一種用于檢測眼科疾病的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種包含特異結(jié)合人瘦素蛋白leptin的核酸適體的試劑盒。本發(fā)明提供的核酸適體，與人瘦素蛋白具有較好的親和能力。利用本發(fā)明的核酸適體，可以捕獲溶液中的人瘦素蛋白，將其制備成為相應(yīng)的試劑盒，將用于眼病的篩查。利用本發(fā)明的試劑盒，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu)點。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及一種用于檢測眼科疾病的試劑盒及其檢測方法。 -種用于檢測眼科疾病的試劑盒及其檢測方法
【背景技術(shù)】
[0002] 格雷夫斯病(Graves'disease)是一種常見病，女性發(fā)病率為1/1000人/年。除甲狀 腺功能亢進W外，25-50%患有格雷夫斯病的個體病情發(fā)展到在臨床上累及眼睛，即甲狀腺 眼病。格雷夫斯眼病(Graves'O地化almopathy，G0或TA0)是甲狀腺眼病的典型形式。雖然一 些GO患者只患有輕微的眼睛不適，但是3-5%患有劇烈疼痛和炎癥伴有復(fù)視乃至視力喪失。 目前由于本病原因未明，臨床主要W激素、免疫抑制劑、生長激素類似物、抗甲狀腺藥物、眶 內(nèi)放射、眼眶減壓術(shù)等綜合治療為主，但由于種種原因，效果并不盡人意，迄今為止尚無任 何一種藥物能有效治療TA0,并獲長期緩解。因此，研究治療甲狀腺相關(guān)眼病的藥物是亟待 解決的技術(shù)問題。而檢測所述疾病更是本領(lǐng)域積極研究的方向。
[0003] 近年來的研究表明，人瘦素蛋白（rh-leptin)對TAO患者眼眶前脂肪成纖維細胞增 殖、移行W及細胞分化過程中細胞內(nèi)脂質(zhì)形成具有重要的作用。因此，檢測人瘦素蛋白的表 達情況，可W直接用于鑒定甲狀腺相關(guān)眼病。然而傳統(tǒng)的檢測人瘦素蛋白的表達情況具有 操作復(fù)雜，費時的缺點。
[0004] 核酸適體(Aptamer，又稱適配體，適配子)是能高親和性、高特異性的結(jié)合某種生 物革El標(biāo)的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù) (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment,SELEX)從人工合成的 DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高度特異性結(jié)合祀標(biāo)分子的單鏈DNA/RNA。已報道核酸適體 的祀標(biāo)包括金屬離子、有機小分子、多膚、蛋白質(zhì)、細胞甚至組織等。核酸適體的分子識別功 能與抗體類似，具有與抗體分子相當(dāng)甚至更強的祀標(biāo)識別能力，但與抗體相比具有很多優(yōu) 良的特性，如分子量小，能批量生產(chǎn)，不易失活，無免疫原性、容易合成與標(biāo)記、快速的穿透 組織、良好的代謝動力學(xué)、不同批次之間產(chǎn)品不會存在差異和具有很好化學(xué)穩(wěn)定性，在生物 檢測、疾病診斷治療等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種特異結(jié)合Ieptin的核酸適體及其試劑盒。
[0006] 本發(fā)明提供的核酸適體，是序列表的序列1-15所示的單鏈DNA。
[0007] 所述核酸適體與Ieptin蛋白具有較好的親和能力。
[000引還可將所述核酸適體進行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。
[0009] 所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種：
[0010] a)將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補的核巧酸，得到的與所述核酸適體具 有相同功能的核酸適體的衍生物；
[0011] b)將所述核酸適體進行核巧酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同 功能的核酸適體的衍生物；
[0012] c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代憐酸醋骨架，得到的與所述核酸適體具有相 同功能的核酸適體的衍生物；
[0013] d)將核酸適體改造為膚核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的 衍生物；
[0014] e)將所述核酸適體連接上巧光、放射性和治療性物質(zhì)后，得到的與所述核酸適體 具有相同功能的核酸適體的衍生物。
[0015] 所述核酸適體可用于制備檢測Ieptin的試劑盒。
[0016] 利用本發(fā)明的核酸適體，可W捕獲血液中的leptin，從而用于甲狀腺相關(guān)眼病篩 查。利用本發(fā)明的核酸適體，部分代替單克隆抗體捕獲Ieptin進行檢測，具有高靈敏、成本 低、易制備、易保存的優(yōu)點。本發(fā)明具有很高的應(yīng)用價值。
【具體實施方式】
[0017] W下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0018] 實施例1、核酸適體的篩選和制備
[0019] 設(shè)計兩端包含大約20個核巧酸、中間包括39個核巧酸的隨機核酸文庫如下：
[0020] 5'-TAGACTATCATGTGACTT(N39)GAGTGCTCGATGCTACTAG-3' ；N39代表39個隨機核巧 酸。
[0021 ]將單鏈DNA文庫擴增為雙鏈DNA，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；W回 收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機文庫，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。7化g RNA文庫經(jīng) 硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與化g 1邱tin蛋白（利用CN100366738C公 開的方法，表達得到的目的蛋白），37°C解育30min，反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗涂濾膜； 然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液（6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸錠，1.5mmol/L EDTA， 0.15% SDS)中煮沸5min，離屯、，取上清，無水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20iilDEPC水中；W RNA為模板RT-PCR擴增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA文庫用于下一輪篩選;每輪篩選過程中RT- PCR得到雙鏈DNA文庫，W該雙鏈DNA為模板體外轉(zhuǎn)錄出RNA適配子庫，篩選共進行12輪。得到 了 15個適配子，其序列分別為SEQ ID NO: 1-15所示。具體序列如下所示：
