一種用于抑制冠狀病毒感染的制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于抑制冠狀病毒感染的制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 冠狀病毒不僅可以引起許多動物疫情的暴發(fā)，同時，也是人類普通感冒的主要病 原之一，兒童感染率較高，主要是上呼吸道感染，一般很少波及下呼吸道，潛伏期2~5天，各 年齡組均有發(fā)病，兒童多見，以上呼吸道感染為特征，少數(shù)可致腹瀉、支氣管炎、肺炎和胸腔 積液等。近年來，尤其值得注意是病冠狀病毒常常引起人類嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)感染，導(dǎo)致嚴(yán)重 急性呼吸綜合征(SARS)和中東呼吸綜合征(MERS)等烈性傳染病的暴發(fā)，對全球公共衛(wèi)生系 統(tǒng)造成極大的沖擊。
[0003] 人類面臨病毒性傳染病的現(xiàn)實和潛在威脅日益嚴(yán)峻，人類應(yīng)對突發(fā)傳染病的防控 壓力日感倍增，但愈來愈多的實際情況表明：當(dāng)病毒發(fā)生突變或出現(xiàn)新型病毒而導(dǎo)致傳染 病疫情暴發(fā)時，原來的特異性防治藥物難以發(fā)揮應(yīng)有防控效果，甚至毫無療效，而人類認(rèn)知 水平和科研周期的限制，又使具有顯著療效的新一代特異性預(yù)防和治療藥物難以在短時間 內(nèi)推出，極易導(dǎo)致疫情的迅速擴(kuò)散和局部地區(qū)的災(zāi)難性暴發(fā)，不僅對當(dāng)?shù)氐墓残l(wèi)生服務(wù) 造成極大的破壞，同時也對社會的政治和經(jīng)濟(jì)造成巨大的沖擊。因此，依據(jù)病毒的基本生物 學(xué)特性，針對病毒侵染宿主細(xì)胞的共性靶點，研發(fā)新型病毒感染抑制劑，對于應(yīng)對病毒性傳 染病疫情的持續(xù)挑戰(zhàn)具有重要意義。
[0004]植物化合物被稱為"第七類營養(yǎng)素"，廣泛存在于日常食物，是一類對人體健康具 有特殊作用的非營養(yǎng)性化學(xué)物質(zhì)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)部分植物化合物具有抑制病毒感染的生物 活性，并逐漸成為抗病毒研究的熱點之一。初步的研究結(jié)果顯示:植物化合物的生物學(xué)效應(yīng) 主要表現(xiàn)在其對細(xì)胞膜生物學(xué)特性的影響和局部微環(huán)境平衡的改變等方面，部分植物化合 物通過直接嵌入細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞膜正常的功能性流動和電勢電位差，進(jìn)而 發(fā)揮一定的生物學(xué)效應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種抑制冠狀病毒感染的制劑及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所提供的應(yīng)用具體為一種制劑在如下（1)或(2)中的應(yīng)用：
[0007] (1)制備用于抑制冠狀病毒感染的產(chǎn)品；
[0008] (2)用于抑制冠狀病毒感染；
[0009] 所述制劑主要由表沒食子兒茶素沒食子酸酯、單寧酸和黃芪多糖混合而成;所述 表沒食子兒茶素沒食子酸酯、所述單寧酸和所述黃芪多糖的質(zhì)量配比為(〇. 5-1.0): (0.5- 1.0):(0.5-1.5)〇
[0010] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述用于抑制病毒感染的制劑具體由表沒食子兒茶素 沒食子酸酯(EGCG)、單寧酸和黃芪多糖混合而成;所述表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、 所述單寧酸和所述黃芪多糖的質(zhì)量配比為1: 1:1.5。
[0011] 在本發(fā)明中，所述抑制冠狀病毒感染為如下(a)或(b):
[0012] (a)預(yù)防冠狀病毒感染；
[0013] (b)在與冠狀病毒同時作用于宿主或宿主細(xì)胞時，抑制所述冠狀病毒對所述宿主 或所述宿主細(xì)胞的感染。
