a)用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主植物細(xì)胞，其中所述構(gòu)建體包含作為可操作連接組分的α球蛋白基因調(diào)控區(qū)以及編碼蛋白的DNA序列，其中所述組分在植物細(xì)胞中起作用，藉此所述DNA構(gòu)建體整合到所述植物細(xì)胞的基因組中；b)從所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生植物；和c)在所述目的DNA序列藉以表達(dá)并獲得具有所述蛋白含量的種子的條件下培養(yǎng)所述植物。72.權(quán)利要求71的方法，其中所述α球蛋白基因調(diào)控區(qū)包含SEQIDNO1中所示的DNA序列。73.權(quán)利要求71的方法，其中所述α球蛋白基因調(diào)控區(qū)包含SEQIDNO2中所示的DNA序列。74.權(quán)利要求71的方法，其中所述α球蛋白基因調(diào)控區(qū)包含SEQIDNO3中所示的DNA序列。75.權(quán)利要求71的方法，其中所述編碼蛋白的DNA序列是異源基因。76.權(quán)利要求72、73或74的方法，其中所述DNA序列編碼改變所述至少一種種子脂肪酸含量的蛋白。77.獲得生產(chǎn)至少一種種子的植物的方法，所述種子具有不同于來自相同物種但未用此方法處理的植物的蛋白含量，所述方法包括用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主植物細(xì)胞，其中所述構(gòu)建體包含作為可操作連接組分的α球蛋白基因調(diào)控區(qū)以及編碼蛋白的DNA序列，其中所述組分在植物細(xì)胞中起作用。78.獲得生產(chǎn)至少一種種子的植物的方法，所述種子具有不同于來自相同物種但未用此方法處理的植物的蛋白含量，所述方法包括用RNA或DNA轉(zhuǎn)化宿主植物細(xì)胞，其中所述構(gòu)建體包含作為可操作連接組分的α球蛋白基因調(diào)控區(qū)以及編碼蛋白的RNA或DNA序列，其中所述組分在植物細(xì)胞中起作用。79.與來自相同物種但未用此方法處理的植物的細(xì)胞相比，改變生產(chǎn)至少一種種子的植物的細(xì)胞中蛋白表達(dá)的方法，所述方法包括將RNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)移至宿主植物細(xì)胞，其中所述構(gòu)建體包含作為可操作連接組分的α球蛋白基因調(diào)控區(qū)以及驅(qū)動(dòng)與編碼蛋白的內(nèi)源RNA互補(bǔ)的RNA轉(zhuǎn)錄的RNA序列，藉此所述內(nèi)源蛋白的表達(dá)得以改變。全文摘要本發(fā)明涉及棉花種子特異性基因α－球蛋白的5′調(diào)控區(qū)。當(dāng)所述5′調(diào)控區(qū)或其部分可操作地連接于天然基因、異源基因的編碼序列或者植物種子中的序列或互補(bǔ)序列時(shí)，該調(diào)控區(qū)可用在表達(dá)盒及表達(dá)載體中用于轉(zhuǎn)化植物。同樣提供的還有通過用本表達(dá)盒及表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物來調(diào)節(jié)天然或異源基因例如脂肪酸合成或脂類代謝基因水平的方法。文檔編號(hào)A01H5/10GK1871354SQ02827579公開日2006年11月29日申請(qǐng)日期2002年12月11日優(yōu)先權(quán)日2001年12月13日發(fā)明者K·S·拉瑟爾,G·蘇尼庫(kù)瑪,J·P·康奈爾,A·S·雷迪申請(qǐng)人:得克薩斯州A&M大學(xué)系統(tǒng)