[0022] Ieptin-I：
[0023] TAGACTATCATGTGACTTCCTTAACTATATACAATTATGTCATATCTTACAAGTACTGAGTGCTCGATGCTACTAG (沈Q ID NO: 1)
[0024] 1邱tin-2:
[0025] TAGACTATCATGTGACTTTACAAGATACATTCATCCCGCAACACACTCAACCAACTCGAGTGCTCGATGCTACTAG (沈Q ID NO:2)
[0026] 1邱tin-3:
[0027] TAGACTATCATGTGACTTTCTACCTAATAATAACCTATACCTCCCTCAGTAATCACAGAGTGCTCGATGCTACTAG (沈Q ID NO:3)
[002引 I邱tin-4:
[0029] TAGACTATCATGTGACTTACCTATTAACTTGTACTCCTACAAACCCAGAACAACACAGAGTGCTCGATGCTACTAG (沈Q ID NO:4)
[0030] I邱tin-5:
[0031] TAGACTATCATGTGACTTTCACTGTTAACACAGATAATTAACATAACAACGTCTATAGAGTGCTCGATGCTACTAG (沈Q ID NO:5)
[0032] leptin-6：
[0033] TAGACTATCATGTGACTTAAACATCCTCCCTATACCTATCCGTATACCGCTTCCTCTGAGTGCTCGATGCTACTAG (沈Q ID N0:6)
[0034] leptin-7：
[0035] TAGACTATCATGTGACTTAACACCGCCTAATATTAATATCCCCTTCTTCATAGATCAGAGTGCTCGATGCTACTAG (沈Q ID NO:7)
[0036] leptin-8：
[0037] TAGACTATCATGTGACTTCCGACTTCATACATACTCCTCTTCATCCTGTAATCAACCGAGTGCTCGATGCTACTAG (沈Q ID N0:8)
[003引 leptin-9:
[0039] TAGACTATCATGTGACTTATATATCCTCCACTTAGATAACAATCTTCAGACACTCCAGAGTGCTCGATGCTACTAG (沈Q ID N0:9)
[0040] I邱tin-10:
[0041] TAGACTATCATGTGACTTCCTCCTTCTTCCTCCGATTCATCCTCAATAGATACTATTGAGTGCTCGATGCTACTAG (沈Q ID NO: 10)
[0042] I邱tin-1I:
[0043] TAGACTATCATGTGACTTTTCACGCTCAATCATAAATCTTAGAATCCAATAATTACCGAGTGCTCGATGCTACTAG (沈Q ID NO: 11)
[0044] I邱tin-12:
[0045] TAGACTATCATGTGACTTCCGCCACTCCTCATCACATCGCCACACCCAAATTCACAAGAGTGCTCGATGCTACTAG (沈Q ID NO: 12)
[0046] I邱tin-13:
[0047] TAGACTATCATGTGACTTCGCTCCTCTCTTGTTTACTACACATATCTTGTTATCTTAGAGTGCTCGATGCTACTAG (沈Q ID NO: 13)
[004引 I邱tin-14:
[0049] TAGACTATCATGTGACTTACCTATTCCGCCCTCACCTTCCTCTACTAGATCATAACTGAGTGCTCGATGCTACTAG (沈Q ID NO: 14)
[0050] leptin-15：
[0化1 ] TAGACTATCATGTGACTTATAATTCTATATATATCGCACTACATCAAACGCCATAAAGAGTGCTCGATGCTACTAG (沈Q ID NO: 15)
[0052] 實施例2蛋白結(jié)合適配子的性能測定
[0053] 將RNA適配子分別取2.化g，用牛小腸堿性憐酸酶(CIP) 37 °C消化化，純化回收去憐 酸化的RNA;通過T4多核巧酸激酶標(biāo)記[丫 -32P]ATP于去憐酸化的RNA分子末端。Wnmol放射 性標(biāo)記的RNA適配子分別與不同濃度（l-200nM)的1邱tin 37°C解育30min，各組反應(yīng)液經(jīng)硝 酸纖維素膜濾過，洗涂濾膜，干燥濾膜，液閃計數(shù)儀測定濾膜上殘留的放射量，同一樣品平 行做兩次測定。計算各個適配子與Ieptin的解離常數(shù)。結(jié)果如下： 「00541
LUU。。」 頭月畫順論化肥了符開化丹仍W 乂假、疋化OT仍
[0056] 分別采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍亂弧菌VgrG3C蛋白，大腸桿菌外膜蛋白 A，LP-PLA2蛋白，1 ept in，與14條適配子進行特異性檢測，經(jīng)過結(jié)合試驗發(fā)現(xiàn)，運些適配子都 不與運些蛋白相結(jié)合，而只與Ieptin結(jié)合保持較高的特異性。
[0057] 將所述的適配子，取0.化g，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置二周。通過RT- PCR檢測，發(fā)現(xiàn)二周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有被降解。
[005引實施例4所述適配子疾病的診斷
[0059] 將14個適配子分別與12個格雷夫斯眼病患者W及正常人的血液混合30min，通過 生物素分離，定量分析其中的Ieptin蛋白的含量，通過分析發(fā)現(xiàn)，12個格雷夫斯眼病患者中 Ieptin蛋白的含量相對于正常人顯著增加2倍。
[0060] W上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本 發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種用于眼科疾病檢測的試劑盒，其含有核酸適體。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述核酸適體為SEQ ID No: 12所述。3. -種檢測眼科疾病的方法，其特征在于利用權(quán)利要求1所述的試劑盒。4. 如權(quán)利要求1-2所述的試劑盒，其特征在于:所述眼科疾病為格雷夫斯眼病。
【文檔編號】C12N15/115GK106018837SQ201610637702
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2015年11月1日
【發(fā)明人】李倩
【申請人】李倩