[0014] 更加具體的，在本發(fā)明的實施例中，所述制劑對所述冠狀病毒感染的抑制作用具 體體現(xiàn)為：以哺乳動物細(xì)胞作為冠狀病毒感染對象，在冠狀病毒感染細(xì)胞的同時或者在冠 狀病毒感染細(xì)胞前施用所述制劑，所述制劑對冠狀病毒的半數(shù)抑制濃度與抑制病毒感染的 陽性對照藥物相比顯著降低。所述陽性對照藥物具體為利巴韋林(Ribavirin)。
[0015] 在本發(fā)明中，所述哺乳動物細(xì)胞(或(b)中所述的宿主細(xì)胞)具體為鼠成纖維細(xì)胞 (17C1-1 細(xì)胞）。
[0016] 在本發(fā)明中，所述冠狀病毒為鼠肝炎冠狀病毒。更加具體的，所述冠狀病毒為鼠肝 炎冠狀病毒A59株。
[0017] 本發(fā)明以冠狀病毒(mouse hepatitis virus，MHV)為實驗對象，采用觀察細(xì)胞病 變的方法，在不同的感染條件下，分別分析了表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、單寧酸和 黃芪多糖這三種植物化合物單體及其混合制劑抑制病毒感染的規(guī)律和特點。結(jié)果證實:本 發(fā)明所提供的三種植物化合物單體和復(fù)合配方混合物的細(xì)胞毒性均不高于已經(jīng)獲得安全 許可的對照樣品利巴韋林，較為安全。在安全的使用濃度下，預(yù)防性使用EGCG和單寧酸等植 物化合物單體以及植物提取物復(fù)合配方混合物，可以有效的抑制冠狀病毒的感染。本發(fā)明 所提供的制劑具有進(jìn)一步研發(fā)為冠狀病毒感染抑制劑的商業(yè)價值。
【具體實施方式】
[0018] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0019] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0020]下述實施例中涉及的定量實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（土s)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng) 計軟件運用單因素水平方差分析的方法對組間比較數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。
[0021] 細(xì)胞株：鼠成纖維細(xì)胞（17C1-1細(xì)胞），由英國布里斯托大學(xué)Stuart Siddell教授 饋贈，記載于"Lin Lei1Sun Ying1Wu Xiaoyan1Sun Zounan1Yang Yi,Su Wenli1Hu Yi1Zhu Qingyu,Guo Deyin,Liu Jingmei,Chang Guohui·Attenuation of Mouse Hepatitis Virus by Deletion of the LLRKxGxKG Region of Nspl.PLoS ONE,2013 8(4) :e61166.，> 一文，公眾可從申請人處獲得，僅用于重復(fù)本發(fā)明實驗使用。細(xì)胞按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。 [0022] 病毒：冠狀病毒（鼠肝炎冠狀病毒A59株，簡稱MHV-A59)記載于"Lin Lei，Sun Ying1Wu Xiaoyan,Sun Zounan1Yang Yi,Su WenIi,Hu Yi,Zhu Qingyu,Guo Deyin1Liu Jingmei,Chang Guohui.Attenuation of Mouse Hepatitis Virus by Deletion of the LLRKxGxKG Region of Nspl.PLoS 0NE，2013 8(4) :e61166."一文，公眾可從申請人處獲 得，僅用于重復(fù)本發(fā)明實驗使用。
[0023] 培養(yǎng)液：1 )、細(xì)胞生長培養(yǎng)液：以DMEM培養(yǎng)基(G1 ibo公司產(chǎn)品）為母液，分別加入 10 % (體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(Sigma公司產(chǎn)品），0 · 2mg/ml谷氨酰胺(G1 ibo公司產(chǎn)品），100U/ml 青霉素，鏈霉素。2)、細(xì)胞維持培養(yǎng)液，胎牛血清含量為2% (體積分?jǐn)?shù)），其余與1)均相同。 3)、病毒增殖培養(yǎng)液:與細(xì)胞生長培養(yǎng)液相同。
[0024] 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG) :Sigma公司產(chǎn)品（分析純度>95%)，產(chǎn)品編號 為E4143，CAS#989-51-5。
[0025] 單寧酸（Tannin):Sigma公司產(chǎn)品（分析純度>99%)，產(chǎn)品編號為V900190;CAS# 1401-55-4。
[0026] 黃芪多糖（APS):上海金穗生物科技有限公司產(chǎn)品（2-(Chl〇r〇methyl )-4-(4-nitrophenyl)-l，3-thiazole)(分析純度 >70%)，產(chǎn)品編號為 JS11328;CAS#89250-26-0。
[0027] 陽性對照藥物:利巴韋林(Ribavirin)，美侖生物公司產(chǎn)品。因目前還未有通過改 變宿主細(xì)胞膜特性抑制病毒感染的標(biāo)準(zhǔn)陽性對照藥物。本研究以目前抗病毒最常用藥物利 巴韋林作為對照。實驗前以PBS緩沖液溶解，制成2560μg/ml過濾，除菌后，-20 °C保存。
[0028] 倒置相差顯微鏡：日本Olympus公司產(chǎn)品。
[0029] 細(xì)胞培養(yǎng)箱:美國Thermo公司產(chǎn)品。
[0030] 多功能酶儀:美國Molecular Devices公司SpectraMax M5型多功能酶標(biāo)儀。
[0031] 1、細(xì)胞復(fù)蘇與傳代
[0032] 液氮中取出17C1-1細(xì)胞，37°C水浴，融化后，以1000 rpm離心5min，棄上清，加入適 當(dāng)?shù)募?xì)胞生長培養(yǎng)液，反復(fù)吹打均勻，使細(xì)胞密度約為2 X IO5個/ml，以IOml/瓶，于T25細(xì)胞 培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。24h后于鏡下觀察，細(xì)胞的貼壁情況，48-72h后，或待細(xì) 胞生長到密度大約為95%時，棄原培養(yǎng)液，加入PBS緩沖液，漂洗兩次，0.5ml 0.25% (0.25g/100ml)EDTA，于37°C培養(yǎng)箱中溫育消化，當(dāng)細(xì)胞收縮變圓時，迅速加入細(xì)胞生長培 養(yǎng)液，終止消化，反復(fù)吹打均勻后，以1000 rpm離心，5min，棄上清，使懸浮細(xì)胞濃度約為I X IO5個/ml，IOml/每瓶，移入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱，進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。
[0033] 2、病毒增殖
[0034] 取細(xì)胞生長密度約為80%的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄原液，以roS，漂洗兩次，以去除血 清殘留，加入已稀釋病毒(稀釋液為PBS緩沖液），接種量MOI = O.01，以及Iml培養(yǎng)基，晃勻， 置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附lh，棄上清，每瓶加入IOml相應(yīng)病毒增殖培養(yǎng)液。觀察細(xì)胞病變，48-72h后，或待細(xì)胞病變達(dá)75 %以上時，收毒，取上清，反復(fù)凍融3次，以3000rpm，4°C，離心 5min，分裝上清，并測定病毒滴度TCID50。
[0035] 3、病毒滴度TCID5q測定
[0036]采用致細(xì)胞病變法(CPE)測定，以單細(xì)胞懸液，加入96孔微量培養(yǎng)板中，每孔200μ 1，使細(xì)胞量達(dá)到2 X IO5個/ml，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h，直至細(xì)胞單層密度約為80 %時， 取出，棄培養(yǎng)基，以PBS漂洗兩遍，利用病毒增殖培養(yǎng)液將病毒原液10倍梯度稀釋為10 3~ 1〇_13,每濃度梯度8孔一列，每